一種來源於蘋果的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列的製作方法

2023-05-21 07:18:56 2

專利名稱：：一種來源於蘋果的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列的製作方法
技術領域：
：本發明涉及的是一種植物基因工程領域的基因序列，具體是一種來源蘋果的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列。
背景技術：
：轉基因作物研究中使用的標記基因99%以上使用的是傳統的標記基因，即GUS基因和抗性標記(抗生素和除草劑)。目前使用的GUS基因來源於大腸桿菌，雖然研究結果證明GUS報告基因是相對安全的，但畢竟來源於大腸桿菌，普通消費者容易引起心理顧忌。因此發掘和改造具有植物內源性的新型安全標記基因具有現實意義。目前應用到的相對安全的標記基因有甜菜鹼醛脫氫酶基因、葡糖醛酸酶基因、木糖異構酶基因、磷酸甘露糖異構酶基因、來源於農桿菌的LM1基因和及甜椒類鐵氧還蛋白基因等。這些代謝相關基因特別是一些來源於植物物種本身的基因與抗生素或除草劑抗性標記基因相比，沒有毒性。利用這些安全標記基因不僅可以獲得無抗性標記基因的轉化植株，緩解抗性標記基因的生物安全性問題，而且可以提高難以轉化的物種的轉化效率，具有一定的優勢。但是這些安全標記基因作為篩選標記而言，篩選效率遠低於傳統的除草劑抗性和抗生素抗性基因。統計至2004年，全球傳基因作物研究中使用的標記基因74%使用的是抗生素抗性基因，25%使用的是除草劑抗性基因，只有不到1%使用的是其他類型的篩選標記。全球種植的轉基因作物中78%以上是抗除草劑性狀。因此可以推斷在相當長的一段時間內，抗性標記(抗生素和除草劑)仍然是最主要的篩選標記。因此發掘和改造來源大面積生產植物本身的新型安全抗生素和除草劑抗性基因將是必要的。目前種植抗除草劑轉基因作物的國家越來越多，面積也迅速增加，種植面積不斷擴大，佔全球種植轉基因作物的78%以上。根據2002年資料表明，耐草甘膦大豆依舊是美國、阿根廷、加拿大、墨西哥、羅馬尼亞、烏拉圭和4南非等七國的主要商品化轉基因農作物。耐草甘膦除草劑大豆在全球範圍內種植3650萬公頃，佔全球總轉基因農作物種植面積的62%。草甘膦是一種廣譜滅生性、內吸傳導型優秀除草劑。廣泛用於果園、膠園、非耕地、免耕地中玉米、大豆、棉花播前或播後處理，以及出苗後定向處理。1974年在美國註冊登記以來，至今已在世界100多個國家註冊，成為世界上使用面積最大的除草劑品種。草甘膦(N-phosphonomethyl-glycine,glyphosate)毒性作用機理是競爭性抑制莽草酸途徑中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(簡稱EPSP合成酶)的活性。EPSP合成酶是植物和微生物體內芳香族胺基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等)生物合成過程中的一個關鍵酶。該酶由wo4基因編碼。
發明內容發明目的利用cDNA末端快速擴增技術從蘋果幼苗中克隆編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列。目前使用的抗草甘膦基因主要來源於微生物的EPSP合成酶基因，有潛在的生物安全性問題。本發明克服了現有技術中的不足，提供了一種來源於大面積種植植物本身，因此具有相對良好的安全性，由於蘋果是人們平時食用的的一種大眾化水果，具有味美、價廉、耐貯等優點，深受國人的喜愛，從中來源的目的基因意義更大。本發明是這樣實施的1.蘋果cDNARACE文庫的構建取生長健壯的蘋果苗採用CTAB法(購買於上海國藥化學公司)抽提總RNA。使用Promega公司的磁珠分離系統進行mRNA的分離，具體步驟參看實施例1。利用SMART技術(Clontech公司)合成cDNA第一鏈，使用的引物是R11464和R11466(GAC,CAG,TGG,TAT,CAA，CGC,AGA，GTA,CGC,GGG和GCA,GGA,CTG,CAG,CTG，ACT,GAC，TAC,TTT,TTT,TTT，TTT,TTT,TTT,TTT,TTT,TTT,TTT,VN)。SMART技術的參照Clontech說明書進行操作。合成好的蘋果cDNA庫保存於-7(TC。2.用PCR的方法獲蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的保守片段根據植物和微生物的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)保守結構域的胺基酸序列特徵設計一對兼併引物MdepspsFl和MdepspsRl(ANG,ANG，GVA，GNT，GDA,GBT，NTC和ANC,TBG,CHC,TNG,ANG,CVT,NGC)，以合成的蘋果cDNARACE文庫為模板，進行PCR擴增(PCR反應體系10xPCRbuffer5.0|il;dNTPs(各2.5mM)4^1;蘋果cDNA模板ljil(20ng);引物MdepspsFl0.5pi;引物MdepspsRl0.5Ex-Taq0.4|il(預變性後加入)；加無菌水定容至50|iL。PCR反應程序94"C預變性10分鐘；94。C變性30秒；52。C退火30秒；72。C延伸50秒；共35個循環；72。C延伸IO分鐘)。獲得一條約250bp的片段(圖3)，將該擴增產物回收後克隆入T-載體(購買於大連寶生物工程公司)，測序得到保守片段的DNA序列，經過Blast比對為5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的保守片段。序列為TTTTGTCGAAGGCGATGCTTCAAGTGCTAGTT。3.RACE方法獲得蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶片段根據已經克隆的蘋果5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的保守片段序列分別合成5'和3'RACE擴增的內側和外側巢式PCR(Nest-PCR)(具體見實施例3)。引物分別為MdepspsW5，MdepspsN5和Mdepsps-W3，MdepspsN3(MdepspsW5:TCC，ACA，TAC,GGA，ATG,GAA,ATT，AG;MdepspsN5:ATA,AGC，AAA,GCA,GTC，AAG,TAC,TG;Mdepsps-W3:ATG,ACT，TTG，AAG，TTG，ATG,GAA，CGC;MdepspsN3:ATC，GGT，TTT,TGA,TCC,AAG，GAG,GTC)。4.PCR方法獲得蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶全長序列通過對5'和3'RACE擴增片段的序列測定和分析，得到全長為1578bp的序列。根據該序列設計引物，從蘋果cDNA文庫中擴增得到全長的蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因，進行序列測定分析。formulaseeoriginaldocumentpage7圖1瓊脂糖凝膠電泳鑑定總RNA產物的結果；圖2瓊脂糖凝膠電泳鑑定分離的mRNA產物的結果；圖3瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增保守片段產物；圖4瓊脂糖凝膠電泳檢測5'RACE擴增產物；圖5瓊脂糖凝膠電泳檢測3'RACE擴增產物；圖6瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增全長的DNA片段。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但不限制本發明。下述實施例中，所用的試驗材料及其來源包括蘋果(M3/wstfowe5"ca)實生苗，株高15cm，27"C人工氣候室培養，16h光照培養兩個月。大腸桿菌￡.^//01150[由上海市農業科學院生物技術研究所植物基因工程研究室得到。克隆載體pMD18-T、各類限制性內切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10xPCRbuffer和DNAmarker購自寶生物工程大連有限公司。含有"flcC7基因啟動子和T1T2終止子的原核表達載體pYPX251由上海市農業科學院生物技術研究所植物基因工程研究室皿，已登陸GenBank(GenBanknumber:AY178046)。所有的化學試劑都從美國西格瑪化學公司和上海國藥化學試劑購買。ABIPRIAMBig-DyeTerminatorDNA測序試劑盒購自美國應用系統公司。SMARTTMRACEcDNA擴增試劑盒購買於美國Clontech公司。下述實施例中常規的基因操作參照有關文獻，其中引物PAGE純化、蛋白質電泳，透析袋回收DNA、DNA測序、質粒鹼法抽提方法參照分子克隆文南犬SambrookJ,FretsEF,MannsdesTetal.In:MolecularCloning.2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989.實施例1:蘋果幼苗RNA的抽提和mRNA的分離(一)試驗方法1、RNA的抽提1)加入100ml提取緩衝液(蘋果RNA提取緩衝液配方CTAB3%(W/V);PVP3%(W/V)(Mw4000);EDTA25mM;NaCl2.0M;Tris-HCl100mM，pH8.0;Spermidine0.5g/L;DEPC0.1%(V/V);0.1%DEPC處理的SDS0.5%(W/V);0.1%DEPC處理的LiClIOM。)至lj50ml聚丙烯管，65°C預熱；2)稱取2.3g植物蘋果幼苗植株材料倒入液氮使材料始終保持凍結和易碎的狀態，研磨；3)研磨後細粉轉移至預先加入65t:預熱的提取緩衝液的50ml離心管；4)將離心管放入65r水浴45min，並偶爾搖動以混合各成分；5)加入等體積氯仿-異戊醇混合液，輕柔地上下顛倒混合約10min;6)在18。C，於12000g離心10min;7)吸取上清液，重複5，6步驟操作；8)吸取上清液，加入1/4體積的10MLiCl溶液，徹底混勻，4。C放置12h;9)在4°C，12000g離心30min;10)RNA沉澱用500W0.5%SDS輕柔溶解，用氯仿-異戊醇混合液抽提，4°C，12000g離心30min;11)上清液轉移至另一新的管子，加入2倍體積-2(TC冰冷的無水乙醇，充分混合，放置在-2(TC條件下2h，沉澱總RNA;12)12000g，4。C離心30min，用75%乙醇漂洗兩次，保留RNA，真空風乾；13)用200^1DEPC處理的去離子水重新溶解，取少量用於RNA質量和濃度的檢測，其餘儲存於-7(TC，備用。2、基因組DNA的去除1)將20—50(igRNA溶於水中，加入10xDNasebuffer5|il，5u/|ilRNAfreeDNase2jil，40u/(ilRNaseInhibitor0.5jil，力口RNAfreeH20至50jil，37°C處理25min，去除DNA的汙染。2)酚氯仿抽提一次，取上清，加入1/10V的3MNaOAc，用兩倍體積無水乙醇沉澱RNA，70%乙醇洗一次，5(TC烘乾後溶於20)al水中。3、mRNA的分離mRNA的分離使用的是Promega公司的polyATractmRNAIsolationSystem,具體步驟參看說明書。(一)、探針的退火1)將O.l-l.Omg的總RNA加入1.5mL的離心管中，用無RNA酶的水定容至50(VL;2)65。C水浴10min;3)在RNA中加入Biotinylated-Olig(dT)探針和26pL20xSSC,緩慢搖勻，置於常溫下直到完全冷卻下來(約10min)，同時準備1.2mL0.5xSSC和1.4mL0.2xSSC;(二)、鏈親和素標記的磁珠(SA-PMPS)清洗用相同量的0.5xSSC溶液清洗3次且在30min內使用。1)輕輕地指彈裝著SA-PMPS的0.6mL離心管底部使之重新懸浮直到完全分散，然後放在磁力架上將磁珠收集於離心管管壁上(約30s);2)小心去除上清，切忌使用離心；3)0.5xSSC溶液清洗3次。每次使用300(iL0.5xSSC，每次使用磁力架來收集磁珠並小心去除上清；4)最後用IO(VL0.5xSSC溶液重新懸浮磁珠；(三)、收集並清洗退火的Olig(diymRNA雜交分子1)將雜交好地總RNA全部加入處理過的SA-PMPS中，置於常溫下10min，並每隔l-2min輕輕地顛倒混合1次；2)用磁力架收集磁珠並小心去除上清，不要觸及和晃動SA-PMPS小球；3)用300pL0.2xSSC溶液清洗磁珠4次，每次輕輕地指彈離心管底部，使所有的磁珠懸浮起來，最後一次清洗儘量多地去除上清且不觸及磁珠；(四)、mRNA的洗脫1)加入100pL無RNase的水，輕彈離心管底部使SA-PMPS磁珠重新懸浮；2)磁力架收集SA-PMPS，收集洗脫的mRNA於新的離心管中，不要拋棄磁珠；3)加入150pL無RNase的水，重複l)和2)，合併洗脫液共250|^L。4、mRNA質量檢測1)分光光度計測定RNA含量和質量質量好的RNA其OD260/OD280比值在2.0左右，按照RNA含量調整為同一濃度進行反轉錄。(二)試驗結果1、採用瓊脂糖凝膠電泳鑑定總RNA產物的結果見圖1，圖中可見明顯的RNA條帶。2、採用瓊脂糖凝膠電泳鑑定mRNA產物的結果見圖2，圖中可見明顯的mRNA條帶。實施例2:PCR的方法獲蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因的保守片段(一)試驗方法根據植物和微生物的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSP合成酶)保守結構域的胺基酸序列特徵設計一對兼併引物MdepspsFl和MdepspsRl(ANG，ANG,GVA,GNT,GDA,GBT，NTC禾卩ANC，TBG,CHC,TNG,ANG,CVT,NGC)，以合成的蘋果cDNA文庫為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系10xPCRbuffer5.0jil;dNTPs(各2.5mM)4蘋果cDNA模板l(il(20ng);引物MdepspsFl0.5)il;引物MdepspsRl0.5)^1;Ex-Taq04(il(預變性後加入)；加無菌水定容至50)iL。PCR反應程序9fC預變性10分鐘；94。C變性30秒；52。C退火30秒；72。C延伸50秒；共35個循環；72'C延伸IO分鐘。(二)試驗結果採用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物為一條約250bp的片段(圖3)，將該擴增產物回收後克隆入T-載體，測序得到保守片段的DNA序列TTTTGTCGAAGGCGATGCTTCAAGTGCTAGTT。實施例3:RACE方法獲得蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因全長片段(一)試驗方法根據已經克隆的蘋果5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的保守片段序列分別合成5，和3，RACE擴增的內側和外側巢式PCR弓1物MdepspsW5，MdepspsN5禾口MdepspsW3，MdepspsN3。具寸本序歹(J為MdepspsW5:TCC,ACA,TAC，GGA,ATG，GAA，ATT，AG;Mdepsps-N5:ATA,AGC,AAA,GCA,GTC，AAG,TAC,TG，Mdepsps-W3:ATG,ACT，TTG,AAG,TTG,ATG，GAA,CGC;MdepspsN3:ATC，GGT，TTT，TGA，TCC，AAG，GAG，GTC)。1)第一輪PCR(5，RACE)。PCR反應體系10xPCRbuffer5.0^1;dNTPs(各2.5mM)4(il;蘋果cDNA模板l|_d(20ng);引物R16325(GGT，GGT,AGG，ATC，CGA,CCA，GTG,GTA,TCA,ACG,CAG)0.5^1;引物MdepspsW50.5|il;Ex-Taq0.4^1(預變性後加入)；加無菌水定容至50(iL。PCR反應程序94。C預變性IO分鐘；94。C變性30秒；55。C退火45秒；72°C延伸90秒；共35個循環；72。C延伸10分鐘。2)第二輪巢式PCR擴增(5，RACE)。PCR反應體系10xPCRbuffer5.0^1;dNTPs4pl(各2.5mM);第一輪PCR產物(稀釋10x)1^1;引物R16323(AGG，ATC,CGA,CCA，GTG，GTA,TCA,ACG，CAG，AGT,AC)0.5fil;引物Md印spsN50.5^1;Ex陽Taq0.4(al;加無菌水定容至50pL。PCR反應程序94。C變性30秒；52。C退火45秒；72。C延伸90秒；共35個循環；72。C延伸10分鐘。按照下列程序進行3'RACE巢式PCR擴增1)第一輪PCR(3，RACE)。PCR反應體系10><PCRbuffer5.0)^1;dNTPs(各2.5mM)化l;蘋果cDNA模板l^il(20ng);引物R16326(GGT,GGT，AGA,GCT,CGC,AGG,ACT,GCA,GCT,GAC,TG)0.5)il;引物MdepspsW30.5(il;Ex-Taq0.4|_il(預變性後加入);加無菌水定容至50|iL。PCR反應程序94。C預變性IO分鐘；94。C變性30秒；55。C退火45秒；72°C延伸卯秒；共35個循環；72"延伸10分鐘。2)第二輪巢式PCR擴增(3，RACE)。PCR反應體系10xPCRbuffer5.0jil;dNTPs4pi(各2,5mM);第一輪PCR產物(稀釋10x)引物R16324(AGA,GCT,CGC，AGG，ACT,GCA,GCT，GAC,TGA,CTA,C)0.5|al;引物MdepspsN30.5jil;Ex-Taq0.4(^1;加無菌水定容至50)aL。PCR反應程序94。C變性30秒；52。C退火45秒；72。C延伸90秒；共35個循環；72°C延伸IO分鐘。(二)試驗結果採用瓊脂糖凝膠電泳檢測5'RACE擴增得到一個約800bp條帶(圖4)。採用瓊脂糖凝膠電泳檢測3'RACE擴增也得到一個約800bp條帶(圖5)c實施例4:蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因全長序列獲得和分析(一)試驗方法將上述擴增產物分別回收後克隆入T-載體，測序後進行拼接。根據拼接的蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因序列，設計兩端引物MdepspSl禾卩MdepspS2(序歹lj分另U為AAG,GAT,CCA,TGG,CCC，AAG，TGA,GCA，AAA，TCT,G和AAG,AGC,TCT，CAA,TGC，TTG,GTA,AAC，TTC，CTG)，並進行PCR擴增得到全長的蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶DNA片段。將上述擴增產物分別回收後克隆入T-載體，進行測序分析。(二)試驗結果採用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增得到全長的DNA片段約1600bp(圖6)。測序分析結果顯示蘋果編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因編碼閱讀框由1578bp組成，編碼一個525個胺基酸。具體的基因序列和胺基酸序列如下蘋果來源的的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列6006607207808409009601020108011401200126013201380144015001560AAGTTTACCAAGCATTGA1578。蘋果來源的的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因編碼的胺基酸序列YDD服MAMAFSLAACGDVPVTIKDPGCTRKTFPDYFEVLRKFTKH。tableseeoriginaldocumentpage15AAGTTTACCAAGCATTGA15782525PRT蘋果(Ma/船do膨Wca)2YDD服MAMAFSLAACGDVPVTIKDPGCTRKTFPDYFEVLRKFTKH權利要求1.一種來源於蘋果幼苗中的編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因具有如下序列ATGGCCCAAGTGAGCAAAATCTGCAGCAATGGTGCTCAAAGCATCAATCTTTTGCCCAAT60GTTTCCAAACCCCAAATGCCCAGATCATCAAATTTTCTCCCATTGAAGTCCCAGTTTCTG120GGTTCCTCAAATTCTTTGAGTTTGAAGCTGAAAAATGGGCTTGTGGGCAGTTGGACCGTC180GGTAAAGTCAGGGTCGATCCGCTTACAGTTGCAGCTTCAGTTGCCACAGCAGAGAAGCCG240TCCACGGTTCCGGAGATTGTGCTGCAACCCATCCAAGAAATCTCGGGCACCATAAAGTTG300CCGGGTTCCAAGTCGTTGTCGAATCGAATTCTGCTGATTGCTGCTCTCTCTGAGGGAACA360ACTGTTGTTGACAACTTGTTAGATAGTGAAGATATTCATTATATGCTTGGTGCATTGAAA420ACCCTTGGGCTGAATGTTGAAGAGGACAAGGAAAACAGGCGAGCGGTCGTGGAGGGTTGT480GGTGGTCGGTTTCCTTTGAGTAATGAATCAGTAGATGAAGTGCAACTATTCCTTGGAAAT540GCTGGAACAGCAATGCGGCCATTGACTGCTGCAGTTGTTGCTGCTGGTGGACATGCTAGG600TATGTACTTGATGGGGTGCCCCGAATGAGGGAGAGACCAATCGGAGACTTAGTTGATGGT660CTTAAGCAGCTTGGTGCGGATGCTGATTGTTTTCTTGGAACAAACTGCCCTCCTGTCCGT720GTGATTGGAAAGGGAGGCCTTCCAGGAGGGAAGGTGAAGCTCTCTGGATCAATTAGTAGT780CAGTACTTGACTGCTTTGCTTATGGCAGCTCCTTTGGCCCTTGGAGATGTTGAAATAGAG840ATTATTGATAAACTAATTTCCATTCCGTATGTGGAAATGACTTTGAAGTTGATGGAACGC900TTTGGGGTCTCAGTGGAACACAGTGATAGTTGGGATCGGTTTTTGATCCAAGGAGGTCAA960AAGTACAAGTCTCCTGGAAATGCTTTTGTCGAAGGCGATGCTTCAAGTGCTAGTTACTTT1020CTAGCTGGTGCTGCTGTCACTGGTGGGACTGTCACTGTTGAAGGCTGTGGGACAAGCAGT1080TTACAGGGAGATGTAAAGTTCGCTGAAGTTCTTGAAAAGATGGGTGCTAAAGTTACATGG1140ACAGAGAATTCTGTCACAGTTACAGGACCTCAACGACTTTCTTCTGGAGGAAAACACTTG1200AAAGCTGTTGACGTCAACATGAACAAAATGCCAGATGTTGCCATGACTCTTGCTGTAGTT1260GCTCTTTTTGCCGATGGACAAACTGCCATAAGAGATGTGGCAAGTTGGAGAGTGAAGGAG1320ACAGAAAGGATGATCGCCATATGCACTGAACTAAGAAAGCTGGGAGCAACCGTTGAAGAG1380GGACCAGATTACTGCATAATCACACCGCCAGAAAAATTAAACTTGACTGCAATAGACACG1440TATGATGACCACCGAATGGCCATGGCTTTCTCTCTTGCTGCCTGTGGAGACGTTCCAGTT1500ACTATCAAGGATCCCGGTTGTACCAGAAAAACATTCCCCGATTACTTTGAAGTCCTCAGG1560AAGTTTACCAAGCATTGA1578基因編碼具有如下的胺基酸序列MAQVSKICSNGAQSINLLPNVSKPQMPRSSNFLPLKSQFLGSSNSLSLKLKNGLVGSWTVGKVRVDPLTVAASVATAEKPSTVPEIVLQPIQEISGTIKLPGSKSLSNRILLIAALSEGTTVVDNLLDSEDIHYMLGALKTLGLNVEEDKENRRAVVEGCGGRFPLSNESVDEVQLFLGNAGTAMRPLTAAVVAAGGHARYVLDGVPRMRERPIGDLVDGLKQLGADADCFLGTNCPPVRVIGKGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPLALGDVEIEIIDKLISIPYVEMTLKLMERFGVSVEHSDSWDRFLIQGGQKYKSPGNAFVEGDASSASYFLAGAAVTGGTVTVEGCGTSSLQGDVKFAEVLEKMGAKVTWTENSVTVTGPQRLSSGGKHLKAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALFADGQTAIRDVASWRVKETERMIAICTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLNLTAIDTYDDHRMAMAFSLAACGDVPVTIKDPGCTRKTFPDYFEVLRKFTKH。2.—種來源於蘋果幼苗中的編碼為5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶序列的用途，通過基因的轉化將該酶序列轉入目標植物本身，使其具有抗除草劑作用。全文摘要本發明涉及植物基因工程領域，更具體涉及5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因。本發明公開了一種利用cDNA末端快速擴增技術從蘋果幼苗中克隆了一個編碼5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶的基因序列。文檔編號C12N15/52GK101418305SQ20071004742公開日2009年4月29日申請日期2007年10月25日優先權日2007年10月25日發明者付曉燕,姚泉洪,彭日荷,賢李,熊愛生,田永生,永薛,偉趙,峰高申請人:上海市農業科學院