澱粉樣β(1-42)蛋白寡聚體、其衍生物及抗體、其製備方法和用途的製作方法

2023-05-06 10:13:21

專利名稱：澱粉樣β(1-42)蛋白寡聚體、其衍生物及抗體、其製備方法和用途的製作方法
澱粉樣β (1-42)蛋白寡聚體、其衍生物及抗體、其製備方
法和用途本申請是發明人於2004年2月2日提交的題為「澱粉樣β (1-42)蛋白寡聚體、其 衍生物及抗體、其製備方法和用途」的中國專利申請200480008812. 5的分案申請。本發明涉及神經調節的澱粉樣β (1-42)蛋白寡聚體、特定的生產方法(通過此方 法能夠以可重複方式以高得率獲得該寡聚體)、該寡聚體作為診斷和治療劑在產生寡聚體 特異性抗體及尋找可與該寡聚體和其構成物相互作用的物質中的用途。本發明同樣也涉及所述寡聚體的衍生物(特別是交聯的寡聚體和以澱粉樣 β (1-42)蛋白的截短形式為基礎的寡聚體)、其製備及其用途。正如抗體本身和所述抗體或物質作為診斷性或治療性試劑的用途，也描述了產生 抗體和發現物質的相應方法。澱粉樣β (1-42)蛋白，也簡稱為Αβ (1-42)，是阿爾茨海默和唐氏(Down's)綜合 徵患者腦中的細胞外由蛋白質、脂類和碳水化合物和鹽組成的不可溶性沉積物(老年或神 經炎斑)的主要成分(C. L. Masters等，PNAS 82，4245-4249，1985)。該蛋白質在水環境中 趨於多聚化，可能以非常不同的分子形式存在。不可溶性蛋白質的沉積與諸如阿爾茨海默氏病之類的痴呆病症的出現或 進展之間的簡單相關經證明是不令人信服的(R. D. Terry等，Neurobiol. Aging 16， 285-298(1995))。相反，突觸和認知的償失似乎與Aβ (1_42)的可溶形式更加相關 (L. F. Lue 等，Am. J. Pathol. 155，853-862，(1999)，C. A. McLean 等，Ann. Neurol. 46， 860-866(1999))。對於A β (1-42)的可溶性形式，主要有兩種不同假說推測分子形式為阿爾茨海默 氏病這類痴呆病症的原因。首先，假設了 Αβ (1-42)原纖維的細胞毒性作用。後者依然是可溶的、纖維 狀、相對高度聚集的Αβ (1-42)形式，具有150至250kDa範圍分子量(Arispe等，PNAS 90.567(1993)，Lashuel等，Nature 418，291 (2002))，由於形成孔的特性，顯然引起通過神 經元細胞膜的不受控制的鈣流入。第二，已描述了具有15_301^￡1範圍內的寡聚4 0 (1-42)衍生物(M. P. Lambert等， PNAS 95,6448-6453(1998))。在顯示抑制海馬部位神經元長時程增強速率的製品中，可以 發現這些非纖維狀寡聚體，也被稱為澱粉樣蛋白質衍生的、可擴散及導致痴呆(dementing)
(ADDL' S forAmyloid Derived Dementing Ligands, B US-A 6, 218, 506 R WO 01/10900，或 for Amyloid Derived Diffusible Ligands，見 Lambert 等，前文)。然而，對寡聚體的現有研究水平以對於實際相關種類的顯著不確定性為特徵。文 獻中的信息差異顯著。因此，US-A 6，218，506描述了具有3至12個亞基的ADDL，而在WO 01/10900中描述的ADDL可能具有高達24個亞基。更具體地，至少討論了兩種形式，這兩種形式在非變性條件下的凝膠電泳分析中 分別具有 27 至 28kDa 和 23 至 24kDa(US_A 6，218，506)或 26kDa 至 28kDa(W0 01/10900) 和 17kDa 至 27kDa(M. P. Lambert 等，PNAS 95，6448-6453 (1998))範圍內的分子量，以及在變性條件下的SDS凝膠電泳分析中分別為17kDa和22kDa(M. P. Lambert等，PNAS95, 6448-6453(1998))和約 22kDa 至約 24kDa 和約 18kDa 至約 19kDa (W0 01/10900)的分子量。 現也通過蛋白質印跡在阿爾茨海默患者的腦上檢測到具有SkDa至12kDa範圍分子量的SDS 穩定的 A β (1-42)寡聚體(C. A. McLean 等，Ann. Neurol. 46，860-866 (1999))。所述製備方法具有導致不均一寡聚體製品的缺點。因此，現在還不可能以可重複的方式提供負責神經調節的Αβ (1-42)的分子形 式，更不用說明確鑑定。然而，可以從例如對阿爾茨海默患者自動免疫接種的最初臨床研究過程衡量均一 製品的重要性。由於形成的抗體也識別假定為細胞內襯(celllining)所需的Αβ (1-42) 形式，從而導致炎症反應，以Αβ (1-42)的聚集前形式接種，在一些患者當中引起相當的副 作用(mengioenc印halitis、出血)(D. Schenk. ；Nat. Rev. Neurosci. 3，824—828 (2002))。因此，特別以中和實際損害性蛋白質形式為目標的傳統治療，絕對需要後者的鑑 定和明確的製品。另外，已報導了與阿爾茨海默氏病有關的Αβ (1-42)蛋白質的N末端截短形式的 出現。除了 A β (1-42)之外，早在1985年，在死亡的阿爾茨海默患者腦沉積物中也檢測到N 末端截短形式(C. Masters等，PNAS 82，4245-4249 (1985))。因此，也已知存在於腦中的特 定蛋白酶(如中性溶酶(NEP 24.11)或IDE(胰島素降解酶的縮寫))可以降解Αβ (1-42) (D. J. Selkoe, Neuron 32,177-180，(2001))。然而，N末端截短形式在阿爾茨海默氏病發病機理中的重要性尚不清楚(E. B. Lee 等，JBS 278,4458-4466(2003))。有趣的是，一些罹患散發性或家族性阿爾茨海默氏病或 唐氏綜合症的患者優先累積這些截短形式(J. N5slund等，PNAS 91,8378-8382, (1994)， C. Russo 等，Nature 405,531-532，(2000)，Τ. C. Saido 等，Neuron 14，457-466，(1995))。 相對新近的研究(N. Sergeant 等，J. of Neurochemistry 85，1581-1591 (2003))顯示，在死 亡的阿爾茨海默患者腦中，60%的不可溶性A β肽基於N末端截短形式。抗Αβ (1-42)蛋白質單體及其特定片段的抗體已有描述。因此，WO 03/016466和WO 03/016467涉及單克隆抗體266及其缺乏CDR2中特定 的糖基化位點的類似物。其人源化版本(Hu-266)也已知。這些文件也提及同抗體226 — 樣識別A β (1-42)胺基酸13-28區域中表位的其它單克隆抗體。這些包括抗體4G8 (也在 Lue等，(1999)中提及，前文)和1C2。另外，McLean等，(1999)(前文)中提及抗體1E8， 該抗體顯然識別Αβ (1-42)胺基酸18-22區域中的表位。此外，已知許多識別Αβ (1-42)N末端序列表位的其它抗體。這些包括可商業獲得 的單克隆抗體 6Ε10 (也在 W001/10900 ；Naslund等，(1994)，前文；Sergeant 等，(2003)， 前文中提及)和單克隆抗體3D6及10D5(見W003/016467)和Ban50及NAB228 (Lee等， (2003)，如上)。另外，必須提到單克隆抗體W02、21F12和3D6以及多克隆血清ADA42 (Sergeant 等，(2003)，前文)。關於目前經歷臨床前試驗的抗A β (1-42)抗體的概述可見於Schenk等，(2002)， 如上。本發明基礎提供引起Αβ (1-42)的神經調節作用，特別是神經元損傷性作用的分子形式為目的，該分子形式在諸如阿爾茨海默氏病和唐氏綜合症這類痴呆病症中的有所增 加存在；本發明使用特定方法，依靠可以從單體Αβ (1-42)蛋白質以均質製品形式獲得的 特定Αβ (1-42)寡聚體，以及依靠所述寡聚體的衍生物，特別是交聯的寡聚體和基於截短 Αβ (1-42)形式的寡聚體，來實現所述目的。製備方法使得在水性介質中難溶的肽合成的 Αβ (1-42)蛋白質能夠以高得率轉變為明確可溶的寡聚體。本發明因此涉及權利要求中詳細定義的主題。本發明因此涉及澱粉樣β (1-42)蛋白的寡聚體，所述寡聚體在SDS凝膠電泳中具 有約15kDa、20kDa、38kDa或48kDa的表觀分子量，或涉及該寡聚體的衍生物，其分子量依據 衍生而可能會或可能不會發生改變。澱粉樣β (1-42)蛋白是具有42個胺基酸的多肽，其通過蛋白質水解加工而來自 澱粉樣前體蛋白質(APP)。除了人類變體，這也包括出現在除人類之外的生物，特別是其它 哺乳動物，尤其是大鼠中的澱粉樣β (1-42)蛋白同種型。根據具體的實施方案，本發明涉及人類澱粉樣β (1-42)蛋白的寡聚體。人類澱粉 樣β (1-42)蛋白具體包括具有胺基酸序列SEQ ID NO 1的蛋白質，以及從所述序列衍生、 特別是通過胺基酸交換而來的突變蛋白質及其等位基因變體。就此而言，必須非常具體地 提到下列胺基酸置換A21G、E22K、E22Q、E22G和D23N。因此，根據本發明，澱粉樣β (1-42) 蛋白的突變蛋白質或等位基因變體具體包括具有胺基酸序列SEQ ID NO :1的蛋白質，其中 選自丙氨酸21、穀氨酸22和天門冬氨酸的一個或多個胺基酸被不同的胺基酸置換，這些氨 基酸優選自甘氨酸、賴氨酸、穀氨醯胺和天門冬醯氨。根據本發明，特別重要的是在22位、 特別是被穀氨醯胺或穀氨酸置換。根據另一個具體的實施方案，本發明涉及大鼠澱粉樣β (1-42)蛋白的寡聚體。大 鼠澱粉樣β (1-42)蛋白具體包括具有胺基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白質，以及從所述序列 衍生、特別是通過胺基酸交換而來的突變蛋白質及其等位基因變體。就此而言，必須非常具 體地提到的是那些對應於在人類序列中討論的胺基酸置換。可以通過已知的肽合成方法或重組製備澱粉樣β (1-42)蛋白。另外，這些蛋白質 許多可商業獲得。以上同樣應用於突變蛋白質和等位基因變體。本發明的寡聚體可以通過澱粉樣β (1-42)蛋白的寡聚化獲得。寡聚化包括單體 澱粉樣蛋白質的非共價聚集，所以可以假定本發明的寡聚體由多個澱粉樣β (1-42)蛋白 單體組成。依賴於寡聚化程度，本發明的寡聚體具有不同的分子量。因此可以通過變性凝膠 電泳為該寡聚體指定表觀分子量。在標準變性條件下(Tris-甘氨酸凝膠，4-20%，參照 Lammli UK, Nature 227,680-685(1970))，使用下列標準蛋白質進行凝膠電泳時，所述表 觀分子量對於寡聚體Al約15kDa，對寡聚體A2約20kDa，對寡聚體Bl約38kDa，對於寡聚 體B2約48kDa，所述標準蛋白質在同一條件下具有下列表觀分子量肌球蛋白250為kDa， 牛血清白蛋白為98kDa，穀氨醯胺氫化酶為64kDa，碳酸酐酶為36kDa，肌紅蛋白為30kDa， 溶菌酶為16kDa，抑肽酶為6kDa，胰島素B鏈為4kDa (參照藍色預染標準物)。根據另一方 面，當在標準天然條件下(Tris-甘氨酸凝膠，4-20% )，使用下列標準蛋白質進行凝膠電泳 時，對於寡聚體B，分子量約為64至90kDa，標準蛋白質在同一條件下具有下列表觀分子量 肌球蛋白250kDa，牛血清白蛋白98kDa，穀氨醯胺氫化酶64kDa，碳酸酐酶36kDa，肌紅蛋白30kDa,溶菌酶16kDa，抑肽酶6kDa，胰島素B鏈4kDa (參照藍色預染標準物)。根據另一方面，本發明的寡聚體以神經元細胞親和性為特徵。可以假定該寡聚體 結合特定的細胞表面蛋白質，尤其是受體。因此，本發明也涉及測定本發明的寡聚體與預先確定的細胞結構結合的方法，該 方法包括i)允許本發明的寡聚體作用於所述細胞結構，以及ii)測定本發明的寡聚體是否與該細胞結構結合。根據另一方面，本發明的寡聚體以神經調節作用為特徵。當允許至少一種本發明 的寡聚體作用於神經元細胞(例如成神經細胞)瘤細胞的培養物時，這種神經調節作用特 別能夠以該細胞降低的存活率降低(神經毒性)而證明自身。這裡，以本身已知的方式評 價細胞存活率是可能的，例如，測定由本發明寡聚體的作用引起的凋亡程度。出於此目的， 可以使用適宜的測定方法，例如基於3- [4，5- 二甲基噻唑-2-基]-2，5- 二苯基-四唑溴 (MTT)的比色方法。這種神經調節作用能夠以神經元發放速率的調節而具體地在體內表明 其本身。因此，本發明也涉及測定本發明的寡聚體的活性，尤其是神經毒性的方法，該方法 包括i)允許本發明的寡聚體作用於細胞並且ii)測定該細胞的狀態是否被改變。可以以上文說明的方式為所述方法提供本發明的寡聚體，例如，以任何上述組合 物的形式提供。細胞及細胞結構能便利地以體外提供，特別是以細胞培養物或其他形式，就 細胞結構而言，以勻漿物提供。這裡，神經元細胞，特別是成神經細胞瘤細胞起測定神經毒 性的作用。另外，體內(特別是作為生物體例如實驗動物的部分)或離體提供細胞也是可 能的。通常在寡聚體作用之前和之後至少一次測定細胞狀態。如果作用前狀態和作用後 狀態之間的比較產生差異，則測試的寡聚體具有活性。將要測定的狀態類型取決於將要測定的活性類型。例如，可以通過測定存活率測 定神經毒性。出於此目的，可以測定基於寡聚體作用前後的細胞總數的活細胞比例，並彼此 比較。基於上文測定結合或活性的方法，根據具體的實施方案，可以測試物質是否抑制 本發明的寡聚體的結合和/或調節，即部分降低或基本完全抑制、或增強其活性。出於此目的，原則上至少實施兩次本方法，一次存在測試物質，還有一次沒有測試 物質。出於此目的，通常在提供寡聚體之後將所述測試物質其加入寡聚體。然而，如果旨在測定待測物質是否影響寡聚體的形成，宜於在寡聚體已經形成之 前，即在提供寡聚體之前，將該物質加至用於寡聚體形成的反應物中。因此，可以在添加測 試物質的情況下實施本發明製備方法，然後測定寡聚體是否形成及形成程度。出於此目的， 可以測定這種方式獲得的方法產物是否具有本發明寡聚體的特徵，即，例如它們的分子量、 結合能力和活性。出於儘量突顯神經調節作用的目的，必須優選本發明的寡聚體B。就此而言，也優 選這些寡聚體的衍生物，尤其強調優選基於N末端截短的A β (1-42)蛋白質的寡聚體。
出於工藝流程的原因，可以以組合物的形式將寡聚體A和寡聚體B作為混合物生 產，其中除了寡聚體，還含有小部分的其他多肽，特別是單體澱粉樣β (1-42)蛋白，以及適 當時聚集的澱粉樣β (1-42)蛋白的更高分子量形式。這種組合物也是本發明的主題，特別 以本發明的寡聚體的比例區別，基於從澱粉樣β (1-42)蛋白衍生的蛋白質總量，至少為重 量的70 %、優選至少為90 %重量、尤其是至少為95 %。在寡聚體A的製備中，寡聚體Α2 (SDS 凝膠中20kDa條帶)的比例至少為重量的50%，優選為至少70%，尤其是至少為85%。在 寡聚體B的製備中，寡聚體Bl和B2 (SDS凝膠中38kDa和48kDa條帶)的比例至少為重量 的60%，優選為至少75%，尤其是至少為90%。可以衍生本發明的寡聚體。這類衍生的目的可以是，例如，調節所述寡聚體的物 理化學性質(尤其是關於生物利用率)、提供具有檢測標記的寡聚體或固定所述寡聚體，例 如，可以將其偶聯到支持物上。標記和固定對於診斷性應用尤其重要。技術人員熟知蛋白質_生物化學領域常用的適當標記。這些包括螢光標記(例如 特定的螢光蛋白和四甲基若丹明衍生物)、發光標記、顯色標記、放射標記和磁性標記以及 具有互補結合配偶體親和力的標記，例如生物素和鏈黴親和素衍生物。關於表觀分子量，必須考慮到，與未衍生、但是聚集數相同的寡聚體相比，寡聚體 衍生物具有可能增加的表觀分子量。因此，例如，基於在SDS凝膠中具有38kDa分子量的 A β (1-42)寡聚體Bl的生物素衍生物，具有42dDa的分子量。根據本發明的特定實施方案，寡聚體是交聯的。合適的交聯劑為技術人員所公 知，並且通常為雙功能試劑，例如甲醛、戊二醛、辛二酸二琥珀醯亞胺酯、Dithiobis (玻 珀醯亞胺丙酸酯)、二琥珀醯亞胺酒石酸酯、雙磺基琥珀醯亞烷酒石酸酯、二甲基、二 甲基 pimelidate> 二甲基 suberimidate> 二甲基-3, 3 『 -dithiobispropionimidate> N- y -maleinimidobutyloxy琥珀醯亞胺酯、琥珀醯亞胺_4 (N-maleinimido甲基)-環己 烷-I-羧酸酯、N-琥珀醯亞胺-(4-碘乙醯hminobenzoat以及N-琥珀醯亞胺_3-(2_吡 啶)丙醯酯。這類交聯的寡聚體具有的優點是穩定，而且其寡聚化通常不再可逆。它們因此特 別適用於診斷性檢驗系統或作為生產寡聚體特異性抗體的免疫原。本發明的寡聚體的衍生物也包括澱粉樣β (1-42)蛋白片段的寡聚體。優選通過 天然存在的蛋白酶作用獲得的那些片段。與澱粉樣β (1-42)蛋白相比，在生理緩衝液中非 變性條件下通過蛋白質水解獲得的片段特別地增加了蛋白質水解穩定性。優選通過內肽酶 作用獲得的片段。根據本發明的特定實施方案，所述片段可以通過胰蛋白酶、糜蛋白酶、嗜 熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶或蛋白內切蛋白酶GluC的作用獲得。根據另一方面， 優選其本發明寡聚體通過神經調節作用區分的片段。對於此方面的進一步說明，參考本發 明澱粉樣β (1-42)蛋白寡聚體的神經調節作用的相關注釋。從結構上，優選片段特別在於它們是通過去除澱粉樣β (1-42)蛋白N末端序列而 衍生的特徵。根據一方面，該N末端序列可以是具有澱粉樣β (1-42)蛋白N末端序列的上 至23個、優選具有上至21個、特別是具有上至19個胺基酸的片段。因此，根據本發明，優 選序列包含相鄰胺基酸24至42、優選22至42、特別是20至42個連續胺基酸的A β (1-42) 蛋白質片段。根據另一方面，將要去除的N末端序列可以是具有至少7個、優選具有至少 9個、特別是具有至少11個Αβ (1-42)蛋白質N末端序列胺基酸的序列。因此，根據本發明，特別優選N末端截短了 7至23個、優選9至21個、特別是11至19個胺基酸的澱粉樣 β (1-42)蛋白的片段。這些片段對應於式Αβ (χ-42)，其中χ為8至24，優選10至22，特 別是12至20。根據本發明，Αβ (χ-42)片段因此優選自下列片段A β (8-42), A β (9-42), Aβ (10-42)、Αβ (11-42)、Αβ (12-42)、Αβ (13-42)、Αβ (14-42)、Αβ (15-42)、Αβ (16—42)、 Aβ (17-42),Aβ (18-42),Aβ (19-42),Aβ (20-42),Aβ (21-42),Aβ (22-42),Aβ (23-42) 和Αβ (24-42)。特殊的片段是通過嗜熱菌蛋白酶作用獲得的澱粉樣蛋白質β (20-42)片段 和通過GluC內切蛋白酶作用獲得的澱粉樣蛋白質β (12-42)片段。本發明的衍生物還有來自具有1個或2個額外C末端胺基酸的澱粉樣蛋白質 β (12-42)的那些形式。其實施例因此包括Αβ (1-43)蛋白質的寡聚體、或其對應於上述內 容的衍生物。製備寡聚體的發明方法可以基本包括三個步驟。其第一步是任選但是有利的，第 二步是寡聚體A和B的製備絕對需要的，第三步起到製備本發明的寡聚體B的作用。步驟1涉及蛋白質的解摺疊。出於此目的，可以允許例如六氟異丙醇(HFIP)這類 氫鍵斷裂試劑作用於蛋白質。當作用溫度為約20至50°C、特別是約35至40°C時，數分鐘 的作用時間(例如約10至60分鐘)足以。隨後，於易於與水性緩衝液混合的適宜有機溶 劑(例如二甲亞碸(DMSO))中溶解蒸發乾燥的殘餘物(優選以濃縮形式)，產生至少部分解 摺疊的蛋白質懸浮液。如果需要，儲備的懸浮液可以於低溫(例如在約-20°C)臨時貯存。上述步驟1的備選方案是，可以在弱酸性、優選水溶液中溶解蛋白質，例如約IOmM 的HCl水溶液。通常孵育數分鐘後，經離心去除不溶性組分。於IOOOOg數分鐘為宜。優選 於室溫(即在20至30°C範圍內的溫度)實施這些方法步驟。離心後獲得的上清液含有澱 粉樣β (1-42)蛋白，並可以於低溫(例如在約-20°C)臨時貯存。步驟2涉及產生寡聚體A的蛋白質寡聚化。出於此目的，任選地允許去垢劑作用 於至少部分解摺疊的蛋白質，直至產生足夠的寡聚體A。優選使用離子去垢劑，特別是陰離子去垢劑。根據具體的實施方案，使用式(I)R-X的去垢劑，其中R基為具有6至20個、優選10至14個碳原子的未分支或分支烷 基，或具有6至20個、優選10至14個碳原子的未分支或分支鏈烯基，X基為酸性基團或其鹽，X優選自-C00_M+、-S03_M+，特別是_0S03_M+，M+是氫陽離子、 或者無機或有機陽離子，優選自鹼性金屬和鹼土金屬陽離子以及銨陽離子。具有式(I)的去垢劑是有利的，其中R是未分支烷基，必須特別提及的是1-烷基。 優選十二烷基硫酸鈉(SDS)。也可以有利地使用月桂酸和油酸。去垢劑十二烷醯肌氨酸的 鈉鹽(也稱為肌氨醯NL-30或Gardol )也格外有利。去垢劑作用時間尤其依賴於進行寡聚化的蛋白質是否解摺疊，如果是，還有解折 疊的程度。根據步驟1，如果預先以氫鍵斷裂試劑(即，特別是以六氟異丙醇)處理蛋白質， 當作用溫度約為20至50°C、特別是約為35至40°C時，數小時範圍內的作用時間是足夠的， 有利地為約1至20、特別是約2至10小時的作用時間。如果以較少解摺疊或基本沒有解折 疊的蛋白質開始，以相應較長的作用時間為宜。如果澱粉樣β (1-42)蛋白經過預處理，例 如，根據上文指出的步驟1的備選方案，或者將所述蛋白質直接引入步驟2，當作用溫度約為20至50°C、特別是約為35至40°C時，約5至30小時、特別是約10至20小時範圍內的 作用時間足以。孵育後，宜通過離心去除不溶性組分。於IOOOOg數分鐘為宜。所選擇的去垢劑濃度取決於所使用的去垢劑。如果使用SDS，濃度0. 01至1%、優 選0. 05至0. 5%比重的範圍，例如約質量0. 2%的比重，經證明是有利的。如果使用月桂酸 或油酸，略高的濃度是有利的，例如，在0. 05至2%、優選0. 1至0. 5%比重的範圍，例如約 0. 5%的比重。去垢劑作用應在接近於生理範圍的鹽濃度下發生。因此，尤其以50至500mM、優選 100至200mM範圍內、特別是140mM的NaCl濃度為宜。產生的含有寡聚體A的溶液，即特別是含有寡聚體Al和/或A2的溶液，可以於低 溫(例如在約-20°C)臨時貯存。該溶液可以用於例如本發明的用途或進一步的反應以產 生寡聚體B、或在第一步之後的進一步處理或純化步驟，所述步驟具體實現了至少一種本發 明的寡聚體A的進一步濃縮。具體地，通過色譜方法，可以從存在於溶液中的其他蛋白質組 分(尤其是來自澱粉樣β (1-42)蛋白的那些組合)取出寡聚體。特別適用於此目的的是 親和色譜方法，該方法可以使用例如特異性抗體，即也特別為本發明的寡聚體特異性抗體。步驟3涉及產生寡聚體B的寡聚化。優選地，選擇含有寡聚體A的組合物作為這 個步驟的反應物。在此方面，根據本發明，寡聚體A是製備寡聚體B的重要中間物。如果 該組合物來自步驟2，其通常含有去垢劑以及生理範圍的鹽濃度。宜降低去垢劑的作用和 鹽濃度。這可以通過降低去垢劑和鹽的濃度而解決，例如通過稀釋，宜使用水或低鹽濃度 緩衝液，例如Tris-HCl，pH 7. 3。在約2至10範圍內、有利地在3至8範圍內、特別是約為 4的稀釋因子經證明為適宜的。也可以添加中和所述去垢劑作用的物質實現去垢劑作用的 降低。這些物質的實例包括能夠絡合去垢劑的物質，如能夠在純化和提取措施過程中穩定 細胞的物質，例如特定的Ε0/Ρ0阻斷共聚物，特別是以商品名Pluronie F 68的阻斷共聚 物。烷氧基化、特別是乙氧基化烷基酚，例如Triton x系列的乙氧基化t-辛基酚(特別 是Triton X100)、3" (3-(膽醯胺基丙基二甲氨基)-1-丙磺酸鹽(CHAPS )或燒氧基化、 特別是乙氧基化山梨聚糖脂肪酯，例如Tween 系列的那些，特別是Tween 20，在特定 的臨界微囊濃度附近或之上的濃度範圍內。隨後，孵育該溶液直至產生足夠的寡聚體B。當作用溫度約為20至50°C、特別是 約為35至40°C時，數小時範圍內、優選約10至30小時範圍內、特別是約15至25小時範圍 內的作用時間足以。然後可以濃縮溶液，並且可能的殘餘物可以通過離心去除。這裡也證 明以IOOOOg數分鐘為宜。離心後獲得的上清液含有寡聚體B。產生的含有寡聚體B( S卩，特別是寡聚體Bl和B2)的溶液，可於低溫(例如在 約-80°C )臨時貯存。該溶液可以用於例如本發明的用途、或進一步處理或純化步驟可以跟 隨第一步。對此，參考與寡聚體A有關的相應測量的注釋。出於基本完全去除用於製備寡聚體的去垢劑的目的，可以實施進一步處理或純化 步驟。例如，可以首先從含有去垢劑的溶液沉澱寡聚體B、分離並重新溶解於不含去垢劑的 介質中。沉澱蛋白質的措施為技術人員所熟知。根據本發明，添加水-甲醇中的乙酸經證 明是有利的。償未結合具體的機制，去垢劑或去垢劑的變種以及鹽濃度看似將蛋白質置於 確定的溶解形式，正如可以通過例如變性或天然凝膠電泳或凝膠滲透層析所檢測的，該形式與溶解於水性生理緩衝液中的蛋白質起始形式明顯不同。這是令人驚訝的，由於去垢劑 通常能夠去聚集，即，使亞基、蛋白質聚集體去組裝，根據本發明，從傾向於聚集的單體開始 獲得了確定的寡聚體。通過實施本發明的上述方法，在已經經過適當衍化的澱粉樣β (1-42)蛋白上有 利地製備了本發明的寡聚體衍生物。另外，衍生寡聚體也是可能的，但是這不應改變所述寡 聚體的結構。合適的蛋白質化學手段為技術人員所公知。可以用本身已知的方式實施本發明的寡聚體或其衍生物的交聯。例如，如果使用 戊二醛作為交聯劑，可以使用戊二醛溶液處理從本發明方法步驟2或3產生的溶液。於室 溫數小時後，寡聚體已與戊二醛反應。該反應然後可以用本身已知的方式，通過將過量的戊 二醛與試劑反應而被終止，所述試劑普遍已知用於此目的，例如氨基乙醇。取決於本發明的 寡聚體A或B是否交聯，獲得分別稱為A-CL和B-CL的本發明交聯寡聚體溶液。特別是對於任選交聯的寡聚體B或其衍生物，在其合成之後，再次增加鹽濃度而 不損害所述寡聚體的穩定性是可能的。這對於該寡聚體的應用是重要的，例如，在生理條件 對應用有利的情況下(細胞應用、體內應用)。原則上，通過寡聚化從相應的單體開始，或者通過蛋白質水解從所述澱粉樣 β (1-42)蛋白的寡聚體開始，都可以製備澱粉樣β (1-42)蛋白片段的寡聚體。因此，根據 第二個方法的變體，可以使用蛋白酶處理由本發明的方法步驟2或3產生的溶液。當達到 需要的蛋白質水解程度時，以公知的方式失活蛋白酶。然後可以按照此處已經說明的程序 分離產生的寡聚體，如果需要，通過另外的處理和純化步驟進一步處理。通過其均一性和穩定性區分本發明的寡聚體以及包含它們的組合物。它們在生理 介質(例如生理鹽溶液)中是可溶的，並通過其稍微的球狀外觀而不同於纖維狀形式。它 們具有的優點是具有的空間結構顯然不同於其他Αβ (1-42)形式，特別是單體、非毒性寡 聚體、包含Αβ (1-42)的前體分子ΑΡΡ、原纖維和纖維。它們因此特別適於在體內和體外產 生特異性抗體，使例如特異性的自動免疫成為可能。就此而言，關鍵是僅僅將那些導致疾病 的寡聚體用於免疫。其他形式的Αβ (1-42)例如單體分子或較小的寡聚體，在生物體中對 於重要的信號功能可能是必需的。同樣，去除推定為對細胞襯裡重要的纖維狀堆積物，可能 損傷生物體。以同樣的方法，使用本發明的同源性寡聚體或含有該寡聚體的組合物，可以實施 可能的治療，例如被動免疫、寡聚體形式的去穩定劑的使用以及受體(部分)激動劑和拮抗 劑的使用。因此，同源性寡聚體製備也使用於被動免疫的多克隆或單克隆抗體的特異性生 產成為可能。使用本發明的寡聚體及含有這些寡聚體的組合物，也可能發現與疾病有關並 受該寡聚形式影響的受體分子或信號分子。由於其涉及澱粉樣β蛋白質相關的生理過程，本發明的寡聚體具有診斷性和治 療性價值。因此，本發明涉及本發明的寡聚體及其衍生物(任選以相應組合物的形式)在 診斷性體外和體內檢測方法中的用途。澱粉樣β蛋白質相關的生理過程包括與澱粉樣蛋白質沉積(澱粉樣蛋白病)有 關的那些。這些包括那些導致神經組織結構改變，並且對例如阿爾茨海默病和唐氏症候群 而言重要的那些過程，以及影響其他組織、諸如澱粉樣微血管病變(例如嗜剛果紅澱粉樣 蛋白血管病(CAA))的那些過程。
本發明還涉及本發明的寡聚體及其衍生物(任選以相應組合物的形式)在產生寡 聚體特異性抗體中的用途。這裡，以Αβ (1-42)蛋白質的截短形式為基礎的發明性寡聚體具有特別的重要 性由於缺失N末端，它們可以產生顯然比Αβ (1-42)蛋白質更具選擇性的免疫反應。盡 管經典A β (1-42)蛋白質中的高免疫原性N末端顯著地產生對該分子此區域的特異性抗 體，例如根據製造商信息針對N末端(6Ε10 :Αβ (1-17)以及ΒΑΜ-10Αβ (1-12))的抗體 6Ε10 (F. Signet)和 BAM-10 (Sigma，St. Louis)，可以使用本發明以截短的 A β (1-42)形式 為基礎的寡聚體獲得的抗體識別寡聚體特異性區域，從而達到與其他Αβ (1-42)形式相當 的選擇性。由於接種後產生的更強選擇性的免疫應答(與ΑΡΡ、單體形式、原纖維、纖維、斑 點(plaque)相比)也必然伴有更少的副反應(例如腦出血、原位單體形式的生理神經營養 活性的損傷)，這個優點尤其可以利用到主動接種當中。特別地，用於被動免疫(即基因治 療)的單克隆抗體的更高的生產和選擇性也是可能的。此用途的一個方面是產生治療框架內寡聚體特異性抗體。本發明因此還涉及本發明的寡聚體及其衍生物在治療領域中、特別是作為疫苗的 用途。這樣的疫苗通常為藥物組合物，包括至少一種本發明的寡聚體和/或至少一種本 發明的寡聚體的衍生物。為此目的，特別可以使用本發明的任何組合物，其包括兩個或多個 寡聚體，或使用不同組合物的組合。因此，特別可以使用寡聚體B，即Bl和B2，或其衍生物 進行接種。該組合物可以進一步包括生理上適宜的載體，以及任選地還含有賦形劑，例如免 疫刺激物。儘管原則上可以選擇任何適宜的載體，載體的類型通常取決於給藥途徑。因此本 發明的疫苗可以特別地以適用於腸胃外(例如靜脈內、肌肉內和皮下)給藥途徑的形式進 行配製。在這些情況下，載體優選包括水、鹽、醇、脂肪、臘和/或緩衝液。本發明的疫苗可以使用多種免疫刺激物中的任一種。例如可以包含佐劑。大多數 佐劑含有保護抗原免於迅速代謝的物質，例如氫氧化鋁或礦物油、以及來源於脂質A、百日 咳球桿菌(Bordadella pertussis)或結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的蛋 白質。適宜的佐劑通常可以商業獲得，例如完全或不完全弗氏佐劑、AS-2、鋁鹽，例如氫氧 化鋁(適當時以凝膠形式)或磷酸鋁、鈣鹽、鐵鹽或鋅鹽、醯化酪氨酸的不溶性懸浮液、醯化 糖、陽離子或陰離子衍生的多聚糖、聚磷腈、可生物降解的微球體、單磷醯脂質A。細胞因子 例如GM-CSF或白介素2、7或12同樣可以用作佐劑。本發明進一步涉及生產抗體的方法，該方法包括i)以至少一種本發明的寡聚體、其衍生物或組合物免疫宿主；並ii)獲得應答該免疫產生的含有抗體的宿主血清。根據生產抗體方法的特定實施方案，給以免疫混合物進行免疫，免疫混合物包括 本發明的多種寡聚體或寡聚體的衍生物的混合物。具體地，在該方法過程中，給以寡聚體組 分不同的多個免疫混合物尤其有利。如果將要使用的寡聚體或寡聚體衍生物沒有或僅有弱的免疫原性，可以將其偶聯 至載體而增加其免疫原性，優選偶聯至載體蛋白質，例如鑰孔槭血藍蛋白(KLH)、鱟蛛血藍 蛋白(LPH)、牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)。許多公知用於此目的的可能的偶聯可供技術人員利用。可能有利的實例是與戊二醛反應，例如，將寡聚體或寡聚體衍生物與適當 的肽或肽混合物在水或水溶液中孵育。該反應可以在環境溫度(即通常在室溫)下方便地 進行。然而，降低或略升高溫度也可能有利。該反應通常在幾小時內產生所需的結果，例如， 2小時的反應時間在常用範圍內。戊二醛濃度常在口口！！！至^範圍內，宜從IOppm高至1%、 優選從IOppm至0. 5 %。反應參數的優化在技術人員技能內，並應考慮到寡聚體A和B或寡 聚體衍生物在所選的反應條件下穩定。優選組合將要使用的成分而製備免疫混合物。孵育最初產生的組分混和物是有利 的。這通常在環境溫度(即室溫)下方便地進行。然而，冷卻或略加熱該混和物可能有利。 孵育期常從幾分鐘至數小時，1小時的孵育時間經證明是有利的。除了抗原，免疫混合物常含有額外的賦形劑，特別是常用於免疫的佐劑，例如弗氏 佐劑。更特別地，將完全弗氏佐劑用於初次免疫，而以不完全弗氏佐劑進行任何額外的免 疫。將抗原(免疫原)(優選以上述組分混和物的形式)添加至賦形劑中製備免疫混合物， 抗原通常被乳化。適宜的宿主特別為齧齒動物或兔。以免疫混合物注射這些或其他適宜的宿主，優 選皮下注射。可以使用免疫測定測量抗體效價，例如競爭性使用羊抗宿主IgG綿羊抗血清 和經標記的寡聚體。因此可以在免疫末期確定特定的宿主是否適於產生抗體。例如，如果 進行4次免疫，可以在第三次免疫後測定抗體效價，然後從具有足夠抗體效價的動物獲得 抗體。優選在數周或數月的時期後從宿主採集血清而獲得產生的抗體。最後，將動物放 血。可以從用本身已知的方式獲得的血液中獲得含有所需抗體的血清。如果需要，這樣獲 得的全部血清可以由技術人員進一步純化，將存在於其中的抗體成分、特別是識別寡聚體 的抗體濃縮。根據本發明方法的特定實施方案，選擇至少一種血清抗體，該抗體特異性識別用 作免疫原的寡聚體或其衍生物，或者在用作免疫原的組合物中存在的至少一種寡聚體或其 衍生物。在本文中，特異性指抗體對免疫原比對其他物質(特別是與相關蛋白質、尤其是與 單體澱粉樣β (1-42)蛋白、以及比本發明的寡聚體具有更高分子量的寡聚或多體澱粉樣 β (1-42)蛋白聚集物相比)具有更高的結合親和力。也可以用此方式獲得寡聚體特異的單 克隆抗體。然而，出於此目的，優選從宿主脾組織摘除、並從由此獲得的脾淋巴細胞開始，以 常用方式建立產生單克隆抗體的雜交瘤。抗體生產詳述B淋巴細胞共含有由幾十億種不同抗體特異性組成的抗體所有組成成分，是哺乳 動物免疫系統的一部分。對特定抗原的正常免疫應答指從所述所有組成成分選擇一種或多 種的該抗原特異性結合抗體。免疫應答的成功至少部分建立在抗體特異性識別(以及最終 消除)刺激性抗原並忽視所述抗體的環境中其他分子的能力。特異性識別一個特定靶抗原的抗體的有效性導致單克隆抗體技術的發展。目前標 準化雜交瘤技術允許對目的抗原具有單獨特異性的抗體的產生。更近來，重組抗體技術，例 如抗體文庫的體外篩選得到發展，這些技術也允許具有對目的抗原的單獨特異性的抗體的產生。在本發明的方法中，允許目的抗原體內或體外作用於抗體所有組成成分。
根據一個實施方案，以抗原體內免疫動物而使抗原作用於所有組成成分。體內途 徑可以進一步包括從動物淋巴細胞建立大量雜交瘤，並選擇分泌與該抗體特異性結合的抗 體的雜交瘤。將要免疫的動物可以是，例如小鼠、大鼠、兔、雞、駱駝或綿羊，或任何上述動 物的轉基因版本；例如，具有人類免疫球蛋白基因的轉基因鼠，其在抗原刺激後產生人類抗 體。其他可以被免疫的動物類型包括重度聯合免疫缺損(SCID)小鼠，其已用人類外周單核 血細胞(嵌合hu-PBMC SCID小鼠)或用淋巴結細胞或其前體細胞重構，以及以致死全身輻 射處理，然後使用重度聯合免疫缺損(SCID)小鼠的骨髓瘤細胞抵抗輻射，並隨後移植人類 功能淋巴細胞的小鼠(「Tremera」系統)。可免疫的另一種動物類型，是基因組中編碼目 的抗原的內源性基因經例如同源重組而關閉(敲除)的動物(例如小鼠)，以致以抗原免 疫後，所述動物將此抗原識別為外來物。對技術人員而言，此方法產生的多克隆或單克隆抗 體，顯然以使用已知的篩選方法為特徵並進行選擇，篩選方法包括(但是不限於)ELISA技 術。根據另一實施方案，以抗原篩選重組抗體文庫，使抗原體外作用於抗體所有組成 成分。可以在例如噬菌體表面或在酵母細胞表面或在細菌表面表達重組抗體文庫。在不同 的實施方案中，重組抗體文庫是例如scFv文庫或Fab文庫。根據另一實施方案，以RNA-蛋 白質融合物表達抗體文庫。生產本發明抗體的另一途徑，包括組合體內和體外途徑。例如，以抗原體內免疫動 物使所述抗原作用於抗體所有組成成分，然後以該抗原體外篩選從該動物淋巴細胞製備的 重組抗體文庫或單結構域抗原文庫(例如含有重和/或輕鏈)。根據另一條途徑，用抗原體 內免疫動物，使所述抗原作用於抗體所有組成成分，然後把該動物淋巴細胞產生的重組抗 體文庫或單結構域文庫進行親和力成熟。根據另一條途徑，用抗原體內免疫動物，使所述抗 原作用於抗體所有組成成分，然後選擇分泌目的抗體的單個抗體產生細胞，並從所選細胞 cDNA獲得重鏈和輕鏈可變區(例如通過PCR)，在哺乳動物宿主細胞內體外表達重鏈和輕鏈 可變區(稱此為選擇淋巴細胞抗體方法或SLAM)，從而可進一步選擇並操縱所選的抗體基 因序列。另外，可以通過在宿主細胞內表達重鏈和輕鏈的抗體基因、並選擇那些分泌具有所 需結合親和力的抗體的哺乳動物細胞，通過表達克隆選擇單克隆抗體。因此，本發明一方面為篩選和反篩選提供明確的抗原。因此，根據本發明，可以選 擇那些多克隆和單克隆抗體，所述抗體結合本發明的寡聚體或其衍生物，而非其他形式的 Αβ (1-42)蛋白質、ΑΡΡ、澱粉樣纖維或澱粉樣斑點以及大量其他無關抗原和組織。技術人員充分了解，抗體選擇以充分確定的抗原為基礎。反之，不充分確定的抗原 在使用時並不具有足夠的選擇性。簡言之，體外作用和選擇與親和層析相似，使用的所需抗 原的「配體」已除去以不充分的親和力結合抗原的那些。因此，在具有其他抗體的巨大集合 體中，所需抗體的富集程度與抗原質量直接相關。令人驚訝的是，本發明的寡聚體及其衍生 物是可用於濃縮合適的相關選擇性抗體，並將其從識別A β (1-42)蛋白質相關的其他形式 及其他無關抗原的抗體有效取出的抗原。本發明的生產抗體的方法可用於生產多種類型的抗體。這些基本包括人類抗體、 嵌合抗體、人源化抗體和CDR移植抗體及其抗原結合部分。本發明生產抗體的方法說明如下。在此指出體內途徑、體外途徑或二者的組合之 間的區別。
體內途徑從體內產生的抗體生產細胞開始，可以通過標準技術生產單克隆抗體，例如最初 由 Kohler 和 Milstein(1975，Natu re 256 :495_497)(也見 Brown 等(1981) J. Immunol 127 539-46 ；Brown 等(1980) J Biol Chem 255 :4980_83 ；Yeh 等(1976) PNAS 76 :2927_31 ； 以及Yeh等(1982) Int. J.CanCer29 :269-75)描述的雜交瘤技術。生產單克隆抗體雜交 瘤的技術廣為人知(一般見 R. H. Kenneth，《Monoclonal Antibodies :A New Dimension InBiological Analyses》，Plenum Publishing Corp., New York, New York(1980)； Ε. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med.，54 :387_402 ;Μ· L. Gefter 等，(1977) Somatic Cell Genet. ,3:231-36)。簡而言之，將不死細胞系(一般為骨髓瘤)與哺乳動物淋巴細胞(一 般為脾細胞或淋巴結細胞或外周血淋巴細胞)融合，其中哺乳動物經本發明的寡聚體或其 衍生物免疫；篩選得到的雜交瘤細胞培養上清液，以鑑定產生對本發明的寡聚體或其衍生 物具有特異性的單克隆抗體的雜交瘤。許多廣為人知的融合淋巴細胞和不死細胞系的方 法中的任一種都可應用於此目的(也見G. Galfre等，(1977)Nature 266 550-52 ；Gefter 等，Somatic Cell Genet.，弓| 用如上；Lerner，Yale J. Biol. Med.，弓| 用如上；Kenneth, ((Monoclonal Antibodies》，引用如上)。此外，技術人員將理解，這類方法有許多改變，這 些改變同樣有用。一般，不死細胞系(例如骨髓瘤細胞系)來自與淋巴細胞相同的哺乳動 物物種。例如，可以將以本發明的免疫原製品免疫的小鼠淋巴細胞與小鼠不死細胞系融合， 建立小鼠雜交瘤。優選的不死細胞系是小鼠骨髓瘤細胞系，該細胞系對含有次黃嘌來呤、 氨基喋呤和胸苷的培養基(HAT培養基)敏感。大量骨髓瘤細胞系中的任何一種可以標準 (standardwise)地用作融合配偶體，例如 P3-NSl/l-Ag4-l、P3-x63_Ag8. 653 或 Sp2/0_Agl4 骨髓瘤系。這些骨髓瘤細胞系可以從美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville, MD獲 得。通常，使用聚乙二醇(PEG)將HAT敏感的小鼠骨髓瘤細胞系與小鼠脾細胞融合，然後 使用HAT培養基選擇融合產生的雜交瘤細胞，從而殺死非融合的、以及非生產性融合的骨 髓瘤細胞(非融合的脾細胞因其未經轉化而在數天後死亡)。通過篩選雜交瘤培養物上清 液中特異性識別本發明的寡聚體及其衍生物的單克隆抗體，鑑定產生這類抗體的雜交瘤細 胞，例如，使用標準ELISA測定法選擇那些可以特異性結合本發明的寡聚體或其衍生物的 抗體。根據需要的抗體類型，多種宿主動物可以用於體內免疫，可以使用自身表達目的 抗原的內源性版本的宿主。另外，可以使用造成目的抗原的內源性版本缺陷的宿主。例如， 通過相應內源性基因的同源重組在特定內源性蛋白質造成缺陷的小鼠(即敲除小鼠)已證 實產生針對用來免疫的蛋白質的體液應答，從而能夠用於對該蛋白質的高親和力單克隆抗 體的生產(見,例如 Roes，J.等，(1995) J. Immunol. Methods 183 231-237 ；Lunn, Μ. P.等， (2000)J. Neurochem. 75 404-412)。對於生產抗本發明的寡聚體或其衍生物的非人類抗體，許多非人類哺乳動物細胞 是抗體生產的適宜宿主。儘管對於雜交瘤的生產優選小鼠，適且的宿主包括小鼠、大鼠、小 雞、駱駝、兔和山羊(及其敲除版本)。另外，表達人類抗體所有組成成分的非人類宿主動物 可用於基本上生產對人類抗原具有雙特異性的人類抗體。這種非人類動物包括含有人類免 疫球蛋白轉基因的轉基因動物(例如小鼠)(嵌合hu-PBMC SCID小鼠)以及在下文中更詳 細說明的人/小鼠輻射嵌合體。
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根據一個實施方案，經本發明的寡聚體及其衍生物免疫的動物是非人的哺乳動 物(優選小鼠)，所述動物為人類免疫球蛋白基因轉基因動物，以致該非人類哺乳動物在 抗原刺激後產生人類抗體。一般，將具有人類生殖細胞系構型的重鏈和輕鏈免疫球蛋白 轉基因引入內源性重鏈和輕鏈基因座被失活的動物。如果以抗原(例如以人類抗原)刺 激這類動物，產生來自人類免疫球蛋白序列的抗體。可以通過標準雜交瘤技術從這類動 物的淋巴細胞製造人類單克隆抗體。關於具有人類免疫球蛋白的轉基因小鼠及其在人 類抗體生產中的用途的進一步描述，見例如US 5，939，598、WO 96/33735、WO 96/34096、 WO 98/24893 和 WO 99/53049(Abgenix Inc.)，以及 US5, 545，806、US 5，569，825、US 5，625，126、US 5，633，425、US 5，661，016、US5, 770，429、US 5，814，318、US 5，877，397 以 及 W 99/45962 (Genpharm Inc.)；也見 MacQuitty，J. J.禾Π Kay，R. Μ· (1992) Science 257 1188 ；Taylor, L. D.等，(1992) Nucleic Acids Res. 20 6287-6295 ；Lonberg, N.等，(1994) Nature 368 :856_859 ；Lonberg ；N.禾口 Huszar，D. (1995)Int Rev. Immunol. 13 :65_93 ； Harding, F. Α.和 Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 7M :536_546 ；Fishwild, D. M.等， (1996)Nature Biotechnology 14 845-851 ；Mendez, Μ. J.等，(1997)Nature Genetics 15 146-156 ；Green, L. L.禾口 Jakobovits，A. (1998)J. Exp. Med. 188 :483_495 ；Green, L. L. (1999) J. Immunol. Methods 231 11-23 ；Yang, X. D.等，(1999) J. Leukoc. Biol. 66 401-410 ；Gallo, Μ. L.等，(2000)Eur. J. Immunol.迎534-540。根據另一實施方案，經本發明的寡聚體及其衍生物免疫的動物可以是重度聯合免 疫缺損小鼠，該小鼠以人類外周單個核血細胞或淋巴結細胞或其前體重建。已證實，這類被 稱為嵌合hu-PBMC SCID小鼠的小鼠在抗原刺激下產生人類免疫球蛋白應答。關於這些小鼠 及其在生產抗體中的用途的進一步描述，見例如Leader，K. Α.等，(1992) Immunology 76 229-234 ；Bombi 1, F.等，(1996) Immunobiol. 195 360~375 ；Murphy, W. J.等，(1996)Semin. Immunol. 8 233-241 ；Herz, U.等，(1997) Int. Arch. Allergy Immunol. U3 150-152 ； Albert, S. Ε.等，(1997) J. Immunol. 159 :1393-1403 ;NRuyen, H.等，(1997)Microbiol. Immunol. 41 901-907 ；Arai, K.等，(1998) J. Immunol. Methods 217 79~85 ；Yoshinari, K. ^P Arai, K. (1998)Hybridomal7 41-45 ；Hutchins, W. Α.等，(1999)Hybridoma 18 121-129 ；Murphy, W. J.等，(1999)Clin. Immunol. 90 -.22-21 ；Smithson, S. L.等，(1999) Mol. Immunol. M 113-124 ；Chamat, S.等，(1999) J. Infect. Diseases 180 268~277 以及 Heard, C.等，(1999)Molec. Med. 5 35-450根據另一實施方案，以本發明的寡聚體及其衍生物免疫的動物是以致死全身輻射 處理，然後以重度聯合免疫缺損小鼠(SCID)小鼠骨髓細胞抵抗輻射，繼之移植人類功能性 淋巴細胞的小鼠。經目的抗原免疫所述小鼠，使用這類被稱為Trimera系統的嵌合體通過 標準雜交瘤技術生產人類單克隆抗體。關於這些小鼠及其在生產抗體中的用途的進一步 描述，見例如 Eren，R.等，(1998) Immunology 迎154-161 ;Reisner，Y 和 Dagan，S. (1998) Trends Biotechnol. 16 242-246 ；Ilan, E.等，(1999)Hepatology 29 553-562 ；以及 Bocher, W. 0.等，(1999) Immunology 巡634_641。體外途徑作為經免疫和選擇而產生本發明抗體的備選方案，可以用本發明的寡聚體及 其衍生物篩選重組免疫球蛋白文庫，從而分離與寡聚體及其衍生物特異性結合的免疫球蛋白文庫成員由此鑑定和分離本發明抗體。生產和篩選展示文庫的試劑盒可商業獲 得(例如 Pharmacia Recombinant PhageAntibody System,目錄號 24-9400-01 ；以及 Stratagene SurfZAP PhageDisplay Kit，目錄號 240612)。在許多實施方案中，展示 文庫是scFv文庫或Fab文庫。篩選重組抗體文庫的噬菌體展示技術已被充分描述。用於 產生和篩選抗體展示文庫的方法和化合物的特別有利的實例，可見於例如McCafTerty等， WO 92/01047、US 5，禾口 EP 589877 (具體描述了 scFv 展示)；Ladner 等，US 5，223，409、US 5, 403, 484,US 5, 571, 698,US 5，837，500 和 EP 436597 (例如，描述 pill 融合)；Dower 等， WO 91/1727UUS 5, 427, 908,US 5，580，717 和 EP 589877 (具體描述Fab 展示)；Winter 等， International Publication WO 92/20791 和 EP 368，684(具體描述免疫球蛋白可變結構 域序列的克隆)；Griffiths等，US 5，885，793和EP 589887 (具體描述使用重組文庫分離 針對人類抗原的人抗體)；Garrard等，W092/09690(具體描述噬菌體表達技術)；Knappik 等，WO 97/08320 (描述人類重組抗體文庫HuCal) ；Salfeld等，WO 97/29131 (描述針對人 類抗原(人腫瘤壞死因子)的重組人抗體的產生，以及重組抗體的體外親和力成熟)以及 Salfeld 等，U. S. Provisional Application No. 60/126，603 和以此為基礎的專利申請(也 描述了針對人類抗原(人白介素12)重組人類抗體的產生，以及重組抗體的體外親和力成 熟)。關於重組抗體文庫篩選的進一步描述，可見於科學出版物中，例如Fuchs等， (1991)Bio/Technology 2 1370-1372 ;Hay 等，(1992)Hum AntibodHybridomas 2:81-85; Huse 等，(1989)Science 246 1275-1281 ；Griffiths 等，(1993)EMB0 J 1^:725-734; Hawkins 等，(1992) J Mol Biol 226 889~896 ;Clarkson 等，(1991)Nature 352 624~628 ； Gram 等，(1992)PNAS^ 3576-3580 ；Garrad 等，(1991)Bio/Technology 2:1373-1377; Hoogenboom 等，(1991)Nuc Acid Res 19 4133-4137 ；Barbas 等，(1991)PNAS M 7978-7982 ；McCafferty 等，Nature (1990) 348 :552_554 ；以及 Knappik 等，(2000) J. Mol. Biol. 296 :57-86。作為使用噬菌體展示文庫系統的替代方案，可以在酵母細胞或細菌細胞表面表達 重組抗體文庫。WO 99/36569描述了在酵母細胞表面表達的文庫的製備和篩選方法。WO 98/49286更詳細地描述了在細菌表面表達的文庫的製備和篩選方法。一旦組合文庫的目標抗體得到鑑定，就使用標準分子生物學技術分離編碼該抗 體輕鏈和重鏈的DNA，例如通過對展示包裝(例如噬菌體)的DNA PCR擴增，所述展示 包裝已在文庫的篩選中被分離。可用於製備PCR引物的抗體輕鏈和重鏈基因的核苷酸 序列為技術人員所公知。在例如Kabat，Ε. A.，等，(1991)《Sequences of Proteins of Immunologicallnterest》，第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIHPublication No. 91-3242以及人類生殖細胞系VBASE序列資料庫中描述了許多這樣的 序列。可以通過在宿主細胞內重組表達免疫球蛋白輕鏈和重鏈基因，產生本發明的抗體 或抗體部分。為了重組表達抗體，以一個或多個重組攜帶編碼該抗體免疫球蛋白輕鏈和重 鏈的DNA片段的表達載體轉染宿主細胞，從而在宿主細胞內表達輕鏈和重鏈，並優選將其 分泌至培養宿主細胞的培養基中。可從此培養基中分離抗體。使用標準重組DNA方法以獲 得重鏈和輕鏈抗體基因。在例如Sambrook、Fritsch及Maniatis (編)，《MolecularCloning ；A Laboratory Manual》，第二版，ColdSpring Harbor,N. Y.，(1989) ；Ausubel,F. M.等(編) 《Current Protocols in Molecular Biology》， Greene Publishing Associates, (1989) 以及Boss等的US 4，816，397中描述了這類方法。一旦獲得編碼目的抗體VH和VL片段的DNA片段，就可以使用標準重組DNA技術 對該DNA片段進行進一步操作，例如為了將可變區基因轉變為抗體鏈全長基因、Fab片段基 因或scFv基因。這些操作包括將編碼VL或VH的DNA片段與編碼另一蛋白質(例如抗體 怛定區域柔性接頭)的另一 DNA片段有效連接。術語「有效連接的」在此理解為指兩個DNA 片段以某種方式彼此連接，在這種方式中，於框內保持了兩個DNA片段編碼的胺基酸序列。將編碼VH區的DNA與編碼重鏈恆定區(CHI、CH2及CH3)的另一個DNA分子有 效連接，可以將分離的編碼VH區的DNA轉變為重鏈全長基因。人類重鏈恆定區基因序列 廣為人知(見例如 Kabat，E.A.等，(1991)《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》，第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，可以通過標準PCR擴增方法獲得跨越該區的DNA片段。重鏈恆定區可以是來 自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM 或 IgD 的恆定區，優選 IgGl 或 IgG4 恆定區。為了 獲得重鏈Fab片段的基因，可以將編碼VH的DNA與僅編碼重鏈恆定區CHl的另一個DNA分 子有效連接。將編碼VL的DNA與編碼輕鏈恆定區CL的另一個DNA分子有效連接，可以將分離 的編碼VL區的DNA轉變為輕鏈全長基因(以及Fab輕鏈基因)。人類輕鏈恆定區基因序 列廣為人知(見例如 Kabat，E.A.等，(1991)《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》，第五版，U. S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)，可以通過標準PCR擴增方法獲得跨越該區的DNA片段。輕鏈恆定區可以是恆 定κ或λ區，優選恆定κ區。為了產生scFv基因，可以將編碼VH和VL的DNA片段與編碼柔性接頭(例如氨基 酸序列(Gly4-Ser)3)的另一個片段有效連接，使VH和VL序列以連續的單鏈蛋白質表達(見 Bird 等，(1988) Science 242 423~426 ;Huston 等，(1988) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 85 5879-5883 ；McCafferty 等，Nature (1990) 348 :552_554)。可以使用上述方法從單結構域文庫分離對本發明的寡聚體或其衍生物具有特異 性的單結構域VH和VL。具有所需特異性的兩個VH單結構域鏈(具有或不具有CHl)或兩 個VL鏈、或一個VH和一個VL鏈的一對可用於從身體中去除本發明的寡聚體或其衍生物。為了表達本發明的重組抗體或抗體部分，可以將編碼部分或全長輕鏈和重鏈的 DNA插入表達載體，以便將基因與轉錄和翻譯控制序列有效連接。本文中，術語「有效連接 的，，理解為指抗體基因以某種方式連接於載體內，在這種方式中，載體內的轉錄和翻譯控制 序列完成其調節該抗體基因轉錄和翻譯的預期功能。選擇表達載體和表達控制序列，以便與使用的宿主細胞兼容。可以將抗體輕鏈基 因與抗體重鏈基因插入到單獨的載體中，或將兩個基因插入到相同的表達載體中，這是通 常的情況。使用標準方法將抗體基因插入表達載體中(例如抗體基因和載體上的互補限制 性切割位點的連接，或者，若不存在限制性切割位點時的平末端連接)。輕鏈和重鏈序列插 入前，表達載體可已經攜帶抗體恆定區序列。例如，一條途徑是將VH和VL序列轉化為全長 抗體基因，通過將其插入到已經分別編碼重鏈和輕鏈恆定區的表達載體中，從而將VH片段和CH片段在載體內有效連接，也將VL片段和CL片段在載體內有效連接。另外，或作為備 選，重組表達載體可以編碼便於抗體鏈從宿主細胞分泌的信號肽。可將該抗體鏈的基因克 隆到載體中，從而將信號肽在框內與抗體鏈基因N末端有效連接。信號肽可以是免疫球蛋 白信號肽或異源信號肽(即非免疫球蛋白蛋白質的信號肽)。除了抗體鏈基因，本發明的 表達載體可以具有控制抗體鏈基因在宿主細胞內表達的調節序列。術語「調節序列」旨在 包括控制抗體鏈基因轉錄和翻譯的啟動子、增強子和其它表達控制元件(例如聚腺苷酸化 信號)° 在例如 Goeddel ；《Gene Expression Technology :Methods In Enzymology 185》， AcademicPress，San Diego,CA(1990)中描述了這類調節序列。技術人員將理解，包括調節 序列選擇在內的表達載體的設計，依賴於諸如將轉化的宿主細胞的選擇、所需的蛋白質表 達強度等因素。哺乳動物宿主細胞中表達的優選調節序列包括在哺乳動物細胞中導致強蛋 白質表達的病毒元件，例如來自自巨細胞病毒(CMV)(例如CMV啟動子/增強子)、猿猴病 毒40 (SV40)(例如SV40啟動子/增強子)、腺病毒(例如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP)) 和多瘤病毒的啟動子和/或增強子。關於病毒調節元件及其序列的進一步描述，見例如 Stinski, US 5，168，062、Bell 等，US 4，510，245 及 Schaffner 等，US 4，968，615。除了抗體鏈基因和調節序列，本發明的重組表達載體可以具有額外序列，例如那 些調節載體在宿主細胞中複製的序列(如複製起點)和選擇性標記基因。選擇性標記基 因便於選擇被引入載體的宿主細胞(見例如Axel等的US專利No 4，399，216,4, 634，665 和5，179，017)。例如，常見的是選擇性標記基因賦予引入載體的宿主細胞藥物抗性，例如 G418、潮黴素或氨甲蝶呤抗性。優選的選擇性標記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因 (用於以甲氨蝶呤選擇/擴增的dhfr_宿主細胞中)和neo基因(用於G 418選擇)。為了表達輕鏈和重鏈，以標準技術將編碼重鏈和輕鏈的表達載體轉染宿主細胞 中。術語「轉染」的不同形式旨在包括常用於將外源DNA引入原核或真核宿主細胞的多種 技術，例如電穿孔、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖轉染等。儘管理論上可以在原核或真核細胞 內表達本發明的抗體，優選在真核細胞中、特別是哺乳動物細胞中表達抗體，因為在這類真 核細胞、特別是哺乳動物細胞中，正確摺疊以及組裝和分泌免疫活性抗體的概率高於原核 細胞。對於活性抗體的高得率生產，抗體基因的原核表達經報導是低效的(Boss，M.A.和 Wood, C. R. (1985)Immunology Today 6 12-13)。優選以哺乳動物細胞表達本發明的重組抗體，這些細胞包括CHO細胞(包括在 Urlaub 和 Chasin，(1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216_4220 中描述的 dhfrXHO 細 胞，如 R. J. Kaufman 和 P. A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159 :601_621 中所描述，其與 DHFR 選擇 標記一起使用)、NSO骨髓瘤細胞、COS細胞和SP2細胞。把編碼抗體基因的重組表達載體 引入哺乳動物細胞時，培養宿主細胞直至抗體在該宿主細胞中表達，或優選將抗體分泌至 宿主細胞生長的培養基中從而生產抗體。可以使用標準蛋白質純化方法將抗體從培養基中 分離。也可以使用宿主細胞生產完整抗體的部分，例如Fab片段或scFv分子。上述方法 的改變當然也包括在本發明內。例如，可能需要以編碼本發明的抗體輕或重鏈的DNA (但是 並非兩者)轉染宿主細胞。如果存在非結合目的抗原所需的輕或重鏈，則可通過重組DNA 技術將本發明這類輕鏈或這類重鏈的DNA或兩者部分或全部去除。由這類截短的DNA分子 表達的分子也包括在本發明的抗體內。另外，也可以通過標準化學方法將本發明的抗體與第二個抗體交聯，生產雙功能抗體，該抗體的一條重鏈和一條輕鏈為本發明的抗體，另一條 重鏈和一條輕鏈對不同於目的抗原的抗原具有特異性。在優選的重組表達本發明抗體或其抗原結合部分的系統中，通過磷酸鈣介導的轉 染方法將編碼抗體重鏈和抗體輕鏈的重組表達載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表達載 體內，抗體重鏈和輕鏈基因在每種情況下與CMV增強子AdMLP-啟動子調節元件有效連接， 以影響該基因的強轉錄。重組表達載體也攜帶DHFR基因，通過使用甲氨蝶呤選擇/擴增， 該基因可用於選擇被載體轉染的宿主細胞。培養選擇的轉化宿主細胞，以表達重鏈和輕鏈， 並從培養基中分離完整抗體。使用標準分子生物學技術製備重組表達載體，轉染宿主細胞， 選擇轉化體，培養所述宿主細胞，並從培養基中獲得抗體。因此本發明涉及合成本發明的重 組抗體的方法，該方法通過在合適的培養基中培養本發明的宿主細胞，直至合成本發明的 重組抗體。該方法可進一步包括從所述培養基分離重組抗體。作為通過噬菌體展示篩選重組抗體文庫的備選方案，技術人員公知的其它方法可 用於篩選大的組合文庫，以鑑定本發明的抗體。在一種類型的備選表達系統中，以RNA-蛋 白質融合物的形式表達重組抗體文庫，如Szostak和Roberts，0 98/31700、以及Roberts， R. W.和 Szostak，J. W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA M 12297-12302 中所描述。在這個 系統中，體外翻譯合成的在3'末端攜帶嘌呤黴素(肽受體抗生素)的RNA產生mRNA與由 其編碼的肽或蛋白質的共價融合物——合成mRNA。因此，以編碼的肽或蛋白質(例如抗體 或其部分)的特性為基礎，例如，所述抗體或其部分對本發明的寡聚體或其衍生物的結合， 可以濃縮mRNA的複雜混合物(例如重組文庫)中的特定mRNA。可以以上述方式通過重組 表達(例如在哺乳動物宿主細胞中)通過對這些庫篩選而獲得的編碼抗體或其部分的核酸 序列，另外，還可以通過更多輪篩選mRNA-肽融合物，將突變引入初始的選擇序列，或以上 述方法使用重組抗體的體外親和力成熟方法，進行親和力成熟。體內和體外途徑的組合也可以使用體內和體外途徑的組合產生本發明的抗體，例如在一個方法中，首先 讓本發明的寡聚體或其衍生物在宿主動物內體內作用於抗體所有組成成分，以刺激產生結 合寡聚體或衍生物的抗體，然後在一種或多種體外技術的幫助下實現進一步的抗體選擇和 /或抗體成熟(即優化)。根據一個實施方案，這種組合方法可以包括首先以本發明的 寡聚體或其衍生物免疫非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、小雞、駱駝、山羊或其轉基因版本 或嵌合小鼠)，以刺激對所述抗原的抗體應答，然後使用淋巴細胞的免疫球蛋白序列製備 和篩選噬菌體展示文庫，其中淋巴細胞已經寡聚體或衍生物的作用體內刺激。可以用上述 與體內途徑有關的方式實施此組合方法的第一步，而用上述與體外途徑有關的方式實施此 組合方法的第二步。以隨後體外篩選噬菌體展示文庫的超免疫非人類動物的優選方法包 括由 BioSite Inc.描述的那些，見例如 WO 98/47343、WO 91/17271、US 5，427，908 和 US 5，580，717，其中噬菌體展示文庫從所述經過刺激的淋巴細胞製備。根據另一實施方案，這種組合方法可以包括首先以本發明的寡聚體或其衍生物 免疫非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、小雞、駱駝、山羊或其轉基因本或嵌合小鼠)，刺激對 所述寡聚體或其衍生物的抗體應答，然後通過篩選雜交瘤(從例如免疫動物製備)選擇產 生具有所需特異性抗體的淋巴細胞。從選擇的克隆分離抗體或單結構域抗體基因(通過標 準克隆方法，例如反轉錄聚合酶鏈反應)，並將其進行體外親和力成熟，從而改進所選抗體
20(可能不只一種)的結合特性。可以用上述與體內途徑有關的方式實施此組合方法的第一 步，而用上述與體外途徑有關的方式實施此組合方法的第二步，特別是使用體外親和力成 熟方法，例如在WO 97/29131和WO 00/56772中描述的那些。在另一組合方法中，使用技術人員公知為選擇淋巴細胞抗體方法(SLAM)的程序 從單個分離的淋巴細胞產生重組抗體，在US 5，627，052、W0 92/02551和Babcock，J. S.等， (1996)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 :7843_7848中描述了該方法。在此方法中，首先以本 發明的寡聚體或其衍生物體內免疫非人類動物(例如小鼠、大鼠、兔、小雞、駱駝、山羊或其 轉基因本、或嵌合小鼠)，以刺激對該寡聚體或衍生物的免疫反應，然後使用抗原特異性溶 血噬斑試驗選擇分泌目的抗體的單個細胞。為此目的，可以使用諸如生物素的接頭將寡聚 體或衍生物或結構相關的目的分子與綿羊紅細胞偶聯，從而可以使用溶血噬斑試驗鑑定分 泌具有合適的特異性抗體的細胞。在鑑定分泌目的抗體的細胞之後，通過反轉錄酶PCR從 細胞獲得輕鏈和重鏈可變區的cDNA，然後可以在哺乳動物細胞(例如COS或CHO細胞)中 將該可變區與合適的免疫球蛋白恆定區(例如，人恆定區)聯合表達。通過塗布轉染細胞， 則可以使宿主細胞經歷進一步體外分析和體外選擇，例如，為了分離表達具有所需特異性 的抗體的細胞，其中宿主細胞由來自體內選擇的淋巴細胞的擴增的免疫球蛋白序列轉染。 擴增的免疫球蛋白序列可被進一步體外操作。與上述程序類似，也可以製備對本發明的寡聚體或其衍生物及結構相關的合成分 子具有特異性的抗體。這包括i)提供抗原，該抗原具有與本發明的寡聚體或其衍生物及結構相關的合成分子所 共有的結構特點；ii)將抗體所有組成成分暴露於該抗原；iii)從該抗體所有組成成分選擇與兩個結構相關分子結合的抗體，從而獲得具有 所需特異性的抗體。本發明涉及可以通過上面方法獲得的寡聚體特異性抗體及其在製備治療澱粉樣 β相關精神障礙的藥物或在製備診斷澱粉樣β相關精神障礙的組合物中的用途。根據本發明獲得的抗體特別包括可以通過上面的方法獲得的抗血清。抗血清可以 是全血清，即去除細胞和凝血成分後從宿主獲得的血液，或該血清的級份，在此級份中，特 別含有濃縮的免疫球蛋白級份，優選濃縮的、識別寡聚體的免疫球蛋白級份。可以使用上述 方法結合抗體純化獲得這種級份。本發明的抗血清是多克隆的，即它們含有具有不同特異性、通常不同類和亞類的 抗體，通常具有所有L鏈同種型，識別多個蛋白質表位。使用本發明的多種寡聚體作為免疫原時，本發明的抗血清通常交叉反應。根據另一方面，根據本發明獲得的抗體也包括單克隆抗體，特別是嵌合和人源化 抗體，及其寡聚體結合片段。本發明涉及與本發明的寡聚體或其衍生物結合的蛋白質和特別是抗體，即對本發 明的寡聚體或其衍生物具有特異性的抗體。本發明也涉及所述蛋白質或抗體的部分，特別 是其抗原結合部分，即與本發明的寡聚體或其衍生物結合的蛋白質或抗體部分。優選以致對本發明的寡聚體或其衍生物的特異性結合具有特定的結合動力學 (即高親和力、低解離、低解離速率、強中和活性)的本發明抗體。
對於對本發明的寡聚體或其衍生物具有的親和力在Kd = 10_6-10_12M範圍內的蛋 白質，特別是抗體。特別優選高親和力蛋白質、特別是高於Kd= IO-8M的親和力、高於Kd = IO-9M的親和力、高於Kd = IO-10M的親和力或高於Kd = IO-11M的親和力結合的抗體。根據另一方面，優選以相對較低的親和力、尤其是以低於Kd= ICT8M的親和力結合 其它Αβ (1-42)蛋白質形式(特別是單體Αβ (1-42)蛋白質和/或Αβ (1-40)蛋白質)的 那些蛋白質，特別是抗體。因此，根據本發明，優選以高於單體Αβ (1-42)蛋白質和/或Αβ (1-40)蛋白質的 親和力結合寡聚體或其衍生物的那些蛋白質，特別是抗體。特別優選10、100、或1000的親 和力比值。根據另一方面，可以選擇本發明的抗體，以致以0. Γ—1或更低的k。ff速率常數與 寡聚體或其衍生物結合。對於IXlO-2 S—1或更低、1 ΧΙΟ—3 S—1或更低、IX ΙΟ、—1或更低、 IXlO-5 S—1或更低的速率常數k。ff，按照指出的順序優選性逐漸增加。另外，可以選擇本發明的抗體，以致以IXIO_6M或更低的IC5tl抑制本發明的寡聚體 或其衍生物的活性，特別是神經毒性活性。對於1 X IO-7M或更低、1 X IO-8M或更低、1 X 10_9M 或更低、1 X IO-10M或更低、或1 X IO-11M或更低的抑制常數IC5tl，按照指出的順序優選性逐漸 增加。抗體優選為分離的抗體。根據另一方面，抗體為中和抗體。本發明的抗體包括單 克隆和重組抗體。根據許多實施方案，抗體可以包括完全來自單一物種的胺基酸序列，例如 人類抗體或小鼠抗體。根據其它實施方案，抗體可以是嵌合抗體或CDR移植物或人源化抗 體的其他形式。術語「抗體」意指由4個多肽鏈，即兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈組成的免疫球蛋 白分子。鏈通常通過二硫鍵與另一個連接。每條重鏈由該重鏈的可變區(此處縮寫為HCVR 或VH)和該重鏈的恆定區組成，重鏈恆定區由CH1、CH2和CH3三個結構域組成。每條輕鏈 由該輕鏈的可變區(此處縮寫為LCVR或VL)和該輕鏈的恆定區組成，輕鏈恆定區由CL結 構域組成。VH和VL去可以進一步劃分為被稱為互補性決定區域(CDR)的高變區和散布的、 被稱為構架區(FR)的保守區。每個VH和VL區由三個CDR和四個FR組成，它們按照下列 順序從 N 端向 C 端排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。術語抗體的「抗原結合部分」(或簡稱為「抗體部分」)指對本發明的寡聚體或其衍 生物具有特異性的一個或多個抗體片段，所述片段仍然能夠特異地結合該寡聚體或其衍生 物。完全抗體的片段經顯示能夠執行抗體的抗原結合功能。依照術語抗體的「抗原結合部 分」，結合片段的實例包括(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHl結構域組成的單價片段；(ii) F(ab' )2片段，即包括兩個Fab片段的二價片段，其中Fab片段通過二硫橋在鉸鏈區中彼 此連接；(iii)由VH和CHl結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體單臂的FL和VH結構域組 成的 Fv 片段；(ν)由￥!1結構域或￥!1、011、012、0!13、或￥!1、012、013組成的(^13片段(Ward 等，(1989)NatureMi =544-546)；以及(vi)分離的互補性決定區域(CDR)。儘管Fv片段 的兩個結構域(即VL和VH)由分離的基因編碼，可以使用合成接頭和重組方法進一步將其 彼此連接，使它們可能以單個蛋白質鏈製備，在該蛋白質鏈中，VL和VH區組合以形成單價 分子(公知為單鏈 Fv (ScFv)；見例如 Bird 等，(1988) Science 242 423~426 以及 Huston 等，(1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA迎5879_5883)。術語抗體的「抗原結合部分」也旨
22在包括這類單鏈抗體。單鏈抗體的其它形式例如「雙抗體」也包括於此。雙抗體是二價雙 特異性抗體，在雙抗體中，VH和VL結構域表達在單個多肽鏈上，但是使用對於能夠組合在 相同鏈上的兩個結構域而言太短的接頭，從而迫使該結構域與不同鏈的互補結構域配對， 並形成兩個抗原結合位點(見例如Holliger，P.等，(1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448 ；Poi jak, R. J.等，(1994) Structure 2:1121-1123)。另外，抗體或抗原結合部分可以是較大的免疫黏附素球蛋白分子的部分，其中免 疫黏附素分子由該抗體或抗體部分與一個或多個其它蛋白質或肽的共價或非共價聯合 而形成。與這類免疫黏附素分子相關的是鏈黴親和素核心區的使用，以製備四聚體scFv 分子(Kipriyanov, S.M 等，(1995)Human Antibodies und Hybridomas 6 93-101),以 及半胱氨酸、標記肽和C末端多組氨酸標籤的使用，以產生二價和生物素化的scFv分子 (Kipriyanov, S. Μ.等，(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058) 使用常規技術例如以木瓜蛋 白酶或胃蛋白酶消化，可以從完整抗體產生諸如Fab和F(ab' )2片段的抗體部分。另外， 使用標準重組DNA技術可以獲得抗體、抗體部分和免疫黏附素分子。「對本發明的寡聚體或 其衍生物具有特異性的分離的抗體」指對本發明的寡聚體或其衍生物具有特異性的抗體， 其基本不含具有不同抗原特異性的其它抗體，即，尤其不含有與上述Αβ (1-42)的其它形 式特異性結合的抗體的抗體。術語「中和抗體」指與特定抗原的結合引起該抗原生物活性的抑制的抗體。使用 適宜的體外或體內測定法，測量抗原的一個或多個生物活性的指標，可以評價該抗原生物 活性的抑制。術語「單克隆抗體」指來自雜交瘤的抗體(例如由雜交瘤分泌的抗體，其中雜交瘤 通過雜交瘤技術(例如根據Kohler和Milstein的標準雜交瘤方法)製備)。因此將來自 雜交瘤產生並對本發明的寡聚體或其衍生物具有特異性的抗體稱為單克隆抗體。術語「重組抗體」指通過重組方法生產、表達、產生或分離的抗體，例如使用轉染入 宿主細胞的重組表達載體表達的抗體；從重組組合抗體文庫分離的抗體；從人類免疫球蛋 白基因轉基因動物(例如小鼠)分離的抗體(見例如Taylor，L. D.等，(1992)Nucl. Acids Res. 20 =6287-6295)；或者以其它方法生產、表達、產生或分離的抗體，在這些方法中將特 定的免疫球蛋白基因序列(例如人類免疫球蛋白基因序列)與其它DNA序列組裝。重組抗 體包括，例如嵌合的、CDR移植物和人源化抗體。術語「人類抗體」指其可變和恆定區對應於或來自人類生殖細胞系免疫球蛋白 序列的抗體，例如Kabat等所描述(見Kabat等，(1"1)《Sequencesof Proteins of Immunological Interest》，第五版，U. S. Department of Healthund Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。然而，本發明的人類抗體可以在例如CDR、特別是CDR3中含有 不是由人類生殖細胞系免疫球蛋白序列編碼的胺基酸殘基(例如通過體外隨機或定點誘 變、或通過體內體細胞突變引入的突變)。本發明的重組人類抗體具有可變區，也可以含有 來自人類生殖細胞系免疫球蛋白序列的恆定區(見Kabat，E.A.等，(1991)《Sequences of Proteins of Immunological Interest》，第五版，U. S. Department of Health und Human Services,NIH Publication No 91-3242)。然而，根據具體的實施方案，將這類重組人類抗 體進行體外誘變(或如果使用人類Ig序列轉基因動物，則為體內體細胞誘變)，以致重組抗 體VH和VL區的胺基酸序列成為非天然體內存在於人類生殖細胞系抗體所有組成成分的序列，儘管其涉及或來自人類生殖細胞系VH和VL序列。根據具體的實施方案，這種重組抗體 是選擇誘變或回復突變或兩者的結果。術語「回復突變」指包括用對應於同源生殖細胞系抗體序列的生殖細胞系殘基替 換人類抗體的部分或全部體細胞突變胺基酸的方法。將本發明的人類抗體重鏈和輕鏈序列 分別在VBASE資料庫中與生殖細胞系序列比較，以鑑定具有最高同源性的序列。突變編碼 這些確定的異化胺基酸的核苷酸位點，將本發明的人類抗體的印記(imprint)回復為生殖 細胞系序列。應當研究以此方式鑑定為候選的回覆突變的各個胺基酸對抗原結合的直接或 間接重要性，不應將突變後削弱該人類抗體所需性質的胺基酸整合到最終的人類抗體中。 為了保持回復突變的胺基酸數目儘可能少，儘管有異於最接近的生殖細胞系序列，與第二 個生殖細胞系序列的相應胺基酸序列相同的那些胺基酸位點應當保持不變，條件是所述第 二個生殖細胞系序列在相關胺基酸兩側以至少10個、優選12個胺基酸與本發明的人類抗 體序列相同併線性對應。可以在抗體優化的任何階段實施回復突變。術語「嵌合抗體」指含有一個物種重鏈和輕鏈可變區序列，但是其中VH和/或VL 的一個或多個CDR區序列被另一個物種的CDR序列置換的抗體，例如具有小鼠重鏈和輕鏈 可變區、其中一個或多個小鼠CDR(例如CDR3)被人類CDR序列置換的抗體。術語「人源化抗體」指含有非人類物種(例如小鼠、大鼠、兔、小雞、駱駝、山羊)重 鏈和輕鏈可變區序列、但是其中至少部分VH和/或VL序列經過改變從而更加「與人類似」， 即與人類生殖細胞系可變區序列更加相似。一種類型的人源化抗體是CDR移植物抗體，其 中將人類CDR序列插入非人類VH和VL序列中，以置換相應的非人類CDR序列。測量抗體結合動力學的一種方式是使用表面等離振子共振方法。術語「表面等離 振子共振」指一種光學現象，通過這種現象，使用例如BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)，以生物傳感器矩陣檢測蛋白質濃度的變化，可 以分析生物特異性相互作用。進一步描述，見J6nSSOn,U.等，(1993)Ann. Biol. Clin. 51 19-26 ； Jonsson, U.等，(1991)Biotechniques 11 620-627 Johnsson, B.等，(1995) J. Mol. Recognit. 8 125-131 ；以及 Johnnson，B.等，(1991) Anal. Biochem. 198:268-277。術語「K。ff」指抗體從抗體/抗原複合物解離的解離速率常數。術語「K/』指特定的抗體_抗原相互作用解離常數。本發明的抗體的結合親和力可以使用標準體外免疫測定例如ELISA或BIAcore分 析進行評價。除了抗體，蛋白質可以是T細胞受體衍生的分子或T細胞受體衍生的受體結構域 或該受體結構域與免疫球蛋白Fc部分的融合蛋白質。本發明也涉及藥物製劑(組合物)，該製劑含有本發明的蛋白質，特別是本發明的 抗體，以及任選的可藥用載體。本發明的藥物組合物可以進一步含有至少一種額外的治療 劑，例如一種或多種治療可被本發明抗體減輕的疾病的治療劑。例如，如果本發明的抗體結 合本發明的寡聚體，藥物組合物可以進一步含有一種或多種額外的治療紊亂的治療劑，其 中所述寡聚體的活性對紊亂是重要的。藥物適宜載體包括任何溶劑、分散介質、包衣、抗菌和抗真菌劑、等滲和延遲吸收 劑等，只要它們是生理學相容的。藥物接受載體包括例如水、鹽溶液、磷酸緩衝鹽溶液、右旋 糖、甘油、乙醇等，及其組合。在許多情況下，優選使用等滲劑，例如糖、多元醇(如甘露醇或山梨醇)，或還有氯化鈉。藥物適宜載體可以進一步含有相對少量的輔助物質，例如潤溼劑 或乳化、防腐劑或緩衝液，它們將增加抗體的半衰期或功效。藥物組合物可適於例如胃腸外施用。在此，優選將抗體製備為具0. l_250mg/ ml的抗體含量的可注射溶液。可以以液體或凍幹形式製備可注射溶液，藥劑形式為鉛玻 璃(flint glass)或小瓶、安瓿或填充注射器。緩衝液可以含有L-組氨酸(l-50mM，優選 5-10mM)，具有5. 0-7. 0、優選6. 0的pH。其它適宜的緩衝液包括(但不限於)琥珀酸鈉、檸 檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀緩衝液。可以使用氯化鈉以調節溶液張力至0-300mM(對於液體劑 量形式優選150mM)濃度。對於凍幹劑量形式也可以包括抗凍劑，例如蔗糖(例如0-10%， 優選0.5-1.0%)。其它合適的防凍劑是海藻糖和乳糖。對於凍幹劑量形式也可以包括填 充物例如甘露糖(例如1_10%，優選2-4% )。穩定劑例如L-蛋氨酸(例如51-50mM，優選 5-10mM)可以用於液體和凍幹劑量形式。其它合適的填充物為甘氨酸和精氨酸。也可以使 用表面活性劑例如聚山梨醇酯80(例如0-0. 05%，優選0. 005-0. 01% )0其它表面活性劑 為聚山梨醇酯20和BRIJ表面活性劑。本發明的組合物可以有多種形式。這包括液體、半固體和固體劑量形式，例如液體 溶液(如可注射及可灌輸溶液)、分散劑或懸浮液、片劑、丸劑、粉末、脂質體和栓劑。優選的 形式取決於欲施用的類型和治療應用。一般，優選對可注射或可灌輸溶液形式的組合物，例 如與人類被動免疫的其它抗體相似的組合物。優選的給藥途徑是胃腸外(例如靜脈內、皮 下腹膜內、肌肉內)。根據優選的實施方案，通過靜脈灌輸或注射給予抗體。根據另一個優 選的實施方案，通過肌肉內或皮下注射給予抗體。治療組合物一般必須是無菌並在製備和儲存條件下穩定的。可以將組合物配製為 溶液、微乳液、分散劑、脂質體或其它適於高活性物質濃度的有序結構。可以以要求的量將 活性化合物(例如抗體)引入合適的溶劑(根據需要，適當時為上述成分的一種或組合)， 然後無菌過濾該溶液，從而製備無菌的可注射溶液。分散劑通常是通過將活性物質引入含 有基本分散介質(恰當時還有其它所需成分)的無菌賦形劑中而製備。在製備無菌可注射 溶液的無菌凍乾粉末的情況下，真空乾燥和噴霧乾燥是優選的製備方法，該方法從前面無 菌過濾溶液生產活性成分、合適時還有其它所需成分的粉末。通過使用例如卵磷脂這類包 衣、在分散劑情況下保持要求的顆粒尺寸或使用表面活性劑，可以保持溶液合適的流動性。 通過將延緩吸收的製劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)額外引入組合物，可以實現可注射組合 物的延長吸收。儘管對於許多治療應用，優選的給藥類型是皮下注射、靜脈注射或靜脈灌注，本 發明的抗體可以通過許多技術人員公知的方法給藥。技術人員將理解，給藥途徑和/或 類型取決於所需的結果。根據具體的實施方案，可以用保護化合物免於迅速釋放的載體 製備活性化合物，例如具有受控釋放的製劑，包括植入物、經皮膏藥以及微膠囊化的釋放 系統。可以使用可生物降解的、生物相容的多聚體，例如乙烯-醋酸乙烯酯共聚物、聚酸 酐、聚乙二醇酸、膠原質、聚原酸酯、聚乳酸。製備這類製劑的方法為技術人員所熟知，見例 如〈〈Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)), J· R· Robinson，編， Marcel Dekker, Inc.，New York，1978。根據具體的實施方案，本發明的抗體可以在例如惰性稀釋劑或可同化的食用載體 中經口給藥。也可以將抗體(如果需要，還有其它成分)封閉在硬或軟明膠膠囊中、壓縮成片劑或直接加入食物中。對於經口治療給藥，可以將抗體與賦形劑混和，以可吞吃片劑、含 片劑、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿劑等形式使用。如果旨在將本發明的抗體通過非胃腸外途徑 給藥，有必要從防止其失活的材料中選擇包衣。本發明的抗體優選能夠體外或體內中和其結合的本發明的寡聚體或其衍生物的 活性。因此，在例如含有所述寡聚體或其衍生物的細胞培養物中，或在存在該寡聚體或其培 養物的人類個體或哺乳動物中，該抗體可以用於抑制本發明的寡聚體或其衍生物的活性。 根據一個實施方案，本發明涉及抑制本發明的抗體或其衍生物的活性的方法，該方法包括 允許本發明的抗體作用於寡聚體或其衍生物，以致抑制該寡聚體或其衍生物的活性。例如， 可以在體外抑制該活性。例如，可以將本發明的抗體加入細胞培養物中，其中的細胞培養 物含有或可疑含有本發明的寡聚體或其衍生物，從而抑制培養物中寡聚體或其衍生物的活 性。另外，可以在個體體內抑制寡聚體或其衍生物的活性。本發明進一步涉及在個體內抑制本發明的寡聚體或其衍生物的活性的方法，其中 個體遭受紊亂，該紊亂涉及澱粉樣β蛋白質，本發明的寡聚體或其衍生物的活性尤其重 要。該方法包括將至少一種本發明的抗體施用於個體，以抑制抗體結合的寡聚體或其衍生 物活性。所述個體優選為人類。本發明的抗體可以出於治療性目的施用於人類個體。另 外，本發明的抗體可以出於獸醫目的或在具體疾病的動物模型框架內施用於非人類哺乳動 物。這類動物模型對於評價本發明抗體的治療性功效(例如測試給藥的劑量和時程)可能 有用。本發明的寡聚體及其衍生物參與其中的紊亂，特別包括在其發展和/或過程中涉 及本發明的寡聚體或其衍生物的紊亂。這尤其指那些紊亂本發明的寡聚體或其衍生物是 該病症明顯或推定的病理生理學原因，或是參與該紊亂的發展或過程的因素。因此，這裡包 括那些病症，在這些病症中，本發明的寡聚體或其衍生物的活性的抑制可以緩解病症的症 狀和/或進展。通過例如在遭受具體病症個體的生物學液體中本發明的寡聚體或其衍生物 濃度的升高(例如在血清、血漿、CSF、尿等中濃度升高)可以證實這些紊亂。這可以使用例 如本發明的抗體檢測。本發明的寡聚體及其衍生物在與許多病症相關的病理學中起到重要 作用，在這些病症中，涉及神經變性因素、認知缺陷、神經毒性因素和炎性因素。本發明的抗體可以與一種或多種對於上述病症的治療備用的額外治療劑一起施 用。本發明的藥物組合物一般含有至少一種本發明的治療有效量或預防有效量的抗 體。根據所需治療，例如是否需要治療性或預防性處理，可以選擇並調整劑量方案。例如， 根據治療情況的需要，可以給以單次給藥、隨時間多次單獨給藥，或增加或降低的劑量。為 了方便給藥並保證劑量統一，以單次劑量形式以配製胃腸外組合物尤其有利。本發明的抗體的治療有效量或預防有效量可以在例如0. l_20mg/kg並優選 l-10mg/kg範圍內，但是不限於此。根據欲緩解病症的類型和嚴重性，這些量當然可以變化。在抗體的診斷性使用框架內，特異性寡聚體的定性或定量測定特別用於診斷疾病 相關的澱粉樣β (1-42)形式。在本文中，特異性指能夠以足夠的靈敏度檢測特定寡聚體或 寡聚體混合物的可能性。本發明的抗體有利地具有低於lOng/ml樣品、優選低於lng/ml樣 品、並特別優選低於100pg/ml樣品的靈敏度，意味著可以通過本發明的抗體檢測到至少在 各例中表明的每毫升樣品中的寡聚體濃度，以及有利的更低濃度。
根據免疫學實施測定。在原則上可以使用任何使用到抗體的分析性或診斷性測 定，包括凝集和沉澱技術、免疫測定、免疫組織化學方法和免疫印跡方法，例如蛋白質印跡 或斑點印跡方法。在此也包括體內方法，例如成像方法(imaging method)。在免疫測定中的用途是有利的。競爭性免疫測定和夾層免疫測定都是合適的， 競爭性免疫測定即抗原和標記的抗原(示蹤物)競爭抗體結合，夾層免疫測定即通常使 用標記的第二抗體檢測特異性抗體對抗原的結合。這些試驗可以是同相的，即沒有分離 成固相和液相，或是多相的，即通過例如固相結合的抗體將結合的標記與未結合的標記 分開。根據標記和測量方法，不同的多相和同向免疫測定形式可以分成具體的類別中， 例如RIA(放射免疫測定)、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、FIA(螢光免疫測定)、LIA(發 光免疫測定)、TRFIA(時間分辨的FIA)、IMAC(免疫活化)、EMIT(酶放大的免疫測試)、 TIA(turbodimetric 免疫測定)、I-PCR(免疫-PCR)。關於本發明的寡聚體測定，優選競爭性免疫測定法，其中標記的寡聚體(示蹤物) 與樣品將要定量的寡聚體樣品競爭結合使用的抗體。藉助於標準曲線，可以從置換的示蹤 物的量測定樣品中抗原的量，即寡聚體的量。可用於這些目的的標記中，經證實酶是有利的。例如，可以使用基於過氧化物酶 (特別是辣根過氧化物酶)、鹼性磷酸酶和β-D-半乳糖酶的系統。可獲得這些酶的特異性 底物，特異性底物的轉化可以通過例如光度法監測。合適的底物系統以下列為基礎對於 鹼性磷酸酶，對硝基苯磷酸鹽(P-NPP)、5_溴-4-氯-3-吲哚磷酸/氮藍四唑(BCIP/NBT)、 Fast-Red/萘酚-AS-TS磷酸；對於過氧化物酶，2，2_聯氮-雙(3-乙基苯並噻唑啉_6_磷 酸)(2,2-Azin o-bis-(3-ethylbenzthiazolin_6- sulfonsaure )) (ABTS)、鄰苯二胺 (OPT) ,3,3' ,5,5'-四甲基對二氨基聯苯(3，3' ,5,5' -Tetramethylbenzidine) (TMB)、 鄰聯茴香胺、5-氨基水楊酸、3-二甲基氨基苯酸(DMAB)和3-甲基_2_苯並噻唑啉酮腙(3 -methyl-2-benzothiazolinhydrazone) (MBTH)；對於 β-D-半乳糖酶，鄰硝基苯-β-D-半 乳糖苷(o-NPG)、對硝基苯- β -D-半乳糖苷和4-MethylumbelIiphenyl-β -D-半乳糖苷 (MUG)。在許多情況下，這些底物系統可商業獲得即用形式，例如以片劑形式，其可以含有其 它試劑，例如適宜的緩衝液等。使用的示蹤物是標記的寡聚體。在這一方面，可以通過標記待測寡聚體並將其用 作示蹤物而測定特定的寡聚體。可以用本身已知的方式將標記與寡聚體偶聯，以製備示蹤物。通過類推提及上文 關於衍生本發明寡聚體的注釋。另外，可以獲得許多為與蛋白質綴合而經過適當修飾的標 記，例如生物素、抗生物素蛋白、extravidin或鏈黴親和素綴合的酶、馬來醯亞胺活化的酶 等。這些標記可以與寡聚體或根據需要與經適當衍生的寡聚體直接反應而生成示蹤物。例 如，如果使用鏈黴親和素過氧化物酶綴合物，則首先需要求生物素化寡聚體。這相應地應用 於相反的順序。關於這個目的，合適的方法也為技術人員所公知。如果選擇多相免疫測定形式，可以通過將抗原-抗體複合物結合到支持物上而將 其分離，例如，通過與支持物偶聯的抗獨特型抗體(如抗兔IgG抗體)來分離。支持物、特 別是以適宜的抗體包被的微滴定板是已知的，並且部分可商業獲得。本發明進一步涉及免疫測定套裝，該套裝具有至少一種上述抗體以及其它組分。 該套裝通常為包裝單位形式，是實施本發明的寡聚體測定的組合物。為了操作儘可能簡單的目的，優選以基本即用的形式提供上述手段。有利的安排是以試劑盒形式提供免疫測定。 試劑盒通常包括用於分開排列組分的多個容器。可以以即用稀釋液、以用於稀釋的濃宿物， 或者以用於溶解或懸浮的乾物質或凍乾物提供所有組分；個別或所有成分可以冷凍或在室 溫保存直至使用。血清優選在例如_20°C迅速冷凍，以致在這種情況下，免疫測定在使用前 不得不優選保持在結冰溫度之下。與免疫測定提供的其它組分取決於該免疫測定的類型。通常，與抗血清一起提供 標準蛋白、示蹤物(可能需要，也可能不需要)以及對照血清。另外，也包括微滴定板(優 選抗體包被的)、用於例如測試、洗滌或底物轉變的緩衝液和酶底物本身。免疫測定、作為實驗室和醫院中的輔助的抗體的生產和使用的通用原則可見於例 如《Antibodies，A Laboratory Manual》(Harlow，Ε·禾口 Lane，D.編，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，NY, 1988)。其它目標還有抑制本發明的寡聚體聚集或加速其解聚的物質。這類物質特別代表 了治療上述澱粉樣β相關紊亂(例如阿爾茨海默病)的可能的治療劑。本發明因此也涉及表徵物質或物質混合物的方法，該方法包括i)以適當的方式提供該物質或物質混合物；ii)允許該物質或物質混合物作用於至少一種本發明的寡聚體、其衍生物或組合 物；以及iii)測定該物質或該物質混合物的特定部分是否與所述寡聚體、其衍生物或存在 於所述組合物中的至少一種寡聚體或其衍生物結合。 也可以在生物來源的混合物中實施該方法，例如細胞製品和細胞提取物，從而鑑 定對本發明的寡聚體具有親和力的天然結合配偶體，例如細胞表面抗原，特別是受體和可 溶性配體，例如特定的蛋白質和中介體。不僅是物質的結合，其與本發明的寡聚體的相互作用及對寡聚體的影響也可以是 該方法的主題。因此特別可以測定是否-該物質能夠調節、特別是抑制澱粉樣β蛋白質向本發明的寡聚體的聚集；-該物質能夠調節、特別是增強本發明的寡聚體的解聚；-本發明的寡聚體引起結合配偶體的功能改變，例如對受體具有激動、部分激動、 拮抗或逆激動作用。所述方法通常為體外篩選方法，可以用於從多種不同物質中選擇對進一步應用最 有前景的那些物質。例如，可以通過組合化學方法建立包括大量潛在活性物質的廣泛的物 質文庫。可以自動化篩選具有所需活性的物質的組合文庫。篩選機器人用於有效地分析單 個的測定，這些測定優選排列在微滴定板上。本發明因此也涉及篩選方法，即一級和二級篩 選方法，優選其中至少應用一種下述方法。如果應用若干方法，它們可以隨時間變化或同時 應用於同一樣品，或應用於待測物質的不同樣品。實施這類方法的特別有效的技術是閃爍親近測定法，簡稱為SPA，該技術為藥物篩 選領域所公知。實施該測定的試劑盒和組分可以商業獲得，例如從Amersham Pharmacia Biotech。原則上，將溶解的或膜固定的受體固定在含有閃爍物質的小的螢光微球體上。當 例如放射性配體與結合受體結合時，由於閃爍物質和放射性配體的空間親近，閃爍物質得 到刺激並發光。
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實施這類方法的另一個特別有效的技術是藥物篩選領域公知的FlashPlateR技 術。實施該測定的試劑盒和組分可以商業獲得，例如從NENR Life Science Products。該 原則也基於閃爍物質包被的微滴定板(96或384孔)的。本發明涉及物質或物質混合物的一部分，及其在製備藥劑或製備組合物中的用 途；作為與寡聚體、其衍生物或與存在於相應組合物中的至少一種寡聚體或其衍生物結合 的配體，其中物質或物質混合物的部分可以根據本方法確定，其中藥劑用於澱粉樣β相關 的紊亂(特別是痴呆)的治療，其中組合物組合物用於診斷澱粉樣β相關的紊亂(特別是 痴呆)。下面的實施例旨在說明本發明，而非限制其範圍。


圖1顯示A β (1-42)寡聚體A製品(泳道Α)、Α β (1-42)寡聚體B製品(泳道B)、 標準蛋白質(分子量標誌蛋白質，泳道C)的SDS PAGE；圖2顯示A β (1-42)寡聚體A製品(泳道Α) ；A β (1-42)寡聚體A-CL製品(泳道 Α，)；Αβ (1-42)寡聚體B製品(泳道B) ；A β (1-42)寡聚體B-CL製品(泳道B』)；標準蛋 白質(分子量標誌蛋白質，泳道C)的SDS PAGE ；圖3顯示生物素A β (1-42)寡聚體B製品(泳道Α)；標準蛋白質(分子量標誌蛋 白質，泳道B)的SDS PAGE ；圖4顯示螢光素Αβ (1-42)寡聚體B製品(泳道Α)；標準蛋白質(分子量標誌蛋 白質，泳道B)的SDS PAGE ；圖5顯示與含有Αβ (1-42)寡聚體B的製品比較，含有Aβ (1-42)凍乾物的溶液 的凝膠滲透層析；圖6顯示Αβ (1-42)寡聚體B製品(泳道Α)；標準蛋白質(分子量標誌蛋白質， 泳道 B)的 NATIVE PAGE ；圖7 顯示(a)單體 A β (1-42)蛋白質、(b) A β (1-42)寡聚體 A 以及(C)A β (1-42) 寡聚體B對人類成神經細胞瘤細胞系IMR-32表面的結合；圖8以％顯示以Αβ (1-42)寡聚體B處理鼠皮質神經元後的神經毒性作用，誤差 條對應於95%置信區間；圖9顯示以胰蛋白酶(泳道2)、糜蛋白酶(泳道3)、嗜熱菌蛋白酶(泳道4)、彈性 蛋白酶(泳道5)、木瓜蛋白酶(泳道6)處理的或未經處理的(泳道7)Αβ (1-42)製品；以 及標準蛋白質(分子量標誌蛋白質，泳道1)的SDS PAGE ；圖10顯示下列反應性的斑點印跡IOOpmol (A行)UOpmol (B行)Upmol (C行)、 0. Ipmol (D行)、0. Olpmol (E行)的實施例6b的Αβ (1-42)寡聚體B製品(列1)、實施例 Ia的HFIP處理的Aβ (1-42)單體(列2)、實施例15a的嗜熱菌蛋白酶剪切的Aβ (1-42) 寡聚體B製品(列3)、實施例14a的戊二醛交聯的A β (1-42)寡聚體B製品(列4)、根據 Μ. P. Lambert 等，J. Neurochem. 79，595-605 (2001)在 4°C或室溫或 37°C (分別為列 5、列 6 和列7)製備的ADDL、溶解於0. NH4OH中的Αβ (1-42)(列8)、實施例27的Αβ (1-42) 原纖維製品(列9)、以及Sigma的PBS稀釋的APP (列10)，其中具有a)單克隆抗體6E10 ； b)實施例25d的多克隆抗血清(dl) ；c)實施例25c的多克隆抗血清(cl) ；d)實施例25a 的多克隆抗血清(al)；以及e)實施例25a的多克隆抗血清(a2)；
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圖11顯示實施例15a的Αβ (1-42)寡聚體B製品(泳道B)；實施例15b的 A β (1-42)寡聚體C製品(泳道C)；實施例6b的A β (1-42)寡聚體B製品(泳道Α)；以及 標準蛋白質(分子量標誌蛋白質，泳道D)的SDS PAGE；圖12顯示與實施例14a的A β (1-42)寡聚體B-CL製品比較，實施例6b的 Αβ (1-42)寡聚體B製品的凝膠滲透層析；圖13顯示單體Αβ (1-42)蛋白質(左)；Αβ (1-42)寡聚體(12體，Α)；以及 Aβ (1-42)寡聚體(12體，C)和Αβ (20-42)寡聚體(12體，B)的圖示表示，後二者可以通 過蛋白酶水解剪切獲得；圖14以Αβ (1-42)寡聚體B對海馬區作用的時間函數顯示興奮性突觸後電位 (fEPSP)；圖15顯示描述與非特異性結合螢光相比(b)，Αβ (1-42)寡聚體B與大鼠海馬神 經元結合的免疫螢光圖像(a)。除非另外指出，本發明寡聚體的濃度以單體Αβ (1-42)多肽的摩爾濃度表示。術 語β澱粉樣(1-42)蛋白質相當於術語澱粉樣β (1-42)蛋白。除非另外指出，使用的蛋白 質(多肽)為人類來源。
實施例實施例1a)人類A β (1-42)貯存懸浮液的製備將2mg人類β澱粉樣(1-42)蛋白質(簡稱Αβ (1-42)；肽合成材料、凍乾物，來 自Bachem，德國)溶解於800 μ 1 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，在Eppendorf管中於37°C 孵育30分鐘。繼之在真空濃縮器(Speed Vac)中蒸發至乾燥。以88 μ 1 DMSO吸收殘餘物， 得到5mM A β (1-42)貯存懸浮液，可保存於_20°C。b)大鼠Αβ (1-42)貯存懸浮液的製備將2mg大鼠β澱粉樣(1_42)蛋白質(簡稱大鼠Αβ (1-42)；肽合成材料、凍幹 物，來自Bachem，德國)溶解於800 μ 11，1，1，3，3，3_六氟_2_丙醇中，在Eppendorf管中於 37°C孵育30分鐘。繼之在真空濃縮器(Speed Vac)中蒸發至乾燥。以88 μ 1 DMSO吸收殘 餘物，得到5mM大鼠A β (1-42)貯存懸浮液，可保存於_20°C。實施例2a)具有15kDa和20kDa分子量的Αβ (1-42)寡聚體[Αβ (1-42)寡聚體Α]的制 備；使用SDS將690 μ 1 PBS 緩衝液(20mM 磷酸鈉，140mM NaCl，pH7. 4)添加到 60 μ 1 實施例 Ia 的貯存溶液中，以75μ 1 2%強度的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液調節該混合物至SDS含量為 0.2%。繼之為在37°C、5小時的孵育，以及於IOOOOgUO分鐘的離心。該Αβ(1_42)寡聚 體A製品(約400 μ MA β (1-42))可以保存於_20°C。b)具有15kDa和20kDa分子量的大鼠A β (1-42)寡聚體[大鼠A β (1-42)寡聚體 Α]的製備；使用SDS將690 μ 1 PBS 緩衝液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl，pH 7.4)添加到 60 μ 1 實施例 lb 的貯存溶液中，以75μ 1 2%強度的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液調節該混合物至SDS含量為0.2%。繼之為在37°C、5小時的孵育，以及於IOOOOgUO分鐘的離心。該大鼠Αβ (1-42) 寡聚體A製品(約400 μ M大鼠A β (1-42))可以保存於_20°C。c)具有15kDa和20kDa分子量的Αβ (1-42)寡聚體[Αβ (1-42)寡聚體Α]的制 備；使用月桂酸將690 μ 1 PBS 緩衝液(20mM 磷酸鈉，140mM NaCl，pH7. 4)添加到 60 μ 1 實施例 Ia 的貯存溶液中，以75μ1 5%強度的月桂酸溶液調節該混合物至月桂酸含量為0.5%。繼之 為在37°C、5小時的孵育，以及於IOOOOgUO分鐘的離心。該Αβ (1-42)寡聚體A製品(約 400μΜ Αβ (1-42))可以保存於 _20°C。d)具有15kDa和20kDa分子量的Αβ (1-42)寡聚體[Αβ (1-42)寡聚體Α]的制 備；使用油酸將690 μ 1 PBS 緩衝液(20mM 磷酸鈉，140mM NaCl，ρΗ7· 4)添加到 60 μ 1 實施例 Ia的貯存溶液中，以75 μ 1 5%強度的油酸溶液調節該混合物至油酸含量為0.5%。繼之 為在37°C、5小時的孵育，以及於IOOOOgUO分鐘的離心。該Αβ (1-42)寡聚體A製品(約 400μΜ Αβ (1-42))可以保存於 _20°C。e)具有15kDa和20kDa分子量的Αβ (1-42)寡聚體[Αβ (1-42)寡聚體Α]的制 備；使用十二烷醯肌氨酸將690 μ 1 PBS 緩衝液(20mM 磷酸鈉，140mM NaCl，ρΗ7· 4)添加到 60 μ 1 實施例 Ia的貯存溶液中，以75μ 1 5%強度的十二烷醯肌氨酸溶液調節該混合物至油酸含量為 0.5%。繼之為在37°C、5小時的孵育，以及於IOOOOgUO分鐘的離心。該Αβ(1_42)寡聚 體A製品(約400 μ M Αβ (1-42))可以保存於_20°C。實施例3a)製備具有15kDa和20kDa分子量的A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體Α]的 備選方法在220 μ 1 IOmM水HCl溶液中吸收Img人類β澱粉樣(1-42)蛋白質(簡稱 A β (1-42)；肽合成材料、凍乾物，來自Bachem，德國)，並於室溫孵育10分鐘。通過於 IOOOOg離心5分鐘去除不溶性成分。上清液(ImMA β (1-42))含有A β (1-42)蛋白質，並如 下進行進一步加工將9 μ 1 PBS緩衝液和1 μ 1 2%強度的SDS溶液添加至1 μ 1上清液中，混合物於 37°C孵育16h。ΙιΑβ (1-42)寡聚體A製品(ΙΟΟμΜ)可以保存於_20°C。b)製備具有15kDa和20kDa分子量的大鼠A β (1-42)寡聚體[大鼠A β (1-42)寡 聚體Α]的備選方法在IOmM水HCl溶液220 μ 1中吸收Img大鼠β澱粉樣(1-42)蛋白質(簡稱大 鼠Αβ (1-42)；肽合成材料、凍乾物，來自Bachem，德國)，並於室溫孵育10分鐘。通過於 IOOOOg離心5分鐘去除不溶性成分。上清液(ImM大鼠Αβ (1-42))含有大鼠Αβ (1-42)蛋 白質，並如下進行進一步加工將9 μ 1 PBS緩衝液和1 μ 1 2%強度的SDS溶液添加至1 μ 1上清液中，混合物於 37°C孵育16h。大鼠Αβ (1-42)寡聚體A製品(ΙΟΟμΜ)可以保存於_20°C。實施例4a)製備具有15kDa和20kDa分子量的A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體Α]的備選方法將Img人類β澱粉樣(1-42)蛋白質(簡稱Αβ (1-42)；肽合成材料、凍乾物，來 自 Bachem，德國)溶解於 44 μ 1 1% SDS/H20 中(5mMA β (1-42))。將 5 μ 1 該溶液與 40 μ 1 PBS及5 μ 1 2% SDS混和，於37°C孵育16h。通過於IOOOOg離心5分鐘去除不溶性成分。 由此獲得的A β (1-42)寡聚體A製品(500 μ M A β (1-42))可以保存於_20°C。b)製備具有15kDa和20kDa分子量的大鼠A β (1-42)寡聚體[大鼠A β (1-42)寡 聚體Α]的備選方法將Img大鼠β澱粉樣(1-42)蛋白質(簡稱大鼠Αβ (1-42)；肽合成材料、凍幹 物，來自Bachem，德國)溶解於44 μ 1 1% SDS/H20中(5mM大鼠A β (1-42))。將5 μ 1該溶 液與40 μ 1 PBS及5 μ 1 2% SDS混和，於37°C孵育16h。通過於IOOOOg離心5分鐘去除不 溶性成分。由此獲得的大鼠Αβ (1-42)寡聚體A製品(500 μ M大鼠Αβ (1-42))可以保存 於-20"C。實施例5a)具有38kDa和48kDa分子量的A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體B]的製備將根據實施例2a獲得的A β (1-42)寡聚體A溶液以2. 475ml水稀釋(0. 05% SDS 含量，0. ImM Aβ (1-42))，於37°C孵育20小時。該Αβ (1-42)寡聚體B製品的等分試樣可 以於-80°C冷凍並保存用於進一步研究。b)具有381^￡1和481^￡1分子量的大鼠4 0 (1-42)寡聚體[大鼠A β (1-42)寡聚體 B]的製備將根據實施例2a獲得的大鼠A β (1_42)寡聚體A溶液以2. 475ml水稀釋(0. 05% SDS含量，0. ImM大鼠Aβ (1-42))，於37°C孵育20小時。該大鼠Aβ (1-42)寡聚體B製品 的等分試樣可以於-80°C冷凍並保存用於進一步研究。c)具有381^^和481^^分子量的八3 (1-42)寡聚體[Αβ (1-42)寡聚體B]的備選 製備將根據實施例2c獲得的A β (1-42)寡聚體A溶液以2. 475ml水稀釋(0. 125%月 桂酸含量，0. ImM Aβ (1-42))，於37°C孵育20小時。該Αβ (1-42)寡聚體B製品的等分試 樣可以於-80°C冷凍並保存用於進一步研究。d)具有38kDa和48kDa分子量的A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體Bl的備選 製備將根據實施例2d獲得的A β (1-42)寡聚體A溶液以2. 475ml水稀釋(0. 125%油 酸含量，0. ImM Aβ (1-42))，於37°C孵育20小時。該Αβ (1-42)寡聚體B製品的等分試樣 可以於-80°C冷凍並保存用於進一步研究。e)具有38kDa和48kDa分子量的A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體B]的備選 製備將根據實施例2e獲得的A β (1_42)寡聚體A溶液以2. 475ml水稀釋(0. 125%十二 烷醯肌氨酸含量，0. ImMAβ (1-42))，於37°C孵育20小時。該Αβ (1-42)寡聚體B製品的等 分試樣可以於-80°C冷凍並保存用於進一步研究。f)具有38kDa和48kDa分子量的無SDS A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體Bl 的製備
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將根據實施例6b獲得的A β (1-42)寡聚體B製品10 μ 1與4% /33% /63%比例 的乙酸/甲醇/水混合物250 μ 1混和，在冰上於0°C孵育30分鐘。離心(10000g，10分鐘) 後，去除上清液，將沉澱的蛋白質以200μ 1緩衝液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl,pH7. 4)吸收。 以此方法獲得的製品含有無SDS形式的溶解的A β (1-42)寡聚體B，可保存於-20°C。實施例6a)具有38kDa和48kDa分子量的A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體B]的透析 和濃縮將根據實施例5a製備的A β (1-42)寡聚體B與30ml含有Pluronie F68 (BASF) 的PBS混和，並於Amicon Centriprep YM，30KD中濃縮至3ml。通過離心(10000g，5分鐘) 去除可能存在的殘餘物。取出上清液。該Αβ (1-42)寡聚體B製品的等分試樣可以於-80°C 冷凍並保存用於進一步研究。b)具有38kDa和48kDa分子量的A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體B]濃縮物 的製備將根據實施例5a製備的Αβ (1-42)寡聚體B 72. 6ml經30KDCentripr印YM Tube(Amicon)濃縮為2ml。於IOOOOg離心10分鐘去除濃縮物。取出上清液，並於6°C在透 析管中對11緩衝液(5mM磷酸鈉，35mM氯化鈉，ρΗ7· 4)透析16h。於IOOOOg離心10分鐘 去除透析物。取出上清液並於-80°C保存用於進一步研究。實施例7生物素-A β (1-42)貯存懸浮液的製備將0.5mg生物素-β-澱粉樣(1_42)蛋白質(簡稱生物素_Αβ (1-42)；肽合成 材料、凍乾物，AnaSpec)溶解於200 μ 1 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，在Eppendorf管中 於37°C孵育30分鐘。繼之在真空濃縮器(Speed Vac)中蒸發至乾燥。以20. 5 μ 1 DMSO吸 收殘餘物，得到5mM生物素A β (1-42)貯存懸浮液，可保存於_20°C。實施例8具有17kDa和22kDa分子量的生物素_Α β (1-42)寡聚體[生物素-A β (1-42)寡 聚體Α]的製備將2 μ 1實施例7的貯存懸浮液與23 μ 1 PBS緩衝液(20mM磷酸鈉，140mM NaCI， PH7. 4)混和，以2. 4 μ 1 2%強度的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液調節至SDS含量為0. 2%。 繼之為於37°C孵育6小時。通過於10000g、5分鐘的離心去除不可溶成分。以此方法獲得 的生物素-Αβ (1-42)寡聚體A製品可以保存於-20°C。實施例9具有42kDa和52kDa分子量的生物素_Α β (1-42)寡聚體[生物素-A β (1-42)寡 聚體B]的製備以82 μ 1水稀釋(含0. 05 % SDS 0. ImM A β )根據實施例8獲得的生物 素-Αβ (1-42)寡聚體Α，於37°C孵育16小時。通過於10000g、5分鐘的離心去除不可溶成 分。生物素_Αβ (1-42)寡聚體B製品可以於-20°C冷凍並保存用於進一步研究(圖3)。實施例10螢光素-A β (1-42)貯存懸浮液的製備將0.5mg螢光素-β-澱粉樣(1-42)蛋白質(簡稱螢光素_Αβ (1-42)；肽合成材料、凍乾物，AnaSpec)溶解於200 μ 1 1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇中，在Eppendorf管中 於37°C孵育30分鐘。繼之在真空濃縮器(Speed Vac)中蒸發至乾燥。以20. 5 μ 1 DMSO吸 收殘餘物，產生5mM螢光素A β (1-42)貯存懸浮液，可保存於_20°C。實施例11具有17kDa和22kDa分子量的螢光素_Α β (1-42)寡聚體[螢光素-A β (1-42)寡 聚體Α]的製備將2 μ 1實施例10的貯存懸浮液與23 μ 1 PBS緩衝液(20mM磷酸鈉，140mM NaCI， PH7. 4)混和，以2. 4μ 1 2%強度的十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液調節至SDS含量為0. 2%. 繼之為於37°C孵育6小時。通過於10000g、5分鐘的離心去除不可溶成分。以此方法獲得 的螢光素-Αβ (1-42)寡聚體A製品可以保存於-20°C。實施例12具有42kDa和52kDa分子量的螢光素_Α β (1-42)寡聚體[螢光素-A β (1-42)寡 聚體B]的製備以82μ1水稀釋(0.05% SDS含量，0. ImM Αβ)根據實施例11獲得的螢光 素-Αβ (1-42)寡聚體Α，於37°C孵育16小時。螢光素_Αβ (1-42)寡聚體B製品可以 於-80°C冷凍並保存用於進一步研究(圖4)。實施例13實施例2a的A β (1-42)寡聚體A的交聯[Α β (1-42)寡聚體A-CL]以7. 5 μ 1 PBS、0. 2% SDS將10 μ 1根據實施例2a製備的A β (1-42)寡聚體A稀 釋為100 μ M Αβ (1-42)含量。將1μ 1新制的IOmM戊二醛水溶液添加至該溶液中，繼之於 室溫攪拌3h。向樣品中添加1 μ 1 IOOmM的氨基乙醇水溶液(ρΗ 7. 4)並攪拌lh，以飽和過 量的戊二醛。以此方法獲得的製品含有交聯Αβ (1-42)寡聚體Α，將其稱為Αβ (1-42)寡聚 體A-CL製品。實施例14a)實施例5a的A β (1-42)寡聚體B的交聯[Α β (1-42)寡聚體B-CL]將10 μ 1根據實施例5a製備的A β (1-42)寡聚體B與1 μ 1新制的IOmM戊二醛 水溶液混和，並於室溫攪拌3h。向樣品中添加1 μ IlOOmM的氨基乙醇水溶液(ρΗ7. 4)並攪 拌lh，以飽和過量的戊二醛。以此方法獲得的製品含有交聯Αβ (1-42)寡聚體B，將其稱為 A β (1-42)寡聚體B-CL製品。 交聯^ (1-42)寡聚體[Αβ (1-42)寡聚體B_CL]的備選方案將72. 6ml根據實施例5a製備的A β (1-42)寡聚體B與7. 26ml新制的IOmM戊二 醛水溶液混和，並於室溫攪拌2h。向樣品中添加726 μ 1緩衝液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl, 500mM氨基乙醇，ρΗ 74溶液(ρΗ 7.4)並攪拌30分鐘，以飽和過量的戊二醛。通過15ml 30kDa Centriprep管將反應混合物濃縮至3ml。經10000g、10分鐘的離心去除濃縮物。去除 上清液，並在透析管中與6°C對IL 5mM磷酸鈉、35mM NaCl，pH7. 4透析16h。隨後經10000、 10分鐘的離心去除透析物，取出上清液並可於-80°C保存以進一步研究。以此方法獲得的 製品含有交聯的A β (1-42)寡聚體B，將其稱為A β (1-42)寡聚體B-CL製品。實施例15a)以嗜熱菌蛋白酶切割，從Αβ (1-42)寡聚體B製備截短的Αβ (20-42)寡聚體
將1. 59ml根據實施例6b製備的Aβ (1-42)寡聚體B製品與38ml緩衝液(50mM MES/NaOH,pH 7. 4)及lmg/ml的嗜熱菌蛋白酶水溶液(Roche) 200 μ 1混和。將反應混合物 於室溫攪拌20h。然後加入80μ1 IOOmM EDTA水溶液(ρΗ7. 4)，另外以400 μ 11 %強度的 SDS溶液將混合物調節至SDS含量為0. 01 %。以15ml 30kDa Centriprep管將反應混合物 濃縮至約lml。將濃縮物與9ml緩衝液(50mM MES/NaOH, 0. 02% SDS, ρΗ7· 4)混和，再次濃 縮至lml。將濃縮物在透析管中於6°C對IL緩衝液(5mM磷酸鈉，35mM NaCl)透析16h。以 2%強度的SDS水溶液將透析物調節至SDS含量為0. 1%。通過於IOOOOgUO分鐘的離心取 出樣品，並去除上清液。進一步分析由此得到的材料(SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳；見圖11)；對產生的截短 的寡聚體的質譜分析顯示，該寡聚體由截短的Αβ (20-42)組成。b)以蛋白質內切酶GluC切割，從Αβ (1-42)寡聚體B製備截短的Aβ (12-42)寡 聚體將2ml根據實施例6b製備的A β (1-42)寡聚體B製品與38ml緩衝液(5mM磷 酸鈉，35mM氯化鈉，ρΗ7· 4)及lmg/ml的GluC蛋白質內切酶水溶液(Roche) 150 μ 1混和。 將反應混合物於室溫攪拌6h，隨後加入另外150 μ 1 lmg/ml的GluC蛋白質內切酶水溶液 (Roche)。將反應混合物於室溫攪拌另外16h，繼之以添加8μ 1 5Μ DIFP溶液。以15ml 30kDaCentriprep管將反應混合物濃縮至約lml。將濃縮物與9ml緩衝液(5mM磷酸鈉， 0. 02% SDS, pH7. 4)混和，再次濃縮至lml。將濃縮物在透析管中於6°C對IL緩衝液(5mM 磷酸鈉，35mM NaCl)透析16h。以1 %強度的SDS水溶液將透析物調節至SDS含量為0. 1%0 通過於IOOOOgUO分鐘的離心取出樣品，並去除上清液。進一步分析由此得到的材料(SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳；見圖11)；對產生的截短 的寡聚體的質譜分析顯示，該寡聚體由截短的Aβ (12-42)組成。A β (1-42)寡聚體的特徵實施例16SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)在變性條件下，根據標準條件在4-20%強度的Tri S-甘氨酸SDS PAGE中分析實施 例2a、5a、9、12、13和14a的製品，所有這些製品含有寡聚體A和B，從而表徵變性條件下的
分子量。上述SDS PAGE的評價(圖1)揭示，起始蛋白質A β (1-42)依然以約4kDa的條帶 存在於寡聚體A製品中，而實施例2a的寡聚體Al和A2(在圖1中分別表示為1和2)在約 15kDa(較弱條帶)和在約20kDa(主要條帶)處可見。在寡聚體B製品中，可以檢測到相對較少的起始蛋白質A β (1-42)(在約4kDa處 的相對弱條帶)。相反，實施例5a的寡聚體Bl和B2 (在圖1中分別表示為3和4)出現在 約38kDa和約48kDa(見箭頭)。對於實施例9和12的生物素和螢光素衍生的寡聚體B，出 現約42kDa和約52kDa的相應較高的分子量(圖3、4)。分別含有交聯產物A-CL和B-CL的製品(實施例13和14a ；圖2)的分析顯示，兩 個樣品基本保持其寡聚化程度(見條帶A與條帶A'，以及條帶B與B')。與寡聚體A和 B相比略微不同的遷移行為可以由輕微改變的SDS結合能力和N末端氨基基團和賴氨酸殘 基各自的修飾解釋。
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截短的Αβ (20-42)寡聚體(實施例15a)的分析顯示，以嗜熱菌蛋白酶蛋白酶水 解去除N末端肽，使38/48kDa雙條帶(圖11，泳道A)轉變為28/38kDa雙條帶(圖11，泳 道B)。相似地，截短的A β (12-42)寡聚體(實施例15a)的分析顯示，以Glu-C蛋白質內切 酶蛋白酶水解去除N末端肽，使38/48kDa雙條帶(圖11，泳道A)轉變為33/40kDa雙條帶 (圖11，泳道C)。實施例17凝膠滲透層析為了更詳細地研究非變性條件下的分子量行為，使用Superose 12HR10/30柱，以 FPLC流程方法實施凝膠滲透層析(GPC)。在4°C進行GPC。將柱子以5個體積的PBS緩衝液(流速0. 5ml/min,UV檢測，214nm)平衡，並首先 使用蛋白質標準標定。隨後，分析實施例5a的Αβ (1-42)寡聚體B製品(圖5，底部)以及 用於比較的相同濃度的Αβ (1-42)凍乾物，其中Αβ (1-42)凍乾物新鮮稱量，溶於PBS，於 10000g、5分鐘的離心去除不溶性成分後進行分析(圖5，上部)。評價顯示，Αβ (1-42)寡聚體B製品具有蛋白質級份，該蛋白質級份以在約50kDa 上下的分子量範圍內的主峰為特徵。而在變性條件下的SDSPAGE中，該蛋白質級份略有別 於單體Αβ (1-42)蛋白質，其中單體Αβ (1-42)蛋白質以約16kDa上下的分子量範圍內的 主峰為特徵。為了研究實施例6b的Αβ (1-42)寡聚體B和實施例14a的Αβ (1-42)寡聚體B_CL 在非變性條件下的分子量行為，使用Superose 12HR10/30柱，以FPLC流程方法於室溫實施 凝膠滲透層析(GPC)。將柱子以5個體積的PBS緩衝液(流速0. 5ml/min,UV檢測，214nm) 平衡，並首先使用蛋白質標準標定。隨後，以PBS緩衝液將實施例6b的Αβ (1-42)寡聚體 B稀釋為lmg/ml,以PBS緩衝液將實施例14a的A β (1-42)寡聚體B-CL稀釋為lmg/ml，分 析兩個混合物(圖12)。評價顯示，SDS含量降低的A β (1-42)寡聚體B製品具有蛋白質級份，該蛋白質級 份以在約IOOkDa上下的分子量範圍內的主峰為特徵。與此相比，具有降低的SDS含量的 Αβ (1-42)寡聚體B-CL製品具有蛋白質級份，該蛋白質級份以約60kDa上下的分子量範圍 內的主峰為特徵。實施例18實施例5a的A β (1_42)寡聚體B的天然聚丙烯醯胺凝膠電泳(NATIVEPAGE)在非變性條件下，在4-20%強度的Tris-甘氨酸中分析實施例5a含有寡聚體B的 製品，從而表徵天然條件下的分子量。以非離子去垢劑Triton X-100中和製品中存在的去垢劑。為此目的，將1 μ 1 (4% Triton X-100)移取到10 μ 1實施例5a的製品中，並於室溫孵育5分鐘。隨後，取10 μ 1與 相同體積的天然樣品緩衝液(4ml IM Tris, pH 6. 8,8ml甘油、Iml溴酚藍於50ml H2O中) 混和並電泳(運行緩衝液7. 5g Tris、36g甘氨酸於2. 5L H2O中)。天然PAGE的評價顯示，起始蛋白質A β (1-42)依然以約28kDa的條帶(泳道A，表 示為1)存在於寡聚體B製品中，而實施例5a製品的主要條帶在表觀分子量64-90kDa處可 見(泳道A，表示為2)(圖6)。重要的是，還可以天然分子量分析方法，例如凝膠滲透層析(見實施例17)或天然
36凝膠電泳(見實施例18)，為本發明的寡聚體(特別是寡聚體B)指定分子量。混和SDS之後，可以在SDS PAGE中指定約38和48kDa分子量的寡聚體B，在天然 凝膠中，基於選擇的標準蛋白質，其被檢測為約64-90kDa分子量範圍內的條帶。由於寡聚 體的遷移行為除了其大小之外，基本尤其電荷本質決定，不能期望該方法提供分子量的精 確讀數。然而，該結果導致確定的寡聚體種類存在的結論。實施例19a)在生理緩衝液中，Αβ (1-42)寡聚體B於多種蛋白質濃度的穩定性在下列條件下，於PBS緩衝液中測試根據實施例6b獲得的A β (1-42)寡聚體B的
穩定性。用PBS以2 X稀釋步驟將5mg/ml稀釋至0. 08mg/ml。於室溫將所有獲得的溶液孵 育24小時。繼之與冷凍的對照製品比較，分析SDS PAGE中的條帶模式。在所有樣品中，條
帶模式一致。b)在生理緩衝液中，Αβ (1-42)寡聚體B於多種溫度並在不同時期後的穩定性以PBS緩衝液將根據實施例6b獲得的A β (1_42)寡聚體B稀釋至0. 5mg/ml，並於 室溫或於37°C孵育24h或96h。隨後，在SDS PAGE中分析條帶模式。在所有樣品中，條帶模式一致。實施例20用多種蛋白酶(胰蛋白酶、糜蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶)酶 解Αβ (1-42)寡聚體B以緩衝液(20mM磷酸鈉，140mM NaCl, pH7. 4)將根據實施例6b獲得的A β (1-42) 寡聚體B製品的等分試樣稀釋至0. 5mg/ml,並在下列條件下於37°C和pH 7. 4與佔圖9 所示各種蛋白酶溶液重量1/50的蛋白酶溶液孵育20h，蛋白酶溶液如圖9所示。任何在 SDS-PAGE中分析1 μ 1反應混合物。SDS PAGE顯示，在選擇的限制性蛋白質水解條件下，從Αβ (1-42)寡聚體B製品開 始，所有蛋白酶將約為38/48kDa的雙帶恢復為約32/28kDa的雙帶。實施例21Αβ (1-42)寡聚體B在大鼠血漿中的穩定性將4 μ 1根據實施例6b製備的A β (1-42)寡聚體B製品76 μ 1大鼠血漿於室溫孵 育0h、lh、2h、4h和8h。在乾冰中冷凍終止孵育。隨後，添加SDS樣品緩衝液後，將所有樣品在SDS PAGE中分析。繼之通過在蛋白 質印跡中對Αβ (1-42)寡聚體B染色進行穩定性評價。抗Αβ (1-42)抗體6Ε IO(Signet) 用於檢測。通過與鹼性磷酸酶偶聯的抗小鼠IgG抗體並添加底物NBT/BCIP使條帶顯影。所 觀察條帶的分子量和強度經2h、4h和8h時期幾乎保持不變。結果提示，Αβ (1-42)寡聚體B具有高的血漿穩定性。據此，血漿中的生物半衰期 在約8小時和更長的範圍內。實施例22分別具有分子量17kDa和22kDa[生物素_Αβ (1-42)寡聚體Α]以及42kDa和 52kDa[生物素-Αβ (1-42)寡聚體B]的生物素_Αβ (1-42)寡聚體對人類神經細胞表面的
糹 口 I=I
通過FACScan(Beckton Dickinson)研究人類β -澱粉樣(1-42)蛋白質和兩種 Aβ (1-42)寡聚體A和Αβ (1-42)寡聚體B對人類成神經細胞瘤細胞系IMR-32 (ATCC編號 CCL-127)的結合。將IMR-32細胞懸浮液(1. 5 X IO6細胞/0. Iml PBS)與生物素標記的人類 β澱粉樣(1-42)蛋白質(肽合成材料，凍乾物，AnaSpec)以及含有生物素標記的寡聚體A 和B的製品(分別為實施例8和9)與37°C孵育20分鐘。隨後以緩衝液(PBS加BSA) 清洗細胞，並與偶聯到鏈黴親和素異硫氰酸酯上的螢光素(Sigma)於室溫孵育20分鐘。在 使用緩衝液的清洗步驟之後，通過FACScan分析對IMR-32細胞表面的結合。虛線表示不存 在生物素標記的組分時的背景螢光。個別製品的添加導致細胞相關螢光的強烈增加並以實 線表示。寡聚體A(圖7B)和B (圖7C)對細胞表面的結合與單體澱粉樣(1-42)蛋白 質的結合(圖7Α)截然不同。數據表示所述寡聚體對人類細胞表面的特定結合位點。實施例23腦室內(icv)給藥後，在大鼠腦勻漿物中檢測Αβ (1-42)寡聚體B以腦室內快速給藥施用IOnmol根據實施例6b獲得的A β (1-42)寡聚體B 10。分 別在15和120分鐘後製備腦。同樣製備未處理的對照動物的腦。為了這個目的，各例中，將 Ig大鼠腦與9ml破碎緩衝液A (200ml 5mM磷酸鈉，35mM NaCl，300mM蔗糖，調節至pH 7.4，
並與4片來自Roche的Complete 蛋白酶抑制品混合物混和)在50ml Falcon管中混 和，並在冰上以超聲破碎2分鐘。靜置溶液20分鐘，然後簡短震蕩，並分裝為8X Iml的等 分試樣(=勻漿物)。為了實施定量檢測，首先在PBS中製備一系列標準Αβ (1-42)寡聚體B製品，製品 濃度在 1. 58ng/ μ 1-0. 005ng/ μ 1 範圍內。另外，作為陽性對照，也處理未處理大鼠對照腦的勻漿物，並以相同的方法在此腦 勻漿物中製備一系列標準Αβ (1-42)寡聚體B。然後將勻漿物進行IOOOOOgUh的超離心， 上清液用於隨後的分析。根據對兩個系列的標準物(PBS與對照腦勻漿物上清液)測量的值的比較，可以如 下定量確定Αβ (1-42)寡聚體B的含量，首先在陽性對照中比較，然後也與經處理的大鼠的 腦樣品中比較。1)斑點印跡檢測將1 μ 1標準樣品系列和經處理動物的樣品提取物液滴加於硝化纖維紙上，使用 抗體6Ε10 (抗Αβ (1-42) ；Signet)檢測Αβ (1-42) 0使用偶聯到抗小鼠IgG上的鹼性磷酸 酶並添加染色試劑NBT/BCIP進行染色。儘管在未處理大鼠的腦提取物中沒有可檢測的A β (1-42) (0. 01nmol/g)，通 過與相應濃度的陽性對照比較染色強度，在處理後15分鐘處死的大鼠中可以檢測到約 0. 4nmol/g A β (1-42)，以相同的方法，在處理後120分鐘處死的大鼠中仍然可以檢測到約 0. 2nmol/go由此得到外源性給藥的A β (1-42)寡聚體B約105分鐘的平均生物半衰期。2)蛋白質印跡檢測所有斑點印跡分析的樣品液同樣以蛋白質印跡分析。蛋白質印跡也以mMAb 6E10(抗Αβ (1-42) ；Signet)、並另外以偶聯到抗小鼠IgG上的鹼性磷酸酶和添加染色試劑 NBT/BCIP 顯色。抗Αβ (1-42)反應性條帶僅僅出現在38/48kDa區域，相當於Aβ (1-42)寡聚體B
38的表觀分子量，即，即使給藥2小時後，寡聚體結構仍然在體內保持。另外，通過與陽性對照中相應於Αβ (1-42)寡聚體B的強染色條帶的比較染色強 度，在15分鐘大鼠(0. 4nmol/g)和120分鐘大鼠(0. 2nmol/g)的腦中，可以評估出與點印 跡方法中相同的濃度。實施例24具有38kDa和48kDa分子量的A β (1-42)寡聚體[Α β (1-42)寡聚體B]對鼠皮質 神經元的神經毒性作用按照文獻製備鼠皮質神經元並與神經膠質細胞以混和培養物培養(Choi等， (1987) J. Neurosci. 7, 357-368) 從腦膜和下腦區(lower brainregion)用器械取下發育 第14-15天胚胎的皮質。在0.05%強度的胰蛋白酶溶液中於37°C孵育5-7分鐘，將細胞彼 此分離，隨後用開口減小的巴斯德吸管將上述溶液吹打數次。確定細胞數量後，於0. 5ml維 持培養基(含有0. 8mM穀氨醯胺、18mM葡萄糖、23mM NaHCO3和10%馬血清的基本必需培養 基)中以每2cm2430000個細胞將細胞接種於細胞培養材料上，細胞培養材料以多聚L鳥氨 酸和層黏連蛋白包被。在潮溼的細胞培養孵育器中於37°C、5% CO2中實施培養和後續的孵 育。培養3-5天後，使用(+)-5_氟-2'-脫氧尿苷/尿苷混合物(各ΙΟμΜ)培養1天，以 中斷神經膠質細胞的繁殖。培養14天後，研究Αβ (1-42)寡聚體B的毒性作用。為此目的， 將細胞在腦細胞緩衝液(120mM NaCl, 5. 4mM KCl, 1. 8mM CaCl2,15mM 葡萄糖，25mM HEPES, PH 7. 2)中孵育15分鐘。將對照細胞1與300 μ M L-穀氨醯胺在腦細胞緩衝液中孵育相 同時間。將Αβ寡聚體儲備液以無血清培養基(含有0.8mM穀氨醯胺、20mM葡萄糖、26mM NaHCO3)稀釋至多個終濃度，並孵育24小時。在無血清培養基中平行孵育以L穀氨醯胺處 理的對照細胞1。另一組細胞(對照細胞2)僅用腦細胞緩衝鹽和無血清培養基處理。24h 後去除細胞培養物上清液，殘餘細胞在蒸餾水中孵育20分鐘而被破壞，酶學測定兩種溶液 中的乳酸脫氫酶(LDH)活性。為了評價，測定細胞培養物上清液的LDH活性與上清液和殘 餘細胞的LDH活性總和的比，形成四重測定的平均值。實施3次實驗，每個實驗條件存在一 式四份(η = 12)。將穀氨醯胺處理的細胞(對照細胞1)平均值設定為100%神經元死亡， 將既沒有以L穀氨醯胺也沒有以A β寡聚體處理的細胞(對照細胞2)的平均值設定為0% 神經元死亡，將以Αβ寡聚體處理的細胞的值加以相應轉換。在各例所用的濃度下測定的 所有神經毒性平均值顯示，具有381^￡1和481^￡1分子量的4 3 (1-42)寡聚體[Αβ (1-42)寡 聚體B]截然不同的毒性作用，見圖8。實施例25抗體的產生用於免疫的混合物含有所有佐劑(Biogenes)，基本成分如下95% 石蠟油2. 4% 吐溫 400. 1% 膽固醇0. 1% 脂多糖將佐劑與抗原溶液以2 1比例混和直至獲得穩定乳劑。乳劑經注射並形成穩定 釋放抗原的儲庫。a)以實施例15a的截短的A β (20-42)寡聚體B免疫兔產生多克隆抗血清
39
根據標準程序，以實施例15a的未綴合的A β (20-42)寡聚體B製品免疫兩隻兔第1天初次免疫，並取免疫前血清第2天第一次加強第14天第二次加強第28天第三次加強並採血第35天取血將兔血於室溫放置，隨後於室溫離心，從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱 為血清(al)。在標準條件下，使用戊二醛將2mg實施例15a的A β (20-42)寡聚體B製品與LPH 偶聯，根據標準程序，以該綴合的A β (1-42)寡聚體B免疫另兩隻兔第1天初次免疫，並取免疫前血清第2天第一次加強第14天第二次加強第28天第三次加強並採血第35天取血將兔血於室溫放置，隨後於室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱 為血清(a2)。b)以實施例15b的截短的A β (12-42)寡聚體B免疫兔產生多克隆抗血清根據標準程序，以實施例15b的未綴合的A β (12-42)寡聚體B製品免疫兩隻兔第1天初次免疫，並取免疫前血清第2天第一次加強第14天第二次加強第28天第三次加強並採血第35天取血將兔血於室溫放置，隨後於室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱 為血清(bl)。在標準條件下，使用戊二醛將2mg實施例15b的A β (12-42)寡聚體B製品與LPH 偶聯，根據標準程序，以該綴合A β (12-42)寡聚體B免疫另兩隻兔第1天初次免疫，並取免疫前血清第2天第一次加強第14天第二次加強第28天第三次加強並採血第35天取血將兔血於室溫放置，隨後於室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱 為血清(b2)。c)以實施例14a的A β (20-42)寡聚體製品B-CL免疫兔產生多克隆抗血清根據標準程序，以實施例14a的未綴合的Αβ (1-42)寡聚體B-CL製品免疫兩隻 兔第1天初次免疫，並取免疫前血清
40
第2天第一次加強第14天第二次加強第28天第三次加強並採血第35天取血將兔血於室溫放置，隨後於室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱 為血清(Cl)。d)以實施例6b的Αβ (1-42)寡聚體製品B免疫兔產生多克隆抗血清根據標準程序，以實施例6b的未綴合的Αβ (1-42)寡聚體B製品免疫兩隻兔第1天初次免疫，並取免疫前血清第2天第一次加強第14天第二次加強第28天第三次加強並採血第35天取血將兔血於室溫放置，隨後於室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱 為血清(dl)。在標準條件下，使用戊二醛將2mg實施例6b的A β (1-42)寡聚體B製品與LPH偶 聯，根據標準程序，以該綴合A β (1-42)寡聚體B製品免疫另兩隻兔第1天初次免疫，並取免疫前血清第2天第一次加強第14天第二次加強第28天第三次加強並採血第35天取血將兔血於室溫放置，隨後於室溫離心從中獲得抗血清。將以此方式獲得的血清稱 為血清(d2)。實施例26實施例25的免疫多克隆血清關於與多種A β (1-42)形式交叉反應的特徵描述為了描述多克隆抗血清的特徵，在lOOpmol/μ l-O.Olpmol/μ 1範圍內，於PBS中 製備多種Αβ (1-42)形式的連續稀釋物。在各例中，將1 μ 1樣品加至硝化纖維膜使用實 施例25的適當的兔血清實施檢測。使用mMAb6E10(Signet)實施檢測以對比。偶聯到抗兔 IgG的鹼性磷酸酶(用於比較偶聯到抗小鼠IgG的鹼性磷酸酶)加染色試劑NBT/BCIP的 添加一起用於染色。圖10顯示以此方式獲得的斑點印跡，可以用數字評價如下
權利要求
製品，其包含寡聚澱粉樣β(1 42)蛋白或寡聚澱粉樣β(1 42)蛋白的標記、固定的衍生物和/或交聯的衍生物，其中所述寡聚澱粉樣β(1 42)蛋白在SDS凝膠電泳中具有約38KDa和/或48KDa的表觀分子量，所述製品中寡聚澱粉樣β(1 42)蛋白的比例為總澱粉樣β(1 42)蛋白的至少60％重量。
2.權利要求1的製品，其中所述製品中寡聚澱粉樣β(1-42)蛋白的比例為總澱粉樣 β (1-42)蛋白的至少75%重量或至少90%重量。
3.權利要求1或2的製品，其中所述寡聚澱粉樣β(1-42)蛋白或衍生物如下獲得將 單體澱粉樣β (1-42)蛋白或單體澱粉樣β (1-42)蛋白的標記的衍生物與去垢劑接觸，然 後降低去垢劑作用並繼續孵育，任選標記、固定和/或交聯得到的寡聚體或衍生物，且回收 包含所述寡聚澱粉樣β (1-42)蛋白或衍生物的製品。
4.製備寡聚澱粉樣β(1-42)蛋白、寡聚澱粉樣β (1-43)蛋白或寡聚澱粉樣β (1-44) 蛋白，或寡聚澱粉樣β (1-42)蛋白、寡聚澱粉樣β (1-43)蛋白或寡聚澱粉樣β (1-44) 蛋白的標記、固定的衍生物和/或交聯的衍生物的方法，所述方法包含將單體澱粉樣 β (1-42)蛋白、單體澱粉樣β (1-43)蛋白或單體澱粉樣β (1-44)蛋白，或單體澱粉樣 β (1-42)蛋白、單體澱粉樣β (1-43)蛋白或單體澱粉樣β (1-44)蛋白的標記的衍生物與 去垢劑接觸，然後降低去垢劑作用並繼續孵育，任選標記、固定和/或交聯得到的寡聚體或 衍生物，且回收所述寡聚體或衍生物。
5.權利要求4的方法，其中所述去垢劑為十二烷基硫酸鈉。
6.寡聚澱粉樣β(1-42)蛋白、寡聚澱粉樣β (1-43)蛋白或寡聚澱粉樣β (1-44)蛋 白，或寡聚澱粉樣β (1-42)蛋白、寡聚澱粉樣β (1-43)蛋白或寡聚澱粉樣β (1-44)蛋白 的標記、固定的衍生物和/或交聯的衍生物，其通過權利要求4或5的方法獲得。
7.諸如疫苗的藥物組合物，其包含權利要求1-5中任一項的製品，或權利要求6中的寡 聚體或衍生物，以及任選的可藥用載體。
8.權利要求1-6中任一項的製品、寡聚體或衍生物在製備用於體內或體外診斷性檢測 方法的組合物中的用途。
9.權利要求1-6中任一項的製品、寡聚體或衍生物在製備用於治療諸如阿爾茨海默病 的澱粉樣β相關的紊亂的疫苗中的用途。
10.表徵物質或物質混合物的體外方法，其包括i)提供所述物質或所述物質混合物；ii)將權利要求1-6中任一項的製品、寡聚體或衍生物與所述物質或物質混合物接觸；以及iii)測定所述物質或所述物質混合物的特定部分是否與所述製品、寡聚體或衍生物結I=I O
11.抗體或其抗原結合部分，其與權利要求1-6中任一項的寡聚體或衍生物特異性結I=I O
12.抗體或其抗原結合部分，其與權利要求1-6中任一項的寡聚體或衍生物以比單體 澱粉樣β (1-42)蛋白更高的親和力結合。
13.權利要求11或12的抗體或其抗原結合部分，其以高於Kd=10、的親和力、以高 於Kd = IO-9M的親和力、以高於Kd = IO-10M的親和力或以高於Kd = 10_"Μ的親和力與所述寡聚體或其衍生物結合。
14.權利要求11-13中任一項的抗體或其抗原結合部分，其以低於Kd= ICT8M的親和力 與單體澱粉樣β (1-42)蛋白和/或單體澱粉樣β (1-40)蛋白結合。
15.權利要求11-14中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體對所述寡聚體 或其衍生物的親和力比對單體澱粉樣β (1-42)蛋白和/或單體澱粉樣β (1-40)蛋白的親 和力高出至少10倍、比對單體澱粉樣β (1-42)蛋白和/或單體澱粉樣β (1-40)蛋白的親 和力高出至少100倍，或比對單體澱粉樣β (1-42)蛋白和/或單體澱粉樣β (1-40)蛋白 的親和力高出至少1000倍。
16.權利要求11-15中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體是多克隆抗體 或單克隆抗體。
17.權利要求11-16中任一項的抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體基本為人類抗 體、嵌合抗體或CDR移植物抗體。
18.藥物組合物，其包含權利要求11-17中任一項的抗體或其抗原結合部分，以及任選 的可藥用載體。
19.權利要求11-17中任一項的抗體或其抗原結合部分在製備用於治療諸如阿爾茨海 默病的澱粉樣β相關的紊亂的藥物中的用途。
20.權利要求11-17中任一項的抗體或其抗原結合部分在製備用於診斷諸如阿爾茨海 默病的澱粉樣β相關的紊亂的組合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及澱粉樣β(1-42)蛋白神經調節的寡聚體、具體的生產方法(通過此方法能夠以可重複方式高得率獲得該寡聚體)、該寡聚體作為診斷性和治療性試劑在寡聚體特異性抗體的產生中及發現及形成可與該寡聚體相互作用的物質中的用途。正如抗體本身和抗體或物質作為診斷或治療劑的用途，也公開了產生抗體和發現物質的相應方法。本發明還涉及該寡聚體的衍生物以及基於澱粉樣β(1-42)蛋白的簡短形式的寡聚體、其產生和用途。
文檔編號A61K38/17GK101985036SQ20101000332
公開日2011年3月16日 申請日期2004年2月2日 優先權日2003年1月31日
發明者A·施特賓格, A·默勒, C·克蘭茨, H·希倫, R·米勒 申請人:阿伯特有限及兩合公司