廣東蟲草菌絲體的生產方法
2023-12-08 18:20:31 1
專利名稱：廣東蟲草菌絲體的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種蟲草菌絲體的生產方法，具體來說涉及一種廣東蟲草(Cw辦ce/w gwa"gctowgeww^ T.H. Li, Q.Y. Lin & B. Song)菌絲體的生產方法。
背景技術：
蟲草屬(Cor辦ce;w)在分類上隸屬於真菌界Fungi，子囊菌門(Ascomycota)，肉座菌目 (Hypocreales)，麥角菌科(Clavicipitaceae)，是目前最值得研究的真菌類群之一。中醫認為，藥 食同源，因此，不少蟲草種類具有極高的食藥用價值，尤以冬蟲夏草(Co^^戸w'"e"^Sacc.) 最為著名。現代科學研究表明，蛹蟲草(又稱北蟲草)(C.脂7/toni(L. :Fr.)Link.)、古尼蟲草 (C.g""m'Z(Berk.)Berk.)等都具有與冬蟲夏草相類似的作用，部分種類的活性成份甚至比冬 蟲夏草還要高。
蟲草中的有效成分例如蟲草素、蟲草酸、腺苷等均具有抗菌、抗腫瘤、抗氧化、滋陰壯 陽、保肝益肺和提高免疫力等功效，另外蟲草子實體中還含有多種對人體有益的營養成分。 隨著人們生活水平的提高和對健康食品需求的增加，冬蟲夏草日益受到人們的喜愛，但至今 為止，冬蟲夏草還未能規模化地人工栽培，而不斷增加的需求和高昂的價格導致人們對野生 冬蟲夏草的過度採集，使其野生資源日益稀缺。因此，開展高活性蟲草種類的人工生產研究， 不但可以有效地緩解緊張的供需關係，而且對提高我國人民的健康和生活水平有著重要的意 義。
廣東蟲草(CoW戸/w gMa"g^owge腦S T.H. Ii, Q.Y. Lin & B. Song，艮卩Co喊ceps7，w'ca f. gwfl"gJowgew^ T.H. Li, Q.Y. Lin et B. Song， GDIM—C050423 )是在廣東地區發現的一個蟲草 新種(見文獻Lin Q Y， Li T H, Song B. Mycotaxon， 2008， 103: 371 - 376.)。經分析， 這種蟲草具有高活性成分，其子實體的腺苷含量達O. 81mg/g，蟲草酸含量達392 mg/g，明顯 高於冬蟲夏草的含量(腺苷0.27mg/g，蟲草酸130mg/g)，而且氣味芳香，味道甘甜無毒。因 此廣東蟲草具有一定的市場潛力，作為冬蟲夏草的替代品進行產業化研究不僅是可行的，而 且具有較大的經濟價值和一定的科學意義。
發明內容
本發明的目的在於開發出廣東蟲草菌絲體的生產方法。
我們通過將廣東蟲草(即日本蟲草廣東變型Cw辦ce;w /fl/wm.ca f.gwa"gcfo"ge"wyr.H. Li， Q.Y. Lin et B. Song, GDIM_C050423 CCTCC No. M206051)母種在PDA培養基=〉液體培養基 培養=〉發酵生產液體培養基或大米培養基中培養，得到了廣東蟲草菌絲體，從而實現了本發明的目的。
本發明的廣東蟲草菌絲體的生產方法，其特徵包括以下的步驟-
(1) 將曰本蟲草廣東變型(CW戸/w勿om'ca f.gwa"gifowg冊zVLH. Li， Q.Y. Lin et B. Song) GDIM—C050423 CCTCC No. M206051接種到PDA培養基上，18 26°C下進行暗培養， 使菌落直徑長至4 6cm，得到斜面菌種；
(2) 將步驟(l)得到斜面菌種接種至一級液體培養基，每100mL接入5 15塊斜面菌種， 20 28°C下振蕩培養，至菌絲球充滿全部培養基，得到一級液體菌種，所述的一級液體培養 基pH6.0 6.5，每1000mL培養基中含有葡萄糖10 15g，蛋白腖3 10g，麥芽提取粉3 6g， 酵母浸膏3 6g，其餘為水；
(3) 將步驟(2)得到的一級液體菌種再次接種到二級液體培養基進行培養，直至菌絲球充 滿全部培養基，得到二級液體菌種，所述的二級液體培養基配方同步驟(2)所述一級液體培養 基；
(4) 將步驟(3)得到的二級液體菌種接種到生產用的液體培養基發酵培養或將二級液體 菌種用無菌水稀釋後接種到大米培養基中避光培養，至菌絲球或菌絲充滿全部液體培養基或 大米培養基，過濾或離心收集充滿菌絲的菌球乾燥或粉碎，或收集充滿菌絲的大米培養基直 接烘乾，即都可得到廣東蟲草菌絲體，所述的生產用的液體培養基pH4 9，每1000mL培養 基中含有麥芽提取粉10 30g，葡萄糖10 20g，黃豆5 15g，酵母浸膏l 4g，其餘為水， 所述的大米培養基由大米和營養液按質量比1:1 1.5配製而成，所述營養液按總質量分數 100%計，配方為葡萄糖1.0% 1.5%，蛋白腖0.3% 1.0%，麥芽提取粉0. 3% 0. 6%，酵母 浸膏O. 3% 0. 6%，其餘為水，pH5. 0 7. 0。
步驟(l)中所述的日本蟲草廣東變型(Cw辦ce;w/qpom'ai f. gwtmgi/o"gera^ T.H. Li, Q.Y. Lin et B. Song) GDIM—C050423於2008年發表的文獻中更名為廣東蟲草(6b/"辦ce;w 卵朋goto/^e/ sj^T.H. Li, Q.Y. Lin & B. Song)(見文獻Lin Q Y， Li T H， Song B. Mycotaxon， 2008， 103: 371 - 376.)。該蟲草菌株分離自廣東蟲草標本(GDGM 24020)，已於2006年5月 16日保藏在中國典型培養物保藏中心，地址中國，武漢，保藏號為CCTCC No. M206051。 該蟲草菌株首先公開在中國專利ZL200610035774. 3中。
步驟(l)中所述的PDA培養基即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，是本領域通常使用的培養基， 所述的暗培養時間最好是20 30天。
步驟(2)所述的振蕩的搖床轉速最好是120 180r/min，培養時間最好是7 8天。
步驟(3)所述的一級液體菌種在培養基中的體積分數最好是3% 15%，所述的培養時間最 好是4 7天。
步驟(4)所述的二級液體菌種在生產用的液體培養基或大米培養基中的體積分數最好是3% 15%，所述的發酵培養的攪拌速度最好是150 180r/min，通氣量最好是8 25L/rain，培 養時間最好是2 5天，所述的避光培養時間最好是9 20天。 上述所用的麥芽提取粉和酵母浸膏都是市售品。
本發明採用液體菌種接種培養廣東蟲草的方法，使廣東蟲草菌絲體溼重的產率達到70 100g/L，乾重產率達到8 15g/L，或直接接種於大米培養基中培養獲得廣東蟲草菌絲體。成 分分析結果表明，本發明的菌絲體的營養成分中包括粗蛋白23% 24. 12%,粗脂肪12% 13. 52%，其活性成分包括多糖7 8mg/g，腺苷1. 05 1. 76mg/g，蟲草素3. 1 3. 31mg/g,甘 露醇(蟲草酸)43 45.18mg/g，因此可作為食品或蟲草產品生產原料使用。
具體實施例方式
以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實施例中所用的麥芽提取 粉和酵母浸膏都是廣東環凱微生物科技有限公司的市售品
實施例l:
將日本蟲草廣東變型(6broyc印51 j'apo/ 2'ca f.卵a^/0"ge/757'5T. H. Li, Q. Y. Lin et B. Song) GDIM—C050423 CCTCC No. M206051母種，接種量大小約為0. 5cm2，接種在PDA培養基 (即馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基，其配製方法是稱取200g馬鈴薯，洗淨去皮切碎，加水1000mL 煮沸半個小時，紗布過濾，再加10 20g葡萄糖和17 20g瓊脂，充分溶解後趁熱紗布過濾， 分裝試管，視試管大小而定每試管約5 10mL， 15磅蒸氣12rC滅菌20分鐘左右後取出試管 擺斜面，冷卻貯存備用)上，2(TC下暗培養20天，使菌落直徑長至4 5cm，得到斜面菌種。
把斜面菌種接種至帶有250mL —級液體培養基YMPD (每1000 mL培養基中含葡萄糖10g， 蛋白腖5g，麥芽提取粉3g,酵母浸膏3g，其餘為水，p朋.O)的三角瓶中，接入15塊菌種 塊，20°C下振蕩培養，搖床轉速為120r/min，培養8天，菌絲球充滿全部培養基，菌絲球平 均直徑約2 3mm，且大小均勻，得到一級液體菌種。
將25mL —級液體菌種接種至250mL —級液體培養基中(培養基的組分同上一步所述)， 培養4天，至菌絲球充滿全部培養基，得到二級液體菌種。
將25mL 二級液體菌種接種至裝有250mL生產用的液體培養基(每1000mL培養基中含麥 芽提取粉20g，葡萄糖10g，黃豆10g，酵母浸膏2g，其餘為水，pH6)的500mL的三角瓶中 發酵培養5天，振蕩速度為150r/min，至菌絲球充滿全部培養基，離心法收集菌絲球，在40°C 下烘乾菌絲體並粉碎至40目過篩，得到廣東蟲草菌絲體3. 5g，產率14g/L。
實施例2:
將日本蟲草廣東變型(Coroyce/ 51麵om'cfl f. T.H. Li, Q.Y. Lin et B. Song)
GDIM—C050423 CCTCC No. M206051母種(約為O. 5cm2大小)接種在PDA培養基上，25°C下 暗培養30天，使菌落直徑長至5 6cm，得到斜面菌種。把斜面菌種接種至帶有250mL —級液體培養基YMPD (每1000 mL培養基中含葡萄糖15g， 蛋白腖3g，麥芽提取粉3g，酵母浸膏3g，其餘為水，p朋.5)的三角瓶中，28。C下振蕩培養, 搖床轉速為180 r/min，培養7天，菌絲球充滿全部培養基，菌絲球平均直徑約2 3mm，且 大小均勻，得到一級液體菌種。
將一級液體菌種7. 5fflL接種至250mL 二級液體培養基中(培養基的組分同上一步所述)， 培養7天，至菌絲球充滿全部培養基，得到二級液體菌種。
將二級液體菌種接種至帶有25L生產用的液體培養基的40L小型發酵罐(每1000mL培養 基含麥芽提取粉10g，葡萄糖20g，黃豆5g，酵母浸膏lg，其餘為水，pH4)中發酵培養，攪 拌速度為180 r/min，通氣量為10L/min，培養2天，至菌絲球充滿全部培養基，過濾法收集 菌絲球，在50。C下烘乾菌絲體，得到廣東蟲草菌絲體250g，產率10g/L。
實施例3:
將曰本蟲草廣東變型(C。r辦ceps/a/ o"z'ca f.gwa"gi/o"ge腦VLH. Li， Q.Y. Lin et B. Song) GDIM_C050423 CCTCC No. M206051母種(大小約為0.4 0.5cm2)接種在PDA培養基上，23°C 下暗培養25天，使菌落直徑長至4 5cm，得到斜面菌種。
把斜面菌種接種至帶有250mL —級液體培養基YMPD (每1000 mL培養基中含葡萄糖10g， 蛋白腖5g，麥芽提取粉6g，酵母浸膏3g，其餘為水，p服.O)的三角瓶中，25。C下振蕩培養， 搖床轉速為150 r/min，培養7天，菌絲球充滿全部培養基，菌絲球平均直徑約2 3mm，且 大小均勻，得到一級液體菌種。
將一級液體菌種37. 5mL接種至250mL 二級液體培養基中(培養基的組分同上一步所述)， 培養5天，至菌絲球充滿全部培養基，得到二級液體菌種。
將二級液體菌種接種至帶有65L生產用的液體培養基的100L小型發酵罐(每1000 mL培 養基中含麥芽提取粉30g，葡萄糖20g，黃豆15g，酵母浸膏4g,其餘為水，pH9)，攪拌速度 為180r/min，通氣量為25L/min，培養3天，至菌絲球充滿全部培養基，採用過濾法收集菌 絲球，粉碎菌絲體至40目過篩，得到廣東蟲草菌絲體550g，產率8.5g/L。
實施例4:
將曰本蟲草廣東變型(Coroycep51 /qpo"/ca f.g"a"gcto"ge"57yr.H. Li， Q.Y. Lin et B. Song) GDIM—C050423 CCTCC No. M206051母種(大小約為0.4 0.5cm2的菌塊)接種在PDA培養基 上，22T下暗培養28天，使菌落直徑長至4 5cm，得到斜面菌種。
把斜面菌種接種至帶有帶有250mL —級液體培養基YMPD (每1000 mL培養基中含葡萄糖 10g，蛋白腖10g，麥芽提取粉3g，酵母浸膏3g，其餘為水，pH6.5)的三角瓶中，26。C下振 蕩培養，搖床轉速為120r/min，培養7天，菌絲球充滿全部培養基，菌絲球平均直徑約2 3mm，且大小均勻，得到一級液體菌種。將一級液體菌種30mL接種至250mL 二級液體培養基中(培養基的組分同上一步所述)， 培養6天，至菌絲球充滿全部培養基，得到二級液體菌種。
將7. 5mL 二級液體菌種用無菌水稀釋後接入20g大米培養基中(培養基由大米和營養液 按質量比l:l配製而成，營養液按總質量分數100%計，配方為葡萄糖1%，蛋白腖0.3%， 麥芽提取粉0. 3%，酵母浸膏0. 3°/。和水98. 1%， p服.0)，避光培養20天，待菌絲體充滿全部 培養基，4(TC下烘乾，得到廣東蟲草菌絲體。
實施例5:
將曰本蟲草廣東變型(CoroycejD51 /fl; o"i'az f.gwarrtg(iowge肌'5T.H. Li, Q.Y. Lin et B. Song) GDIM_C050423 CCTCC No. M206051母種(大小約為0.4 0.5cm2的菌塊)接種在PDA培養基 上，20。C下暗培養20天，使菌落直徑長至4 5cm，得到斜面菌種。
把斜面菌種接種至帶有250mL —級液體培養基YMPD (每1000 mL培養基中含葡萄糖10g, 蛋白腖5g，麥芽提取粉3g，酵母浸膏3g，其餘為水，p朋.O)的500mL三角瓶中，20°C下振 蕩培養，搖床轉速為120r/min,培養8天，菌絲球充滿全部培養基，菌絲球平均直徑約2 3mra，且大小均勻，得到一級液體菌種。
將一級液體菌種25mL接種至250mL 二級液體培養基中(培養基的組分同上一步所述)， 培養4天，至菌絲球充滿全部培養基，得到二級液體菌種。
將7. 5mL 二級液體菌種用無菌水稀釋後接入20g大米培養基中(培養基由大米和營養液 按質量比1:1.5配製而成，營養液按總質量分數100%計，配方為葡萄糖1. 5%，蛋白腖1. 0%， 麥芽提取粉0.6%，酵母浸膏0. 6%和水96. 3%， pH6.5)，避光培養9天，4(TC下烘乾，得到廣 東蟲草菌絲體。
權利要求
1. 一種廣東蟲草菌絲體的生產方法，其特徵包括以下的步驟(1)將日本蟲草廣東變型(Cordyceps japonica f.guangdongensisT.H.Li，Q.Y.Lin et B.Song)GDIM_C050423 CCTCC No.M206051接種到PDA培養基上，18～26℃下進行暗培養，使菌落直徑長至4～6cm，得到斜面菌種；(2)將步驟(1)得到斜面菌種接種至一級液體培養基，每100mL接入5～15塊斜面菌種，20～28℃下振蕩培養，至菌絲球充滿全部培養基，得到一級液體菌種，所述的一級液體培養基pH6.0～6.5，每1000mL培養基中含有葡萄糖10～15g，蛋白腖3～10g，麥芽提取粉3～6g，酵母浸膏3～6g，其餘為水；(3)將步驟(2)得到的一級液體菌種再次接種到二級液體培養基進行培養，直至菌絲球充滿全部培養基，得到二級液體菌種，所述的二級液體培養基配方同步驟(2)所述一級液體培養基；(4)將步驟(3)得到的二級液體菌種接種到生產用的液體培養基發酵培養或將二級液體菌種用無菌水稀釋後接種到大米培養基中避光培養，至菌絲球或菌絲充滿全部液體培養基或大米培養基，過濾或離心收集充滿菌絲的菌球乾燥或粉碎，或收集充滿菌絲的大米培養基直接烘乾，即得到廣東蟲草菌絲體，所述的生產用的液體培養基pH4～9，每1000mL培養基中含有麥芽提取粉10～30g，葡萄糖10～20g，黃豆5～15g，酵母浸膏1～4g，其餘為水，所述的大米培養基由大米和營養液按質量比1:1～1.5配製而成，所述營養液按總質量分數100％計，配方為葡萄糖1.0％～1.5％，蛋白腖0.3％～1.0％，麥芽提取粉0.3％～0.6％，酵母浸膏0.3％～0.6％，其餘為水，pH5.0～7.0。
2. 根據權利要求1所述的一種廣東蟲草菌絲體的生產方法，其特徵是步驟(l)所述的暗 培養時間是20 30天，步驟(2)所述的振蕩的搖床轉速是120 180 r/min ，培養時間是7 8天，步驟(3)所述的一級液體菌種在培養基中的體積分數是3% 15%，所述的培養時間是4 7天，步驟(4)所述的二級液體菌種在生產液體培養基或無菌培養基中的體積分數是3% 15%, 所述的發酵培養的攪拌速度是150 180 r/min ，通氣量是8 25L/min,所述的生產液體培 養基的培養時間是2 5天，所述的大米培養基的避光培養時間是9 20天。
全文摘要
本發明涉及一種廣東蟲草菌絲體的生產方法，特徵是將廣東蟲草(Cordyceps guangdongensisT.H.Li，Q.Y.Lin et B.Song)即日本蟲草廣東變型GDIM_C050423 CCTCC No.M206051母種接種在PDA培養基上培養得到斜面菌種，然後接種至一級液體培養基培養得到一級液體菌種，再接種到二級液體培養基培養，最後將得到的二級液體菌種接種到生產用的液體培養基中發酵培養或用無菌水稀釋後接種到大米培養基中避光培養至菌絲充滿培養基，收集培養物乾燥或粉碎得到廣東蟲草菌絲體。本發明菌絲體的營養成分中含粗蛋白23％～24.12％，粗脂肪12％～13.52％，活性成分中含多糖7～8mg/g，腺苷1.05～1.76mg/g，蟲草素3.1～3.31mg/g，甘露醇43～45.18mg/g。
文檔編號C12N1/14GK101463326SQ20081022062
公開日2009年6月24日 申請日期2008年12月30日 優先權日2008年12月30日
發明者斌 宋, 挺 李, 李泰輝, 林群英, 沈亞恆, 浩 黃 申請人:廣東省微生物研究所