抗狂犬病的廣譜狂犬病病毒屬病毒疫苗的製作方法

2023-12-08 22:01:16 4

專利名稱：抗狂犬病的廣譜狂犬病病毒屬病毒疫苗的製作方法
技術領域：
本公開涉及重組狂犬病病毒及其用作廣譜狂犬病病毒屬病毒疫苗來防止狂犬病病毒屬病毒感染的用途。
背景技術：
狂犬病病毒屬(Lyssavirus)是單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)(具有單鏈、反義基因組的病毒)中彈狀病毒科(Rhabdoviridae)的成員。在恆溫動物和人類中，狂犬病病毒屬病毒是狂犬病腦炎的病原(Tordo et al. , 「Lyssaviruses」 In Fauquetet al. eds. Virus taxonomy: the classification and nomenclature of viruses. The8thReport of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: OxfordAcademic，2006，pages623_629;World Health Organization Expert Consultation onRabies，5_80ctober2004，first report, World Health Organization Technical reportseries931, Geneva:World Health Organization, 2005，pagesl5_19)。狂犬病病毒屬的種包括狂犬病病毒(RABV，基因型I)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat viioisXLBV，基因型2)、莫可拉病毒(Mokola virus) (M0KV，基因型 3)、杜文海格病毒(Duvenhage virus) (DUVV，基因型4)、歐洲蝙蝠狂犬病病毒-1 (European bat lyssavirus-1) (EBLV-1，基因型5)、歐洲蝙幅狂犬病病毒-2 (European bat lyssavirus-2) (EBLV-2，基因型6)、澳大利亞蝙幅狂犬病病毒(Australian bat lyssavirus) (ABLV，基因型7)和從中亞和俄羅斯蝙蝠中分離出的4個其他種(Aravan病毒-ARAV、Khujand病毒-KHUV、Irkut病毒-1RKV和西高加索蝙幅病毒(West Caucasian bat virus)-WCBV) (Kuzmin et al. , Emerg.1nfect. Dis. 14(12) :1887-1889, 2008;Weyer et al.，Epidemiol.1nfect. 136:670-678，2007;Kuzmin andRupprechtj iiBat rabies，，In Rabies, 2nd Edition, New York，Academic Press，2007，pages259-307，Jackson and Wunnerj eds.)。基於狂犬病病毒屬病毒分離株的系統發生、免疫原性和毒力，已提出狂犬病病毒屬病毒的兩個遺傳譜系(Bactane et al.，J. Virol. 75:3268-3276，2001 )。遺傳譜系的劃分一般與對狂犬病病毒屬病毒觀察到的疫苗交叉保護模式相關狂犬病病毒屬病毒(Badraneet al.，J. Virol. 75: 3268-3276，2001; Hanlon et al.，Virus Res.1ll:44-54，2005;Nelet al.，Expert Rev. Vaccines4:553-540，2005)。遺傳譜系 I 包括基因型 1、4、5、6 和 7 以及 ARAV、KHUV 和 IRKV (Kuzmin et al. ,Virus Res. 97:65-79, 2003;Kuzmin et al. ,VirusRes. 111:28-43, 2005; Hanlon et al. ,Virus Res.1ll :44_54，2005)。目前可用的商業疫苗和生物製品被認為可有效抗這個譜系中的病毒感染(Nel et al.，Expert Rev.Vaccines4:553-540, 2005)。然而，這些用於狂犬病的疫苗和生物製品不能提供抗狂犬病病毒屬病毒譜系I之外的病毒(即，基因型2和3)感染的完全保護。此外，WCBV是公認的最不同的狂犬病病毒屬病毒並呈現有限的與基因型2和3病毒的關聯性。先前的研究已表明，抗RABV的血清與WCBV沒有或幾乎沒有交叉中和反應(Botvinkin et al. , Emerg.1nfect.Dis. 9:1623-1625, 2003;Hanlon et al. , Virus Res.1ll :44-54, 2005)。因此，需要開發狂犬病疫苗，這種疫苗可以抗廣譜的狂犬病病毒屬病毒，尤其是WCBV和狂犬病病毒屬基因型2和3，以提供保護。

發明內容
本文公開了具有來自至少兩種不同狂犬病病毒屬病毒的糖蛋白基因的重組狂犬病病毒。所公開的病毒可以用作廣譜狂犬病病毒屬病毒疫苗以提供抗多種基因型的狂犬病病毒屬病毒感染的保護。本文提供了重組狂犬病病毒。在一些實施方案中，所述重組狂犬病病毒的基因組包括狂犬病病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、RNA依賴性RNA聚合酶(L)和糖蛋白(G)的基因和至少一個、至少兩個或至少三個不同的異源狂犬病病毒屬病毒糖蛋白基因。在一些實施方案中，所述狂犬病病毒屬病毒選自LBV、MOKV、DUVV、EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV和WCBV。在具體的實施方案中，所述狂犬病病毒屬病毒選自LBV、MOKV和WCBV0還提供了一種包括全長的狂犬病病毒基因組反義DNA的載體。在一些實施方案中，所述基因組反義DNA包括狂犬病病毒N基因、P基因、M基因、L基因和G基因，並且所述載體還包括至少一個、至少兩個或至少三個不同的異源狂犬病病毒屬病毒G基因。還提供了包含本文描述的狂犬病病毒載體的細胞。還提供了包括一種或多種本文描述的重組狂犬病病毒和可藥用載體的組合物。還提供了通過給予受試者一種或多種本文公開的重組狂犬病病毒在所述受試者中誘發抗狂犬病病毒屬病毒的免疫應答的 方法。從下面參照附圖的具體實施方式
，本發明的上述以及其他目的、特徵和優點將變得更加明顯。


圖1A :ERA轉錄質粒的示意圖。圖示了錘頭狀核酶和ERA反義基因組的位置。沿5』至3』方向示出了N蛋白、P蛋白、M蛋白、G蛋白和L蛋白的相對位置。圖1B :構建全長ERA狂犬病病毒基因組cDNA質粒pTMF的示意圖。示出了 RT-PCR產物Fl和F2片段，以及限制性內切酶識別位點(Nhel，Kpnl，Blpl，Pstl和Notl)。標出了RdRz-錘頭狀核酶和HDVRz- 丁型肝炎病毒核酶。菱形符號表示Kpnl或Pstl位點被刪除，垂直箭頭表示Nhel或Notl被完整保留。圖2 :示意性圖示的提出的機制是PNLST7質粒的NLST7RNA聚合酶自身基因作用。DNA轉染試劑複合物通過內吞作用被攝入細胞。從溶酶體和內涵體釋放的大部分DNA保留在細胞質中。有限量的質粒被轉運到細胞核1)通過CMV極早期啟動子，NLST7基因由細胞RNA聚合酶II轉錄；2)成熟的NLST7mRNA被從細胞核運送到細胞質，用於NLST7RNA聚合酶合成；3)新合成的NLST7RNA聚合酶被轉運到細胞核中，而微量的NLST7被保留在細胞質中；4)NLST7RNA聚合酶通過PT7啟動子起始轉錄。通過轉錄後修飾，產生用於蛋白合成的另外的NLST7mRNA，因而提高病毒恢復效率。圖3:10個衍生ERA病毒基因組的示意圖。每個基因的大小不是按比例繪製的。符號表示第333位胺基酸殘基(本文中稱為G333)處G的突變，「 Ψ 」標出Psi區域。圖4 :構建ERA-3G的示意圖。將G333突變引入至ERA的主鏈並加入兩個轉錄(trans)單元。將這些轉錄單元引入至P基因和M基因之間以及G基因和L基因之間。將MOKV G基因和WCBV G基因克隆至這些轉錄單元內以形成具有三個糖蛋白基因的重組ERA狂犬病病毒(ERA-3G)。圖5 :構建ERA-4G的示意圖。將G333突變引入至ERA主鏈並加入三個轉錄(trans)單元。將這些轉錄單元引入至N基因和P基因之間、P基因和M基因之間以及G基因和L基因之間。將LBV G基因、MOKV G基因和WCBV G基因克隆至這些轉錄單元內以形成具有四個糖蛋白基因的重組ERA狂犬病病毒(ERA-4G)。序列表使用標準核苷酸鹼基字母縮寫和胺基酸的三字母代碼(如在37C. F. R.1. 822中所定義的)顯示所附序列表中列出的核酸序列和胺基酸序列。只顯示每個核酸序列的一條鏈，但應理解互補鏈通過提及所示鏈而被包括在內。在所附序列表中SEQ ID NO:1是通過反向遺傳學復原的重組狂犬病病毒ERA的核苷酸序列。所述重組病毒的第4370-4372位核苷酸已從aga變為gag (相對於野生型病毒)，這在G蛋白第333位殘基上引入了從Arg到 Glu的胺基酸改變。 SEQ ID NO: 2是狂犬病病毒ERA N蛋白的胺基酸序列。SEQ ID NO: 3是狂犬病病毒ERA P蛋白的胺基酸序列。SEQ ID NO: 4是狂犬病病毒ERA M蛋白的胺基酸序列。SEQ ID NO: 5是第333位胺基酸突變(從Arg至Glu)的狂犬病病毒ERA G蛋白的
胺基酸序列。SEQ ID NO: 6是狂犬病病毒ERA L蛋白的胺基酸序列。SEQ ID NO:7是野生型狂犬病病毒ERA G蛋白的胺基酸序列。SEQ ID NO: 8_11是用於擴增全長狂犬病病毒基因組cDNA的RT-PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO: 12_15是用於合成錘頭狀核酶和丁型肝炎病毒核酶的寡核苷酸序列。SEQ ID NO: 16-40是PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:41和42是用於整合異源ORF的轉錄單元的核苷酸序列。SEQ ID NO:43和44是用於擴增MOKV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:45和46是用於擴增WCBV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:47和48分別是MOKV G的核苷酸和胺基酸序列。SEQ ID NO:49和50分別是WCBV G的核苷酸和胺基酸序列。SEQ ID N0:51和52是用於擴增LBV G基因的RT-PCR引物的核苷酸序列。SEQ ID NO:53和54分別是LBV G的核苷酸和胺基酸序列。
具體實施方式
1.縮寫ABLV 澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒ARAV Aravan 病毒CMV巨細胞病毒DFA直接螢光抗體DUVV 杜文海格病毒EBLV-1 歐洲編fe狂犬病病毒_1EBLV-2 歐洲蝙蝠狂犬病病毒_2ERAEvelyn-Rokitnick1-AbelsethFFU蝕斑形成單位G糖蛋白1.m.肌肉注射IRES內部核糖體進入位點IRKVIrkut 病毒KHUV Khujand 病毒LRNA依賴性RNA聚合酶LBV拉各斯蝙蝠病毒M基質蛋白MOKV 莫克拉病毒N核蛋白NLS核定位信號ORF開放閱讀框P磷蛋白PAGE 聚丙烯醯胺凝膠電泳RABV 狂犬病病毒RNP核糖核蛋白RABV 狂犬病病毒WCBV 西高加索蝙蝠病毒I1.術語和方法除非另有說明，技術術語依其常規用法使用。分子生物學中的常用術語的定義可見於 Benjamin Lewin, Gene V,由 Oxford University Press 出版，1994(ISBN0-19-854287-9) ；Kendrew 等(eds.) ,The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994 (ISBN0-632-02182-9)和 Robert A. Meyers(ed. ) , Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference,由VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。為了有助於閱讀本公開的各個實施方案，提供了對具體術語的如下解釋佐劑可非特異增強對抗原的免疫應答的物質或載體。佐劑可包括吸附了抗原的礦物質(如明礬、氫氧化鋁或磷酸鹽)懸浮物；或油包水乳劑，其中抗原溶液乳化在礦物油(例如弗氏不完全佐劑)中，有時包含滅活的分支桿菌(弗氏完全佐劑)以進一步增強抗原性。免疫刺激寡核苷酸(如包含CpG基序的那些)也可被用作佐劑(例如，參見美國專利 No. 6，194，388,6, 207，646,6, 214，806,6, 218，371,6, 239，116,6, 339，068,6, 406，705 和6，429，199)。佐劑還包括生物分子，如共刺激分子。示例性的生物佐劑包括IL-2、RANTES、GM-CSF, TNF- a、IFN- y、G-CSF, LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、0X-40L 和 41BBL。給予本文所用的向受試者給予組合物例如疫苗是指給予、施用或使組合物與所述受試者接觸。給藥可通過很多途徑中的任一種來完成，例如，局部的、口服的、皮下的、肌肉的、腹膜內的、靜脈內的、鞘內的和肌肉的。動物有生命的多細胞脊椎生物，種類包括例如哺乳動物和鳥類。術語哺乳動物包括人和非人哺乳動物。術語「動物」包括人受試者和獸受試者。例如，人、非人靈長類、狗、貓、馬、浣熊、蝙蝠、大鼠、小鼠，狐狸、松鼠、負鼠、土狼、狼和牛。抗體包括一種或多種多肽的蛋白(或蛋白複合體)，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼。已知的免疫球蛋白基因包括K、λ、α、Υ、δ、ε和μ恆定區基因以及大量的免疫球蛋白可變區基因。輕鏈分類為K或λ。重鏈分類為Υ、μ、α、δ或ε，這些重鏈又反過來分別定義免疫球蛋白的種類IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。基本免疫球蛋白(抗體)結構單元通常是四聚體。每個四聚體由兩對相同的多肽鏈組成，每對具有一個「輕鏈」(約25kDa)和一個「重鏈」(約50-70kDa)。每條鏈的N-端限定了約100至110或更多個胺基酸的可變區域，所述可變區域主要負責抗原識別。術語「可變輕鏈(' )」和「可變重鏈(Vh ) 」分別是指這些輕鏈和重鏈。本文所用的術語「抗體」包括完整的免疫球蛋白以及許多很好表徵的片段。例如，結合目標蛋白(蛋白或融合蛋白內表位)的Fab、Fv和單鏈Fv (scFvs)也可以是所述目標蛋白(或表位)的特異性結合物質。這些抗體片段如下所示(I) Fab，包含抗體分子的單價抗原結合片段的片段，其是通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體以產生完整輕鏈和一條重鏈的一部分而產生的；(2) Fab』，通過用胃蛋白酶處理完整抗體，之後還原以產生完整輕鏈和部分重鏈而得到的抗體分子片段；每個`抗體分子得到兩個Fab』片段；(3) (Fab』)2，將完整的抗體用胃蛋白酶處理後未經之後的還原得到的抗體片段；(4) F (ab』)2，是兩個Fab』片段通過兩個二硫鍵連接在一起的二聚體；(5)Fv，含有表達為2條鏈的輕鏈可變區和重鏈可變區的基因工程片段；(6)單鏈抗體，含有由合適的多肽接頭連接在一起的輕鏈可變區、重鏈可變區的基因工程分子，其為基因融合的單鏈分子形式。製備這些抗體片段的方法是常規的方法(參見，例如，Harlow 和 Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, CSHL, NewYork, 1999)。抗體結合親和力是指單個抗體結合位點與配體(例如，抗原或表位)之間的結合強度。抗體結合位點X對配體Y的親合力由解離常數(Kd)表示，解離常數是指佔據溶液中存在的一半結合位點X所需要的Y的濃度。Kd越小表示X與Y之間的親和相互作用越強或越高，也表示佔據所述位點所需的配體濃度越低。通常，抗體互補位所識別的表位中，一個或多個胺基酸的改變、修飾和/或替代會影響抗體結合親和力。結合親和力可以使用本領域已知的任何技術來測量，例如Ag-ELISA測定中的終點滴定。抗原能夠在動物體內刺激抗體產生或T細胞應答的化合物、組合物或物質，包括被注射或吸收進入動物體內的組合物。抗原與特異性體液免疫或細胞免疫的產物反應，所述產物包括由異源免疫原誘導的那些。
反義基因組在具有負鏈RNA基因組(如狂犬病病毒屬病毒的基因組)病毒的情形中，「反義基因組」是指負鏈基因組的互補鏈(正鏈)。減毒的在活病毒例如狂犬病病毒的情形中，如果它感染細胞或受試者的能力和/或產生疾病的能力降低(例如，被消除)，則所述病毒是減毒的。通常，減毒病毒保留至少一些在給予有免疫能力的受試者後誘發免疫應答的能力。在一些情況下，減毒病毒能夠誘發保護性免疫應答而不引起任何的感染跡象或症狀。表位抗原決定簇。它們是分子上具有抗原性(即誘發特異性免疫應答)的特定化學基團，如連續或不連續的肽序列。基於抗體的三維結構和表位的匹配(或同源)三維結構，抗體可結合特定的抗原性表位。Evelyn-Rokitnick1-Abelseth (ERA):狂犬病病毒 ERA 株衍生自Street-Alabama-Dufferin (SAD)株，SAD株是1935年在阿拉巴馬州(美國)從一隻瘋狗中首次分離出來的。ERA株衍生自在小鼠大腦、幼倉鼠腎(BHK)細胞和雞胚胎中多次傳代之後的SAD狂犬病病毒。融合蛋白通過表達由編碼兩個不同(異源)蛋白的至少一部分的核酸序列經基因工程得到的核酸序列而產生的蛋白。為形成融合蛋白，所述核酸序列必須在相同的閱讀框內並且在所述閱讀框內無終止密碼子。異源的本文所用的「異源核酸序列」是來自不同來源、種或株的核酸序列。在本文所描述的一些實施方案中，所述異源核酸序列是編碼狂犬病病毒ERA以外的狂犬病病毒屬病毒的糖蛋白的核酸序列狂犬病病毒屬病毒。在重組ERA狂犬病病毒的情形中，異源核酸序列是非來自ERA狂犬病病毒的任何核酸序列。免疫應答免疫系統的 細胞例如B細胞、T細胞、巨噬細胞和多形核白細胞對刺激(如抗原)的應答。免疫應答可以包括參與宿主防禦反應的任何身體細胞，包括例如，分泌幹擾素或細胞因子的上皮細胞。免疫應答包括但並不限於先天免疫應答或炎症。本文所用的保護性免疫應答是指可保護受試者不受感染(防止感染或防止感染相關疾病的發生)的免疫應答。免疫保護受試者免受疾病(例如，感染性疾病)，例如通過接種疫苗。免疫原在適合條件下能夠刺激在動物體內免疫應答(如抗體產生或T細胞應答)的化合物、組合物或物質，包括被注射或吸收進入動物體內的組合物。本文所用的「免疫原性組合物」是包括免疫原的組合物。免疫原性組合物可用於刺激或誘發脊椎動物特異性免疫應答(或免疫原性應答)的組合物。在一些實施方案中，免疫原性組合物包括重組狂犬病病毒，例如表達一種或多種異源糖蛋白(如來自MOKV、LBV或WCBV的糖蛋白)的重組狂犬病病毒。在一些實施方案中，免疫原性應答是保護性的，或者可提供保護性免疫，因為它使動物更好地抗所述免疫原性組合物所針對的病原體(例如，狂犬病病毒和其他狂犬病病毒屬病毒)的感染和/或所述病原體所致疾病的發展。一種類型的免疫原性組合物的一個具體實例是疫苗。在一些實施方案中，免疫原性組合物的「有效量」或「免疫刺激量」是當給予受試者時足以產生可檢測的免疫應答的量。這樣的應答可以包括例如產生對所述免疫原性組合物中提供的一個或多個表位特異的抗體。或者，所述應答可以包括對所述免疫原性組合物中提供的一個或多個表位的輔助性T細胞應答或基於CTL的應答。在其他實施方案中，免疫原性組合物的「保護性有效量」是當給予動物時足以賦予所述動物保護性免疫的量。抑制或治療疾病抑制疾病或病症的充分發展，例如在處於疾病風險的受試者中。疾病的一個具體實例是狂犬病。「治療」是指在疾病或病理狀態開始出現之後改善其徵兆或症狀的治療性介入。本文所用的術語「改善」當述及疾病、病理狀態或症狀時是指所述治療的任何可觀察到的有益效果。有益效果可例如被以下方面所證實在易感受試者中所述疾病臨床症狀的推遲發生、所述疾病的一些或全部臨床症狀嚴重程度的減輕、所述疾病發展趨緩、所述疾病復發次數的減少、所述受試者整體健康狀況改善或者所述具體疾病特異性的本領域熟知的其他參數。分離的「分離的」或「純化的」生物組分(如核酸、肽、蛋白質、蛋白複合體或顆粒)已基本上從所述組分天然產生的生物體的細胞的其他生物組分中(B卩，其他的染色體DNA和RNA、染色體外DNA和RNA以及蛋白質)分離、分開而產生或純化出來。已被「分離的」或「純化的」核酸、肽和蛋白質因此包括通過常規的純化方法純化的核酸和蛋白質。所述術語還包括通過在宿主細胞內重組表達而製備的核酸、肽和蛋白質，以及化學合成的核酸或蛋白質。術語「分離的」或「純化的」不要求絕對的純度，而是意在作為一個相對術語。因此，舉例來說，分離的生物組分是其生物組分比其細胞內天然環境或其他生產容器中的生物組分更富集。優選地，對製劑進行純化，使得所述生物組分佔所述製劑的總生物組分含量的至少50%，如至少70%、至少90%、至少95%或更高。標籤可檢測的化合物或組合物，所述化合物或組合物是直接或間接地與另一分子綴合以方便檢測所述分子。標籤的具體非限制性施例包括螢光標記、酶聯物和放射性同位素。狂犬病病毒屬(Lyssavirus):單分子負鏈RNA病毒目(Mononegavirales)(具有單鏈、反義基因組的病毒)內彈狀病毒科(Rhabdoviridae)中的病毒屬。狂犬病病毒屬病毒是溫血動物和人的狂犬病腦炎的病原。狂犬病病毒屬病毒的種包括狂犬病病毒(RABV，基因型I)、拉各斯蝙蝠病毒(LBV，基因型2)、莫可拉病毒(M0KV，基因型3)、杜文海格病毒(DUVV，基因型4)、歐洲蝙蝠狂犬病病毒-1 (EBLV-1，基因型5)、歐洲蝙蝠狂犬病病毒-2 (EBLV-2,基因型6)、澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒(ABLV，基因型7)和從中亞和俄羅斯蝙蝠中分離出的4個其他物種(Aravan病毒-ARAV、Khujand病毒-KHUV、Irkut病毒-1RKV和西高加索蝙 fe病毒-WCBV) (Kuzmin et al. , Emerg.1nfect. Dis. 14 (12) : 1887-1889，2008; Weyeret al. , Epidemiol.1nfect. 136:670-678, 2007;Kuzmin and Rupprecht, 「Bat rabies，，InRabies, 2nd Edition, New York, Academic Press, 2007, pages 259-307, Jackson andffunner, eds. XORF (開放閱讀框):編碼胺基酸的沒有任何終止密碼子的一系列核苷酸三聯體(密碼子)。這些序列通常可被翻譯成肽。可操作連接當第一核酸序列與第二核酸序列以有功能關係放置時，第一核酸序列就與第二核酸序列可操作連接。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，那麼啟動子可操作連接到編碼序列。通常，可操作連接的DNA序列是連續的，並在必要時將兩個蛋白編碼區在相同的閱讀框內連接。如果存在內含子，可操作連接的DNA序列可以是不連續的。可藥用載體 可用於本公開的可藥用載體是常規的。Remington’sPharmaceuticalSciences, by E. ff. Martin, Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 15 版(1975 年)描述了適用於藥物遞送一種或多種治療性化合物或分子、蛋白或結合這些蛋白的抗體、病毒或載體和其他藥劑的組合物和製劑。通常，所述載體的性質將依賴於所採用的具體給藥方式。例如，腸胃外製劑通常包括可注射的流體，所述流體包括藥學上和生理上可用的流體，例如水、生理鹽水、平衡鹽溶液、葡萄糖水溶液、甘油或類似載體。對於固體組合物(例如，粉劑、丸劑、片劑或膠囊形式)，常規的非毒性的固體載體可以包括例如藥物級的甘露糖醇、乳糖、澱粉或硬脂酸鎂。除了生物中性載體之外，用於給藥的藥物組合物可以含有少量無毒的輔助物質，如潤溼劑或乳化齊U、防腐劑、pH緩衝劑等，例如乙酸鈉或脫水山梨糖醇單月桂酸酯。質粒能夠在宿主細胞中自主複製的環形核酸分子。多肽其中單體是通過醯胺鍵連接在一起的胺基酸殘基的聚合物。當胺基酸是α -胺基酸時，不論L-光學異構體還是D-光學異構體都可以使用，對於許多生物用途優選L-異構體。本文所用的術語「多肽」或「蛋白質」意在包括任何胺基酸分子並包括修飾的胺基酸分子。術語「多肽」特別地意在包括天然存在的蛋白質，以及重組或合成產生的蛋白質。保守胺基酸置換是發生時對原始蛋白性質影響最小的胺基酸置換，也就是說，所述蛋白的結構，特別是功能，是保守的，不會被這樣的置換顯著改變。保守置換的實例顯示如下。
權利要求
1.一種重組狂犬病病毒，其中，所述狂犬病病毒的基因組包括狂犬病病毒核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、RNA依賴性RNA聚合酶(L)和糖蛋白(G)的基因以及至少兩個不同的異源狂犬病病毒屬病毒糖蛋白基因，其中所述狂犬病病毒屬病毒選自拉各斯蝙蝠病毒(LBV)、莫克拉病毒(MOKV)、杜文海格病毒(DUVV)、歐洲蝙蝠狂犬病病毒-1 (EBLV-1)、歐洲蝙蝠狂犬病病毒-2 (EBLV-2)、澳大利亞蝙蝠狂犬病病毒(ABLV)、Aravan病毒(ARAV)、Khujand病毒(KHUV), Irkut病毒(IRKV)和西高加索蝙蝠病毒(WCBV)。
2.權利要求1的重組狂犬病病毒，其中所述狂犬病病毒屬病毒選自LBV、MOKV和WCBV。
3.權利要求1的重組狂犬病病毒，所述狂犬病病毒包括兩個不同的異源狂犬病病毒屬病毒G基因。
4.權利要求3的重組狂犬病病毒，其中所述兩個異源G基因是MOKVG基因和WCBV G基因。
5.權利要求4的重組狂犬病病毒，其中所述MOKVG基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同，所述WCBV G基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同。
6.權利要求4的重組狂犬病病毒，其中所述MOKVG基因包括SEQ ID NO:47的核苷酸序列，所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列。
7.權利要求1的重組狂犬病病毒，所述重組狂犬病病毒包括三個不同的異源狂犬病病毒屬病毒G基因ο
8.權利要求7的重組狂犬病病毒，其中所述三個異源G基因是LBVG基因、MOKV G基因和WCBV G基因。
9.權利要求8的重組狂犬病病毒，其中所述MOKVG基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同；WCBV G基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同；LBV G基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:53的核苷酸序列至少95%相同。
10.權利要求8的重組狂犬病病毒，其中所述MOKVG基因包括SEQ ID NO: 47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列；所述LBV G基因包括SEQ IDNO:53的核苷酸序列。
11.權利要求1的重組狂犬病病毒，其中一個異源G基因位於狂犬病病毒P基因和M基因之間。
12.權利要求1的重組狂犬病病毒，其中一個異源G基因位於狂犬病病毒G基因和L基因之間。
13.權利要求1的重組狂犬病病毒，其中一個異源G基因位於狂犬病病毒N基因和P基因之間。
14.權利要求3的重組狂犬病病毒，其中所述異源G基因位於狂犬病病毒P基因和M基因之間以及狂犬病病毒G基因和L基因之間。
15.權利要求7的重組狂犬病病毒，其中所述異源G基因位於狂犬病病毒N基因和P基因之間、狂犬病病毒P基因和M基因之間以及狂犬病病毒G基因和L基因之間。
16.權利要求1的重組狂犬病病毒，其中所述基因組來自狂犬病病毒ERA株。
17.權利要求16的重組狂犬病病毒，其中所述ERA株基因組的核苷酸序列包括與SEQID NO:1至少95%相同的序列ο
18.權利要求16的重組狂犬病病毒，其中所述ERA株基因組的核苷酸序列包括SEQIDNO:1。
19.權利要求1的重組狂犬病病毒，其中所述狂犬病病毒糖蛋白在第333位胺基酸包括Glu (SEQ ID N0:5)。
20.一種載體，所述載體包括全長狂犬病病毒反義基因組DNA，其中所述反義基因組DNA包括狂犬病病毒N基因、P基因、M基因、L基因和G基因，和至少兩個不同的異源狂犬病病毒屬病毒G基因，其中所述狂犬病病毒屬病毒選自LBV、MOKV, DUVV, EBLV-1、EBLV-2、ABLV、ARAV、KHUV、IRKV 和 WCBV。
21.權利要求20的載體，其中所述狂犬病病毒屬病毒選自LBV、M0KV和WCBV。
22.權利要求20的載體，所述載體包括兩個不同的異源狂犬病病毒屬病毒G基因。
23.權利要求22的載體，其中所述兩個異源G基因是MOKVG基因和WCBV G基因。
24.權利要求23的載體，其中所述MOKVG基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同，所述WCBV G基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同。
25.權利要求23的載體，其中所述MOKVG基因包括SEQ ID NO: 47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO: 49的核苷酸序列。
26.權利要求20的載體，所述載體括三個不同的異源狂犬病病毒屬病毒G基因。
27.權利要求26的載體，其中所述三個異源G基因是LBVG基因、MOKV G基因和WCBVG基因。
28.權利要求27的載體，其中所述MOKVG基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少95%相同；所述WCBV G基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:49的核苷酸序列至少95%相同；所述LBV G基因的核苷酸序列與SEQ ID NO:53的核苷酸序列至少95%相同。
29.權利要求27的載體，其中所述MOKVG基因包括SEQ ID NO: 47的核苷酸序列；所述WCBV G基因包括SEQ ID NO:49的核苷酸序列；並且所述LBV G基因包括SEQ ID NO: 53的核苷酸序列。
30.權利要求20的載體，其中一個異源G基因位於狂犬病病毒P基因和M基因之間。
31.權利要求20的載體，其中一個異源G基因位於狂犬病病毒G基因和L基因之間。
32.權利要求20的載體，其中一個異源G基因位於狂犬病病毒N基因和P基因之間。
33.權利要求22的載體，其中所述異源G基因位於狂犬病病毒P基因和M基因之間以及狂犬病病毒G基因和L基因之間。
34.權利要求26的載體，其中所述異源G基因位於狂犬病病毒N基因和P基因之間、狂犬病病毒P基因和M基因之間以及狂犬病病毒G基因和L基因之間。
35.權利要求20的載體，其中所述反義基因組DNA來自狂犬病病毒ERA株。
36.權利要求35的載體，其中所述ERA株反義基因組DNA的核苷酸序列包括與SEQIDNO:1至少95%相同的序列。
37.權利要求35的載體，其中所述ERA株反義基因組DNA的核苷酸序列包括SEQIDNO:1。
38.一種細胞，所述細胞包含權利要求20-37任一項中的載體。
39.一種組合物，所述組合物包括權利要求1-19任一項的重組狂犬病病毒和可藥用載體。
40.權利要求39的組合物，所述組合物還包括佐劑。
41.權利要求1-19任一項的重組狂犬病病毒在製備用於在受試者中誘發抗狂犬病病毒屬病毒的免疫應答的藥劑中的用途。
42.權利要求39或40中的組合物在製備用於在受試者中誘發抗狂犬病病毒屬病毒的免疫應答的藥劑中的用途。
43.權利要求41或42的用途，其中在所述受試者中抗狂犬病病毒屬病毒的免疫應答保護所述受試者免受至少三種不同基因型的狂犬病病毒屬病毒的感染。
44.權利要求41或42的用途，其中在所述受試者中抗狂犬病病毒屬病毒的免疫應答保護所述受試者免受至少四種不同基因型的狂犬病病毒屬病毒的感染。
45.權利要求1-19任一項的重組狂犬病病毒,用於在受試者中誘發抗狂犬病病毒屬病毒的免疫應答的方法中。
全文摘要
本文描述了重組狂犬病病毒，所述重組狂犬病病毒編碼狂犬病病毒糖蛋白和至少一種來自另一種狂犬病病毒屬病毒例如莫克拉病毒、拉各斯蝙蝠病毒和/或西高加索蝙蝠病毒的異源糖蛋白。在具體的實施方案中，所述重組狂犬病病毒包括兩種或三種異源的狂犬病病毒屬病毒糖蛋白。所公開的重組狂犬病病毒可以用作廣譜狂犬病病毒屬病毒疫苗以提供抗引起狂犬病的狂犬病病毒屬病毒的保護。
文檔編號C12N15/47GK103068985SQ201180040773
公開日2013年4月24日 申請日期2011年6月23日 優先權日2010年6月24日
發明者吳賢福, C·E·魯普雷希特, I·V·庫茲明 申請人:美國政府(由衛生和人類服務部、疾病控制和預防中心的部長所代表)