一種親和層析材料及製備方法和應用的製作方法

2023-12-09 04:43:16

專利名稱：一種親和層析材料及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域。
茨菇抑制劑為新鮮茨茹中提取的兩種多功能結晶蛋白酶抑制劑A和B的混合物，這兩種蛋白酶抑制活性上略有不同，例如抑制劑A對糜蛋白酶和激肽釋放酶親和性較強而抑制B對胰白酶親和性較強。可見，怎樣利用茨茹抑制劑更好地去除蛋白質中蛋白酶和激肽釋放酶，是目前該領域仍需解決的課題。
本發明的目的在於提供一種茨茹抑制劑一載體製備的親和層析材料該層析材料的製備方法，以及採用該層折材料去除蛋白質中蛋白酶、激肽釋放酶的方法。
本發明滿足下列結構要求R＿茨菇抑制劑這裡R代表一種不溶於水的基質材料，包括各種類型的瓊糖。
本發明中親和材料的製備如下1、茨茹抑制劑的製備取新鮮茨菇塊莖，去除外皮洗淨、切碎、加少許去離子水勻漿，用200目濾布過濾，殘渣用少量去離子水攪拌，浸泡過濾。和並濾液，調節PH至3.8～4.0。棄去沉澱，取上清加硫酸銨至飽和度為50％，沉澱蛋白、質棄上清，沉澱加水溶解用去離子水透析除鹽，完畢後置65～75℃水浴中熱變性5分鐘，離心去除沉澱，上清調PH至7.0，用0.015M磷酸緩衝溶液透析。
取二乙基氨基乙基纖維素(DEAE-cellulose)凝膠裝栓，先用0.015mol/L(PH7.8)磷酸緩衝溶液平衡，將上述溶液從柱上端加入，用0.05mol/L(PH7.8)磷酸緩衝溶液衝洗柱床，然後用0.012mol/L(PH7.8)磷酸緩衝溶液洗脫，收集蛋白質抑制劑洗脫峰，將洗脫峰用飽和硫酸銨透銨透析至沉澱不再增加，離心收集沉澱。加水溶解，用去離子水透析除鹽，冷凍乾燥後即得。
2、茨菇抑制劑與載體交聯任何適合的不溶於水的基質材料均可作為載體材料，例如瓊脂糖凝膠(包括瓊脂糖2B、瓊脂糖4B、瓊脂糖6B和二乙基氨基瓊脂糖)，將載體事先用溴化氰或其他激活劑活化，加入適量的茨菇抑制劑，在1～30℃條件下反應，在適合的緩衝溶液中放置12小時以上。茨菇抑制劑時即可充分與載體材料交聯。
本發明的親和層析材料的應用茨菇抑制劑為兩種多功能結晶蛋白酶抑制劑A和B的混合物，這兩種蛋白酶抑制劑在抑制活性上略有不同，採用這種親和層析材料在適合的PH條件下可用於除去蛋白質中所含的蛋白酶和激肽釋放酶。
取約1000ml沉降體積的瓊脂糖2B(Sephrose 2B，Pharmacia公司產品)用沙芯漏鬥抽濾成半乾物，用0.5mol/L氯化鈉溶液洗滌，再用蒸餾水洗滌至中性。按每10ml沉降體積的瓊脂糖2B與2g溴化氰的比例，稱取溴化氰的研缽中碾磨，溶於0.1mol/L碳酸氫的溶液中。
將瓊脂糖珠與溴化氰溶液的冰浴中混和攪拌，並滴加2mol/L氫氧化鈉溶液，使pH保持在11.0～11.5之間，10分鐘後移至室溫放置10分鐘。將混和液倒入布氏漏鬥，並立即用0.1mol/L碳酸氫鈉(pH9.5)緩衝溶液抽洗，在2～3分鐘內洗下相當於瓊脂糖珠10～15倍體積的緩衝溶液，終止活化。
按每1ml活化的凝膠可交聯2.25mg的茨菇抑制劑計算，加入已調pH至9.5的茨菇抑制劑水溶液在4℃條件下緩慢攪拌2小時至少放置12小時。用約20倍體積的0.1mol/L碳酸氫鈉(pH9.5)緩衝溶液洗滌已交聯的瓊脂糖珠，洗去未結合的蛋白。用0.1mol/L鹽酸—甘氨酸緩衝溶液(pH2.4)洗去非特異性吸附蛋白。再用0.2mol/L甘氨酸緩衝溶液(pH8.5)封閉瓊脂糖珠上與蛋白結合的活性基團，置4℃緩慢攪拌20小時再用0.1mol/L三羥甲基氨基甲烷—鹽酸液(pH7.5)抽洗，即製得茨菇抑制劑-瓊脂糖交聯複合物。加20％乙醇置4℃保存備用。
實施實例II重複實施例I，用瓊脂糖4B(Sephrose 4B，Pharmacia公司產品代替瓊脂糖2B同樣操作，製得茨菇抑制劑—瓊脂糖4B交聯複合物。
實施實例III重複實施例I，用瓊脂糖6B(Sephrose 6B，Pharmacia公司產品)代替瓊脂糖2B同樣操作，製得茨菇抑制劑—瓊脂糖6B交聯複合物。
實施實例IV重複實施例I，用二乙基氨基乙基瓊脂糖(DEAE-Sephrose，Pharmacia公司產品)代替瓊脂糖2B同樣操作，製得茨菇抑制劑—二乙基氨基乙基瓊脂糖交聯複合物。
實施實例V1.柱層析取採用以上實施實例方法製備的親和層析材料各1000ml，裝柱。事先用0.1mol/L(pH8.0)的磷酸緩衝溶液(含0.2mol/L的氯化鈉)作為平衡液衝洗柱床至流出液電導與平衡液電導一致。另取尿激酶(比活力50000IU/mg)製成濃度為100000IU/ml的溶液，調節pH至8.0。每次上樣1000ml，上樣完畢後，用1000ml的平衡液衝洗柱床，蛋白酶和激肽釋放酶被親和層析柱吸附，尿激酶則隨溶液流出。層析柱可用0.1mol/L(pH4.0)醋酸鈉緩衝溶液再生重複使用。
2.蛋白酶和激肽釋放酶的測定(1)激肽釋放酶的測定方法採用發色底物S-2266測定法[入江章子等，臨床藥理(日本)29，419，(1981)]。
取0.2mol/L(pH8.0)三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液500ul，37℃保溫5～10分鐘，再加入檢品溶液400ul，混合37℃保溫2～5分鐘後加底物溶液100ul[25mgS-2266(日本第一化學製藥株式會社產品)加28.8ml的蒸餾水溶解)混合37℃保溫30分鐘在加50％醋酸溶液終止反應。另取500ul的含抑肽酶10000～50000IU/L的0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液(pH8.0)代替0.2mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩衝溶液(pH8.0)同樣操作，作為空白對照在濾長405nm處測定吸收度(A)，按下式計算激肽釋放酶的含量
激肽釋放酶的含量(mU/ml)＝A×9.55(2)蛋白酶的測定方法酪蛋白分解活力測定法。
取1.0ml檢品溶液加1.0ml的1％酪蛋白溶液混勻37℃保溫1小時後，加入50％的三氯醋酸混勻沉澱未水解的蛋白質，3000rpm離心5分鐘，棄去沉澱。另取1.0ml經100℃煮沸2～3分鐘的檢品溶液代替上述檢品溶液同樣操作，作為空白在280nm處測定吸收度(B)作為蛋白酶的活力(O.D.280/ml)。
(3)按上述方法測定尿激酶經親和層析前後溶液中激肽釋放酶和蛋白酶的含量(處理前激肽釋放酶2.1mU/ml，蛋白酶0.243O.D.280/ml)，測定結果見表一表一親和層析柱 樣品處理後殘存率(％)激肽釋放酶 蛋白酶激肽釋放酶 蛋白酶(mU/ml) (O.D.280/ml)M-Spherose 2B 0.0292 0.040 1.4 16.5M-Spherose 4B 0.0181 0.044 0.86 18.1M-Spherose 6B 0.0240 0.035 1.1 14.4M-DEAE-Spherose 0.0070 0.009 0.33 3.7M代表茨菇抑制劑實施實例VI重複實施實例V，用尿胰蛋白酶抑制劑(比活力2500U/mg，含激肽釋放酶10.5mU/ml，蛋白酶0.2300.D.280/ml)代替尿激酶製成濃度為50000U/ml的溶液，同樣操作，測定結果見表二表二親和層析柱 樣品處理後殘存率(％)激肽釋放酶 蛋白酶激肽釋放酶 蛋白酶(mU/ml) (O.D.280/ml)M-Spherose 2B0.0227 0.0450.22 19.8M-Spherose 4B0.0137 0.0260.13 11.3M-Spherose 6B0.0121 0.0320.12 13.9M-DEAE-Spherose 0.0068 0.0140.06 6.1M代表茨菇抑制劑
權利要求
1.一種親和層析材料，其特徵在於其滿足下列結構要求R＿茨菇抑制劑R代表一種不溶於水的基質材料，包括各種類型的瓊糖。
2.一種親和層析材料的製備方法，其特徵在於首先將不溶於水的基質材料R用溴化氰或其他激活劑活化，加入適量茨菇抑制劑，在1～30℃條件下反應，在適合的緩衝溶液中放置12小時以上，茨菇抑制劑即可充分與載體R交聯。
3.一種親和層析材料的應用，特徵在於該材料在適合的PH條件下去除蛋白質中所含的蛋白酶和激肽釋放酶。
全文摘要
一種親和層析材料，滿足下列結構要求R-茨菇抑制劑，特定載體R採用不溶於水的基質材料，如各類瓊脂糖，在一定條件下與茨菇抑制劑交聯，製備一種親和層析材料，從而利用該層析材料去除蛋白質中蛋白酶、激肽釋放酶。
文檔編號G01N33/50GK1141212SQ9511425
公開日1997年1月29日 申請日期1995年12月4日 優先權日1995年12月4日
發明者傅和亮, 謝永立, 何欄, 巫錦娣, 鄭少亮 申請人:廣州市博普生物技術有限公司, 廣東天普生物化學製藥有限公司