篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法
2023-12-09 09:36:46 1
專利名稱：篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種篩選基因調控相關機制和分子的研究方法，尤其涉及一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法。
背景技術：
真核基因調控，是一種將蘊藏在DNA序列中的遺傳信息，顯現為有功能的蛋白質或核酸，進而參與各項生命活動的過程。這一過程要求基因組內各基因按特定的次序在特定的時間，空間，以適當的形式和數量進行表達。基因表達調控是生命得以維持和延續的前提。雖然人們對原核基因的表達調控已經有了比較深入的了解，但由於真核基因本身結構 和功能極為複雜，又缺乏有效的研究手段和技術，雖經多年巨大的努力，但相關研究的進展仍極為緩慢。時至今日，人們對真核基因的表達調控，依然所知甚少。真核基因是斷裂基因，包括能夠編碼蛋白質序列的外顯子和非編碼的內含子序列以及非編碼的調控序列。外顯子能夠經過翻譯過程生成蛋白質，調控序列則結合相關的調控因子。在人類基因組內，編碼外顯子的序列僅佔全序列的1%左右，非編碼序列中，內含子佔24%，剩餘的75%為非編碼的各種調控序列和大量重複序列。基因的平均長度為27kb，85%的基因長度小於lOOkb。就基因表達調控而言，每一特定基因的表達調控都可以單獨進行。基因調控過程中，轉錄調控是最關鍵的環節。特定基因的轉錄調控是通過不同的轉錄因子與參與該基因調控的相關序列相結合來實現的。這些調控序列被稱為順式作用元件，與其結合的轉錄分子稱為反式作用因子。順式作用元件包括啟動子，增強子，沉默子等。除啟動子一般位於緊鄰基因的上遊之外，其他作用元件可以位於基因的上下遊，位置無法預測。同特定基因啟動子相結合的是RNA聚合酶和相關蛋白，這些因子決定該基因轉錄的起始。同特定基因增強子相結合的是組織特異性轉錄因子，決定該基因在某類組織和細胞內的表達水平。某一特定基因的表達都是多種轉錄因子和不同調控序列相結合結果。在人類基因組內，能夠參與基因表達調控，擁有DNA結合區段的蛋白編碼基因有2600多種。這些轉錄因子之間可以發生複雜的相互作用，轉錄因子連同與它們相結合的調控序列共同構成了一個龐大基因調控網絡。核酸內切酶是一類能夠識別雙鏈DNA上某段特定核酸序列的核酸酶。這些特定的核酸序列被稱之為該核酸內切酶的酶切位點。不同的核酸內切酶擁有各自不同的特異性的酶切位點。當某一核酸內切酶同DNA上其特異性酶切位點結合後，在適當的條件下，可以在該識別位點切斷雙鏈DNA。不同核酸內切酶的酶切位點長度和序列不同。當酶切位點的長度增加時，其在基因組內的識別位點的數量會變得稀少。當識別位點長度超過一定限度後，其識別位點的數量可以稀少到一套完整的基因組內也沒有一個的程度。例如，當酶切位點長度為18bp時，隨機出現一個識別位點的DNA長度為418bp，這是人類基因組的20倍。極稀少位點核酸酶是一類特殊的核酸內切酶，它們的酶切識別位點序列長度一般在IObp以上。其中，兆位核酸酶(meganuclease)是一類識別位點長度在12_40bp的極稀少位點核酸酶。目前已經從多種生物體內發現了數百種兆位核酸內切酶,並且新的兆位核酸酶數量還在不斷增加。由於兆位核酸酶在每種生物的基因組內的識別位點極為稀少，這就為高特異性，高選擇性的定向基因操作(包括基因治療，遺傳育種)等研究領域提供了廣闊的應用前景。通過分析這些兆位核酸酶的結構特點，研究者們已經成功製備出經人工改造過的兆位核酸酶。這些人工兆位酶幾乎能夠識別任意特定的核酸序列。同時，已經有商品化的純化兆位核酸酶在市場出售。由於基因組內絕大多數基因的長度都小於lOOkb，當包含某一基因的基因組片段足夠長時，該片段的長度就可以包含該基因的完整編碼序列和參與調控該基因表達的所有調控元件。在基因組計劃中發展起來的大容量基因組載體庫已經能夠提供包含絕大多數基因完整序列的特定克隆，其中，Pl人工染色體(PAC)和細菌人工染色體(BAC)能夠容納長達100-300kb的基因組片段，酵母人工染色體(YAC)可容納500kb-lMb的基因組片段。利用這 些載體構建的基因組文庫已經實現了商品化，任何一段基因組序列，幾乎都能夠檢索到相應的載體克隆。目前，對這些大容量基因組載體內的基因組大片段進行定點突變，插入，刪除等多項操作的分子生物學技術已經成熟，改建好的載體能夠在體外大量擴增，從而可以方便的獲得修飾後的基因組片段，與此相關的技術服務已經實現商品化運作。近年來，生物合成技術的進步已經使得人們能夠對多個DNA片段進行有序的拼接，這些片段可以是PCR的產物，整個拼接過程均可以在體外完成，效率極高。利用這些拼接技術，能夠很容易的向合成的DNA片段內加入特定的序列，從而避免了繁瑣的克隆篩選過程。應用這一技術，已經能夠生成500kb以上的基因組片段，進行DNA拼接的生物合成相關試劑目前也已經實現了商品化。轉基因技術的發展已經能夠利用多種技術向細胞內導入大容量基因組載體，製備出含有基因組大片段的轉基因細胞系或動物。同傳統的小片段轉基因相比，利用基因組大片段進行的轉基因研究，能夠向細胞內轉入特定基因表達調控所需要的全部調控元件，這使得轉入基因的表達能夠同內源性基因一樣受到同步調控，其表達狀態直接反映出內源性基因的調控狀態，同時其表達水平不受插入位點的影響，僅同轉入基因的數量同關。在基因組內，由於不同基因的表達是細胞內外多種因素作用的結果，因此反式作用因子同順式調控元件的結合多是暫時性的，這使得基因表達的調控具有靈活性，但同時也增加了分析的難度。在基因調控研究中，為了能夠捕捉到這些短暫的轉錄因子同DNA的相互作用，通常要採用交聯劑將蛋白和核酸固定在一起，再進行分離分析的手段。交聯劑可以是物理上的電離輻射，紫外光照射，也可以是化學試劑，種類很多。交聯劑將DNA和與其結合的轉錄因子交聯在一起，經分離後，可以運用多種蛋白組，生化和分子生物手段分析參與基因調控的蛋白種類和相關調控元件的序列。由於體外研究的許多結果無法真實的反應體內的情況，人們迫切需要一種能夠對體內基因調節進行研究的手段。當前能夠直接檢測體內同DNA相結合的蛋白的研究方法主要是染色質免疫沉澱法(CHIP)。這種方法首先用交聯劑將DNA和與其結合的蛋白質交聯固定，再用核酸酶消化法或超聲粉碎法將染色質隨機斷成小片段，再採用能夠特異性識別DNA結合蛋白的抗體，捕捉交聯後的相應的片段。通過分析獲得片段的序列，並與基因組序列進行比對，就能夠確定在整個基因組內，與某類蛋白相結合所有調控序列所在的位置，提示其可能參與基因調控的種類和數量。這種方法只能應用在對全基因組的分析上，無法給出參與特定基因調控的相關蛋白情況。另一種分離染色質片段的蛋白組(PICH)方法，通過設計出與特定基因序列相結合的DNA探針，再利用探針對交聯後的全基因組片段進行多輪反覆的雜交，通過特異性的探針結合相應的基因組片段，分離出能夠同特定基因片段相結合的所有蛋白。由於每一個基因在單一細胞內僅有兩個等位基因，為了能夠從複雜的基因組片段內成功的提取出所需的基因片段，PICH方法要求的材料數量很大，一次實驗的細胞數高達IO9以上，培養細胞可達上百升，這對絕大多數細胞實驗而言都很困難，因此這一方法僅在端粒結合蛋白中進行了驗證。CHIP和PICH這兩種方法代表了不同的研究策略，但在分析的過程中，都要將細胞勻漿，使得基因組斷成小片段，再運用抗體或核酸探針進行特異性分離。參與這一過程的因素十分複雜，通常會會導致很高的背景，這使得抗體選用，探針設計，分離純化和雜交條件的優化等非常困難。由於操作步驟繁瑣，技術複雜，信號丟失嚴重，難以在組織細胞層面得到實施。
發明內容
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為了解決當前基因調控研究技術中存在的上述問題，本發明提供了一種能夠高效篩選參與指定基因或遺傳位點表達調控相關蛋白及其結合位點的高特異性，高靈敏性研究方法。特別是，本方法能夠對真核細胞基因組內參與特定基因調控相關的蛋白種類和數量進行分析，包括組織和細胞。本發明的技術解決方案是本發明提供了一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法。本發明的特殊之處在於所述篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法包括以下步驟I)通過查找基因組資料庫和相關載體庫，找到包含有目的基因或基因組位點的完整基因組序列，並根據以往對該基因或基因位點的相關研究，確定研究所需基因組片段長度。通常研究所需的基因組片段長度的範圍在100kb-300kb之間；2)對步驟I)所選定的基因組片段進行修飾，得到修飾後的基因組片段；3)將步驟2)所得到的修飾後的基因組片段進行大量擴增純化，並運用轉基因手段將修飾後的基因組片段導入目標細胞或目標動物內，分別形成轉基因細胞或轉基因動物4)對步驟3)所得到的轉基因細胞或轉基因動物施以特定刺激，這些刺激因素能夠影響轉基因表達調控機制，使得特定基因的表達發生變化；5)從步驟4)所得到的刺激後的轉基因細胞或轉基因動物中獲取基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白；6)分離分析與核酸結合的蛋白和相應的核酸序列；上述步驟2)中的修飾的內容包括向選定的基因組片段內的特定位點插入選擇和顯示標記以及向選定的基因組片段內的特定位點導入極稀少位點核酸酶的酶切位點；所述向選定的基因組片段內的特定位點插入選擇和顯示標記是將抗藥性基因和/或螢光蛋白等序列加入基因編碼區內，利用這些遺傳標記的表達變化觀察和分析內源基因的表達情況，進行定向篩選，得到成功的轉基因細胞；所述向基因組片段內導入的極稀少核酸酶的酶切位點是一段能夠為極稀少核酸酶所特異性識別的核酸序列。極稀少核酸酶能夠識別這些位點並與之結合，並能夠在相應的酶切位點處切斷雙鏈DNA，製備出有雙鏈斷端的DNA序列；所述極稀少位點核酸酶包括但不限於兆位核酸酶類、重組酶以及能夠在特定序列處切斷DNA的酶類；所述兆位核酸酶類包括內含子核酸內切酶以及歸巢子核酸內切酶；所述極稀少核酸酶識別的位點長度在IObp以上；所述修飾的實現方式是基因組載體重組工程法和/或生物合成法。上述步驟3)的具體實現方式是 3. I)通過載體在特定宿主菌內擴增或通過吉布森拼接大量合成修飾後的基因組片段；3. 2)通過常規的分子克隆方法對步驟3. I)所得到的大量的修飾後的基因組片段進行分離和純化；3. 3)運用轉基因方法將步驟3. 2)所得到的修飾後的基因組大片段導入目標細胞或目標動物內；若導入目標細胞時，所述轉基因方法包括但不限於脂質體轉染或電穿孔轉染等方法，利用選擇性培養基或標記基因篩選轉染陽性細胞，若需要，可以建立穩定的轉基因細胞或進行瞬時表達分析；若導入目標動物時，所述轉基因方法包括但不限於原核微注射，並據此製備包含修飾後基因組大片段的轉基因動物；3. 4)利用southern雜交、定量PCR、螢光原位雜交等分子生物學方法確定在轉基因細胞或轉基因動物體內轉入的基因片段的數量；3. 5)運用蛋白電泳、特異性抗體以及組織染色等分子生物學方法分析目標基因的表達情況。上述步驟4)的具體實現方式是4. I)對轉基因細胞或轉基因動物施加特定刺激，所述刺激為研究所設定的刺激，包括各種物理化學或其他類刺激，可以包括但不限於藥物、損傷、激素以及生長因子等；4. 2)觀察轉入基因的顯示標記的變化，確定轉入的基因表達發生了所需變化；使用交聯劑將核酸和核酸結合蛋白交聯固定；所述交聯劑包括但不限於質量百分比濃度是O. 5-1%的多聚甲醛，例如可包括紫外線照射。上述步驟5)的具體實現方式是5. I)收集步驟4)所得到的刺激後的轉基因細胞或轉基因動物的組織；5. 2)獲取轉基因細胞的細胞核或轉基因動物組織的細胞核，並將細胞核包埋在成形劑中；所述成形劑包括但不限於低熔點瓊脂糖；5. 3)破損核膜，加入極稀少核酸內切酶以及適當的緩衝系進行消化；加入適合所述極稀少核酸內切酶發揮作用的特定條件(特定的離子和緩衝體系)；極稀少核酸酶將在轉入的基因片段上的特定酶切位點處將DNA切斷；5. 4)去除成形劑，釋放消化後生成的基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白；
5. 5)將步驟5. 4)所得到的基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白進行分離純化；所述分離純化片段包括但不限於蔗糖密度梯度離心、超速離心、抗體磁珠捕捉以及片段末端標記雜交純化。上述步驟6)的具體實現方式是6. I)對蛋白進行分離及蛋白種類的確定所述蛋白分離包括核酸外切酶降解核酸片斷、蛋白電泳、酶解蛋白以及質譜分析蛋白譜，所述蛋白分離是確定結合蛋白的種類；6. 2)對核酸片段進行分析；所述核酸片段分析包括蛋白酶降解蛋白、通過常規酚氯仿抽提、DNA電泳、PCR分析、用核酸內切酶和外切酶結合，切除片段內未結合蛋白的核酸 到與蛋白結合處，向DNA末端接入接頭，用蛋白酶消化掉結合的蛋白，用接頭連接各蛋白結合片段，擴增測序，獲得與蛋白結合的位點序列；6. 3)通過比對轉入的基因組片段核酸序列，確定各結合位點在基因調控序列中的位置。本發明的優點是本發明涉及一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的新方法。該方法是一種能夠分析體內參與特定基因表達調控相關蛋白的方法。本發明的原理是基於利用同源重組或生物合成的方法，在含有特定基因或遺傳位點的基因組大片段內定向定位地導入極稀少核酸酶識別序列(酶切位點)，再用轉基因方法將修飾後的含特定基因的基因組大片段轉入真核細胞內製備成轉基因細胞或動物。當給與轉基因細胞或動物以特定刺激後，可調節轉入基因的表達變化。通過交聯劑將轉入特定基因的基因組大片段上參與基因表達調控的相關蛋白與核酸位點相交聯固定，用極稀少核酸酶特異性剪切轉入的含特定基因的基因組大片段，生成多個結合有調控因子的含轉入基因基因組片段的子片段。通過分析釋放的子片段的核酸序列和同其結合的蛋白質譜，即可獲得在某一生物過程中，參與對特定基因的表達進行調控的蛋白種類，數量和相應的結合位點。本發明是目前唯一能夠對真核基因內特定基因表達調控進行系統篩選的方法，能夠應用到各類真核基因或特定遺傳位點的表達分析研究，特別是對參與重要生理病理過程相關基因的在體調控的分子機制的分析，將有助於為疾病防治尋找新的潛在靶點，將有著廣泛的應用前景。
具體實施例方式本發明提供了一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，該方法包括以下步驟I)選定所要研究的基因或基因組位點，通過查找基因組資料庫和相關載體庫，找到包含有目的基因或基因組位點的完整基因組序列，並根據以往對該基因位點的相關研究，確定研究所需基因組片段長度(一般為儘量保持該基因位點的所有調控元件，並考慮到簡化後續操作，選擇的基因組片段長度在100kb-300kb之間，具體的情況視實驗要求而定)。目前有多種開放的免費基因組資料庫，並且每種資料庫都能夠提供多種檢索工具，適合各種相關數據的檢索和分析，例如NIH的基因組網站可以提供多種動物，植物，微生物，病毒和細胞器等多種基因組序列(http: //www. ncbi. nlm. nih. rov/sites/Renome)0其中，有關哺乳動物已經完成和正在進行的測序種類就達到125種。含有目的基因的大片段基因組載體庫，可以在專業網站查詢到，並可以訂購(http://bacpac. chori. org/)0此夕卜，也可以通過正在實施的大規模轉基因動物計劃，如NIH的Gensat計劃(http://www.gensat. otr/index, html)查到相關的已經實現了轉基因表達的細菌性人工染色體載體，並可以訂購。如果需要，可以自行構建所需的基因組載體庫。2)向選定的基因組片段內的特定位點插入選擇和顯示標記(通常使用抗藥性基因和/或螢光蛋白等基因加入基因編碼區內，利用這些遺傳標記觀察基因表達情況，進行定向篩選，得到成功的轉基因細胞)。向選定的基因組片段內的特定位置導入極稀少位點核酸酶的酶切位點(這些酶切位點的種類，數量和具體位置，視實驗需要而定)。導入標記和位點的方法為同源重組工程法或生物合成法。向基因組片段內導入方法特定序列的方法包括以下幾大類 a)基因組載體重組工程法(Recombineering),通過設計導入載體(包含有兩側與目標位點相同的同源序列和中間的導入位點序列)，在相關重組酶(recombinase)的作用下，以導入載體所含序列替代基因組內的目標序列。這一過程不依賴特定的酶切位點，能夠隨意對任何基因組片段內的特定位點進行操作。b)合成生物法(Synthetic Biology),主要採用吉布森拼接法(GibsonAssembly)。這包括以基因組片段的不同部位為模板進行多片段PCR擴增，通過設計PCR引物，將特定的序列導入PCR產物中。擴增後的各個PCR片段的末端含有相互重疊序列。再將這些PCR片段通過吉布森拼接反應，連接成含有導入位點的基因組大片段。c)也可以將上述兩種方法相結合，通過重組將特定序列導入載體內的基因組片段中，再將各個片段分離提純後，進行吉布森拼接反應。有關吉布森拼接反應的詳細過程參見相關網站(http://www. synbio. org. uk/dna-assembly/guidetogibsonassembly. html)。向基因組片段內導入的極稀少酶切位點能夠為該類核酸酶所特異性識別，並能夠在相應的酶切位點處切斷雙鏈DNA，製備出雙鏈斷端。此類核酸酶包括自然生成和人工改造過的，其中包括a)兆位核酸酶類(meganuclease),包括內含子核酸內切酶(intronendonucleases)和歸巢子核酸內切酶(intein endonucleases)。這類核酸酶的識別位點長度為12-40bp，不同的酶識別的位點不同，部分酶類已經有了商品化產品出售。b)重組酶(recombinase)和其他能夠在特定序列處切斷DNA的酶類,例如整合酶(integrase)。這類酶識別的位點長度在30_200bp之間,這些酶類可以通過轉基因技術在體內表達,並有商品化產品出售。c)其他種類的核酸酶類，如人工改造或人工合成過的極稀少核酸酶。3)大量擴增修飾後的基因組大片段。通過上述方法的到的修飾後基因組大片段可以通過載體在特定宿主菌內擴增，或通過吉布森拼接大量合成。這些大片段可以通過常規的分子克隆技術進行分離和純化。注意由於基因組片段比較大，操作時避免剪切力的損傷。運用轉基因手段(脂質體轉染或電穿孔轉染)將修飾後的基因組大片段導入目標細胞內，利用選擇性培養基或標記基因篩選轉染陽性細胞，建立穩定的轉染的細胞系。通過轉基因技術(原核微注射等)，製備包含修飾後基因組大片段的轉基因動物。利用southern雜交，定量PCR，螢光原位雜交等技術，確定轉基因細胞或轉基因動物體內轉入基因片段的數量。運用蛋白電泳，特異性抗體和組織染色等技術，分析目標基因的表達情況。
4)根據實驗目的，給與轉基因細胞或動物施加適當刺激，使得轉基因表達調控發生變化。這些刺激包括藥物，損傷，激素，生長因子等等，通過觀察轉入基因的顯示標記的變化，如細胞的目標蛋白含量，螢光強度等等，確定轉入的基因表達發生了所需變化。使用適當的交聯劑將核酸和核酸結合蛋白交聯固定，通常採用多聚甲醛(O. 5-1%)，紫外線照射法，還可以根據實驗要求選擇其他類交聯固定劑，注意所用交聯劑不應導致轉入基因組片段斷裂。同時，也可以使用非固定的細胞作為正常背底對照。5)收集所需數量的轉基因細胞或組織，破碎細胞，收集細胞核，清洗，將細胞核包埋在成形劑(如低熔點瓊脂糖)中(避免剪切力對轉入的基因組大片段的損傷)。破損核膜，加入當緩衝系，加入極稀少核酸內切酶進行消化。這些酶類將在轉入的基因片段上的特定酶切位點處將DNA切斷。去除成形劑，釋放消化後生成的基因片段(包括結合在這些片段上的調控蛋白)，分離純化片段(蔗糖密度梯度離心，超速離心，抗體磁珠捕捉，片段末端標記雜交純化等多種方法)。6)分離分析與核酸結合的蛋白和相應的核酸序列。蛋白分離包括核酸外切酶降解核酸片斷，蛋白電泳，酶解蛋白，質譜分析蛋白譜，確定結合蛋白的種類。核酸片段分析包括·蛋白酶降解蛋白，通過常規酚氯仿抽提，DNA電泳或PCR分析片段的種類位置。還可以用核酸內切酶和外切酶結合，切除片段內未結合蛋白的核酸到與蛋白結合處，向DNA末端接入接頭，用蛋白酶消化掉結合的蛋白，用接頭連接各蛋白結合片段，擴增測序，獲得與蛋白結合的位點序列。再通過比對轉入的基因組片段核酸序列，確定各結合位點在基因調控序列中的位置。本發明基於在真核細胞內，含特定基因的基因組大片段內含有調節該基因表達調控的所有序列，採用基因重組和生物合成等技術，在體外將極稀少核酸酶的特異性酶切位點定向插入含特定基因的基因組大片段內的特定位點。擴增純化這些含特定基因的修飾後基因組大片段後，將其導入細胞或動物內，製成含有多個修飾後基因組大片段的轉基因細胞或動物，從而使得內源性基因的相關調控因子能夠通過結合轉入基因所含有的基因調控元件，與內源性基因同步調節轉入的特定基因的表達。利用交聯劑將調控因子與相應的核酸序列交聯固定，並通過極稀少位點核酸酶具有的極高特異性消化轉入的修飾基因組片段，並保持原有細胞基因組不變，使得轉入的基因組片段在特定的酶切位點斷裂，生成交聯有調控因子的該基因的基因組小片段。再通過對這些生成的含該基因的基因組小片段進行蛋白分析和核酸序列分析，從而獲得同該基因在基因組內的調控機制相關的調節蛋白和調控序列的知識。與現有技術相比，本發明具有以下特點I、利用基因組大片段的大容量能夠包含所有特定基因體內表達調控元件的特點；
2、向這個含特定基因的基因組大片段內定嚮導入極稀少位點核酸酶的酶切位點；3、將修飾後的含有極稀少位點核酸酶酶切位點的基因組大片段導入細胞內，導入的修飾後基因組片段可達上百個，利用細胞內源基因的調控分子對導入基因的表達進行調控；4、用交聯劑將結合在含極稀少位點核酸酶酶切位點的導入基因組片段上的調控因子和核酸進行交聯；5、用極稀少位點核酸酶消化含有修飾後特定基因組片段，由於原有基因組內不含有特異性極稀少位點核酸酶的酶切位點，極稀少位點核酸酶將只切斷導入的修飾後基因組大片段，生成交聯有調控因子的小片段；6、分析這些產生自導入基因組大片段的小片段及交聯的調控分子，就可以得到調控該基因 表達的調控因子和相關調控序列。
權利要求
1.一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特徵在於所述方法包括以下步驟 1)通過查找基因組資料庫和相關載體庫，找到包含有目的基因或基因組位點的完整基因組序列，並根據以往對該基因或基因位點的相關研究，確定所需基因組片段長度，所述所需基因組片段長度的範圍在100kb-300kb之間； 2)對步驟I)所選定的基因組片段進行修飾，得到修飾後的基因組片段； 3)將步驟2)所得到的修飾後的基因組片段進行大量擴增純化，並運用轉基因手段將修飾後的基因組片段導入目標細胞或目標動物內，並分別形成轉基因細胞或轉基因動物 4)對步驟3)所得到的轉基因細胞或轉基因動物施加特定刺激，所述特定刺激能夠影響轉基因表達調控機制，使轉基因表達發生變化； 5)從步驟4)所得到的刺激後的轉基因細胞或轉基因動物中獲取基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白； 6)分離分析與核酸結合的蛋白和相應的核酸序列。
2.根據權利要求I所述的篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特徵在於所述步驟2)中的修飾的內容包括向選定的基因組片段內的特定位點插入選擇和顯示標記以及向選定的基因組片段內的特定位點導入極稀少位點核酸酶的酶切位佔. 所述向選定的基因組片段內的特定位點插入選擇和顯示標記是將抗藥性基因和/或螢光蛋白等序列加入基因編碼區內，利用這些遺傳標記觀察轉入基因的表達情況，並進行定向篩選，獲得成功的轉基因細胞和/或動物； 所述向基因組片段內導入的極稀少核酸酶的酶切位點是一段能夠為極稀少核酸酶所特異性識別的核酸序列；所述極稀少核酸酶能夠識別並結合這些位點並與這些位點結合，並能夠在相應的酶切位點處切斷雙鏈DNA，製備出有雙鏈斷端的DNA ;所述極稀少核酸酶包括但不限於兆位核酸酶類、重組酶以及能夠在特定序列處切斷DNA的酶類；所述兆位核酸酶類包括內含子核酸內切酶以及歸巢子核酸內切酶；所述極稀少核酸酶識別的位點長度在IObp以上； 所述修飾的實現方式是基因組載體重組工程法和/或生物合成法。
3.根據權利要求2所述的篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特徵在於所述步驟3)的具體實現方式是 3.I)通過載體在特定宿主菌內擴增或通過吉布森拼接大量合成修飾後的基因組片段； 3.2)通過常規的分子克隆方法對步驟3. I)所得到的大量的修飾後的基因組片段進行分離和純化； 3.3)運用轉基因方法將步驟3. 2)所得到的修飾後的基因組大片段導入目標細胞或目標動物內； 若導入目標細胞時，所述轉基因方法包括但不限於脂質體轉染或電穿孔轉染，利用選擇性培養基或標記基因篩選轉染陽性細胞，建立穩定的轉基因細胞； 若導入目標動物時，所述轉基因方法包括但不限於原核微注射，並據此製備包含修飾後基因組大片段的轉基因動物；.3. 4)利用southern雜交、定量PCR、螢光原位雜交等分子生物學方法確定在轉基因細胞或轉基因動物體內轉入的基因片段的數量； .3.5)運用蛋白電泳、特異性抗體以及組織染色等分子生物學方法分析目標基因的表達情況。
4.根據權利要求3所述的篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特徵在於所述步驟4)的具體實現方式是 4.I)對轉基因細胞或轉基因動物施加特定刺激，所述特定刺激是為研究所設定的刺激，包括各種物理、化學以及其他分子生物學上可接受的刺激；所述特定刺激包括但不限於藥物、損傷、激素以及生長因子； 4.2)觀察轉入基因的顯示標記的變化，確定轉入的基因表達發生了所需變化；使用交聯劑將核酸和核酸結合蛋白交聯固定；所述交聯劑包括但不限於質量百分比濃度是O. 5-1%的多聚甲醛。
5.根據權利要求4所述的篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特徵在於所述步驟5)的具體實現方式是 5. I)收集步驟4)所得到的刺激後的轉基因細胞或轉基因動物的組織；使用交聯劑將核酸和同核酸結合的蛋白交聯在一起； 5. 2)獲取轉基因細胞的細胞核或轉基因動物組織的細胞核，並將細胞核包埋在成形劑中；所述成形劑包括但不限於低熔點瓊脂糖； 5. 3)破損核膜，加入極稀少核酸內切酶以及適當的緩衝系進行消化；所述極稀少核酸內切酶將在轉入的基因片段上的特定酶切位點處將DNA切斷； 5. 4)去除成形劑，釋放消化後生成的基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白； 5.5)將步驟5. 4)所得到的基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白進行分離純化；所述分離純化片段包括但不限於蔗糖密度梯度離心、超速離心、抗體磁珠捕捉以及片段末端標記雜交純化。
6.根據權利要求5所述的篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，其特徵在於所述步驟6)的具體實現方式是 6.I)對蛋白進行分離及蛋白種類的確定所述蛋白分離包括核酸外切酶降解核酸片斷、蛋白電泳、酶解蛋白以及質譜分析蛋白譜，所述蛋白分離是確定結合蛋白的種類； 6.2)對核酸片段進行分析；所述核酸片段分析包括蛋白酶降解蛋白、通過常規酚氯仿抽提、DNA電泳、PCR分析、用核酸內切酶和外切酶結合，切除片段內未結合蛋白的核酸到與蛋白結合處，向DNA末端接入接頭，用蛋白酶消化掉結合的蛋白，用接頭連接各蛋白結合片段，擴增測序，獲得與蛋白結合的位點序列； 6.3)通過比對轉入的基因組片段核酸序列，確定各結合位點在基因調控序列中的位置，並確定與這些位點相結合的蛋白種類，確定參與特定基因表達調控的相關蛋白及其結合位點。
全文摘要
本發明涉及一種篩選真核細胞基因組內特定基因調控相關機制和分子的方法，1)確定研究所需基因組片段長度；2)對選定的基因組片段進行修飾；3)將修飾後的基因組片段進行大量擴增純化，並運用轉基因手段將修飾後的基因組片段導入目標細胞或目標動物內，分別形成轉基因細胞或轉基因動物4)對轉基因細胞或轉基因動物施以特定刺激；5)從刺激後的轉基因細胞或轉基因動物中獲取基因片段以及結合在這些基因片段上的調控蛋白；6)分離分析與核酸結合的蛋白和相應的核酸序列；本發明提供了一種能夠高效篩選參與指定基因或遺傳位點表達調控相關蛋白及其結合位點的高特異性，高靈敏性研究方法。
文檔編號G01N33/68GK102839214SQ20121032638
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月6日 優先權日2012年9月6日
發明者許漢鵬 申請人:許漢鵬