一種抗凋亡高效表達hVEGF₁₆₅細胞模型及其建立方法

2023-12-09 09:34:51 2

專利名稱：一種抗凋亡高效表達hVEGF165細胞模型及其建立方法
技術領域：
本發明涉及一種抗凋亡高效表達hVEGF165細胞模型及其建立方法。屬於生物醫學研究技術領域。
背景技術：
研究表明VEGF的血管生成作用部分是通過誘導血管內皮細胞中BCL-2的表達來實現的。VEGF誘導BCL-2的高表達有助於提高血管內皮細胞在低氧、中毒等條件下的存活 [18]。Xu等的實驗表明BMSCs移植改善心梗後的心功能主要是通過旁分泌一些諸如VEGF等的細胞因子進而上調心肌細胞的BCL-2的表達來實現心臟保護作用的[19]。BCL-2還能抑制由NO誘導的血管內皮細胞的凋亡，促進血管的形成_]。腫瘤細胞中BCL-2的過表達促進了 VEGF的表達及腫瘤的血管生成[21]。可見在多種細胞中VEGF和BCL-2之間存在著互相上調的級聯關係，生物學功能上形成協同作用。BCL-2和VEGF共表達聯合應用於基因治療上，可能產生較單個治療基因更為理想的治療效果。腺病毒載體宿主範圍廣、轉染效率和基因表達水平高、安全性較好，是基因治療的優良載體，是心肌梗死基因治療較為理想的載體。目前心肌梗死的基因治療或對幹細胞基因修飾後移植治療心肌梗死採用的大多為抗凋亡或促血管生成等單基因的治療方法，少有應用雙基因治療的報導，更罕見應用雙基因共表達載體。目前尚未見同時應用人BCL-2和人VEGF165基因治療心肌梗死或對幹細胞基因修飾後移植治療心肌梗死的報導。骨髓間充質幹細胞(BMSCs)在骨髓中含量低，它的分離純化問題一直是BMSCs研究中的一個重要但至今還沒完全解決的問題。目前分離純化BMSCs的方法有2種1)密度梯度離心法，BMSCs與其他細胞密度不同，根據沉降作用原理，將其置於某一梯度的介質中離心以除去其他細胞。這種密度梯度離心法可獲得相對較高純度的骨髓間充質幹細胞 (BMSCs)，但對細胞活性的幹擾較大。2)表面標誌物篩選法，根據細胞表面的一些特殊表面標誌物，用各種單克隆抗體進行陽性或陰性篩選，因BMSCs無特殊的表面標記物，只好採用多種標記物聯合篩選的方法進行，目前有流式細胞儀分選法、免疫溶解法、平面粘附分離法、免疫磁珠分離法。上述方法對BMSCs的細胞活性同樣有影響，而且需要用到特殊抗體或者分離液，比較費時且花費較多。腺病毒轉染細胞最重要的一個步驟是細胞表面有受體與其結合，且轉染效率與細胞表面的腺病毒受體密度及數量密切相關。而許多細胞表面上腺病毒受體通常是低水平表達或者不表達，包括許多腫瘤細胞、骨骼肌細胞、淋巴細胞、纖維細胞、造血幹細胞。而且腺病毒轉染細胞後，對細胞有毒性作用，可導致細胞的死亡。因此，想讓重組腺病毒能夠表達所攜帶的基因並提高轉染的效率，首先就得選擇合適的腺病毒轉染目標細胞，而BMSCs往往作為第一選擇，但是普通BMSCs在體外培養壽命較短，不能持續高效表達hVEGF165。因此， 如何構建一種使BMSCs凋亡比例降低、壽命延長、持續時間更長、高效表達hVEGF165的細胞模型是本發明的主要任務。

發明內容
本發明的第一個目的，是為了解決現有技術BMSCs在體外培養壽命較短，不能持續高效表達hVEGF165的問題，提供一種活力良好的抗凋亡高效表達hVEGF165的細胞模型。本發明的第二個目的，是為了提供一種簡單方便、經濟有效的抗凋亡高效表達 hVEGF165的細胞模型的建立方法。本發明的第一個目的可以通過以下技術方案達到一種抗凋亡高效表達hVEGF165的細胞模型，其特徵是以純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs作為轉染細胞，以hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒，將hBCL_2和 hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒轉染純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs，構成抗凋亡且高效表達hVEGF165的細胞模型。本發明的第二個目的可以通過以下技術方案達到一種抗凋亡高效表達hVEGF165的細胞模型的建立方法，其特徵在於包括以下步驟1)取得純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs取大鼠股骨，在無菌條件下剔除肌肉組織，剪去兩端幹骺端，抽取含20%胎牛血清 FBS的DMEM培養基，反覆衝洗骨髓腔，收集細胞懸液於離心管中進行離心後棄去上清，加入 DMEM培養基後放於細胞培養瓶中，將培養瓶置於35°C 39°C、5% CO2的細胞培養箱內培養；經過20-30小時後部分細胞貼壁生長，棄去上清液，然後每2-3天換液1次，直到細胞達到85%-90%融合時，以1 2或1 3傳代培養，再以DMEM培養基繼續培養，直到獲得純化的的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs ；2)重組腺病毒轉染純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs調整純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs的細胞懸液密度，以5X104/ml密度接種在多孔板上，每孔加入DMEM培養基，在細胞培養箱以35°C 39°C、5% CO2的條件下培養； 經過40-50小時後，吸除舊培養液，再次每孔加入DMEM培養基，按病毒感染複數MOI = 0、 10、50、100、200、400分別加入相應體積的重組腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 ；對所述大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs細胞轉染、經過20-30小時後，棄去舊培養液，換為更低含量FBS 的DMEM培養液，繼續對所述大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs細胞轉染，在此次轉染過程中的不同時間段分別觀察細胞綠色螢光蛋白的表達，繼續培養60-80小時後，然後消化多孔板細胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；將每孔的細胞消化後重懸於含0. 5ml的0. OlM PBS的流式細胞儀專用檢測管中，用吸管輕輕吹打為單個細胞懸液，在流式細胞儀上逐管檢測綠色螢光蛋白陽性細胞的比例，測得轉染效率最高的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs ；3)然後，採用轉染效率最高的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs建立的細胞模型，抗凋亡且高效表達hVEGF165的細胞模型。本發明的第二個目的還可以通過以下技術方案達到步驟1)對大鼠BMSCs分離純化過程可以為如下所述將大鼠用3%戊巴比妥鈉aiil/kg腹腔注射麻醉後置於75%酒精中浸泡lOmin， 剪去其皮毛；取大鼠股骨，在無菌條件下剔除肌肉組織，剪去兩端幹骺端，用IOml注射器抽取含20%胎牛血清FBS的DMEM培養基，反覆衝洗骨髓腔，收集細胞懸液於離心管中，以1200rpm/min離心lOmin，棄去上清，加入含有10% FBS的DMEM培養基，吹勻後放於細胞培養瓶中，將培養瓶置於35°C 39°C、5% CO2的細胞培養箱內培養；經過24h後，部分細胞貼壁生長，棄去上清液，然後每2-3天換液1次，當細胞達到85%-90%融合時，以1 2或 1 3傳代培養，以10% FBS的DMEM培養基繼續培養，從而獲得大量純化的BMSCs ；步驟2)重組腺病毒轉染BMSCs過程可以如下所述用細胞計數儀調整BMSCs細胞懸液的密度，以5X 104/ml密度接種在6孔板上， 每孔加入1. 5ml含10% FBS的DMEM培養基，在細胞培養箱以35°C 39°C、5% CO2的條件下培養；經過4 後，吸除舊培養液，每孔加入1.5ml的DMEM，按病毒感染複數MOI = O、 10、50、100、200、400分別加入相應體積的重組腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 (滴度為 5X109pfu/ml)；轉染24h後，棄去舊培養液，換為含2% FBS的DMEM培養液，經過24h、48h、 7 分別在螢光顯微鏡下觀察細胞綠色螢光蛋白的表達，結果得出7 時表達最強；繼續培養72h，然後消化6孔板細胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；將每孔的細胞消化後重懸於含0. 5ml的0. OlM PBS的流式細胞儀專用檢測管中，用吸管輕輕吹打為單個細胞懸液，在流式細胞儀上逐管檢測綠色螢光蛋白陽性細胞的比例，從而測得MOI = 400時轉染效率最高；然後，採用MOI = 400轉染72h的BMSCs建立細胞模型。步驟1)步中所述大鼠可以為SD大鼠，重100_150g。步驟1)步中所述細胞培養瓶可以為2個T-25cm2細胞培養瓶。步驟2~)步中所述觀察細胞綠色螢光蛋白的表達可以通過普通光鏡或螢光顯微鏡觀察。本發明所述抗凋亡且高效表達hVEGF165細胞模型的用途，1)用於治療心肌梗死等疾病；2)用於移植至受體器官。本發明具有如下突出的有益效果1、本發明篩選出BMSCs作為hBCL_2和hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒理想的轉染目標細胞，測定出轉染重組腺病毒後BMSCs高效分泌hVEGF165並且在模擬血清剝奪環境下轉染後的BMSCs凋亡比例降低；解決了 hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒不易轉染細胞及在目標細胞裡面表達的問題，也解決了普通BMSCs移植到缺氧心臟後壽命較短，不能持續高效表達hVEGF165的問題；本細胞模型將在幹細胞移植治療心肌梗死領域開闢新的道路，具有廣泛的臨床應用前景。2、本發明通過改良的分離純化可以快速大量獲得活力良好的BMSCs，轉染效率達 70 %，為臨床上BMSCs細胞移植治療心肌梗死等疾病提供便利。3、本發明轉染重組腺病毒BMSCs較普通BMSCs的細胞凋亡比例有明顯減少，壽命延長，能夠高效表達hVEGF165，有利於將該細胞模型移植至受體器官，並且可以提高治療疾病的效果，具有廣泛的應用前景。


圖1A-1C為原代培養的大鼠BMSCs圖。圖1D-1F為傳代培養的大鼠BMSCs圖。圖2A-2H為BMSCs細胞表面標記物流式細胞儀檢測結果示意圖。圖3A、3C、3E為轉染重組腺病毒後的BMSCs的普通光鏡Mh、48h、7ai變化圖。
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圖;3B、3D、3F為轉染重組腺病毒後的BMSCs的螢光顯微鏡變化圖。圖4A-4F為流式細胞儀測定重組腺病毒轉染BMSCs效率示意圖。圖5為VEGF165分泌水平示意圖。圖6A-6C為BMSCs凋亡檢測流式細胞儀散點示意圖。
具體實施例方式具體實施例1 本實施例涉及的抗凋亡且高效表達hVEGF165的細胞模型，以純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs作為轉染細胞，以hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒，將hBCL_2 和hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒轉染純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs，構成抗凋亡且高效表達hVEGF165的細胞模型。本實施例的建立方法以及檢測過程包括以下步驟1)取得純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs ；2)重組腺病毒轉染純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs ；3)然後，採用轉染效率最高的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs建立的細胞模型，抗凋亡且高效表達hVEGF165 的細胞模型。具體操作方法如下一、對大鼠BMSCs分離純化1、大鼠BMSCs的分離1)取100_150g的雄性SD大鼠，3 %戊巴比妥鈉^il/Kg腹腔注射麻醉，將其置於 75%酒精中浸泡10分鐘，繼而將老鼠放在一個消毒過的塑料盆中。2)戴無菌手套，剪開SD大鼠下肢皮膚，完全暴露下肢肌肉，鈍性分離肌肉組織，顯露股骨和脛骨，從股骨和脛骨連接處小心進行分離，完整取出股骨；同法取出脛骨，然後轉移至超淨工作檯，放於含無菌0. OlM胎牛血清FBS的培養皿中。3)將分離的SD大鼠股骨和脛骨置於裝有IOml無菌胎牛血清FBS培養皿中，換新的無菌手套，換用超淨臺裡面的無菌鑷子及剪刀，剔除脂肪及肌肉組織，露出骨髓端。然後放到另外一個含無菌胎牛血清FBS的培養皿中去除骨頭外面的血液及附著的肌肉，用無菌胎牛血清FBS反覆衝洗三遍，直至骨頭外面無血液及肌肉殘留。4)用大剪刀剪去骨頭兩端的軟骨，止血鉗夾住骨頭，用IOml注射器抽取含20%胎牛血清FBS的H-DMEM培養基5ml，將針頭插入骨髓腔內反覆衝洗，可見骨髓液從軟骨端呈雲霧狀流出，待骨髓腔變白時可停止衝洗，同法獲取其餘骨頭的骨髓。5)收集骨髓懸液於15ml離心管中，1200rpm室溫離心lOmin，棄上清，用8ml含 20%胎牛血清FBS新鮮培養基重懸細胞，轉移至2個T-25cm2細胞培養瓶中。2、大鼠BMSCs的原代培養將細胞培養瓶置於37°C、5% CO2飽和溼度的細胞培養箱中培養，剛接種時骨髓中體積較大的單個核細胞呈球形，懸浮於培養液中，8-10h開始逐漸沉降貼壁；24h後棄去未貼壁細胞，更換培養液，用含10 %胎牛血清FBS的H-DMEM培養基培養細胞，可見細胞基本貼壁，但細胞數量較少，細胞呈長條形或多角形，如圖IA所示；以後每2-3天換液1次，培養至第3天可見細胞多逐漸變成長梭形，如圖IB所示；之後細胞快速增殖，細胞核居中，偶有雙核，至接種後第6天細胞形成集落，形似短棒狀或纖維樣，呈平行或旋渦狀排列，如圖IC所示；貼壁細胞接近80% -90%融合後，結束原代培養。3.大鼠BMSCs傳代擴增培養1)細胞融合至80%-90%時，棄去舊培養液，加入2ml滅菌0. OlM的胎牛血清FBS 溶液，輕輕晃動，洗滌細胞生長面，然後棄去PBS溶液。幻加入Iml 0.25%胰酶，置於倒置顯微鏡下觀察細胞形態，待鏡下細胞之間突起消失、變圓後，棄去胰酶；加入含10%胎牛血清FBS的H-DMEM細胞培養基6ml終止消化，用吸管輕柔吹打成單細胞懸液。3)按1 2傳代分至2個新的T-25cm2培養瓶，置於37°C ,5% CO2的培養箱中繼續培養，此時記為Pl (第1代)，以後每3-4天細胞傳代一次。傳代培養3-4h開始貼壁，6-8h 貼壁完全，至P1、P2、P3以備實驗用時細胞形態未見明顯變化，但生長更為迅速，同樣時間內更快長滿瓶底，均勻有序地以成纖維細胞樣分布特徵，如圖1D-1F所示。4.大鼠BMSCs的鑑定1)P3細胞融合至90%左右，用0. 25%胰酶消化細胞，具體步驟同上。2)收集細胞懸液，細胞計數儀計數後，調整每個檢測樣本的細胞數為5X105。3) 1200rpm室溫離心5分鐘，棄上清。4)滅菌胎牛血清FBS洗滌2遍並於相同條件下離心，棄上清，於待檢測的樣本中各加入IOOul滅菌1 X胎牛血清FBS溶液，輕輕混勻，分別加入⑶四、⑶34、⑶44、⑶45、⑶90 一抗及同型陰性對照各10ul。5)37°C避光孵育15分鐘，每管加入胎牛血清FBS溶液Iml後上流式細胞儀檢測。 檢測結果如圖2A-2H所示。二、重組腺病毒轉染BMSCs1、重組腺病毒轉染BMSCs效率的測定1)用細胞計數儀調整消化後細胞懸液的密度，以5 X IOVml密度接種在6孔板，每孔加入1. 5ml含10%胎牛血清FBS DMEM在細胞培養箱以5% CO2, 37°C條件下培養。2)培養24h後吸除舊培養液，每孔仍加入1. 5ml含10%胎牛血清FBS的DMEM培
養基，繼續在培養箱中培養。3)24h後，吸除舊培養液，每孔加入1. 5ml DMEM培養基。為獲得最佳的病毒感染複數(multiplicity ofinfection，MOI)，按 MOI = O、10、50、100、200、400 分別加入相應體積的重組 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 (滴度為 5X K^pfu/mL)病毒液。4)轉染24h後棄去舊培養液，換為含2%胎牛血清FBS的DMEM培養基，經過Mh、 48h,72h分別觀察細胞綠色螢光蛋白的表達，結果表明在72h時達到最強，其後不再增加， 如圖3A-3F所示。5)繼續培養72h，然後消化6孔板細胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；將每個孔的細胞消化後重懸於含0. 5ml 0.01M PBS的流式細胞儀專用檢測管中，用吸管輕輕吹打為單個細胞懸液。6)在流式細胞儀上逐管檢測檢綠色螢光蛋白陽性細胞的比例，測得其轉染效率在 8. 08% 70. 65%之間，可知最佳MOI = 400，如圖4A-4F所示。三、ELISA檢測轉染後BMSCs培養上清中VEGF165的含量1、BMSCs培養上清液的收集
1)消化細胞接種於6孔板，並用病毒液轉染BMSCs。2)分為3組第1組為正常BMSCs組；第2組為轉染Ad-EGFP的BMSCs組；第3組為轉染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 的 BMSCs 組。在轉染病毒後第 1、3、5、7、9、11、13、15、17 天收集培養孔的細胞上清液，每次收集完上清液後，每孔再重新加入1. 5ml新鮮的DMEM培養基。 直至第15天。收集後的上清液以3000rpm/min，4°C離心20min，然後放於_20°C冰箱保存。 待收集完所有時間點的細胞上清液後，將各個標本同時進行檢測。2. ELISA試劑盒檢測上清液中VEGF165濃度1)標準品的稀釋與加樣在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第1、第2孔中分別加入標準品lOOul，然後在第1、第2孔中加標準品稀釋液50ul，混勻；然後從第1、第2孔中各取IOOul分別加到第3孔和第4孔，再在第3、第四孔分別加標準品稀釋液50ul，混勻 』然後在第3孔和第4孔中先各取50ul棄掉，再各取50ul分別加入到第5、第6孔中，再在第5、 第6孔中分別加入標準品稀釋液50ul，混勻；混勻後從第5、第6孔中各取50ul分別加到第 7、第8孔中，再在第7、第8孔中分別加入標準品稀釋液50ul，混勻後從第7、第8孔中分別取50ul加到第9、第10孔中，再在第9第10孔分別加入標準品稀釋液50ul，混勻後從第9 第10孔各取50ul棄掉。(稀釋後各孔加樣量都為50ul，濃度分別為600pg/ml，400pg/ml， 200pg/ml,100pg/ml，50pg/ml)。2)加樣分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同)、 待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40ul，然後再加待測樣品 IOul (樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加於酶標板孔底部，儘量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。3)溫育用封板膜封板後置於37°C溫育30分鐘。4)配液將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋後備用。5)洗滌小心揭掉封板膜，棄去液體，甩幹，每孔加滿洗滌液，靜置30秒後棄去，如此重複5次，拍幹。6)加酶每孔加入酶標試劑50ul，空白孔除外。7)溫育操作同3)步。8)洗滌操作同5)步。9)顯色每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50ul，輕輕振蕩混勻，37°C避光顯色15分鐘。10)終止每孔加終止液50ul，終止反應。11)測定以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(0D值)。測定應在加終止液後15分鐘以內進行。12)繪製標準曲線，SPSS10. 0軟體擬合二次方程，將樣品OD值轉換為濃度。轉染重組腺病毒後BMSCs的VEGF165分泌水平(pg/ml)如圖5所示，除了 ld、3d、 7d及lld，轉染Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2腺病毒的BMSCs上清中VEGF165的分泌水平與正常 BMSCs組相比，均顯著提高，差異有統計學意義(P<0.05)；除了 Id及3d，其餘時間點與轉染Ad-EGFP的BMSCs組相比，VEGF165的分泌水平有統計學差異(P 0. 05)。隨著時間的推移，轉染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2腺病毒組VEGF165分泌量逐漸增加，至13d達到高峰(924. 3士56. 5)pg/ml, η = 3。此後，VEGF165分泌逐漸下降，但仍保持在一個可檢測水平之上，並持續至 17d(4682 士83. 3) pg/ml 以後。轉染 Ad-EGFP 的 BMSCs 組(494. 6 士 114. 8) pg/ml 及正常 BMSCs 組(592. 0士 135. 8)pg/ml都於Ild達到分泌峰值。四、轉染重組腺病毒後BMSCs在模擬血清剝奪環境下凋亡檢測1、用Annexin V-PE/7-AAD檢測盒對細胞凋亡檢測1)消化細胞接種於6孔板，並用病毒液轉染BMSCs。2)分為3組第1組為正常BMSCs組；第2組為轉染Ad-EGFP的BMSCs組；第3組為轉染 Ad-EGFP-VEGF165-BCL-2 的 BMSCs 組。3)在轉染病毒24h後，各個組的細胞用0. OlMPBS漂洗2次，以去除殘留的培養基， 加入不含FBS的H-DMEM培養基，以無血清環境下培養6天。4)吸除培養孔裡面的舊培養液，每個孔用0. OlM的胎牛血清FBS漂洗一遍。5)每孔加入0. 25%胰酶消化細胞lmin，加樣槍輕輕吸除胰酶。6)每孔加入Iml胎牛血清FBS溶液，用吸管吹打孔裡面的貼壁細胞，然後將單細胞懸液轉移到15ml離心管。7) 1200rpm/min，4°C離心 5min。8)加入IOOul IXBinding Buffer，用吸管輕輕吹打成單細胞懸液，然後轉移到流式細胞儀專用檢測管。9)每個檢測管依次加入 5ul Annexin V-PE 及 5ul 7-AAD。10)輕輕振蕩檢測管，室溫下避光反應15min。11)每個管再加入400ul IXBinding Buffer，輕輕振蕩混勻。12)在Ih內於流式細胞儀上機檢測。如圖6A-6C所示，分別為第1組、第2組和第3組BMSCs凋亡檢測流式細胞儀散點圖，左下象限顯示活細胞，為(PE-/AAD-)；右上象限是非活細胞，即壞死及晚期凋亡細胞， 為(PE+/AAD+)；而右下象限為早期凋亡細胞，顯現(PE+/AAD-)，可以看到第3組細胞左下象限細胞數少，凋亡細胞比例低，而第1組及第2組細胞左下象限凋亡細胞比例較高。第3組細胞的凋亡率(3. 43士 1.61% )明顯比第2組(9. 92士5. 99% )及第1組 (10. 51 士4. 54% )低，且有統計學差異(ρ 0. 05)。凋亡檢測的結果證明轉染重組腺病毒後BMSCs表達BCL-2蛋白增加，可以抑制細胞的凋亡，降低凋亡細胞比例，具有實際的生物學效應。如下表1所示。
權利要求
1.一種抗凋亡高效表達hVEGF165的細胞模型，其特徵在於以純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs作為轉染細胞，以hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒，將hBCL_2和 hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒轉染純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs，構成抗凋亡且高效表達hVEGF165的細胞模型。
2.如權利要求1所述的一種抗凋亡高效表達hVEGF165的細胞模型的建立方法，其特徵在於包括以下步驟1)取得純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs取大鼠股骨，在無菌條件下剔除肌肉組織，剪去兩端幹骺端，抽取含20%胎牛血清FBS 的DMEM培養基，反覆衝洗骨髓腔，收集細胞懸液於離心管中進行離心後棄去上清，加入 DMEM培養基後放於細胞培養瓶中，將培養瓶置於35°C 39°C、5% CO2的細胞培養箱內培養；經過20-30小時後部分細胞貼壁生長，棄去上清液，然後每2-3天換液1次，直到細胞達到85%-90%融合時，以1 2或1 3傳代培養，再以DMEM培養基繼續培養，直到獲得純化的的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs ；2)重組腺病毒轉染純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs調整純化的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs的細胞懸液密度，以5X104/ml密度接種在多孔板上，每孔加入DMEM培養基，在細胞培養箱以35°C 39°C、5% CO2的條件下培養；經過40-50小時後，吸除舊培養液，再次每孔加入DMEM培養基，按病毒感染複數MOI = 0、10、 50、100、200、400分別加入相應體積的重組腺病毒液Ad-EGFP-VEGF165-BCL_2 ；對所述大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs細胞轉染、經過20-30小時後，棄去舊培養液，換為更低含量FBS 的DMEM培養液，繼續對所述大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs細胞轉染，在此次轉染過程中的不同時間段分別觀察細胞綠色螢光蛋白的表達，繼續培養60-80小時後，然後消化多孔板細胞，每孔加入0. 25%胰酶0. 5ml，操作同前；將每孔的細胞消化後重懸於含0. 5ml的0. OlM PBS的流式細胞儀專用檢測管中，用吸管輕輕吹打為單個細胞懸液，在流式細胞儀上逐管檢測綠色螢光蛋白陽性細胞的比例，測得轉染效率最高的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs ；3)然後，採用轉染效率最高的大鼠骨髓間充質幹細胞BMSCs建立的細胞模型，抗凋亡且高效表達hVEGF165的細胞模型。
3.如權利要求2所述的一種抗凋亡高效表達hVEGF165的細胞模型的建立方法，其特徵在於步驟1)中，在將取大鼠股骨前，先將大鼠用3%戊巴比妥鈉aiil/kg腹腔注射麻醉後置於75%酒精中浸泡lOmin，剪去其皮毛；所用衝洗骨髓腔的DMEM培養基為含20%胎牛血清FBS的DMEM培養基；用於培養細胞的的DMEM培養基為含10%胎牛血清FBS的DMEM培養基。
4.如權利要求2所述的一種抗凋亡高效表達hVEGF165的細胞模型的建立方法，其特徵在於步驟1)中，用於第一次培養細胞的DMEM培養基為含10%胎牛血清FBS的DMEM培養基，用於第二次培養細胞的DMEM培養基為含2%胎牛血清FBS的DMEM培養基。
5.根據權利要求2所述的一種抗凋亡且高效表達hVEGF165細胞模型的建立方法，其特徵在於1)步中所述的大鼠為SD大鼠，重100-150g。
6.根據權利要求2所述的一種抗凋亡高效表達hVEGF165細胞模型的建立方法，其特徵在於1)步中所述的細胞培養瓶為二個T-25cm2細胞培養瓶。
7.根據權利要求2所述的一種抗凋亡高效表達hVEGF165細胞模型的建立方法，其特徵在於 步中所述的觀察細胞綠色螢光蛋白的表達通過普通光鏡或螢光顯微鏡觀察。
全文摘要
本發明涉及一種抗凋亡高效表達hVEGF165細胞模型及其建立方法，該細胞模型以BMSCs作為轉染細胞，與hBCL-2和hVEGF165雙基因共表達重組腺病毒。其建立方法包括以下步驟1)對大鼠BMSCs分離純化，從而獲得大量純化活力良好的BMSCs；2)重組腺病毒轉染BMSCs，採用病毒感染複數MOI＝400轉染72h的BMSCs建立細胞模型。其用途特徵是1)用於治療心肌梗死等疾病；2)用於移植至受體器官。本發明轉染重組腺病毒BMSCs較普通BMSCs的細胞凋亡比例有明顯減少，壽命延長，能夠高效表達hVEGF165，有利於將該細胞模型移植至受體器官，並且可以提高治療疾病的效果，具有廣泛的應用前景。
文檔編號C12N7/01GK102329777SQ201110206260
公開日2012年1月25日 申請日期2011年7月22日 優先權日2011年7月22日
發明者何曉青, 倪曉彬, 劉世明, 林育輝, 羅承鋒, 陳敏生 申請人:廣州醫學院第二附屬醫院