診斷應激的藥物和方法

2023-12-10 00:09:21 4

專利名稱：：診斷應激的藥物和方法診斷應激的藥物和方法發明領域本發明總體上涉及測定免疫系統狀態的方法和藥物。更具體地說，本發明涉及以下用途的分子和試驗定量或定性測定應激對免疫系統的影響，因應激導致免疫系統功能障礙而對疾病或病症易感，與監測動物對付應激的能力。本發明可用於檢測對免疫調節治療的反應，監測在應激狀態下對天然疾病的免疫應答。在某些實施方案中，本發明可用於監測徑賽動物的訓練，檢測衰老對應激和外部應激反應能力的影響，能夠對因受應激作用而處於患病危險或易於患病動物作出更好治療和處理決定。發明背景
發明內容免疫系統有保護生物免遭外來侵襲和攻擊的作用。哺乳動物的宿主免疫系統按功能可分為適應性免疫和先天性免疫。先天免疫力往往是對外部攻擊的第一道防線，由天然屏障組成，例如角質表面、分泌物和化學物質，如皮膚、黏膜、溶菌酶和急性期蛋白。大多數生物有先天免疫系統，它是非特異性的，作為先天免疫系統一部分的許多防禦分子在廣泛物種之間進化上保守(例如，在無脊椎動物進化早期己出現補體組分)。適應性免疫系統可產生特異性應答並"記住"感染或入侵因子從而使宿主對以後的攻擊產生回憶應答。適應性免疫系統按功能也可分為體液和細胞免疫。體液免疫由可溶性因子組成，在哺乳動物中是抗體。高等生物的免疫系統細胞由淋巴(細胞)或骨髓(細胞)系組成。淋巴細胞在胸腺(T細胞)或骨髓(B細胞)中分化。B細胞和T細胞形態學相同。骨髓細胞有吞噬細胞和其它細胞，例如血小板和肥大細胞。吞噬細胞有單核細胞或多形核細胞。[免疫系統及其細胞和體液組分的概述見《基礎免疫學》(EssentialImmunology),第十版，Roitt和Delves,BlackwellPublishing,2001;《免疫生物學.健康人和病人的免疫系統》(Immunobiology.TheImmunesysteminHealthandDisease),第四版，Janeway等，GarlandPublishing,1999〗。哺乳動物免疫系統的功能性研究已有大量文獻，可採用許多試驗來檢測免疫系統的功能。與細胞免疫系統相比，體液免疫系統更易於進行功能性測試。例如，抗體與其靶分子特異性結合，可採用諸如抗體擴散與沉澱試驗、酶聯免疫吸附測定來直接檢測，或可用於抗原捕獲試驗來檢測是否存在侵入性生物。細胞免疫系統的功能更難於檢測，往往包括用染色劑或細胞表面蛋白質的特異性抗體對細胞的不同亞群進行簡單計數。例如，醫學上最常見的血液檢測之一是檢測紅細胞、白細胞和血小板數目的全血計數(CBC)。區別性白細胞計數採用瑞氏(Wright)染色來計數淋巴細胞、嗜中性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、嗜酸性粒細胞與單核細胞。細菌感染往往導致外周血液樣品中嗜中性粒細胞數量增加，寄生蟲感染往往導致嗜酸性粒細胞數量增加。然而，對外周血液樣品中白細胞類型的計數往往不是免疫系統功能的良好指標，它是非特異性的(不能確定感染或攻擊的性質)，不能區分B和T細胞譜系的淋巴細胞。B淋巴細胞產生抗體，T淋巴細胞是免疫系統的主要調節(細胞)和效應(細胞)。根據B和T細胞表面蛋白質的不同(標記)可區分它們的各種亞群。B細胞在細胞表面表達免疫球蛋白(抗體)，T細胞根據它們的發育和功能階段表達不同標記。已開發了許多不同的試劑(往往是抗體)來區分人與實驗動物的T和B細胞不同亞群，許多試劑可購自例如AlexisCorporation(www.alexis-corp.com)等公司。此外，B和T細胞(包括亞群)簡單計數不能提供這些細胞功能的信息。製備用於檢測細胞表面標記的試劑是費力和高度專門化的工作。檢測細胞免疫功能有更直接的方法，包括空斑形成、趨化、隨機遷移、超氧化物陰離子釋放、測定用植物凝集素體外刺激後循環CD4+細胞中的ATP濃度、耙細胞的螢光染料釋放試驗。但許多這些檢驗費力，需要預先製備細胞和純化方法(往往影響隨後試驗的結果)，並且只能檢測細胞某一特定亞組的功能。總之，目前需要更有效地檢測免疫系統功能，特別是細胞免疫系統功能的方法。'競賽動物不能將它們的健康狀況告知它們的主人或訓獸師。此外，人類運動員往往不知曉自己的健康狀況(因為高強度訓練)或不能將這種情況有效地告知教練或醫師。因此，也需要更有效地監測細胞免疫系統(特別是競賽動物)的方法。自從首次發現應激(狀態)可激活對身體有益或有害的生理應答幾乎已有70年了(SeyleH.，1936，Atowe，138:32)。應激是導致機體或精神緊張的一種物理、化學或情感因素，它可以是致病因素之一。Pedersen等(1994，/W"5iwrtoM^/.，15:5116-5121)發表文章綜述了對應激與疾病領域所進行的工作。近年來，免疫學領域的高速發展對社會心理學、營養學和生理因素誘導的應激狀態與免疫系統之間的相互作用產生了強烈興趣。此工作的主要前提是應激可通過產生免疫抑制作用而提高對疾病的易感性。這在與免疫學機制，例如感染、惡性腫瘤和自身免疫疾病密切相關的疾病中尤其如此。證明應激可導致免疫力改變的研究包括許多模型，在這些模型中大多數類型的實驗性和天然產生的應激與免疫系統諸組分的改變相關聯。美國國家宇航局(NASA)進行了一些最早期的工作。NASA的研究顯示在空間飛行急降落階段(splash-downphase)白細胞和T淋巴細胞升高。然而，在回到地球後的前3天內促分裂原刺激的淋巴細胞增殖應答反應受損。在發射前，可能由於期待的原因也觀察到淋巴細胞對這種刺激的應答略微降低。應激與免疫功能的概述見"應激、免疫力與疾病一綜述"(Stress,ImmunityandIllness—AReview),Dorian和Garfmkel著，PsychologicalMedicine,17:393-407，(1987)。也已知身體活動與鍛鍊可產生免疫系統的各種改變。劇烈鍛鍊的作用看來可抑制免疫功能，損傷宿主對上呼吸道感染的防護能力。流行病學研究普遍顯示運動越劇烈對上呼吸道感染的危險越大。參見Heath等，1992，S;oWMW"'we，14(6)353-365。除了身體活動和鍛鍊之外，外部因素例如創傷(身體的)、主要生命活動、身體健康狀況和生活方式可導致應激狀態。感知這些外部因素的作用方式與身體調整方式可影響最終的生理應答。主要由交感神經系統和下丘腦、垂體、腎上腺軸(HPA軸)組成的始停靜止(allostatic)系統應對機體對應激的反應(McEwenB.，1998，WewEwg/am/Jowma/o/Me^"'"e，338:171-179)。術語"始停靜止負荷"指啟動複雜應答與停止此應答之間的平衡所致的生理應答量。不斷的應激、對應激不適應、不能關閉始停靜止應答與某一系統中缺乏始停靜止應答導致另一系統應答增加可產生始停靜止負荷。有強有力的證據表明始停靜止負荷可導致對疾病的易感性、患病風險和發病率增加。例如，應激誘導的血壓升高可激發人心肌梗塞與靈長類動物動脈粥樣硬化(Muller等，1989，C7簡/加.o"，79:733-743，Kaplan等，1991C〖腦/油o",84增刊VI:VI-23-VI-32)。高強度田徑訓練增加的始停靜止負荷可導致體重減輕、閉經和神經性厭食(Boyar等，1977，7Vew￡"g//M/.，296:190-193;Loucks等，1989，JC/fn.五mfocn'm/.Mefak/.，68:402-411)。小鼠的反覆群居爭鬥失敗(socialdefeat)(應激源)與已知是免疫抑制劑的皮質酮血漿濃度升高相關(Stark等，爿m.J.iegw/,/"feg/r.Com;.P/zjw.o/.,280:R1799陽R1805)。年齡與HPA軸能力關閉相關，對生理系統的長時間刺激通過HPA軸可導致大腦海馬回受損及隨後的認知缺陷(Lupien等，1994，JA^wmsc/.,14:2893-2903)。在確定具有遺傳性HPA軸反應低下的Lewis大鼠中，炎性應答增加可導致自身免疫和炎性疾病發病率增加(Sternburg等，1989，屍rac.A^/.JcW.&/，fOS"，86:4771-4775)。也認為HPA反應低涉及人纖維肌痛(humanfibromyalgia)(Crofford等，1994，臉謂.，37:1583-1592)、慢性疲勞症候群(PoteliakhoffA.，1981，J屍^c/zosom.L，25:91-95)、嬰兒異位性皮炎(Buske-Kirschbaum等，1997，i^yc/zosommet/.，59:419-426)和創傷後應激疾病(Yehuda等，1991，5/o.P^c/z/afr;;,30:1031-1048)。嘗試了採用以下代謝和心血管生理學量度來模擬(approximating)始停靜止負荷，包括收縮血壓、過夜尿皮質醇含量和兒茶酚胺分泌量、腰圍與臀圍比例、糖基化血紅蛋白值、血清總膽固醇濃度中血清高密度脂蛋白比例、硫酸脫氫表雄酮血清濃度和高密度脂蛋白膽固醇的血清濃度。檢測這些參數(發現)具有較低始停靜止狀態的患者身體和精神功能較強，而心原的血清濃度高也與冠心病風險增加相關(Markowe等，1985，BritishMed.J,291:1312-1314)。此外，注意到用磁共振成像檢測到應激誘導了海馬回CA3區中的錐體神經元萎縮(SapolskyR.M.，1996，&/麵，273:749-750)。這些檢測需要多種不同的試驗，費用昂貴、費力且只能提供始停靜止負荷的近似值。總之，需要更有效的檢測始停靜止負荷的方法。應激狀態能影響免疫系統是熟知的(Hawkley和Cacioppo，2004，5ra/"/mm.，18:114-119;Engler等，2004，JA^w/w'mm.,148:106-115;Woods等，2003,5m/"_Se/wv./mw.，17:384-392;Mars等，1998，5/o//z>^.J"Cow肌，249:366-370;Bierhaus等，2003，/Voc,A/a",Jcad5W，(T/5^，100(4):1920-1925;Horohov等，1996，Fe〃mm而o/,/7wmmo;a仇，53:221-233)。應激主要通過交感神經系統和HPA軸導致兒茶酚胺、促腎上腺皮質激素和皮質醇(類固醇的一個例子)釋放進而作用於免疫系統。已知這些分子具有免疫調節作用，但它們的作用機理尚未完全了解。例如，糖皮質激素(類固醇)，如皮質醇能與細胞外表的類固醇受體結合，然後直接轉運入細胞核。一旦進入核中，類固醇激素可通過基因編碼區上遊的類固醇效應元件來調節基因表達進而調節免疫功能(Geng和Vedeckis，2004，Mo/.五Woot'"o/.，18(4):912-924)。按照對免疫系統的影響，可將應激狀態分為急性(一次持續不到兩天)和慢性形式(應激持續數日或數月)。已證實急性應激能通過使白細胞從血液再分配至各身體區室(bodycompartment),例如皮膚、淋巴結和骨髓而增強免疫力(Dhabhar等，1995，J./mmwo/.，154:5511-5527)，該作用部分是因內源性糖皮質激素釋放所致。據報導急性應激的影響可持續3-5天(Dhabhar等，1996，J/wwwo/.，157:1638-1644)。另一方面，慢性應激可引發HPA軸和自主神經系統(失調)，降低細胞免疫應答並增加對疾病的易感性(McEwen等，1997，萬ra/"i"^乂，23:79-113;Cohen等，1992，i^yc/zo/.Scz'.，3:301-304;Cohen等，1993，WM4，277:1940-1944;Peijie等，2003，h/e&/e"c^，72:2255-2262)。總之，需要更好的檢測和監測始停靜止負荷對免疫系統功能影響的方法。發明概述本發明代表了對目前定量測定始停靜止負荷與檢測和監測免疫功能技術的明顯進步。對宿主細胞，特別是循環白細胞的某些功能性標記水平的檢測部分是估計性的。更具體地說，本發明涉及的分子和試驗可用於篩檢和監測因應激狀態導致免疫功能不全所致疾病或有患病風險的動物，測定動物對付或應付外部應激的能力，和監測給予免疫調節性藥物時的免疫功能。本發明可實際應用於監測處於應激狀態，特別是田徑訓練中的動物，檢測衰老對外部應激起反應能力的影響，能夠對因應激的作用而處於患病危險或易患病動物作出更好的治療和處理決定。在某些實施方案中，本發明可實際應用於檢測對疫苗接種或免疫調節治療的反應，例如，處於應激狀態的動物可能不會對疫苗接種或治療產生適當的保護性應答。在其它實施方案中，當某動物處在應激狀態時或因對應激的不恰當應答而處於危險中時，本發明可實際應用於監測對天然疾病的免疫應答。這代表了對處於應激狀態的動物的篩選、監測和處理的明顯且出乎意料的進步。因此，本發明致力於解決的問題是通過檢測，例如可檢測宿主細胞基因表達模式的差別(differentialgeneexpressionpattern)來檢測是否存在生理學應激應答及其程度，或評估健康狀況，包括免疫系統功能。優選的實施方案包括監測免疫系統外周白細胞中某些基因的表達，這反映在與始停靜止負荷或免疫調節活動有關的RNA水平或蛋白質表達模式的改變。因此，本發明一方面提供測定測試對象中對應激的生理學應答或相關疾病的存在及其程度的方法。這些方法一般包括檢測該對象中至少一種選自以下的基因(本文也稱為"應激標記基因")的異常表達(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的基因SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的基因。按照本發明，這些應激標記基因在對應激的生理學應答中或具有始停靜止負荷的動物中表達異常。合適的相關疾病是免疫抑制疾病。存在對應激的生理學應答或相關狀態與心理應激或身體應激(例如，身體強迫症(physicalduress),如田徑訓練和身體創傷)適當相關。示範性的心理疾病包括抑鬱、全身性焦慮症、創傷後應激疾病、恐慌、慢性疲勞、疼痛性腦病(myalgicencephalopathy)、通過(行動)抑制產生的應激(stressthroughrestraint)、失眠、暴食和行為(自發性)調節(behavioral(operant)conditioning^其它心理疾病，特別是涉及獸醫學應用的，包括但不限於與監禁、急轉向、航運或人-動物相互作用相關的應激狀態。身體應激的示範性例子包括身體強迫症，如田徑訓練和身體創傷。本文所用的應激標記基因多核苷酸表達產物稱為"應激標記多核苷酸"。該應激標記基因的多肽表達產物在本文稱為"應激標記多肽"。因此，在一些實施方案中，這些方法包括檢測選自以下的應激標記多核苷酸的異常表達(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、,29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、,81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少含有該序列的15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少可在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它實施方案中，這些方法包括檢測選自以下應激標記多肽的異常表達(i)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的胺基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(ii)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個連續胺基酸殘基；(iii)所含胺基酸序列與以下任一序列的至少15個連續胺基酸殘基至少有30%(和至少31%-至少99%及其之間所有整數百分比)相似性的多肽SEQIDN0:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(iv)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、,36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少'5個連續胺基酸殘基，並且與和(i)、(ii)或(iii)的序列具有免疫相互作用活性的抗原結合分子具有免疫相互作用活性。應激標記基因的異常表達一般通過以下步驟檢測(1)檢測得自對象生物學樣品中至少一種應激標記基因表達產物的水平或功能活性，和(2)將所檢測到的各表達產物水平或功能活性與得自一位或多位正常對象或一位或多位未處於應激狀態對象的參比樣品中相應表達產物的水平或功能活性作比較，其中與參比樣品中相應表達產物的水平或功能活性相比，該生物學樣品中表達產物的水平或功能活性有差異，表明存在對應激的生理學應答。在一些實施方案中，當該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性與相應的該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性不同時，該方法還包括測定應激應答的程度(或應激水平)或免疫調節水平。在這些實施方案中，與各相應表達產物的水平或功能活性相比，該差異通常表示各表達產物的水平或功能活性至少增加約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，或者甚至至少增加約100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%;或者至少降低約10%、20%、30%40%、50°/。、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或者甚至至少降低約99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%，即本文所稱的"異常表達"。在此類型的示範性例子中，通過檢測至少一種選自以下應激標記多核苷酸的水平或功能活性降低來測定是否存在對應激的生理學應答(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、7、9、11、19、21、24、25、33、34、38、39、40、41、42、50、51、56、57、59、62、63、66、70、71、73、75、79、81、83、89、90、91、92、93、97、99、105、107、108、111、119、121、122、123、129、130、137、139、140、141、142、143或185，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸seqidno:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138，其中所述部分至少含有該序列的15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示範性例子中，通過檢測至少一種選自以下應激標記多核苷酸的水平或功能活性的增加來確定是否存在對應激的生理學應答(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、13、15、16、17、23、26、28、29、30、32、35、37、44、46、48、52、54、55、64、68、77、85、87、95、96、101、103、113、115、117、118、125、126、131、133、135、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、183、184、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206或210，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211，其中所述部分至少含有該序列的15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實施方案中，當該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性與相應的該表達產物或各表達產物的所檢測水平或功能活性相同或相似時，該方法還包括測定是否不存在對應激的生理學應答。在這些實施方案中，各表達產物檢測到的水平或功能活性與各相應表達產物檢測到的水平或功能活性的差異不超過約20%、18%、16%、14%、12%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1°/。或0.1%時，下文稱為"正常表達"。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45種應激標記基因各表達產物的水平或功能活性。例如，這些方法可包括單獨檢測一種應激標記多核苷酸或聯合檢測多至44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1種其它應激標記多核苷酸的水平或功能活性。在另一實施例中，這些方法可包括單獨檢測一種應激標記多肽或聯合檢測多至44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或l種其它應激標記多肽的水平或功能活性。在此類型的示範性例子中，這些方法包括檢測與存在對應激的生理學應答或風險高度相關的至少1、2、3、4、5或6種應激標記基因(下文稱為"一級相關應激標記基因水平")各表達產物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限於(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:89、90、103、125、126、163、178、182、184或190，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下胺基酸序列多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189，其中所述部分至少含有該序列的15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示範性例子中，這些方法包括檢測與存在針對應激的生理學應答或風險高度相關的至少1、2、3、4、5、6、7或8種應激標記基因(下文稱為"二級相關應激標記基因水平")各表達產物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限於(a)含有與以下任一序列具有至少50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:17、23、44、52、133、135、144、147、148、151、155、192、196、202或206，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207,其中所述部分至少含有該序列的15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示範性例子中，這些方法包括檢測與存在對應激的生理學應答或風險中等相關的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10種應激標記基因(下文稱為"三級相關應激標記基因")各表達產物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限於(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、30、37、48、54、55、64、66、70、77、79、85、91、92、95、96、101、115、117、118、121、150、153、158、164、170、180、186或198,或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199,其中所述部分至少含有該序列的15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示範性例子中，這些方法包括檢測與存在對應激的生理學應答或風險適度相關的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10種應激標記基因(下文稱為"四級相關應激標記基因")各表達產物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限於(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:7、15、16、19、21、24、25、26、28、35、38、39、42、46、57、68、73、81、83、97、99、107、113、123、160、165、175、187、188、194、195或200，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201，其中所述部分至少含有該序列的15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(C)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在其它示範性例子中，這些方法包括檢測與存在對應激的生理學應答或風險較低相關的至少l、2、3、4、5、6、7、8、9或10種應激標記基因(下文稱為"五級相關應激標記基因")各表達產物的水平或功能活性，其代表性例子包括但不限於(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、9、11、13、32、33、34、40、41、50、51、56、59、62、63、71、75、87、93、105、111、119、127、129、130、131、37、139、141、143、145、156、161、167、169、171、173、176、185、204或210，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211;(c)含有編碼與以下任一序列至少一部分至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211，其中所述部分至少含有該序列的15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少4種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種一級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少4種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少I種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少l種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少4種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少4種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少5種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少4種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少l種二級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少5種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少4種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少5種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少4種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種三級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少5種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少3種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少3種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少4種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少5種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少6種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少l種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少2種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少3種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少4種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少5種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少1種四級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性和至少6種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在一些實施方案中，這些方法包括檢測至少1種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少2種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在其它實施方案中，這些方法包括檢測至少3種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少3種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少4種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少5種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。在還有其它實施方案中，這些方法包括檢測至少6種五級相關應激標記基因表達產物的水平或功能活性。生物學樣品優選通常含有白細胞的血液，特別是外周血。所述表達產物宜選自RNA分子或多肽。在一些實施方案中，所述表達產物與相應的表達產物相同。在其它實施方案中，所述表達產物是相應表達產物的變體(例如，等位基因變體)。在某些實施方案中，所述表達產物或相應的表達產物是靶RNA(例如，mRNA)或該耙RNA的DNA拷貝，其水平可用至少能在低嚴謹性條件下與該耙RNA或該DNA拷貝雜交的至少一種核酸探針來檢測，該核酸探針至少含有某應激標記基因的15個連續核苷酸。在這些實施方案中，將該靶RNA或其DNA拷貝所檢測到的水平或豐度按存在於同一樣品中的參比RNA或該參比RNA的DNA拷貝的水平或豐度標準化。核酸探針宜固定在固體或半固體支持物上。在此類型的示範性例子中，該核酸探針形成諸核酸探針空間陣列的一部分。在一些實施方案中，通過雜交(例如採用核酸陣列)檢測結合該靶RNA或該DNA拷貝的核酸探針的水平。在其它實施方案中，通過核酸擴增(例如，採用聚合酶鏈式反應(PCR))檢測結合該靶RNA或該DNA拷貝的核酸探針的水平。在還有其它實施方案中，通過核酸酶保護試驗檢測結合該靶RNA或該DNA拷貝的核酸探針的水平。在其它實施方案中，所述表達產物或相應的表達產物是靶多肽，其水平可用能與該靶多肽免疫相互作用的至少一種抗原結合分子來檢測。在這些實施方案中，將該靶多肽檢測到的水平或豐度按存在於同一樣品中的參比多肽的水平標準化。抗原結合分子宜固定於固體或半固體支持物上D在此類型的示範性例子中，該抗原結合分子形成抗原結合分子空間陣列的一部分。在一些實施方案中，通過免疫測定(例如利用ELISA)檢測結合該靶多肽抗原結合分子的水平。在還有其它實施方案中，所述表達產物或相應的表達產物是靶多肽，其水平可用能與該靶多肽反應形成反應產物的至少一種底物來檢測。在這些實施方案中，將該耙多肽檢測到的功能活性按存在於同一樣品中的參比多肽的功能活性標準化。在一些實施方案中，可用適當包括至少一個與基站(basestation)相耦聯的終端站(endstation)的某系統來執行該方法。該基站宜(a)通過通信網絡從終端站接受所述數據，其中所述數據代表生物學樣品中至少一種表達產物所檢測到的或標準化水平或功能活性相應的參數值，和(b)將所述數據與代表參比樣品中至少一種相應表達產物的所檢測到的或標準化水平或功能活性的預定數據作比較，從而測定與參比樣品中相應表達產物水平或功能活性相比，該生物學樣品中此表達產物的水平或功能活性的任何差異。基站還可理想地診斷應激應答是否存在、其程度或發生的風險。在這些實施方案中，基站還可通過通信網絡將診斷指徵傳遞至終端站。本發明另一方面提供測定檢驗對象中是否存在免疫抑制及其程度的方法。這些方法一般包括檢測至少一種上述應激標記基因在對象中的異常表達。在還有另一方面，本發明提供治療或預防檢驗對象中產生應激或相關疾病的方法。這些方法一般包括檢測至少一種應激標記基因在對象中的異常表達，和處理該對象的環境以防止或儘可能不使該對象與致應激源接觸和/或給予該對象有效量的藥物以治療或緩解症狀，或者逆轉或抑制該對象發生應激狀態。在某些實施方案中，所述相關疾病是免疫抑制。因此，在一相關方面，本發明提供治療或預防檢驗對象產生免疫抑制的方法。這些方法一般包括檢測至少一種應激標記基因在對象中的異常表達，處理該對象的環境以防止或儘可能不使該對象與致應激源接觸和/或給予對象有效量的藥物以治療或緩解症狀，或者逆轉或抑制該對象發生應激狀態。在還有另一方面，本發明提供評估對象免疫系統對所選抗原產生免疫應答能力的方法。這些方法一般包括測定至少一種上述應激標記基因在對象中的正常還是異常表達，故而該應激標記基因或各應激標記基因正常表達表明產生免疫應答能力正常，而該應激標記基因或各應激標記基因異常表達表明產生免疫應答能力受損。在其它方面，本發明提供給予含有所選抗原的組合物來誘導檢驗對象對該抗原的免疫應答的方法。這些方法一般包括檢測至少一種上述應激標記基因在該對象中的正常表達和給予該對象所述組合物。在一些實施方案中，這些方法還包括檢測至少一種上述應激標記基因在對象中的異常表達，處理該對象的環境以防止或儘可能不使該對象與致應激源接觸和/或給予該對象有效量的藥物以逆轉或抑制該對象發生應激狀態，和給予該對象所述組合物。在一些實施方案中，當該應激標記基因或各應激標記基因在對象中正常表達時給予該對象所述組合物。在一相關方面，本發明提供改進檢驗對象對所選抗原免疫應答的方法，給予所述對象含該抗原的組合物。這些方法一般包括檢測至少一種上述應激標記基因在該對象中的異常表達，處理該對象的環境以防止或儘可能不使該對象與致應激源接觸和/或給予該對象有效量的藥物以逆轉或抑制該對象發生應激狀態，這種處理或給藥從而可使該應激標記基因或各應激標記基因在該對象中正常表達。在另一方面，本發明提供本文稱為"應激標記多核苷酸"的分離的多核苷酸，所述多核苷酸選自(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互補序列；(b)含有包含以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分至少含有該序列或互補序列的15個連續核苷酸；(C)至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)或(b)的序列或其互補序列雜交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列的一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互補序列，其中所述部分至少含有該序列或互補序列的15個連續核苷酸並至少能在低嚴謹性、中嚴謹性或高嚴謹性條件下與(a)、(b)或(C)的序列或其互補序列雜交。在另一方面，本發明提供含有操作性連接於調節元件的上述多核苷酸的核酸構建物，該構建物可在宿主細胞中操作。在某些實施方案中，所述構建物是載體形式，特別是表達載體。在還有另一方面，本發明提供含有上述核酸構建物或載體的分離的宿主細胞。在某些優選的實施方案中，所述宿主細胞選自細菌細胞、酵母菌細胞和昆蟲細胞。在還有另一方面，本發明提供用於所査詢的核酸中是否存在上述多核苷酸的探針。這些探針一般包括至少能在低嚴謹性條件下與上述多核苷酸雜交的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述探針基本上由對應於編碼以下任一胺基酸序列的核苷酸序列一部分或與其互補的核酸序列構成SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、40、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少長15個核苷酸。在其它實施方案中，這些探針含有至少能在低嚴謹性條件下與編碼以下任一胺基酸序列的核苷酸序列至少一部分雜交的核苷酸序列SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、,80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分至少長15個核苷酸。在還有其它實施方案中，這些探針含有至少能在低嚴謹性條件下與以下序列的至少一部分雜交的核苷酸序列SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，其中所述部分至少長15個核苷酸。用於檢測本發明應激標記多核苷酸的代表性探針如SEQIDNO:250-1807(見表2)所示。在一相關方面，本發明提供在其上固定了至少一種上述核酸探針的固體或半固體支持物。在一些實施方案中，該固體或半固體支持物包含固定於其上的核酸探針空間陣列。在其它方面，本發明提供稱為"應激標記多肽"的分離的多肽，所述多肽一般選自(i)含有與上述應激標記基因的多肽表達產物至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的胺基酸序列的多肽，所述應激標記基因具體是例如含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、卯、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243;(ii)(i)所述序列的一部分，其中該部分至少含有該多肽的5個連續胺基酸殘基；(iii)含有與(i)所述多肽的至少15個連續胺基酸殘基至少有30%相似性(和至少31%-至少99%及其之間所有整數百分比)的胺基酸序列的多肽；和(iv)含有能與(i)、(U)或(iii)的序列發生免疫相互作用的抗原結合分子發生免疫相互作用的胺基酸序列的多肽。本發明還有一方面提供能與上述應激標記多肽發生免疫相互作用的抗原結合分子。在一相關方面，本發明提供在其上固定了至少一種上述抗原結合分子的固體或半固體支持物。在一些實施方案中，該固體或半固體支持物包含固定於其上的抗原結合分子空間陣列。本發明還有另一方面提供一種或多種上述應激標記多核苷酸、一種或多種上述探針、一種或多種上述應激標記多肽或一種或多種上述抗原結合分子在製備評估對象對應激的生理學應答或免疫功能的試劑盒中的應用。附圖簡述圖1是比較(施加)應激後第28天與第0天(第0天是道路運輸(roadtransport)2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判另ij功能評分(crossvalidatedcomponentsdiscriminantfunctionscores)製備。圖2是比較(施加)應激後第28天與第2天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製備。圖3是比較(施加)應激後第28天與第4天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製備。圖4是比較(施加)應激後第28天與第7天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製備。圖5是比較(施加)應激後第28天與第9天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製圖6是比較(施加)應激後第28天與第11天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製備。圖7是比較(施加)應激後第28天與第14天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製備。圖8是比較(施加)應激後第28天與第17天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製備。圖9是比較(施加)應激後第28天與第21天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製備。圖10是比較(施加)應激後第28天與第24天(第0天是道路運輸2天後)基因表達的接收器操作曲線(ROC)。ROC曲線根據交叉驗證的組分判別功能評分製備。發明詳述1.定義除非另有定義，本文所用的所有技術和科學術語與本發明所屬領域普通技術人員通常理解的意義相同。雖然可利用與本文所述相似或等價的任何方法和材料來實施或檢驗本發明，但本文所述的是優選的方法和材料。為本發明的目的定義了以下術語。本文所用的冠詞"一"和"一個"指一個或多個(即至少一個)該冠詞在語法上的賓語。例如，"一個元件"指一個元件或多個元件。本文用於描述應激標記基因表達的術語"異常表達"，指與取自健康對象或未遭受應激對象的細胞中某應激標記基因或其變體的表達水平相比，該應激標記基因過度表達或表達不足，和/或與取自健康對象或未處於應激狀態對象的組織樣品或體液中該應激標記基因產物(例如，轉錄產物或多肽)的水平相比，較高或較低。具體地說，如果與取自健康對象或未處於應激狀態對象的細胞中某應激標記基因的表達水平相比，和/或與取自健康對象或未處於應激狀態對象的組織樣品或體液中該應激標記基因的表達水平相比，該應激標記基因高至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%，或甚至至少約100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%,或者低至少約10%、20%、30%40%、50%、60%、70%、80%、90%、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或甚至至少約99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%，則該應激標記基因異常表達。"約"指與參比的量、水平、數值、數字、頻率、百分比、維數、大小、用量、重量或長度相比，可多至30、25、20、25、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1%不同的量、水平、數值、數字、頻率、百分比、維數、大小、用量、重量或長度。術語"擴增子"指擴增的靶序列和/或擴增的靶序列的擴增產物。在某些其它實施方案中，"擴增子"可包含用於擴增的探針或引物序列。"抗原結合分子"指對耙抗原具有結合親和力的分子。應該知道該術語可擴展至顯示具有抗原結合活性的免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和非免疫球蛋白衍生的蛋白質框架。當本文所用的術語"特異性結合"、"特異性免疫相互作用"等指某抗原結合分子時，這些術語指能確定在蛋白質和其它生物製品的異質群體中存在該抗原的結合反應。因此，在所指定的免疫測定條件下，所述抗原結合分子能與其特定抗原相結合而不以明顯量與樣品中存在的其它蛋白質或抗原相結合。在這種條件下與某抗原特異性結合可能需要選擇對該特定抗原有特異性的抗原結合分子。例如，可製備針對所選蛋白質抗原的抗原結合分子，該分子能與該抗原而非樣品中其它蛋白質抗原相結合。可採用各種免疫測定方式來選擇能與某特定蛋白質起特異性免疫相互作用的抗原結合分子。例如，常規採用固相ELISA免疫測定來選擇能與某蛋白質發生特異性免疫相互作用的單克隆抗體。可用於測定特異性免疫反應的免疫測定方式和條件可參見Harlow和Lane，(1988)，"抗體，實驗室手冊"(Antibodies,ALaboratoryManual),ColdSpringHarborPublications，紐約。"生物學活性部分"指保留了親代分子活性的全長親代肽或多肽的一部分。本文所用的術語"生物學活性部分"包括具有親代分子活性的缺失突變體和具有例如至少約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900、1000個連續胺基酸殘基的肽。可用標準的重組核酸技術來獲得或釆用常規液相或固相合成技術來合成此種類型部分。例如，可參考如BlackwellScientificPublications出版，Nicholson所編的名為《合成疫苗》(SyntheticVaccines)的出版物中Atherton和Shephard所著名為"肽合成"(PeptideSynthesis)的第9章中所述的液相合成或固相合成。或者，可用蛋白酶，例如endoLys-C、endoArg-C、endoGlu-C和葡萄球菌V8-蛋白酶消化本發明的肽或多肽來製備這類肽。可通過例如高效液相層析(HPLC)技術純化所消化的片段。也可採用重組核酸技術來製備這種蛋白質。本文所用的術語"生物學樣品"指從動物提取的、未處理、處理、稀釋或濃縮的樣品。生物學樣品可包括生物學液體，例如全血、血清、血漿、唾液、尿、汗液、腹水、腹膜液、滑膜液、羊水、腦脊液、組織活檢(樣品)等。在某些實施方案中，生物學樣品是血液、特別是外周血。應理解本文所用的術語"順式作用序列"、"順式作用元件"、"順式調節區"或"調節區"或類似的術語指當置於某可表達遺傳序列的適當位置時能調節，至少部分調節該遺傳序列表達的任何核苷酸序列。本領域技術人員知道順式調節區能在轉錄或翻譯後水平上激活、沉默、增強、抑制或者改變基因序列的表達水平和/或細胞類型特異性和/或發育特異性。在本發明的某些實施方案中，順式作用序列是能增強或刺激某可表達遺傳序列表達的激活序列。除非文中另有需要，本說明書中的詞語"包含"和"含有"應理解為指包括某所述步驟或元件或者一組步驟或元件，但不排除任何其它步驟或元件或者一組步驟或元件。"對應"或"對應於"指以下的多核苷酸(a)其含有的核苷酸序列與某參比多核苷酸序列的整體或一部分基本上相同或互補，或(b)其編碼的胺基酸序列與某肽或蛋白質的氮基酸序列相同。該短語的範圍也包括含有的胺基酸序列與參比肽或蛋白質的胺基酸序列基本上相同的肽或多肽。在治療或預防某疾病的章節中，"有效量"指將該用量的活性(化合物)以單次劑量或連續劑量的一部分給予需要這種治療或預防的個體，該用量可有效防止該疾病的症狀發生、抑制該疾病的這種症狀和/或治療該疾病的已有症狀。有效量依待治療個體的健康和身體狀況、待治療個體的分類學組、組合物的劑型、醫學狀況的評估和其它相關因素而不同。希望該用量可用常規試驗測定具有較寬範圍。術語"表達"或"基因表達"指產生信使RNA或信使RNA翻譯為蛋白質或多肽。採用本文所述方法檢測基因表達的這二種類型之一是本發明的一部分。"表達載體"指能指導該載體所含的多核苷酸轉錄和適當地合成該多核苷酸所編碼的肽或多肽的任何自主遺傳元件。本領域技術人員知道這種表達載體。本文所用的術語"基因"指細胞基因組的任何與所有的不連續編碼區及其相關的非編碼調節區。基因也指編碼具體多肽的開放讀框、內含子、參與表達調節的毗鄰的5'和3'非編碼核苷酸序列。在這點上，基因還可含有與某給定基因天然相關的調控信號，例如啟動子、增強子、終止和/或聚腺苷酸化信號，或異源調控信號。DNA序列可以是cDNA或基因組DNA或其片段。可將基因引入合適的載體中而維持於染色體外或整合入宿主。"高密度多核苷酸陣列"等指每cm2至少含有400個不同特徵元件(feature)的那些陣列。短語"高度鑑別性雜交條件"指可測定出一個鹼基錯配的雜交條件。本文用"雜交"表示互補核苷酸序列配對產生雜交DNA-DNA或雜交DNA-RNA。互補鹼基序列是通過鹼基配對原則相互關聯的那些序列。在DNA中，A與T配對，C與G配對。在RNA中，U與A配對，C與G配對。在這點上，本文所用術語"匹配"和"錯配"表示互補核酸鏈中配對核苷酸的雜交可能性。匹配的核苷酸能有效雜交，例如上述典型的A-T和C-G鹼基配對。錯配是不能有效雜交核苷酸的其它組合。短語"特異性雜交"等指在嚴謹性條件下，當某特定核苷酸序列存在於複雜的DNA或RNA混合物(例如，總細胞的)中時，某分子只與該序列結合、形成雙螺旋或雜交。本文提及"免疫相互作用"包括提及分子之間(特別是在所述分子之一是或模擬免疫系統某組分的場合)的任何相互作用、反應或其它結合形式。"免疫功能"或"免疫反應性"指通過本領域熟知的標準試驗檢測免疫系統對外來抗原的反應能力。術語"免疫抑制"指應激或對應激的生理應答導致免疫系統的總免疫反應性降低。宜與不存在應激狀態時的免疫反應性相比，其降低了至少20-40%，或至少50-75%、或者甚至至少80%。此外，術語"免疫抑制"的範圍包括與未處於應激的對象相比，免疫應答發生滯後。免疫應答發生滯後可以是短時滯後，例如1小時-10天，即1小時，2、5或10天。免疫應答發生滯後也可以是長時間滯後，例如10天-10年(即，30天、60天、90天、180天，1、2、5或10年)。本發明的"免疫抑制"也可表示免疫應答強度降低，例如強度降低比未受應激損害對象的免疫應答低5-100%、25-100%或75-100%。"分離的"表示實質上或基本上不含其天然狀態下正常伴有組分的物質。例如，本文所用的"分離的多核苷酸"指去除了天然狀態下其側接序列的純化多核苷酸，例如DNA片段是從去除了該片段正常毗鄰序列的片段。或者，本文所用的"分離的肽"或"分離的多肽"等指體外去除了其天然細胞環境和與之結合的細胞其它組分，即與體內物質不結合的分離和/或純化的肽或多肽分子。"標記基因"表示能賦予表達該標記基因的細胞獨特表型從而使這種轉化細胞能與不含有該標記的細胞相區別的基因。可選擇標記基因能根據對選擇性因子(例如，除草劑、抗生素、輻射。熱或其它破壞未轉化細胞的處理方法)的抗性賦予"選擇"特性。可篩選標記基因(或報導基因)能賦予可通過觀察或檢驗，即通過"篩選"來鑑定的特性(例如，未轉化細胞中不存在的P-葡糖醛酸酶、螢光素酶或其它酶活性)。本文所用的"天然產生的"核酸分子指具有天然產生的核苷酸序列的RNA或DNA分子。例如，天然存在的核酸分子能編碼天然產生的蛋白質。"取自"表示某樣品，例如細胞提取物或核酸或多肽提取物是分離自或衍生自特定來源。例如，可直接從對象的生物學液體或組織中分離提取物。本文所用的術語"寡核苷酸"指經磷酸二酯鍵相連的多個核苷酸殘基(脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相關的結構變體或合成類似物，包括含有修飾或取代糖基團等的核苷酸)構成的聚合物(或其相關的結構變體或合成類似物)。因此，儘管術語"寡核苷酸"通常指其中的核苷酸殘基與殘基之間的連接鍵是天然存在的核苷酸聚合物，但應知道該術語的範圍也包括各種類似物，包括但不限於肽核酸(PNA)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酉旨(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoraniladate、亞磷醯胺、膦酸甲酯、2-0-甲基核糖核酸等。該分子的確切大小視具體應用而不同。寡核苷酸是長200個以下鹼基的多核苷酸亞組。寡核苷酸優選長10-60個鹼基，最優選長12、13、14、15、16、17、18、19或20-40個鹼基。雖然寡核苷酸可以是雙鏈，例如用於構建不同核酸序列，但寡核苷酸通常是單鏈的，例如探針。本發明的寡核苷酸可以是有義或反義寡核苷酸。術語"寡核苷酸陣列"指具有寡核苷酸探針的基板，在該基板表面的已知不連續位置沉積了不同的已知序列。例如，該基板可以是如美國專利號5,424,186所述的兩維基板形式。這種基板可用於合成兩維空間尋址的寡核苷酸(矩陣)陣列。或者，該基板的特徵在於通過將兩維平面的薄片巻成三維管狀構型而形成管狀陣列。該基板也可採取與光纖表面相連的微球或珠形式，例如Chee等在WO00/39587中所述的那樣。這些寡核苷酸陣列至少具有兩種不同的元件，其密度為每cm2至少400個元件。在某些實施方案中，這些陣列的密度可以是每cm2約500、至少一千、至少一萬、至少十萬、至少一百萬或至少一千萬個元件。例如，該基板可以是矽或玻璃，具有載玻片或蓋玻片的厚度，或者可由其它合成聚合物構成。當在該基板上進行試驗的方法包括光檢測時，可用透光的基板。該術語也指探針陣列和與其相連形成晶片一部分的基板。本文所用的術語"操作性連接"或"操作性相連"表示將結構基因置於啟動子的調控下，從而可控制該基因的轉錄和任選的翻譯。在構建異源啟動子/結構基因組合時，通常優選將遺傳序列或啟動子安置在與基因轉錄起始位點的距離與其天然設置中該遺傳序列或啟動子與其所調控的基因，即衍生該遺傳序列或啟動子的基因的距離大體相同。本領域己知可允許對此距離作一些變動而不喪失功能。類似地，調控序列元件與置於其控制下的異源基因的優選定位可由該元件在其天然設置，即衍生其的基因中的定位所確定。本文所用的術語"多核苷酸"或"核酸"指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。該術語通常指至少長10個鹼基的核苷酸的聚合形式，無論是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二類核苷酸的修飾形式。該術語包括DNA的單鏈或雙鏈形式。術語"多核苷酸變體"和"變體"指與參比多核苷酸序列的序列基本上相同的多核苷酸，或能在下述嚴謹性條件下與參比序列雜交的多核苷酸。這些術語也包括其中有一個或多個核苷酸添加或刪除，或用不同的核苷酸取代的多核苷酸。在這點上，本領域熟知可按照參比多核苷酸對所述多核苷酸作出某些改變，包括突變、添加、缺失和取代，從而使改變的多核苷酸仍保留該參比多核苷酸的生物學功能或活性。術語"多核苷酸變體"和"變體"也包括天然產生的等位變體。"多肽"、"肽"和"蛋白質"在本文可互換使用，指胺基酸殘基的聚合物及其變體與合成的類似物。因此，這些術語適用於其中一個或多個胺基酸殘基是合成的非天然胺基酸(例如，相應的天然胺基酸的化學類似物)的胺基酸聚合物以及天然產生的胺基酸聚合物。術語"多肽變體"指通過至少一個胺基酸殘基的添加、缺失或取代而與參比多肽相區別的多肽。在某些實施方案中，參比多肽的一個或多個胺基酸殘基可用不同的胺基酸所取代。如下所述，本領域熟知一些胺基酸可以改變成具有大致相似性質的其它胺基酸而不會改變多肽的活性(保守取代)。"引物"表示當與DNA的一條鏈配對時在有合適的聚合試劑存在下能啟動引物延伸產物合成的寡核苷酸。為使擴增效率最大，引物優選單鏈，但或者可以是雙鏈。引物足夠長從而能在聚合試劑存在時引發合成延伸產物。引物的長度取決於許多因素，包括應用領域、所採用的溫度、模板反應條件、其它試劑和引物來源。例如，取決於靶序列的複雜性，引物的3'末端可比模板序列短至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500到1個鹼基從而延伸核酸鏈，雖然引物5'末端長度可延伸超出模板序列的3'末端。在某些實施方案中，引物可以是大的多核苷酸，例如約35個核苷酸到數千鹼基以上。可選出與模板序列"基本上互補"的引物，設計這些引物設計能與模板雜交並用作合成的起點。"基本上互補"表示該引物的互補性足夠與靶多核苷酸雜交。引物和所設計的與其雜交的模板最好不含錯配，但這不是必需的。例如，可將非互補核苷酸殘基連接在引物的5'末端，而該引物序列的其餘部分與模板互補。或者，可將非互補核苷酸殘基或非互補核苷酸殘基的延伸段間插入引物中，前提是該引物序列與和其雜交的模板序列足夠互補從而可形成合成該引物的延伸產物所需的模板。"探針"指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結合的分子。除非另有指出，術語"探針"通常指能通過互補鹼基配對與另一多核苷酸(往往稱為"靶多核苷酸")結合的多核苷酸探針。取決於雜交條件的嚴謹性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結合。探針可直接或間接標記，其範圍包括引物。本文所用的術語"重組多核苷酸"指通過操作核酸使其成為自然界中正常沒有發現的形式而在體外形成的多核苷酸。例如，重組多核苷酸可以採取表達載體形式。這種表達載體一般包括操作性連接於該核苷酸序列的轉錄和翻譯調節核酸。"重組多肽"表示採用重組技術，即通過重組子或合成多核苷酸表達而製備的多肽。"調節元件"或"調節序列"表示在具體宿主細胞中表達操作性相連編碼序列所需的核酸序列(例如，DNA)。例如，適用於原核細胞的調節序列包括啟動子和任選的順式作用序列，如操縱子序列與核糖體結合位點。適用於真核細胞的控制序列包括啟動子、聚腺苷酸化信號、轉錄增強子、翻譯增強子、調節mRNA穩定性的前導和尾隨序列，以及使轉錄的多核苷酸編碼產物靶向細胞內區室或耙向胞外環境的引導序列。本文所用的術語"序列相同性"指二序列在比較窗上根據核苷酸對核苷酸或胺基酸對胺基酸的相同性程度。因此，"序列相同性百分比"可通過以下步驟計算在比較窗上比較兩條最佳比對的序列，測定兩條序列中相同的核苷酸鹼基(例如，A、T、C、G、I)或相同的胺基酸殘基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置數得到匹配的位置數，將匹配的位置數除以比較窗口的總位置數(即，窗口大小)，再將結果乘以100得到序列相同性百分比。為本發明的目的，應將"序列相同性"理解為用DNASIS電腦程式(適用於windows的2.5版；貝勾自HitachiSoftwareengineeringCo,，Ltd.,SouthSanFrancisco,力口禾!j福尼亞，美國)，採用該軟體所附參考手冊中使用的標準默認(參數)計算的"匹配百分比"。如下表3所定義，"相似性"指相同或構成保守取代的胺基酸百分數。可利用序列比較程序，例如GAP(Deveraux等，1984，NucleicAcidsResearch,12，387-395)測定相似性。長度與本文所述序列相似或基本上不同的序列可以此方式通過在排列中插入空格來比較，這種空格可通過例如GAP所用的比較算法確定。用於描述兩條以上多核苷酸或多肽之間的序列相關性的術語包括"參比序列"、"比較窗口"、"序列相同性"、"序列相同性百分比"和"基本上相同"。"參比序列"的長度至少12個，但更多15-18個，往往至少25個單體單元，包括核苷酸和胺基酸殘基。由於兩條多核苷酸各含有(l)兩條多核苷酸之間相似的序列(即，只是整個多核苷酸序列的一部分)，和(2)兩條多核苷酸序列之間有差別的序列，則一般通過在"比較窗口"上比較這兩條多核苷酸的序列來鑑定和比較局部區域的序列相似性從而在兩條(以上)多核苷酸之間進行序列比較。"比較窗口"指具有至少6個，通常約50-約100個，更常見是約100-約150個連續位置的概念上的片段，其中某序列與參比序列最佳比對後，該序列與具有相同數目連續位置的參比序列作比較。為(進行)兩條序列的最佳比對，與參比序列(不包含添加或缺失)相比，比較窗口可包含約20%以下的添加或缺失(即，空位)。為比對比較窗口，可通過計算機執行算法(GAP、BESTFIT、FASTA禾QTFASTA，WisconsinGeneticsSoftwarePackageRelease7.0，GeneticsComputerGroup,575ScienceDriveMadison,WI，USA)或通過目測和所選擇的各種方法之一產生的最佳比對(即導致比較窗口上最高同源性百分比)，對諸序列進行最佳比對。也可參考如Altschul等，1997，Nucl.AcidsRes.，25:3389所述的BLAST程序族進行比對。序列分析的詳述可見Ausubel等，《最新分子生物學方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)的第15章，第19.3單元，JohnWiley&SonsInc，1994-1998。在本文可互換使用的術語"對象"、"個體"或"患者"指需要治療或預防的任何對象，特別是脊椎動物對象，更特別指哺乳動物對象。本發明範圍中的合適脊椎動物包括但不限於靈長類動物、鳥類、家畜(例如，綿羊、母牛、馬、驢、豬)、實驗室檢驗動物(例如，家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠)、陪伴動物(例如，貓、狗)和捕獲的野生動物(例如，狐、鹿、野狗)。優選的對象是需要治療或預防應激的馬。然而，應該知道以上術語並未暗示有症狀存在。本文的短語"基本上相似的親和力"指靶序列在所選擇的一組嚴謹性條件下與它們的互補或基本上互補的寡核苷酸探針雜交時具有相似的可檢測強度。本文所用的術語"模板"指用於產生與該"模板"鏈互補的核酸鏈的核酸。模板可以是RNA和/或DNA，其互補鏈也可以是RNA和/或DNA。在某些實施方案中，互補鏈可包括該"模板"的所有或部分互補序列，和/或可包含突變，因而其不與該"模板"完全互補。在本文所述的檢測試驗以及本領域己知的其它試驗中，不與模板鏈完全互補的鏈可以與模板鏈特異性雜交，這種可用於檢測試驗中的互補鏈是本發明的一部分。術語"轉化"表示通過引入外來或內源性核酸而改變某生物體，例如細菌、酵母菌、哺乳動物、鳥類、爬行動物、魚或植物的基因型。"載體"表示可在其中插入或克隆入某多核苷酸的多核苷酸分子，合適的載體可以衍生自，例如質粒、細菌噬菌體、酵母菌、病毒、哺乳動物、鳥類、爬行動物或魚的DNA分子。載體優選含有一個或多個獨特的限制性位點並能在確定的宿主細胞，包括靶細胞或組織或其子代細胞或組織中自主複製，或能與確定的宿主細胞基因組整合從而可複製所克隆的序列。因此，載體可以是自主複製的載體，即以染色體外實體存在的載體，其複製獨立於染色體的複製，例如線形或閉環質粒、染色體外元件、微染色體或人工染色體。載體可含有任何確保自身複製的元件。或者，當將載體引入宿主細胞後它能整合入基因組中與所整合入的染色體一起複製。載體系統可包含一種載體或質粒，均包含待引入宿主細胞基因組的總DNA的兩種以上載體或質粒，或轉座子。選擇載體一般取決於該載體與待引入該載體的宿主細胞的相容性。載體也可包含選擇性標記，例如可用於選擇合適轉化子的抗生素抗性基因。本領域技術人員已知這種抗性基因的例子。術語"野生型"和"正常的"可互換使用，指大多數天然產生的物種的特徵性表型，其相對的例子是突變體表型。2.縮寫nt=核苷酸nts=多個核苷酸aa=胺基酸kb=千鹼基或千鹼基對kDa-千道爾頓d=曰h=小時s=秒3.應激標記及其應用本發明涉及檢測感興趣對象的應激水平或針對應激的生理應答。本發明公開了受到應激或感到處於應激狀態下的對象的細胞，具體是血細胞，更具體是外周血細胞中的應激標記，這些標記採取所述序列的RNA分子或這些RNA分子所表達的多肽形式。這些標記是應激的指標，當它們差異性表達時可作為測試對象產生了對應激的生理應答的診斷指標。在此領域中，與現有技術相比，這種標記認為有許多優點。在某些利用外周血進行分析的優選實施方案中，監測對應激的應答的可能的，此外採集血樣的侵入性很小且相對廉價。因此，本文所述的檢測方法適用於廣泛篩檢對象。看來本文所述的核酸序列發現可用於評估對應激的應答以及處理和治療應激的各種用途。本文範圍內的這些應用的例子包括利用特異性引物擴增應激標記、通過與寡核苷酸標記雜交、將分離的核酸摻入載體、使摻入載體的核酸表達為RNA和蛋白質與使對應於該標記所編碼產物的免疫學試劑顯影來檢測應激標記。所鑑定的應激標記進而可用於設計特異性寡核苷酸探針和引物。這種探針和引物可以是能與所鑑定的標記基因序列特異性雜交的任何長度，其至少長約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500個核苷酸，而探針可長達本文所鑑定的標記基因序列的全長。探針也可在其5'和/或3'末端包含其它序列從而能延伸超出與其雜交的靶序列。當聯用核酸擴增方法時，這些探針和引物能快速分析生物學樣品(例如，外周血樣品)來檢測或定量測定標記基因轉錄產物。這種方法包括本領域已知或本文所述用於複製或增加靶核酸或其互補序列的拷貝數或含量的任何方法或技術。所鑑定的標記也可用於從基因組DNA文庫中鑑定和分離全長基因序列，包括基因表達的調節元件，它們宜為(但不限於)馬來源的元件。本文鑑定的cDNA序列可用作雜交探針採用常規技術來篩檢基因組DNA文庫。一旦鑑定到部分基因組克隆，可通過"染色體行走"(也稱為"重疊雜交")釆用，例如Chinault和Carbon(1979，G^e，5:11l-126)所述的方法來分離全長基因。一旦利用cDNA雜交探針分離得到部分基因組克隆，位於該部分基因組克隆兩末端或附近的非複製型區段可用作雜交探針作進一步基因組文庫篩檢，最終分離得到感興趣應激標記的整個基因序列。應知道可用本文所述的部分cDNA序列或短的表達序列標籤(ETS)，採用例如Sambrook等，(《分子克隆.實驗室手冊》(MOLECULARCLONING.ALABORATORYMANUAL),(冷泉港出版社，1989)和Ausubel等，(《最新分子生物學方法》(CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY),JohnWiley&Sons,Inc.,1994)所述的標準技術獲得全長基因。此外，可採用公開的，例如以上參考教材中所述的標準技術，利用所述序列來鑑定和分離得到全長cDNA序列。可採用本文所述的檢測方法利用這些技術鑑定和分離的序列來檢測應激標記基因，這些序列是本發明的一部分。作為本發明一部分，本領域普通技術人員能從所鑑定的標記基因中選擇一些區段用於測定易感性，各種檢測、診斷或預後方法，載體構建物，製備抗原結合分子，試劑盒和/或本文所述任何實施方案中。本發明需要使用的標記基因序列是以下SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109-、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、l卯、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248(參見表l)所示的序列。4.本發明的核酸分子如實施例和表1所述，本文提供了通過GeneChipTM分析正常和遭遇應激的馬匹的血液鑑定到的134種應激標記(g卩，134種應激標記基因)。在這134種標記基因中，96種具有全長或基本上全長的編碼序列，其餘38種在它們的5'和3'末端的一端或兩端具有部分序列信息。所鑑定的應激標記基因包括38種以前未特徵鑑定的馬基因。根據本發明，本文所述分離的核酸序列本身可用作雜交探針或擴增引物。這些核酸可用於，例如診斷性評估生物學樣品或用於克隆全長cDNA或與其相對應的基因組克隆。在某些實施方案中，這些探針和引物提供了長度足以和自生物學樣品提取的RNA或DNA樣品特異性雜交的寡核苷酸。這些序列通常約10-20個核苷酸長，但可以更長。某些實施方案需要較長的序列，例如約30、40、50、100、500個核苷酸和甚至多達全長。本發明考慮了具有以下SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248所示任一序列的約10、15、17、20、30、40、50、60、75或100或500個核苷酸的連續延伸段的核酸分子。本發明也考慮了與上述序列互補，能在高嚴謹性條件下與之結合的分子。這些探針可用於各種雜交實施方案，例如Southern和Northern印跡。在一些例子中，本發明考慮可使用能與多種靶序列雜交而不損傷它們有效檢測應激應答能力的探針。總之，本發明考慮了本文所述雜交探針既可用作溶液雜交(如PCR中)的試劑來檢測相應基因的表達以及可用於固相實施方案中。設計了圍繞所述核苷酸序列的各種探針和引物。例如，在某些實施方案中，用於設計探針和引物的序列可包括通常連接於所鑑定標記基因RNA兩末端的腺嘌呤核苷酸的重複延伸段(poly-A尾部)。在其它實施方案中，由於本領域普通技術人員可能認為某些區段更適用於所述檢測方法，故可將探針和引物專門設計為不包括所鑑定標記基因的這些或其它區段。在任何情況中，普通技術人員均能為所選的應用選擇引物或探針序列。用於檢測應激標記基因的示範性探針序列見表2。引物可以是雙鏈或單鏈形式，雖然單鏈形式更可取。可將探針設計為能與靶DNA或RNA結合(儘管可能引發(應答))而無需用於擴增方法中。在某些實施方案中，可用放射性物質(32P、"C、35S、3H或其它標記物)、螢光團(例如羅丹明、螢光素)或化學發光標記物(例如，螢光素酶)標記這些探針或引物。本發明提供可用作應激標記的96種基本上全長的cDNA序列以及59種EST或部分cDNA序列。然而，應該知道本文不限於這些公開的序列，特別是至少要包括能與含有所公開序列的核酸或這些核酸的變體雜交的分離的核酸。例如，可用核酸的部分序列來鑑定結構相關的基因或其所衍生的全長基因組或cDNA克隆。本領域已知可用作上述探針的耙序列的cDNA和基因組文庫的製備方法(參見，例如Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)。所有這種核酸以及本文所述的特異性核酸分子統稱為"應激標記多核苷酸。"此外，本發明的範圍包括應激標記多核苷酸的分離或純化的表達產物(即，RNA轉錄物和多肽)。因此，本發明包括分離的或基本上純化的核酸或蛋白質組合物。"分離的"或"純化的"核酸分子或蛋白質，或其生物學活性部分是基本上或在本質上不含有在該核酸分子或蛋白質天然存在環境中發現的與其正常相伴或相互作用的組分。因此，當分離或純化的多核苷酸或多肽通過重組技術產生時其基本上不含其它細胞物質或培養基成分，或者當它們用化學合成時基本上不含化學前體或其它化學物質。"分離的"多核苷酸宜不含產生該多核苷酸的生物體的基因組DNA中天然側接該多核苷酸的序列(即，位於該多核苷酸的5'和3'末端的序列)，特別是蛋白質的編碼序列。例如，在各種實施方案中，分離的應激標記多核苷酸可含有少於約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的產生該多核苷酸的細胞的基因組DNA中天然側接該多核苷酸的核苷酸序列。基本上不含細胞物質的多肽包括含有少於約30%、20%、10%、5%(以乾重計)的汙染蛋白質的蛋白質製劑。當本發明的蛋白質或其生物學活性部分用重組方法製備時，培養基成分宜少於約30%、20%、10%或5%(以乾重計)的化學前體或非感興趣蛋白質的化學物質。本發明也包括應激標記基因的全長或基本上全長核苷酸序列的各部分，或者它們的轉錄物或這些轉錄產物的DNA拷貝。應激標記核苷酸序列的各部分可編碼多肽部分或保留該天然多肽生物學活性的區段。或者，可用作雜交探針的應激標記核苷酸序列的各部分通常不編碼保留這種生物學活性的胺基酸序列。因此，應激標記核苷酸序列的各部分至少含有編碼本發明應激標記多肽的核苷酸序列的約15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、80、90、100個核苷酸，或者幾乎高達其全長的核苷酸序列。編碼本發明應激標記多肽的生物學活性部分的應激標記核苷酸序列的一部分至少可編碼全長應激標記多肽中的約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、卯、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000、或者甚至至少約2000、3000、4000或5000個連續胺基酸殘基，或者幾乎高達其胺基酸總數。可用作雜交探針或PCR引物的應激標記核苷酸序列的各部分一般無需編碼應激標記多肽的生物學活性部分。因此，應激標記核苷酸序列的一部分可編碼應激標記多肽的生物學活性部分，或者它可以是用作本領域己知標準方法的雜交探針或PCR引物的片段。可通過分離一條本發明應激標記核苷酸序列的一部分，表達其所編碼的應激標記多肽的一部分(例如通過體外重組表達)並評估所編碼的該應激標記多肽的一部分(活性)來製備該應激標記多肽的生物學活性部分。作為應激標記核苷酸序列各部分的核酸分子至少含有全長應激標記核苷酸序列中的約15、16、17、18、19、20、25、30、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600或650個核苷酸，或者幾乎高達其核苷酸總數。本發明也考慮了應激標記核苷酸序列的變體。核酸變體可以是天然產生的，例如等位變體(同一基因座)、同源物(不同基因座)和直向同源物(不同生物體)或者可以是非天然產生的。可採用熟知的分子生物學技術，例如本領域已知的聚合酶鏈式反應(PCR)和雜交技術鑑定天然產生在的變體，例如這些變體。可通過誘變技術，包括適用於多核苷酸、細胞或生物體的技術來製備非天然產生的變體。這些變體可含有核苷酸取代、缺失、倒位和插入。編碼和/或非編碼區可發生變異。變異既可導致保守性也可導致非保守性胺基酸取代(與編碼產物相比)。就核苷酸序列而言，保守性變體包括因遺傳密碼子的簡併性而編碼本發明應激標記多肽之一的胺基酸序列的那些(核酸)序列。變體核苷酸序列也包括合成衍生但仍能編碼本發明應激標記多肽的核苷酸序列，例如通過定點誘變產生的那些序列。總體上，通過本文所述的序列比對程序利用默認參數測定到本發明某特定核苷酸序列的變體與該核苷酸序列至少具有約30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%，一般至少約75%、80%、85%,優選約90%-95%以上，更優選約98%以上的序列相同性。本發明的應激標記核苷酸序列可用於分離其它生物體，特別是其它哺乳動物，尤其是其它品種馬的相應序列與等位變體。核酸序列的雜交方法是本領域現有的不難獲得。其它生物體的編碼序列可通過熟知技術根據其與本文所述編碼序列的序列相同性分離得到。在這些技術中，可將所有或部分的已知編碼序列用作探針，與所選生物體的克隆的基因組DNA片段或cDNA片段群(即，基因組或cDNA文庫)中存在的其它應激標記編碼序列選擇性雜交。因此，本發明也考慮了在下述嚴謹性條件下能與所述應激標記基因核苷酸序列或其互補序列雜交的多核苷酸。本文所用的術語"在低嚴謹性、中等嚴謹性、高嚴謹性或極高嚴謹性條件下雜交"描述了雜交和洗滌的條件。進行雜交反應的指南可見Ausubel等(1998，同上)，第6.3.1-6.3.6部分。該參考文獻中描述了水性和非水性方法，二者均可用。本文提及的低嚴謹性條件包括至少約1-至少約15%v/v的甲醯胺和至少約1-至少約2M的鹽，42'C雜交，與至少約1-至少約2M的鹽，42"C洗滌。低嚴謹性條件也可包括1%牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5MNaHPO4(pH7.2)、7%SDS，65。C雜交，與(i)用2XSSC、0.1%SDS;或(ii)用0.5%BSA、1mMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、5%SDS，室溫洗滌。低嚴謹性條件的一個實施方案包括約45t:在6X氯化鈉/擰檬酸鈉(SSC)中雜交，然後至少在5(TC(低嚴謹性條件的洗滌溫度可升高至55t:)用0.2XSSC，0.1。/。SDS洗滌兩次。中等嚴謹性條件包括至少約16-至少約30%v/v的甲醯胺和至少約0.5-至少約0.9M的鹽，42'C雜交，與至少約0.1-至少約0.2M的鹽，55'C洗滌。中等嚴謹性條件也可包括1%牛血清白蛋白(BSA)、1mMEDTA、0.5MNaHPO4(pH7.2)、7%SDS，65。C雜交，與(i)用2XSSC、0.1%SDS;或(ii)用0.5%BSA、lmMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、5%SDS，60陽65。C洗滌。中等嚴謹性條件的一個實施方案包括約45'C在6XSSC中雜交，然後6(TC用0.2XSSC，0.1%SDS洗滌一次以上。高嚴謹性條件包括至少約31-至少約50%v/v的甲醯胺和約0.01-約0.15M的鹽，42'C雜交，與用約0.01-約0.02M的鹽，55。C洗滌。高等嚴謹性條件也可包括1%BSA、1mMEDTA、0.5MNaHP04(pH7.2)、7%SDS，65。C雜交，與(i)用0.2XSSC、0.1。/。SDS;或(ii)用0.5%BSA、1mMEDTA、40mMNaHPO4(pH7.2)、1%SDS，在超過65'C的溫度洗滌。高嚴謹性條件的一個實施方案包括約45'C在6XSSC中雜交，然後65。C用0.2XSSC，0.1%SDS洗滌一次以上。在某些實施方案中，本發明的應激標記多核苷酸在極高嚴謹性條件下與所述核苷酸序列雜交。極高嚴謹性條件的一個實施方案包括65'C在0.5M磷酸鈉、7。/。SDS中雜交，然後65。C用0.2XSSC，1。/。SDS洗滌一次以上。本領域技術人員熟知其它嚴謹性條件，技術人員知道可操縱各種因素來優化雜交的特異性。可優化最終洗滌的嚴謹性以確保高程度雜交。詳細例子可參見Ausubel等，同上，第2.10.1-2.10.16頁和Sambrook等，(1989，同上)，第1.101-1.104部分。雖然一般在約42'C-68"C的溫度下進行嚴謹性洗滌，但本領域技術人員知道其它溫度也適合於嚴謹性條件。為形成DNA-DNA雜交，發生最大雜交率的溫度一般比Tm低約2(TC-25。C。本領域熟知Tm是解鏈溫度，或者是兩條互補多核苷酸序列解離的溫度。本領域熟知評估Tm的方法(參見Ausubel等，同上，第2.10.8頁)。總體上，可利用以下公式預測DNA的最佳匹配雙螺旋的Tm近似值Tm=81.5+16.6(logioM)+0.41(%G+C)-0.63(%甲醯胺)—(600/長度)其中M是Na+的濃度，優選0.01-0.4摩爾；％G+C是鳥苷和胞苷鹼基之和佔鹼基總數的百分比，其範圍在30%和75%G+C之間；％甲醯胺是以體積計的甲醯胺濃度的百分比；長度是DNA雙螺旋中鹼基對的數目。隨機錯配的鹼基對數目每上升1%，雙螺旋DNA的Tm降低約rC。高嚴謹性洗滌通常在Tm-15'C時進行，或者中等嚴謹性在Im-30'C進行。在雜交方法的一個例子中，含有固定DNA的膜(例如，硝酸纖維素膜或尼龍膜)42'C在含有標記探針的雜交緩衝液(50M去離子甲醯胺、5XSSC、5XDenhardt溶液(0.1%ficoll、0.1%聚乙烯妣咯烷酮和0.1%牛血清白蛋白)、0.1。/。SDS和200mg/mL變性鮭魚精子DNA)中雜交過夜。然後以中等嚴謹性條件連續洗滌該膜兩次(即，45'C用2XSSC、0.1%SDS洗滌15分鐘，然後5(TC用2XSSC、0.1%SDS洗滌15分鐘)，在較高嚴謹性連續洗滌兩次(即，55。C用0.2XSSC、0.1%SDS洗漆12分鐘，然後65-68'C用0.2XSSC、0.1%SDS溶液洗滌12分鐘)。5.本發明的多肽本發明也考慮了本發明的應激標記基因編碼的全長多肽以及那些多肽的生物學活性部分，統稱為"應激標記多肽"。全長應激標記多肽的生物學活性部分包括至少長約6、8、10、12、14、16、18、20、25、30、40、50、60個胺基酸殘基的具有免疫相互作用活性的部分。例如，本發明所考慮的免疫相互作用片段至少長6個，優選至少8個胺基酸殘基，它們能在動物中引發免疫應答從而產生能與本發明的應激標記多肽發生免疫相互作用的抗原結合分子。這種抗原結合分子可用於篩檢其它哺乳動物，特別是馬類哺乳動物的與結構和/或功能相關的應激標記多肽。全長應激標記多肽的各部分一般可能參與某種相互作用，例如分子內或分子間相互作用。分子間相互作用可以是特異性結合相互作用或酶促相互作用(例如所述相互作用可以是瞬時性，可形成或打斷某共價鍵)。全長應激標記多肽的生物學活性部分包括含有與某(假定的)全長應激標記多肽的胺基酸序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示的胺基酸序列足夠相似或衍生自該胺基酸序列的胺基酸序列的肽，這些序列含有少於全長應激標記多肽的胺基酸並至少顯示該多肽的一種活性。生物學活性部分通常包含至少具有全長應激標記多肽的一種活性的結構域或基序。全長應激標記多肽的生物學活性部分可以是長，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、卯、100、120、150、300、400、500、600、700、800、900或1000，或者甚至至少約2000、3000、4000或5000個以上胺基酸殘基的多肽。所述部分宜是含有不低於其所衍生的全長多肽的約1%、10%、25%、50%活性的"生物學活性部分"。本發明也考慮了應激標記多肽的變體。"變體"多肽包括通過以下方式從天然蛋白質中衍生的蛋白質在該天然蛋白質的N-末端和/或C-末端刪除(稱為截短)或添加一個或多個胺基酸；在該天然蛋白質的一個或多個位點處刪除或添加一個或多個胺基酸；或者在該天然蛋白質的一個或多個位點處取代一個或多個胺基酸。本發明的變體蛋白質是生物學活性的，即它們繼續具有該天然蛋白質的所需生物學活性。例如，遺傳多態性或人為操作可形成這種變體。通過本文所述的序列比對程序利用默認參數測定到本發明的天然應激標記蛋白質的生物學活性變體與該天然蛋白質的胺基酸序列可具有至少40%、50%、60%、70%，一般至少75%、80%、85%,優選約90%-95%以上，更優選約98%以上的序列相似性。本發明蛋白質的生物學活性變體與該蛋白質一般可有多達1000、500、400、300、200、100、50或20個胺基酸殘基，或者宜少至1-15個胺基酸殘基、少至1-10個(例如6-10個)、少至5個、少至4、3、2或者甚至l個胺基酸殘基不同。可以各種方式改變本發明的應激標記多肽，包括胺基酸取代、缺失、截短和插入。本領域一般知道這種操作方法。例如，可通過DNA突變製備應激標記蛋白質的胺基酸序列變體。本領域熟知誘變與核苷酸序列改變的方法。參見，例如Kunkel(1985，屍麼.JcW.,,82:488-492)，Kunkel等，(1987，M"/zo&〖"￡>zz>wo/.,154:367-382)，美國專利號4,873,192;Watson，J,D.等，(《基因的分子生物學》(MolecularBiologyoftheGene)，第四版，Benjamin/Cummings，MenloPark,Calif.，1987)和它們所引用的參考文獻。適當進行胺基酸取代而不影響感興趣蛋白質的生物學活性的指南見Dayhoff等，(1978)，《蛋白質序列和結構圖》(AtlasofProteinS叫uenceandStructure),(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.)的模型。本領域已知篩選具有所選特性的通過點突變或截短(方法)製備的組合文庫基因產物和篩選cDNA文庫的基因產物的方法。這種方法適用於快速篩選通過組合誘變產生的應激標記多肽的基因文庫。可聯用能提高該文庫中功能性突變體的頻率的技術-遞推集團誘變(REM)技術與篩選試驗來鑑定應激標記多肽變體(Arkin和Yourvan，(1992)，屍亂淑/.爿cacf.,，S9:7811-7815;Degrave等，(1993)，屍她/w五，'廳"'"g，6:327-331)。下文詳述了理想的保守性取代，例如用另一個具有相似特性的胺基酸替換某一胺基酸。與親代應激標記胺基酸序列相比，應激標記多肽變體在沿它們序列的不同位置可含有保守性胺基酸取代。"保守性胺基酸取代"是用具有相似側鏈的胺基酸殘基取代某胺基酸殘基。本領域定義了具有相似側鏈是胺基酸殘基家族，它們一般可再分為酸性該殘基因在生理pH下失去H離子而帶負電荷，該殘基受水溶液吸弓|，因此當包含它的肽處於生理pH的水性介質中時，它吸附於該肽構型的表面位置。含有酸性側鏈的胺基酸包括穀氨酸和天冬氨酸。鹼性該殘基因在生理PH下或在其一兩個pH單位內結合H離子而帶正電荷(例如，組氨酸)，該殘基受水溶液吸引，因此當包含它的肽處於生理pH的水性介質中時，它吸附於該肽構型的表面位置。含有鹼性側鏈的胺基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶電荷的這些殘基在生理pH時帶電荷，因此包括含有酸性或鹼性側鏈的胺基酸(即，穀氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸和組氨酸)。疏水性這些殘基在生理pH下不帶電荷並被水溶液所排斥，因此當包含它的肽處於水性介質中時，它吸附於該肽構型的內部位置。含有疏水側鏈的胺基酸包括酪氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。中性/極性這些殘基在生理pH下不帶電荷，但水溶液不十分排斥它們，因此當包含該殘基的肽處於水性介質中時，它吸附於該肽構型的內部位置。含有中性/極性側鏈的胺基酸包括天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、組氨酸、絲氨酸和蘇氨酸。本說明書也將某些胺基酸特徵鑑定為"小的"胺基酸，因為它們的側鏈不夠大(即使缺乏極性基團)因而不能賦予疏水性。除脯氨酸以外，"小的"胺基酸是當側鏈上有至少一個極性基團時具有4個以下碳，和當側鏈上沒有極性基團時具有3個以下碳的那些胺基酸。具有小側鏈的胺基酸包括甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸和蘇氨酸。基因編碼的二級胺基酸-脯氨酸因已知其對肽鏈的二級構型有影響而成為一種特殊情況。脯氨酸的結構不同於所有其它天然產生的胺基酸在於其側鏈與a-氨基的氮以及oc-碳結合。例如Dayhoff等((197S)，"蛋白質進化改變的模型"(Amodelofevolutionarychangeinproteins))公開了幾種胺基酸相似性矩陣(例如，PAM120矩陣和PAM250矩陣)。然而，刊於M.O.Dayhoff編的《蛋白質序列和結構圖》(AtlasofProteinS叫uenceandStructure),第5巻，第345-358頁，NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonDC;禾口Gonnet等，1992，S"'e"ce，256(5062):144301445中用於測定遠程關係的矩陣將脯氨酸包括在與甘氨酸、絲氨酸丙氨酸和蘇氨酸的同一組中。因此，為本發明的目的將脯氨酸歸類為"小"胺基酸。將(胺基酸)分為極性或非極性所需的吸引或排斥程度是隨意的，因此本發明專門考慮的胺基酸可分為一類或另一類。可根據已知的性能對大多數未專門命名的胺基酸進行分類。胺基酸殘基還可再分為環狀或非環狀、芳香族或非芳香族、根據殘基的側鏈取代基可自圓其說分類為小的或大的。如果某殘基總共含有4個以下碳原子(包括羧基碳)，認為其是小胺基酸，前提是存在其它極性取代基；如果不存在其它極性取代基，總共含3個以下碳原子的殘基可認為是小胺基酸。小殘基當然總是非芳香族殘基。可根據胺基酸殘基的結構性能將其分為兩種以上的種類。就天然產生的蛋白質胺基酸而言，根據此方案的亞分類見表3.保守性胺基酸取代也包括根據側鏈的分類。例如，含有脂族側鏈的一組胺基酸包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；含有脂族-羥基側鏈的一組胺基酸包括絲氨酸和蘇氨酸；含醯胺側鏈的一組胺基酸是天冬醯胺和穀氨醯胺；含有芳香族側鏈的一組胺基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；含有鹼性側鏈的一組胺基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；與含有硫側鏈的一組胺基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。例如，可以合理地希望用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、穀氨醯胺取代天冬醯胺、絲氨酸取代蘇氨酸，或者用結構相關的胺基酸相似地取代某種胺基酸時不會嚴重影響所產生的變體多肽的性能。胺基酸改變是否能產生功能性應激標記多肽不難通過檢驗其活性來測定。保守性取代可見表4示範性取代的標題。更優選的取代見優選取代標題。本發明範圍內的胺基酸取代一般通過選擇其作用對(a)維持取代區域中肽骨架的結構，(b)維持該分子在耙位點的電荷或疏水性，或(C)維持側鏈的體積的作用中沒有明顯不同的.取代來實現。引入取代後，篩選變體的生物學活性。或者，可根據側鏈的相同性將製備保守性取代的相似胺基酸分為三類。如Zubay，G.，《生物化學》(S/ocAem/W;7)，第三版，Wm.C.BrownPublishers,(1993)所述，第一組包括均含有帶電荷鏈的穀氨酸、天冬氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸；第二組包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺；第三組包括亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、甲硫氨酸。因此，通常用同一側鏈家族中的另一胺基酸殘基取代應激標記多肽中預計的非必需胺基酸殘基。或者，可沿著全部或部分應激標記基因編碼序列隨機引入突變，例如通過飽和誘變，然後篩選得到的突變體有無親代多肽的活性來鑑定保留了該活性的突變體。誘變編碼序列後，可重組表達所編碼的肽，測定該肽的活性。因此，本發明也考慮了天然產生的應激標記多肽序列的變體或它們的生物學活性片段，其中所述變體可通過添加、缺失或取代一個或多個胺基酸殘基而與天然產生的序列相區別。總體上，變體可顯示與親代應激標記多肽序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的相似性。變體優選與親代應激標記多肽序列，例如以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、29、22、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少約30、40、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相同性。此外，本發明考慮了通過添加、缺失或取代1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、500個以上胺基酸而與天然或親代序列不同但仍保留了該親代應激標記多肽特性的序列。應激標記多肽也包括能在本文所定義的嚴謹條件下，68特別是高嚴謹條件下與上述本發明應激標記多核苷酸序列或其非編碼鏈雜交的多核苷酸編碼的多肽。在一個實施方案中，變體多肽與應激標記序列有至少一個但少於50、40、30、20、15、10、8、6、5、4、3或2個胺基酸殘基不同。在另一實施方案中，變體多肽與以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示的相應序列有至少1%但低於20%、15%、10%或5%的殘基不同。(如果此比較(方法)需要比對，則應比對這些序列的最大相似性。因缺失或插入或錯配所產生的"環"外序列可認為有差別)。這些差別優選是位於非必需殘基的差別或改變或保守性取代。"非必需"胺基酸殘基是可從某實施方案多肽的野生型序列中改變，而不破壞或基本上不改變其一種或多種活性的殘基。所述改變優選基本上不改變這些活性，例如不改變野生型多肽的20%、40%、60%、70%或80%活性。"必需"胺基酸殘基是當從本發明應激標記多肽的野生型序列中改變時會破壞該親代分子的活性從而使野生型多肽存在的活性低於20%的殘基。在其它實施方案中，變體多肽包括與應激標記多肽的相應序列，例如以下SEQIDNO..2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示任一序列具有至少約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、卯％、91%、92%、93%、94%95%、96%、97%、98%以上相似性並具有該應激標記多肽活性的胺基酸序列。可通過本領域技術人員已知的任何合適方法製備本發明的應激標記多肽。例如，可通過包括以下步驟的方法製備這些多肽(a)製備含有至少編碼某應激標記多核苷酸的一部分並與調節元件操作性相連的核苷酸序列的嵌合型構建物；(b)將該嵌合型構建物引入宿主細胞；(C)培養該宿主細胞表達該應激標記多肽；和(d)從宿主細胞中分離該應激標記多肽。在示範性的例子中，所述核苷酸序列至少編碼以下SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249所示序列的一部分，或其變體。嵌合型構建物通常釆取表達載體的形式，宜選自自身複製的染色體外載體(例如質粒)和能整合入宿主基因組中的載體。調節元件一般應適合於表達該應激標記多肽所用的宿主細胞。本領域己知各種宿主細胞的許多類型的表達載體和調節元件。此類型的示範性元件包括但不限於啟動子序列(例如可以是天然產生的或含多種啟動子的組合元件的組成型或可誘導啟動子)、前導或信號序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列、與增強子或激活序列。在一些實施方案中，所述表達載體包含可選擇的標記基因以選擇轉化的宿主細胞。可選擇標記基因是本領域熟知的並隨所用的宿主細胞而不同。所述表達載體也可包含融合伴侶(通常由該表達載體提供)從而可將應激標記多肽表達製備為含有融合伴侶的融合多肽。融合伴侶的主要優點是它們有助於鑑定和/或純化該融合多肽。為製備融合多肽，需要將應激標記多核苷酸連接入表達載體中從而使融合伴侶與應激標記多核苷酸的翻譯讀框重合。融合伴侶的熟知例子包括但不限於穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、人IgG的Fc部分、麥芽糖結合蛋白(MBP)和六個組氨酸(hexahistidine)(HIS6)，這些伴侶特別可用於通過親和層析分離融合多肽。在一些實施方案中，可利用與融合伴侶結合的基質(例如但不限於穀胱甘肽-、直鏈澱粉-和鎳-或鈷-偶聯樹脂)通過親和層析純化這些融合多肽。許多這種基質可以"試劑盒"形式購買到，例如利用(HIS6)伴侶的QIAexpressTM系統(Qiagen)和PharmaciaGST純化系統。本領域己知的其它融合伴侶是發光蛋白質，例如可用作螢光"標籤"通過螢光顯微術或流式細胞術來鑑定和/或分離融合多肽的綠色螢光蛋白(GFP)和螢光素酶。流式細胞術方法，例如螢光激活細胞分選(FACS)法在該後一應用中特別有用。融合伴侶也優選含有蛋白酶切割位點，例如因子Xa或凝血酶的切割位點，從而使相關蛋白酶能部分消化該融合多肽而從融合構建物中釋放應激標記多肽。隨後可通過層析分離方法來分離所釋放的多肽。融合伴侶的範圍也包括"表位標籤"，這些標籤通常是可利用特異性抗體(純化)的短肽序列。易於利用特異性單克隆抗體(純化)的表位標籤的熟知例子包括c-Myc、流感病毒、血凝素和FLAG標籤。可通過包括"轉導"和"轉染"等適當方法將本發明的嵌合型構建物引入.宿主中，這在技術上意味著通過核酸介導的基因轉移將核酸，例如表達載體引入受者細胞中。然而，"轉化"指宿主的基因型因細胞攝入外源性DNA或RNA而改變的過程，例如轉化細胞含有本發明的表達系統。將嵌合型構建物引入細胞有許多方法。所用的方法一般取決於宿主細胞的選擇。本領域技術人員熟知將嵌合型構建物引入宿主細胞的技術。己描述了四類將核酸分子遞送入細胞的方法(1)化學方法，例如磷酸鈣沉澱、聚乙二醇(PEG)-介導的沉澱和脂質轉染；(2)物理方法，例如顯微注射、電穿孔、加速方法和真空滲入；(3)載體方法，例如細菌和病毒載體介導的轉化；和(4)受體介導的轉化。本領域技術人員熟知這些和其它類型的轉化技術，而新的技術也不斷湧現。具體選擇轉化技術取決於該技術轉化特定宿主細胞的效率以及採用具體選擇的方法實施本發明之人的經驗和偏好。技術人員明顯可知對本發明而言，將嵌合型構建物引入細胞中的轉化系統的具體選擇對本發明不是實質性的或對本發明的限制，只要該系統能實現可接受的核酸轉移水平。可通過培養用嵌合型構建物轉化的宿主細胞來製備重組應激標記多肽。適合表達應激標記多肽的條件隨所選表達載體和宿主細胞而不同，技術人員通過常規實驗不難確定這些條件。適合表達的宿主細胞可以是原核或真核細胞。表達本發明多肽的示範性宿主細胞是細菌。所用的細菌可以是大腸桿菌C&yc/2^7'cWfl或者，宿主細胞可以是酵母菌細胞或昆蟲細胞，例如利用杆狀病毒表達系統的s屍9細胞。可採用如Sambrook等，(1989，同上)，特別是第16和17部分；Ausubel等，(1994，同上)，特別是第10和16章；和Coligan等，《蛋白質科學的最新方法》(CURRENTPROTOCOLSINPROTEINSCIENCE),(JohnWiley&Sons，Inc.,1995-1997)，特別是第1、5和6章中所述的標準方法不難製備重組應激標記多肽。或者，可通過化學合成，例如採用如Atherton和Shephard，(同上)第9章和Roberge等，(1995，腸"ce，269:202)中所述的液相合成或固相合成來化學合成應激標記多肽。6.抗原結合分子本發明也提供可與本發明應激標記多肽發生特異性免疫相互作用的抗原結合分子。在一個實施方案中，該抗原結合分子包括多克隆全抗體。可通過，例如將本發明的應激標記多肽注射入能產生(抗體)的動物(包括小鼠和家兔)以獲得多克隆抗血清來製備這種抗體。本領域技術人員熟知製備多克隆抗體的方法。可採用的示範性方法見，例如Coligan等，《免疫學最新方法》(CURRENTPROTOCOLSINIMMUNOLOGY),(JohnWiley&Sons,Inc，199l)和Ausubel等，(1994-1998，同上)，特別是第ll章的第III部分。可採用，例如K池ler和Milstein(1975，iV倉e，256，495-497)所述的標準方法或採用，例如Coligan等，(1991，同上)所述的最新改進方法，用得自接種了一種或多種本發明應激標記多肽的產生(抗體的)動物的無限增殖脾細胞或其它抗體產生細胞來製備單克隆抗體，替代在產生(抗體的)動物中得到的多克隆抗血清。本發明也考慮用Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段作為抗原結合分子。或者，抗原結合分子可包括合成的穩定的Fv片段。此類型的示範性片段包括用肽接頭分別橋連V/z結構域的N末端或C末端與V丄結構域的C末端或N-末端的單鏈Fv片段(sFv，通常稱為scFv)。ScFv缺乏完整抗體的所有恆定區，因而不能激活補體。可根據，例如Kreber等(Kreber等，1997，J/mm朋o/.M"/zo&，201(1):35-55)所概述的方法製備ScFv。或者，可通過美國專利號5,091,513;歐洲專利號239,400或Winter和Milstein的文章(1991，Mm^e，349:293)和PKickthun等(1996，刊於《抗體工程改造一種實用方法》(J加》o辦ewg&een'"g:爿prac"ca/appraac/z),203-252)所述的方法製備它們。在另一實施方案中，合成的穩定的Fv片段包括二硫鍵穩定的Fv(dsFv)，在該片段中將二個半胱氨酸殘基引入Vi/和V丄結構域中從而在完全摺疊的分子中此二殘基彼此之間形成二硫鍵。產生dsFv的合適方法描述於，例如(Glockscuther等，飾c/j綴,29:1363-1367;Reiter等，1994,C/z謹,，269:18327-18331;Reiter等，1994，說oc/zem.，3丄5451-5459;Reiter等，1994，Omcer^M.，54:2714-2718;Webber等，1995，Mo/./wm麗o/.，32:249-258)。本領域已知製備抗-應激標記多肽的抗原結合分子的噬菌體展示與組合方法(例如，以下文獻中所述的Ladner等，美國專利號5,223,409;Kang等，國際公布號WO92/18619;Dower等，國際公布號WO91/17271;Winter等，國際公布WO92/20791;Markland等，國際公布號WO92/15679;Breitling等，國際公布WO93/01288;McCafferty等，國際公布號WO92/01047;Garrard等，國際公布號WO92/09690;Ladner等，國際公布號WO90/02809;Fuchs等，(1991)Sw/rec/mo/ogv，2:1370-1372;Hay等，(1992)，//wm^""k^7/#/^/omw,2:81-85;Huse等，(1989)，謹:1275-1281;Griffths等，(1993)，￡MSO/，12:725-734;Hawkins等，(1992)，/M/淑，226:889-896;Clackson等，(1991)，A/fl&re，352:624-628;Gram等，(1992)，iW^4S，3576-3580;Garrad等，(1991)，說'o/Tec/mo/ogy，2:1373-1377;Hoogenboom等，(1991)，7W^爿c/c/b，J^:4133-4137;和Barbas等，(1991)，iWA5，絲7978-7982)。這些抗原結合分子可用於篩選應激標記多肽變體的表達文庫。它們也可用於檢測和/或分離本發明的應激標記多肽。因此，本發明也考慮可利用這些抗原結合分子，採用例如任何合適的免疫親和方法(包括但不限於免疫層析和免疫沉澱)來分離應激標記多肽。合適的方法利用固相吸附，其中抗-應激標記多肽的抗原結合分子與合適的樹脂相連，使該樹脂與懷疑含有應激標記多肽的樣品接觸，然後從樹脂上洗脫應激標記多肽(如果存在的話)。示範性樹脂包括Sepharose(Pharmacia)、Poros⑧樹月旨(RocheMolecularBiochemicals，Indianapolis)、ActigelSuperflowTM樹月旨(SterogeneBioseparationsInc.,CarlsbadCalif.)禾口Dynabeads(DynalInc.，LakeSuccess,N.Y.)。抗原結合分子可與某化合物，例如標記物，如放射性核素，或成像試劑，如放射性、酶活性(試劑)或其它試劑，如NMR對比試劑相偶聯。優選能產生可檢測放射性射線或螢光的標記物。為評估蛋白質表達的豐度和模式，可利用抗-應激標記多肽的抗原結合分子(例如，單克隆抗體)來檢測應激標記多肽(例如，在細胞裂解物或細胞上清液中的)。在本發明的某些優選應用中，可用這種抗原結合分子來監測生物學樣品(含有完整的細胞和液體)中的應激標記多肽水平而診斷是否存在應激狀態及其程度或應激所致疾病的風險。將抗體與可檢測物質(即，抗體標記)相偶聯(S卩，物理連接)有助於檢測。可檢測物質的例子包括各種酶、輔基、螢光材料、發光材料、生物發光材料和放射性材料。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、(3-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適的輔基複合物的例子包括鏈黴親和素/生物素與親和素/生物素；合適的螢光材料的例子包括傘形酮、螢光素、螢光素異硫氰酸酯、羅丹明、二氯三吖嗪胺螢光素(dichlorotriazinylaminefluorescein)、丹磺醯氯或藻紅蛋白；發光材料的例子包括魯米諾；生物發光材料的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性材料的例子包括U5l、131^35s或3h。標記物可選自色原、催化劑、酶、螢光基團、化學發光分子、鑭系離子，如銪(Eu3勺、放射性同位素和直接可見的標記物。就直接可見標記物而言，可用膠體金屬顆粒或非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、有機聚合物、乳膠顆粒、脂質體或含有信號產生物質的其它載體等製備標記。美國專利說明書U.S.4,366,241;U.S.4,843,000和U.S.4,849,338公開了大量可用作標記物的酶。本發明可用的酶標記物包括鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶、螢光素酶、卩-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、溶菌酶、蘋果酸脫氫酶等。溶液中酶標記物可單獨使用或與第二種酶聯用。7.檢測應激標記基因異常表達或等位基因的方法本發明部分基於以下發現與未經受應激的馬相比，經受應激的馬的某些基因或者這些基因的某些等位基因(本文稱為應激標記基因)異常表達。有人提出在處於應激狀態下的其它動物中發現這些基因或它們的同源物或直向同源物的異常表達。因此，本發明的特徵在於通過檢測取自某對象(優選哺乳動物)的生物學樣品中某應激標記基因的異常表達來評估該對象的應激狀態或診斷應激或應激相關疾病(應激後遺症)的方法。按照一些實施方案，所述相關疾病的特徵在於皮質類固醇或其調節劑(例如，促腎上腺皮質激素釋放因子)的水平升高。這種相關疾病的示範性例子包括身體應激，例如田徑訓練和身體外傷；情感障礙，例如抑鬱，包括重度抑鬱、單一事件抑鬱(single印isodedepression)、復發性抑鬱(recurrentdepression)、虐待兒童誘導的抑鬱(childabuseinduceddepression).季節性情感障礙、產後抑鬱、胸腺機能障礙(dysthemia)、雙相性精神障礙和循環性情感；焦慮症，包括恐慌、恐怖症、強迫性精神失調；創傷後應激疾病；應激誘導的睡眠障礙；炎症；疼痛；慢性疲勞症候群；應激誘導的頭痛；癌症；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；神經變性疾病，例如阿爾茨海默病、帕金森病和亨廷頓病；腸胃疾病，例如潰瘍、激惹性腸症候群、克羅恩病、痙攣性結腸炎、腹瀉、術後腸梗阻和病理心理學失調或應激相關的結腸過敏症，-飲食疾病，如厭食和神經性貪食；核上麻痺(supranuclearpalsy);肌萎縮性側索硬化症；免疫功能降低或免疫抑制；出血性應激；應激誘導的精神病發作(stress-inducedpsychoticepisode);甲狀腺機能不正常症候群；抗腹瀉激素(ADH)不適當症候群；暴食或肥胖症；不育症；頭部創傷；脊髓創傷；缺血性神經元損傷(例如，腦缺血，如腦海馬回缺血)；興奮性中毒神經元損傷；癲癇；心血管疾病，包括高血壓、心動過速和充血性心力衰竭；中風；免疫功能失調，包括應激誘導的免疫失調(如應激誘導的發燒、豬應激症候群、牛航運熱、馬陣發性顫抖與小雞禁閉、綿羊急轉向(sheering)應激或狗的人-動物相互作用相的關應激誘導的失調)；自製；行為(自發的)調節；肌肉痙攣；尿失禁；阿爾茨海默型早老性痴呆；多發性腦梗死性痴呆；肌萎縮性側索硬化症；化學物質依賴性和成癮性(例如，酒精、古柯鹼、海洛因、苯並二氮雜蕈類或其它藥物)；藥物和酒精戒除症狀；骨質疏鬆症；社會心理(psych0S0cial)侏儒症；低血糖血症；脫髮；晝夜節律異常；和晝夜節律異常相關的疾病，例如時區改變症候群、季節性情感障礙、失眠、睡眠-清醒模式不規律、遲發性睡眠階段症候群、晚期睡眠階段症候群、非-24小時睡眠清醒障礙、光誘導的時鐘重設置症、REM睡眠障礙、睡眠過度、深眠狀態、嗜眠症、夜間遺尿、下肢不寧症候群、睡眠呼吸暫停、精神抑鬱症與抗抑鬱藥物長期給藥和停藥相關的心率異常。為作出評估或診斷，需要定性或定量測定應激標記基因轉錄物的水平、某應激標記基因的特定等位基因的存在或水平或應激標記多肽的水平或功能活性。在一些實施方案中，當生物學樣品中存在的某應激標記基因產物的可檢測水平低於取自正常對象或未處於應激狀態的對象的參比樣品中存在的該基因的水平時，則可診斷存在應激狀態、其程度或階段或者存在發生應激後遺症的風險。在其它實施方案中，當生物學樣品中存在的某應激標記基因產物的可檢測水平高於取自正常對象或未受應激的對象的參比樣品中存在的該基因的水平，則可診斷應激的存在、程度或階段或者發生應激後遺症的風險。總之，當生物學樣品中的某應激標記基因產物的水平或功能活性與參比樣品中相應的應激標記基因產物的水平或功能活性相比至少有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、卯％、92%、94%、96%、97%、98%或99%，或甚至至少約99.5%、99.9%、99.95%、99.99%、99.995%或99.999%,或甚至至少約100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%或1000%的差異時，可作出這種診斷。代表性應激標記基因表達水平的示範性升高或降低見表6。相應的基因產物通常選自生物學樣品中存在的同一基因產物、含有等位變體或剪接變體的變體基因(例如，同源或直向同源基因)所表達的基因產物或它們的蛋白質產物。在一些實施方案中，該方法包括檢測至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30種應激標記基因的各表達產物的水平或功能活性。生物學樣品一般含有血液，特別是外周血，或其組分或提取物。生物學樣品通常含有血細胞，例如成熟、不成熟和發育的白細胞，包括淋巴細胞、多形核白細胞、嗜中性白細胞、單核細胞、網織紅細胞、嗜鹼性粒細胞、腔胞、血細胞、嗜酸性粒細胞、巨核細胞、巨噬細胞、樹突細胞、天然殺傷細胞，或這些細胞的組分(例如，核酸或蛋白質部分)。在特定的實施方案中，生物學樣品含有的白細胞，包括外周血單核細胞(PBMC)。7.1核酸診斷方法可按照標準方法(Sambrook等，1989，同上；Ausubel等，1994，同上)從生物學樣品所含細胞中分離核酸用於多核苷酸試驗。所述核酸一般是分級的(例如，polyA+RNA)或全細胞RNA。當將RNA作為檢測對象時，需要將RNA轉化為互補DNA。在一些實施方案中，採用模板依賴性核酸擴增技術擴增該核酸。可採用許多模板依賴性方法來擴增某給定模板樣品中存在的應激標記序列。示範性核酸擴增技術是詳述於美國專利號4,683,195;4,683,202和4,800,159;Ausubel等(同上)和Innis等，(《PCR方法》(PCRProtocols),AcademicPress,Inc.,SanDiegoCalif.，1990)中的聚合酶鏈式反應(稱為PCR)。簡言之，在PCR中，製備與該標記序列的相對互補鏈上區域互補的兩條引物序列。向反應混合物中加入過量的脫氧核苷三磷酸和DNA聚合酶，例如化《聚合酶。如果某樣品中存在同源應激標記序列，這些引物將與該標記(序列)結合，聚合酶可通過添加核苷酸使該引物沿著標記序列延伸。通過升高或降低反應混合物的溫度，延伸的引物可與標記(序列)解離形成反應產物，過量的引物可與標記(序列)和反應產物結合，而反覆進行該過程。為定量測定所擴增的mRNA含量，可採用逆轉錄酶PCR擴增方法。將RNA逆轉錄為cDNA的方法是熟知的，其描述於Sambrook等，1989,同上。其它逆轉錄方法利用熱穩定的RNA依賴性DNA聚合酶。WO90/07641描述了這些方法。本領域熟知聚合酶鏈式反應方法。在某些優選實施方案中，模板依賴性擴增包括實時定量測定轉錄物。例如，可採用實時PCR技術(Higuchi等，1992，萬Zo&c/mo/ogy，10:413-417)定量測定RNA或DNA。通過測定PCR反應中完成相同數目擴增輪次處於線性範圍內的耙DNA擴增產物的濃度，可以測定原始DNA混合物中特異性靶序列的相對濃度。如果DNA混合物是從分離自不同組織或細胞的RNA合成的cDNA，則可測定產生該靶序列的各組織或細胞的特異性mRNA的相對豐度。PCR產物的濃度與mRNA相對豐度之間的這種直接正比例關係只在PCR反應的線性範圍內才正確立。可通過反應混合物中試劑的利用率測定該曲線平臺部分靶DNA的終濃度，該終濃度獨立於該靶DNA的原始濃度。另一擴增方法是EPONo.320308所公開的連接酶鏈式反應("LCR")。在LCR中，製備兩對互補探針，在靶序列存在下每對與靶序列的相反互補鏈結合從而使它們毗鄰。在連接酶存在下，此兩對探針可相連形成一個單位。與PCR中一樣，通過溫度循環，結合的連接單位從靶序列上解離，然後用作連接過量探針對的"靶序列"。美國專利號4,883,750描述了與LCR相似，使探針對和耙序列結合的方法。也可使用PCT申請號PCT/US87/00880所述的QP複製酶。在此方法中，在RNA聚合酶存在下將具有與靶序列某區域相互補區域的RNA複製序列加入樣品中。聚合酶可拷貝該複製序列，然後檢測。利用限制性核酸內切酶和連接酶擴增在一條鏈的限制性位點含有核苷酸5'a-硫代-三磷酸的耙分子的恆溫擴增方法也可用於擴增本發明的核酸，Walker等，(1992，屍亂胸/.顛t/U^，89:392-396)。鏈置換擴增(SDA)是進行核酸恆溫擴增的另一種方法，該方法包括多輪鏈置換與合成，即切口平移。稱為修復鏈式反應(RCR)的相似方法包括使幾種探針與擴增的整個靶區域上退火，然後只對四種鹼基中的兩種進行修復反應。為便於檢測將另兩種鹼基作為生物素化衍生物加入。SDA中採用了類似的方法。也可採用循環探針反應(CPR)檢測特異性靶序列。在CPR中，具有非特異性DNA3'和5，序列與特異性RNA中段序列的探針與樣品中存在的DNA雜交。雜交後，用RNA酶H處理反應(混合物)，探針的產物鑑定為消化後釋放的不同產物。使原始模板與另一循環探針退火，重複進行此反應。還可採用英國專利申請號2202328和PCT申請號PCT/US89/01025所述的另一種擴增方法。在前一申請中，將"修飾的"引物用於PCR-樣的模板和酶依賴性合成中。可用捕獲部分(例如，生物素)和/或檢測部分(例如，酶)標記修飾這些引物。在後一申請中，將過量的標記探針加入樣品。在靶序列存在下，探針結合併被酶催化切割。切割後，靶序列完整釋放進而與過量探針結合。標記探針的切割是靶序列存在的信號。其它核酸擴增方法包括轉錄擴增系統(TAS)，包括核酸序列擴增(NASBA)和3SR(Kwoh等，1989，/VocAto/"6*2，86:1173;Gingeras等，PCT申請WO88/10315)。在NASBA中，可通過臨床樣品的標準苯酚/氯仿提取、熱變性、裂解緩衝液處理和微量離心(minispin)柱分離DNA和RNA或通過氯化胍提取RNA來製備用於擴增的核酸。這些擴增技術包括使具有靶特異性序列的引物退火。聚合後，用RNA酶H消化雜交的DNA/RNA雜種，對雙鏈DNA分子再進行熱變性。在兩種情況中，通過加入第二條靶特異性引物然後聚合從而將單鏈DNA製成完全雙鏈。然後用RNA聚合酶，例如T7或SP6多次轉錄該雙鏈DNA分子。在恆溫循環反應中，將RNA逆轉錄為單鏈DNA，然後轉變為雙鏈DNA，接著用RNA聚合酶，例如T7或SP6再一次轉錄。得到的產物無論是截短的還是完整的均顯示為靶特異性序列。Davey等，EPONo.329822公開了核酸擴增方法，包括可用於本發明的循環合成單鏈RNA("ssRNA")、ssDNA和雙鏈DNA(dsDNA)。ssRNA是逆轉錄酶(RNA依賴性DNA聚合酶)延伸的第一引物寡核苷酸的模板。然後利用核糖核酸酶H(RNA酶H，對含DNA或RNA的雙螺旋中RNA特異性RNA酶)的作用除去得到的DNA:RNA雙螺旋中的RNA。得到的ssDNA是第二引物的模板，該引物在5'(端)也含有與該模板同源的RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)的啟動子序列。然後用DNA聚合酶(例如大腸桿菌DNA聚合酶I的大"Klenow"片段)延伸此引物，得到雙鏈DNA("dsDNA")分子，其序列與引物之間的與原始RNA的相同，在一末端還含有啟動子序列。合適的RNA聚合酶可利用此引物序列製備該DNA的多份RNA拷貝。然後這些拷貝可再進入循環從而導致快速擴增。適當地選擇酶，可恆溫進行此擴增(方法)而無需在每輪加入酶。由於此方法的循環性質，可選擇DNA或RNA形式的起始序列。Miller等在PCT申請WO89/06700中公開的核酸序列擴增方案根據啟動子/引物序列與單鏈靶DNA("ssDNA")雜交，然後轉錄該序列的多份RNA拷貝。此方案不是循環性的，即得到的RNA轉錄物不會產生新模板。其它擴增方法包括"RACE"禾B"單邊(one-sided)PCR"(Frohman，M.A.，刊於《PCR方法方法與應用指南》(PCRProtocols:AGuidetoMethodsandApplications),科學出版社，N.Y.，1990;Ohara等，1989，亂廳A^/."S丄86:5673-567)。也可採用在含有所產生的"二-寡核苷酸"序列的核酸存在下連接兩條(或多條)寡核苷酸從而擴增該"二-寡核苷酸"的方法來擴增靶核酸序列。Wu等，(1989，G譜w/oy，4:560)。取決於所用的方式，可採用上述模板依賴性擴增或在擴增後用第二種已知的核酸直接鑑定樣品中感興趣的應激標記核酸。然後檢測所鑑定的產物。在某些應用中，可通過目測方法進行檢測(例如，凝膠溴化乙錠染色)。或者，檢測可包括通過化學發光、放射性標記的放射性閃爍照相術或螢光標記物或甚至通過利用電或熱脈衝信號的系統來間接鑑定產物(AffymaxTechnology;Bellus，1994，JMacromo/.Sc/.屍we，J;7p/.CAem.，A31(l):1355-1376)。在一些實施方案中，可目測擴增產物或"擴增子"以證實應激標記序列的擴增。一種典型的目測方法包括用溴化乙錠染色凝膠，在UV光下觀察。或者，如果擴增產物整體用放射性或螢光標記的核苷酸作了標記，可在分離後使這些擴增產物曝光x-射線膠片或在合適的激發光譜下目測。在一些實施方案中，可間接進行目測。擴增產物分離後，使標記的核酸探針與擴增的應激標記序列接觸。探針優選與生色團偶聯，但也可放射性標記。或者，探針可與結合伴侶，例如抗原結合分子或生物素偶聯，而結合對的另一成員攜帶可檢測部分或報導分子。所涉及的技術是本領域技術人員熟知的，可在許多分子方法的標準教科書(例如，參見Sambrook等，1989，同上和Ausubel等，1994，同上)中找到。例如，用生色團或放射性標記的探針或引物可在擴增期間或其後鑑定耙(序列)。在某些實施方案中，採用本領域技術人員熟知的印跡技術定量測定靶核酸。Sourthern印跡利用DNA作為耙子，而Northern印跡利用RNA作為耙子。各方法可提供不同類型的信息，雖然cDNA印跡在許多方面與上述印跡或RNA相似。簡言之，探針用於靶向固定於合適的基質上，往往是硝酸纖維素膜上的DNA或RNA。不同種類核酸在空間上應分開以便分析。這一般通過核酸的凝膠電泳，然後"印跡"到膜上來實現。隨後，在促進變性和再雜交(rehybridisation)的條件下共同培育印跡的靶(序列)與探針(通常是作標記的探針)。因為探針設計為可與靶(序列)鹼基配對，探針可在復性條件下與靶序列的一部分結合。然後除去未結合的探針，如上所述進行檢測。檢測/定量測定後，可將某給定對象中觀察到的結果與對照反應(結果)或正常對象或無應激對象的統計學有效參比組作比較。以此方式可使所檢測的應激標記核酸含量與疾病的進程或嚴重性相關聯。本發明也考慮了如Kristensen等，(Biotechniques，30(2):318-322)所述的基因分型方法和等位基因鑑別方法和技術，這些方法和技術包括採用單一核苷酸多態性分析、高效液相層析、TaqManTM、液相層析和質譜。本發明也考慮了生物晶片技術，例如Hacia等(1996，Ato"reGw拍'"，14:441-447)和Shoemaker等(1996,AtowwGe""/"，14:450-456)所述的技術。簡言之，這些技術包括快速而精確地分析許多基因的定量測定方法。通過寡核苷酸給基因加標籤或者利用固定的探針陣列，可用生物晶片技術將靶分子分隔成高密度陣列並根據雜交篩選這些分子。也參見Pease等(1994，Prac.W加/.JcWU^.，91:5022-5026);Fodor等(1991，Sc/e"ce，251:767-773)。簡言之，製備應激標記多核苷酸的核酸探針，如本文所概述，將其與用於篩選和診斷方法的生物晶片相連。可將連接生物晶片的核酸探針設計為基本上與特異性表達的應激標記核酸，即靶序列(無論是樣品的靶序列還是其它探針序列，例如夾心測定中的序列)互補，從而使得耙序列與本發明的探針發生雜交。此互補性無需完美；靶序列與本發明的核酸探針之間可存在幹擾雜交的一定數量的鹼基對錯配。然而，如果錯配的數量太大以致於即使在最低嚴謹性雜交條件下也不發生雜交，則該序列不是靶序列的互補序列。在某些實施方案中，每條序列可利用多種探針，可利用重疊的探針或針對靶序列不同部分的探針。艮口，可用兩種、三種、四種以上的探針(優選三種)構建具體靶(序列)的冗餘度。這些探針可以是重疊的(即某些序列相同)或分離的。本領域普通技術人員應該知道，可以各種方式將核酸連接於或固定於固體支持物。本文的"固定的"或其語法等價體表示核酸探針與固體支持物之間的連接或結合在下述的結合、洗滌、分析和去除條件下足夠穩定。結合可以是共價或非共價的。本文的"非共價結合"與其語法等價體表示靜電性、親水性和疏水性相互作用的一種或多種。非共價結合包括分子，例如鏈黴親和素與支持物的共價連接與生物素化探針與鏈黴親和素的非共價結合。本文的"共價結合"及其語法等價體表示兩部分、固體支持物與探針至少通過一根鍵，包括CT鍵、兀鍵和配位鍵相連。探針與固體支持物之間可直接形成共價鍵，或者可通過交聯接頭或通過固體支持物或探針或此兩種分子上所含的特異性反應活性基團來形成共價鍵。固定化也可包括聯用共價和非共價相互作用。總之，本領域技術人員知道可以各種方式使探針與生物晶片相連。如本文所述，可先合成核酸，然後與生物晶片相連，或者可直接在生物晶片上合成。生物晶片包含合適的固體或半固體基板或固體支持物。"基板"或"固體支持物"表示可經修飾而含有適合與核酸探針相連或結合的多個不連續位點並適用於至少一種檢測方法的任何材料。本領域技術人員知道可用的基板很多，包括但不限於玻璃與改性或功能化玻璃，塑料(丙烯酸、聚苯乙烯與苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM等)，多糖，尼龍或硝酸纖維素，樹脂，二氧化矽或含矽與修飾的矽、碳、金屬、無機玻璃、塑料的二氧化矽材料等。總之，這些基板可用光學方法檢測並且不帶螢光。所述基板一般是平的，雖然本領域技術人員知道也可利用其它構型的基板。例如，為對流過的樣品進行分析而儘可能降低樣品體積，可將探針置於試管的內表面。類似地，所述基板可以是可彎曲的，例如可彎曲的泡沬塑料，包括特定塑料製成的閉孔泡沫塑料。在某些實施方案中，本領域己知可在基板上合成寡核苷酸探針。例如，利用光聚合化合物和技術的光活化技術。在一示範性例子中，採用熟知的光版印刷技術，例如WO95/25116;稀95/35505;美國專利號5,700,637和5,445,934及其引用的參考文獻中所述的技術原位合成核酸；這些連接方法構成AffymetrixGeneChipTM技術的基礎。在一示範性生物晶片分析的例子中，使生物晶片上的寡核苷酸探針在有助於特異性雜交的條件下與懷疑含有一種或多種應激多核苷酸的核酸樣品接觸。可從生物材料的懸液中製備樣品的DNA或RNA提取物(無論單鏈或雙鏈)，或者研碎生物材料，或者按照細胞裂解步驟製備，所述步驟包括但不限於用SDS(或其它洗滌劑)、滲透壓衝擊、異硫氰酸胍和溶菌酶處理進行裂解。可用於本發明方法的合適DNA包括cDNA。可採用多種常用方法之一製備這種DNA，例如見Ausubel等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。可用於本發明方法的合適RNA包括信使RNA、DNA轉錄的互補RNA(cRNA)或基因組RNA或次基因組RNA。可採用標準方法製備這種RNA,例如Ausubd等，1994，同上；和Sambrook等，1989，同上所述。可通過，例如超聲波處理或用限制性核酸內切酶處理使cDNA片段化。優選使cDNA片段化從而使得到的DNA片段長於固定的寡核苷酸探針，但足夠小而可在合適的雜交條件下快速接觸固定的探針。或者，可採用上述合適的核苷酸擴增技術來選擇並擴增cDNA片段，這涉及利用合適的隨機或特異性引物。通常作可檢測性標記靶應激標記多核苷酸從而可測定它們與各探針的雜交。通常用報導分子可檢測性標記靶多核苷酸，該報導分子的示範性例子包括色原、催化劑、酶、螢光染料、化學發光分子、生物發光分子、鑭系離子(例如，Eu3勺、放射性同位素和直接可見標記物。對於直接可見標記物，可利用膠體金屬顆粒或非金屬顆粒、染料顆粒、酶或底物、有機聚合物、乳膠顆粒、脂質體或含有信號產生物質的其它載體等。此類型的示範性標記物包括大膠體，例如金屬膠體，如金、硒、銀、錫和鈦氧化物膠體。在一些將酶用作直接可見標記物的實施方案中，將生物素化的鹼基摻入靶多核苷酸中。通過與鏈黴親和素-報導分子溫育來檢測雜交。合適的螢光染料包括但不限於異硫氰酸螢光素(FITC)、異硫氰酸四甲基羅丹明(TRITC)、R-藻紅蛋白(RPE)和德克薩斯紅(TexasRed)。其它示範性螢光染料包括Dower等(國際公布WO93/06121)中所討論的。螢光染料也可參考美國專利5,573,909(Singer等)；5,326,692(Brinkley等)。或者，螢光染料可參考美國專利號5,227,487;5,274,113;5,405,975;5,433,896;5,442,045;5,451,663;5,453,517;5,459,276;5,516,864;5,648,270和5,723,218中所述。可購得的螢光標記物包括，例如螢光素亞磷醯胺，如Fluoreprime(Pharmacia)、FluorediteTM(Millipore)禾卩FAM(AppliedBiosystemsInternational)。放射性報導分子包括，例如可通過X-射線或磷酸成像(phosphoimager)技術檢測的32p。可在適合於寡核苷酸探針與測試核酸(包括DNA或RNA)雜交的條件下進行雜交形成步驟。就此而言，可參考例如《核酸雜交，一種實用方法》(NUCLEICACIDHYBRIDIZATION,APRACTICALAPPROACH),(Homes和Higgins編)，(IRLpress,WashingtonD.C.，1985)。總之，雜交是否發生受寡核苷酸探針和所測試寡核苷酸序列的長度、pH、溫度、一價和二價陽離子的濃度、雜交形成區中G和C核苷酸的比例、介質粘度和可能存在的變性劑的影響。這些可變因素也影響雜交所需時間。因此，優選的條件取決於具體應用。然而，可用常規方法確定這些經驗性條件而無需過多實驗。某些優選實施方案採用高度鑑別性雜交條件。例如，可參考Wallace等(1979，A^c/.A^si"，6:3543)，他描述了與含有一個內部鹼基對錯配的相似寡核苷酸探針作比較，可區別與靶序列完美匹配和完全同源的11-17個鹼基長的寡核苷酸探針的雜交條件。也可參考Wood等(1985，iVoc.Ato/.JcW.Sd.t/&4，82:1585)，他描述了利用3M氯化四甲銨使11-20個鹼基長的寡核苷酸雜交條件，其中雜交物的解鏈溫度只取決於寡核苷酸探針的長度，而無論其GC含量。此外，Drmanac等(同上)描述了6-10個核苷酸長的寡聚物的嚴謹雜交條件，利用核苷酸類似物，例如"鎖定核酸"不難獲得相似的條件(Christensen等，2001，BiochemJ，354:481-4)。雜交反應一般可在有雜交緩衝液存在下進行，所述緩衝液任選含有雜交優化試劑，例如穩定劑(isostabilisingagent)、變性劑和/或復性加速劑。穩定劑的例子包括但不限於甜菜鹼和低級四烷基銨鹽。變性劑是通過幹擾雙鏈核酸鹼基之間的氫鍵或核酸分子的水合作用來降低雙鏈核酸分子解鏈溫度的組合物。變性劑包括但不限於甲醯胺、甲醛、二甲基亞碸、四乙基乙酸酯(tetraethylacetate)、脲、異硫氰酸胍(guanidiumisothiocyanate)、甘油和離液鹽。雜交加速劑包括核內不均一核糖蛋白(hnRP)Al和陽離子洗滌劑，如十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)和十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)、聚賴氨酸、精胺、亞精胺、單鏈結合蛋白(SSB)、噬菌體T4基因32蛋白和乙酸銨與乙醇的混合物。雜交緩衝液可含有濃度為約0.005-約50nM、優選約0.5-5nM、更優選約1-2nM的耙多核苷酸。使含有耙應激標記多核苷酸的雜交混合物與探針陣列接觸並在室溫培育適當時間以使靶多核苷酸中的靶序列與任何互補探針雜交。接觸可發生在任何合適的容器中，例如設計用於盛放其上連接有探針的固體支持物的碟或小室。培育溫度通常為核酸雜交所用的溫度，例如約20-約75°C、如約25°C、約30。C、約35。C、約40。C、約45。C、約50°C、約55°C、約60。C，或約65。C。長度超過14個核苷酸的探針優選20-5(TC。對較短的探針而言，優選較低溫度。將靶多核苷酸樣品與探針培育足夠時間使靶多核苷酸中的靶序列與任何互補探針之間達到所需雜交水平。例如，可在約45'C+A10t:在甲醯胺中雜交1-2天。雜交物形成步驟後，用含有與雜交步驟所用相同濃度的雜交優化劑的雜交緩衝液洗滌探針以除去任何未結合的核酸。此洗滌步驟只留下結合的靶多核苷酸。然後可檢測探針以鑑定哪種探針與靶多核苷酸雜交。然後可檢測雜交反應以確定哪種探針與相應的靶序列雜交。取決於和靶多核苷酸連接的報導分子的性質，可通過以下方式用儀器檢測信號用光照射螢光標記物，用螢光計檢測螢光；提供酶系統以產生可用分光光度計檢測的顏色-,或者利用光反射儀檢測染料顆粒或有色的膠體金屬顆粒或非金屬顆粒；利用放射性標記物或化學發光分子時採用輻射計數器或放射自顯影術。因此，檢測裝置應適用於檢測或掃描標記物相關的光，所述光可包括螢光、冷光、聚焦光束或雷射。此時，可用電荷耦合器件(CCD)或光龜池來掃描微陣列中各位置探針:靶多核苷酸雜交物發射的光並直接在數字計算機上記錄數據。在一些情況中，無需檢測電子信號。例如，在酶促產生與核酸陣列模式相關的顏色斑點情況中，目測該陣列就可解釋陣列上的模式。在核酸陣列的情況中，檢測裝置優選與模式識別軟體相連從而將陣列的信號模式轉化為普通語言遺傳分布模式。在某些實施方案中，不同應激標記基因產物的特異性寡核苷酸探針採取核酸陣列形式，利用"晶片閱讀器"檢測陣列上報導分子所產生的信號。可採用"晶片閱讀器"的檢測系統如Pimmg等(美國專利號5,143,854)所述。晶片閱讀器通常也包括一些信號加工過程來確定某具體陣列位置或元件處的信號是真陽性或者可能是假信號。示範性晶片閱讀器例如Fodor等(美國專利號5，925，525)所述。或者，當陣列是由各種可尋址型標記的微珠混合物製成時，可採用流式細胞術檢測該反應。7.2蛋白質診斷與本發明一致的是，存在異常濃度的應激標記蛋白質表明存在應激狀態、及其程度或階段或有發生應激後遺症的風險。可採用本領域已知的任何合適方法檢驗生物學樣品中應激標記蛋白質的水平。例如，當應激標記蛋白質是酶時，可根據其催化活性或根據樣品所含該蛋白質分子數來定量測定該蛋白質。可採用抗體技術，例如免疫組織學和免疫組織化學方法來檢測組織樣品中感興趣蛋白質的水平。例如，用一抗(多克隆或單克隆)提供特異性識別，用第二檢測系統檢測一抗的存在(或結合)情況。可將可檢測標記物，例如螢光標記物、放射性標記物或能產生可定量測定(如有色的)的產物的酶(如，鹼性磷酸酶、辣根過氧化物酶)與二抗相偶聯。在另一合適的方法中，可檢測性標記一抗本身。因此可對組織切片作免疫組織學標記。在一些實施方案中，從生物學樣品(例如，組織、細胞)中製備分析用蛋白提取物。可採用常規免疫印跡方法(Jalkanen等，1985，丄C"/.腸/.,101:976-985;Jalkanen等，1987，/Ce//.5z'o/.，105:3087-3096)經western-印跡或斑點/狹線實驗(分析)這種提取物(例如，洗滌劑提取物)中感興趣蛋白質的水平。其它有用的抗體方法包括免疫測定，例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)和放射免疫測定(RIA)。例如，蛋白質特異性單克隆抗體可用作免疫吸附劑與酶標記探針來檢測和定量測定感興趣的應激標記蛋白質。可採用線性回歸計算機算法(參見'Lacobilli等，1988，5reaWCa"cerie"arc/zam/7Vea加ew"11:19-30)，參考標準製劑中的含量來計算樣品中這種蛋白質的含量。其它實施方案可用針對感興趣蛋白質的兩種不同單克隆抗體，一種作為免疫吸附劑，另一種作為酶標記探針。此外，蛋白質捕獲陣列領域的最新進展使得能同時檢測和/或定量測定大量蛋白質。例如，濾膜上的低密度蛋白質陣列，如通用蛋白質陣列系統(Ge，2000，A^c/w'cJc/&，28(2):e3)釆用標準ELISA技術和掃描電荷耦聯器件(CCD)檢測器拍攝組成陣列的抗原圖像。也開發了能同時檢測臨床分析物的免疫傳感器陣列。目前已能用蛋白質陣列來分析體液中，例如健康或患病對象以及藥物治療前後對象血清中的蛋白質表達分布模式。蛋白質捕獲陣列一般包含多種蛋白質捕獲劑，它們各自確定了該陣列上空間位置不同的元件。蛋白質捕獲劑可以是能結合蛋白質並將其固定在陣列上的蛋白質捕獲劑位點的任何分子或分子複合物。蛋白質捕獲劑可以是一種蛋白質，其在細胞中的天然功能是能特異性結合另一種蛋白質，例如抗體或受體。或者，蛋白質捕獲劑可以是能特異性結合某蛋白質的部分合成或全合成或重組的蛋白質。或者，蛋白質捕獲劑可以是在體外根據對特異性靶蛋白質或肽的結合親和力選自誘變、隨機或完全隨機化與合成文庫的蛋白質。所用的選擇方法任選可以是本領域已知的展示方法，例如核糖體展示或噬菌體展示方法。或者，經體外選擇得到的蛋白質捕獲劑可以是能特異性結合靶蛋白質的DNA或RNA適體(參見，例如Potyrailo等，1998,爿"a/.C/zem.，70:3419-3425;Cohen等，1998,iVoc.Ato/.爿cadScZ.f/S^，95:14272-14277;Fukuda等，1997，7Vwc/dc爿c/^5y^.&廣，37:237-238;得自SomaLogic)。例如，用Selex方法從寡核苷酸文庫中選擇適體，可通過共價連接，例如摻入溴化脫氧尿苷和紫外光活化的交聯(光適體)來提高它們與蛋白質的相互作用。適體的優點在於易通過自動寡核苷酸合成來製備和DNA的穩定性和強度優良；可採用通用螢光蛋白質染色技術來檢測結合情況。或者，體外選擇的蛋白質捕獲劑可以是多肽(例如，抗原)(參見，例如Roberts和Szostak，1997，iVoc.A^/.Sc/.OS^，94:12297-12302)。捕獲分子的另一種陣列是通過"分子印刷"技術製成的陣列，其中的肽(例如，來自蛋白質的C-末端區域)用作模板在可聚合基質中產生結構互補的序列特異性空隙；然後這些空隙能特異性捕獲具有合適的一級胺基酸序列的(變性的)蛋白質(例如，得自ProteinPrintTM和AspiraBiosystems)。示範性蛋白質捕獲陣列包括通常稱為抗體陣列的含有空間上可尋址的抗原結合分子的陣列，該陣列有助於大規模同時分析眾多蛋白質來確定蛋白質組或蛋白質亞組。抗體陣列顯示具有所需的特異性性質和可接受的背景，一些陣列可購得(例如，BDBiosciences,Clontech，BioRad和Sigma)。製備抗體陣列的各種方法已有報導(參見，例如Lopez等，2003，J.C/zramaMgr.S，787:19-27;Cahill，2000，7>e"A/"5/Wec/mo/og;;，7:47-51;美國專利申請公布2002/0055186;美國專利申請公布2003/0003599;PCT公布WO03/062444;PCT公布WO03/077851;PCT公布WO02/59601;PCT公布WO02/39120;PCT公布WO01/79849;PCT公布WO99/39210)。這些陣列的抗原結合分子至少可識別某細胞或細胞群所表達蛋白質的亞組，其示範性例子包括生長因子受體、激素受體、神經遞質受體、兒茶酚胺受體、胺基酸衍生物受體、細胞因子受體、胞外基質受體、抗體、凝集素、細胞因子、絲抑蛋白、蛋白酶、激酶、磷酸酶、ras-樣GTP酶、水解酶、類固醇激素受體、轉錄因子、熱激轉錄因子、DNA-結合蛋白、鋅指蛋白、亮氨酸拉鏈蛋白、同源域蛋白、胞內信號轉導調節劑和效應物、凋亡相關因子、DNA合成因子、DNA修復因子、DNA重組因子.、細胞表面抗原、C型肝炎病毒(HCV)蛋白酶和HIV蛋白酶。在噬菌體展示或核糖體展示文庫(例如，得自CambridgeAntibodyTechnology,Biolnvent,Affitech和Biosite)中選擇後可通過常規免疫方法(例如，多克隆血清和雜交瘤)，或作為通常在大腸桿菌中表達的重組片段製備抗體陣列的抗原結合分子。或者，可將含非共價締合的VH和VL結構域的"混合體(combibody)"製備為產生雙抗體細菌克隆(例如，得自Domantis)組合物所產生的矩陣形式。用作蛋白質捕獲劑的示範性抗原結合分子包括單克隆抗體、多克隆抗體、Fv、Fab、Fab'和F(ab')2免疫球蛋白片段、合成的穩定Fv片段(如單鏈Fv片段(scFv)、二硫鍵穩定的Fv片段(dsFv))、單可變區結構域(dAbs)小抗體(minibody)、混合體和多價抗體(如雙抗體和多-scFv)、camelids的單種結構域或工程改造的人等價抗體。空間位置不同的各蛋白質捕獲劑通常連接在一般是平的或有起伏的支持物表面。常規物理支持物包括載玻片、矽、微孔、硝酸纖維素或PVDF膜與磁性微珠和其它微珠。雖然廣泛採用將蛋白質微滴遞送到平面上，但有關的其它構造包括基於微流體學進展開發的CD離心裝置(例如，得自Gyros)和專門化的晶片設計，例如平面中工程改造的微通道(例如，TheLivingChip,得自Biotrove)和矽表面的微小3D柱(例如，得自Zyomyx)。也可將懸浮液中的顆粒用作陣列的基礎，只要它們有身份編碼；這些系統包括用顏色編碼的微珠(例如，得自Luminex、Bio-Rad禾nNanomicsBiosystems)、半導體納米晶體(例如，Qdots,得自QuantumDots)、棒形編碼珠(UltraPlex,得自Smartbeads)和多金屬微杆(NanobarcodesTM顆粒，得自Surromed)。也可將這些珠在半導體晶片上組裝成平面陣列(例如，得自LEAPStechnology和BioArraySolutions)。當用顆粒時，各蛋白質捕獲劑通常連接於各顆粒以提供空間確定位置或分開的陣列。然後分別(但同時)以隔離方式，例如在微滴定板的孔中或不同試管中檢測這些顆粒。在操作中，將蛋白質樣品任選片段化形成肽片段(參見，例如美國專利申請公布2002/0055186)，在適合於蛋白質或肽結合的條件下遞送到蛋白質捕獲陣列；洗滌該陣列將樣品中未結合或非特異性結合的組分從陣列上洗去。然而，利用合適的檢測系統檢測存在的與陣列上各元件相結合的蛋白質或肽，或含量。與陣列上某元件相結合的蛋白質含量可相對於與該陣列第二元件相結合的第二蛋白質的含量來測定。在某些實施方案中，樣品中第二蛋白質的含量己知或已知是不變的。為分析兩種細胞或細胞群之間蛋白質表達的差異，將第一種細胞或細胞群的蛋白質樣品在適合於蛋白質結合的條件下遞送到該陣列。將第二種細胞或細胞群的蛋白質樣品以類似方式遞送到與第一陣列相同的第二陣列。然後洗滌兩陣列將樣品中未結合或非特異性結合的組分從陣列上洗去。最後，將維持與第一陣列元件相結合的蛋白質含量和維持與第二陣列的相應元件相結合的蛋白質含量作比較。為測定兩種細胞或細胞群之間蛋白質表達模式的差異，將與第一陣列各元件相結合的蛋白質含量從與第二陣列的相應元件相結合的蛋白質含量中扣除。在一示範性例子中，可利用螢光標記檢測與陣列結合的蛋白質。將與解讀DNA微陣列所用相同的儀器應用於蛋白質捕獲陣列。為差別展示，可用得自兩種不同狀態細胞的蛋白質作螢光標記後檢測捕獲陣列(例如，抗體陣列)，兩種狀態中細胞裂解物用不同螢光團(例如，Cy-3和Cy-5)標記並混合，從而可將顏色作為靶分子豐度改變的讀數。通過酪醯胺信號擴增(TSA)(例如，得自PerkinElmerLifesciences)可將螢光讀數靈敏度提高10-100倍。平面波導技術(例如，得自Zeptosens)能迸行超靈敏的螢光檢測，其另一優點是無需洗滌。利用藻紅蛋白作標記物(例如，得自Luminex)或利用半導體納米晶體(例如，得自QuantumDot)性能的懸浮珠和顆粒也能實現高靈敏度。已採納螢光共振能量轉移來檢測可用於陣列的未標記配體的結合(例如，得自Affibody)。已開發了幾種其它讀出裝置，包括以下方法的改進裝置表面等離振子共振(例如，得自HTSBiosystems和IntrinsicBioprobes)、滾動循環DNA擴增(例如，得自MolecularStaging)、質i普(例如，得自SenseProteomic，Ciphergen,Intrinsic和Bioprobes)、共振光散射(例如，得自GeniconSciences)和原子力顯微鏡(例如，得自BioForceLaboratories)。NextGen禾口PerkinElmerLifeSciences共同開發了用於樣品與載玻片上的陣列自動培育和洗滌的微流體系統。在某些實施方案中，用於檢測應激標記表達產物的技術包括內部或外部標準品來定量或半定量測定那些產物，從而能有效地比較生物學樣品中這些表達產物與參比樣品中相應表達產物的水平或功能活性。技術人員採用標準方法可以確定這種標準品。具體實施例中測定了各表達產物的水平或功能活性的絕對值。在特定的實施方案中，可利用如國際公布號WO02/090579和2003年11月14日提交的待批PCT申請號PCT/AU03/01517中所述的，包括至少一個與基站相耦聯的終端站的系統來執行此診斷方法。基站通常與一個或多個資料庫相耦聯，這些資料庫含有來自大量個體的代表應激標記表達產物的水平或功能活性的預定數據以及代表收集這些預定數據時這些個體實際狀態徵候令(例如，應激存在與否、其程度、階段或發生應激後遺症的風險)。在操作中，基站一般通過通信網絡從終端站接受數據並將所述數據與存儲在資料庫中的預定數據作比較，所述數據代表對應於取自測試對象的生物學樣品中至少一種表達產物的檢測或標準化水平或功能活性。將該對象的數據與預定數據作比較使基站能根據比較結果確定該對象的狀態。因此，基站試圖鑑定具有相似參數值的個體與測試對象，一旦根據該鑑定(結果)而確定了狀態，基站會將診斷指令送至終端站。7.3試劑盒可將檢測與定量測定應激標記基因表達產物所需的所有必需材料和試劑一起組裝在試劑盒中。這些試劑盒也任選裝有檢測標記物的合適試劑、陽性和陰性對照、洗滌溶液、印跡膜、微滴定板稀釋緩衝液等。例如，核酸檢測試劑盒可裝有(i)應激標記多核苷酸(可用作陽性對照)，(ii)能與某種應激標記多核苷酸特異性雜交的引物或探針。也可裝有適用於擴增核酸的酶，包括各種聚合酶(逆轉錄酶，Taq，S叫uenaseTMDNA連接酶等，取決於所採用的核酸擴增技術)，脫氧核苷酸和緩衝液以提供擴增所需的反應混合物。這種試劑盒一般以合適的方式裝有各種試劑和酶以及各種引物或探針的不同容器。或者，蛋白質檢測試劑盒可裝有(i)應激標記多肽(可用作陽性對照)，(ii)能與某應激標記多核苷酸發生免疫相互作用的抗原結合分子。該試劑盒的特徵也在於裝有進行本文所述試驗的各種裝置和試劑；和/或印製的用該試劑盒定量測定應激標記基因表達的使用說明書。7.4監測免疫功能本發明也提供通過檢測某對象的一種或多種應激標記基因表達產物水平或功能活性來監測免疫功能的方法。當所檢測的水平或功能活性與取自一位或多位正常對象或一位或多位未處於應激狀態下的對象的參比樣品中相應表達產物檢測到的水平或功能活性相同或相似時，這一般表明該對象未處於應激狀態下，具有正常的免疫功能。相反，當所檢測的水平或功能活性與相應表達產物檢測到的水平或功能活性不同時，這一般表明該對象處於應激狀態下，因而免疫功能降低(或免疫抑制)。正常免疫功能對有效抵禦疾病和天然攻擊的最後保護很重要。此外，免疫功能對獲得對疫苗接種的有效免疫應答很關鍵，就此而言，所鑑定的應激標記也可用作監測個體的免疫系統何時接種疫苗方能產生導致最佳保護水平的免疫應答。例如，就競賽動物，如人類運動員和賽馬而言，以此方式監測免疫系統能使競賽動物(performanceanimal)或其教練降低可能導致對疫苗接種產生不適當或非保護性免疫應答的潛在應激狀態。如利用所鑑定的應激標記測定的那樣，當競賽動物的免疫系統恢復後，可進行疫苗接種。所鑑定的應激標記也可用於評估免疫系統對疫苗製劑的應答。對疫苗接種產生不適當免疫應答時，可決定再次接種，或改變接種方案，或延遲接種方案直至除去了潛在的應激狀態(影響免疫功能的)和動物的免疫系統恢復。例如，已知已有可用於馬皰疹病毒的疫苗製劑。它在獸醫學領域廣為使用，特別是用於妊娠母馬從而可通過傳遞乳汁抗體(初乳)賦予幼駒一定的保護作用。妊娠和產後時期是高應激和免疫調節時期。可利用所鑑定的應激標記監測這些時期的免疫功能來安排疫苗接種時間從而產生合適的與保護性疫苗應答。或者，可利用應激標記水平根據監測到的對疫苗接種的免疫應答來修改疫苗接種方案。8.治療或預防方法在對象有發生應激後遺症風險診斷陽性後，本發明也可拓展至治療或預防對象的應激狀態。總體上，治療包括給予診斷陽性對象有效量藥物或療法以改善症狀或逆轉應激的發生，或降低或消除上述應激相關疾病，或降低對象發生應激相關疾病的可能性。目前適用於治療應激的藥物包括但不限於美國專利號6，723，721;6,670,371;6,664,261;6,586,456;6,548,509;6,323,312;6,255,310所述的促腎上腺皮質激素釋放因子拮抗劑；美國專利申請公布號20020169152公開的糖皮質激素受體拮抗劑；美國專利號6,642,209所述的腺苷化合物；美國專利號6,455,542所述的一氧化氮供體；美國專利號6,444,700;6,391,332和6,218,420所述的營養組合物；美國專利號6,416,795公開的草藥提取物；美國專利號6，087，348公開的NK-1受體拮抗劑；美國專利號6,077,867所述的脂肪酸組合物；美國專利申請公布號20040101934公開的酵母菌產生的肽衍生物；和美國專利申請號20020183300所述的鋅離子載體。或者，可採用本領域已知的應激緩解方法治療對象，包括例如去除或降低對象環境中的應激源水平；如美國專利申請公布號20030233124所述，用電場改變通過細胞膜的離子流。然而，應該知道本發明包括可用於治療或預防應激的任何藥物或方法，並不限於上述的示範性化合物和製劑。應激緩解藥物一般與藥學上可接受的載體組成藥物(或獸醫學)組合物以有效量給予來達到它們所需的目的。給予對象的活性化合物的劑量應在一段時間內足以在對象中實現有益應答，例如降低或減輕應激症狀。待給予的藥學活性化合物的用量取決於待治療的對象，包括其年齡、性別、體重和全身健康狀況。就此而言，所給予的活性化合物的精確用量取決於從業醫師的判斷。在確定給予治療或預防應激的活性化合物的有效量過程中，醫師或獸醫可評估應激存在相關症狀的嚴重性，包括上述應激後遺症相關症狀。在任何情況中，本領域技術人員不難確定應激緩解藥物的合適劑量與合適的治療方案而無需過多實驗。應激緩解藥物可與輔助性治療聯合給予以降低對象的異常免疫應答。這類輔助性治療的示範性例子包括但不限於除去應激源、瑜伽、冥想、針灸、按摩、適度運動和呼吸鍛鍊。為便於理解本發明和付諸實施，通過以下非限制性實施例描述了特別優選的實施方案。實施例實施例1鑑定應激的特異性診斷基因利用含有馬白細胞所表達的幾千種基因的GeneChipsTM(使用方法詳述於下文"基因表達數據的產生")分析取自經受48小時期運輸應激的20隻動物的血液樣品。分析這些數據(參見下文"鑑定應答基因與證明診斷潛力")揭示第0天到第28天特異性基因有差別表達。利用至少一種，優選至少兩種應激標記基因設計的試驗可以檢測樣品中的RNA水平，所述應激標記基因的代表性序列如下所示SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248。麗與方法採血從馬匹(非激動狀態)採血提取高質量的RNA或蛋白質。收集、保藏、轉運和分離RNA的合適採血試管包括PAXgeneTM試管(PreAnalytixInc.,Valencia,CA，USA)。或者，可將血液採集入含有設計用於保藏核酸的溶液(得自Roche，Ambion，Invitrogen和ABI)的試管中。為測定蛋白質水平，將50ml血液收集入含有4ml4%檸檬酸鈉的試管中防止凝結。分離白細胞和血槳，冷凍保藏用於隨後特異性蛋白質的分析與檢測。將PAXgene試管維持於室溫，然後提取RNA。以標準格式記錄臨床體徵。提取總RNAQiagenInc(Valencia,CA，USA)的試劑盒裝有用於分離收集在PAXgene血液RNA試管中2.5ml血液的總RNA的試劑和使用說明書。分離從離心沉澱PAXgene血液RNA試管中的核酸開始。用含有蛋白酶K的優化緩衝液洗滌、重懸並培育沉澱物以消化蛋白質。再離心一次除去殘留的細胞碎片，將上清液轉移至新鮮的微離心管中。加入乙醇調節結合條件，將裂解物加到PAXgeneRNA旋轉柱上。在簡單離心期間，RNA選擇性地與矽膠膜結合，而汙染物流出。經三次有效洗滌步驟除去殘留的汙染物，然後用緩衝液BR5洗脫RNA。提取前要用Agilent生物分析儀和分光光度計以吸光度260/280比值定量和定性測定RNA。DNA提取QiagenInc(Valencia,CA，USA)的試劑盒裝有用於分離收集在PAXgene血液RNA試管中8.5ml血液的總DNA的試劑和使用說明書。分離從加入額外的裂解溶液開始然後離心。用含有蛋白酶K的優化緩衝液洗滌、重懸並培育沉澱物以消化蛋白質。乙醇沉澱DNA，再離心一次沉澱核酸。洗滌除去殘留汙染物，然後將DNA重懸於緩衝液BG4中。提取前要用分光光度計或瓊脂糖凝膠龜泳定量和定性測定DNA。產生基因表達數據選擇方法可採用各種技術檢測組織樣品中的特異性RNA水平。本領域熟知的兩種常規且易於使用的技術是採用Affymetrix技術的GeneChip⑧分析；實時聚合酶鏈式反應(例如，AppliedBiosystems的TaqMan)。GeneChips⑧通過檢測與構建在矽基板上的短寡核苷酸雜交的標記cRNA來定量測定RNA。該技術和方法詳見www.affymetrix.com。實時聚合酶鏈式反應(RT-PCR)利用兩種PCR引物、標記的探針和熱穩定的DNA聚合酶來定量測定RNA。PCR產物產生時將一種染料釋放入溶液，檢測之。內部對照，例如18SRNA探針常用於測定樣品中總RNA的起始水平。各基因與內部對照分別測定。該技術和方法詳見www.appliedbiosytems.com或www.qiagen.comorwww.biorad.com。AppliedBiosystems提供以下服務即客戶提供DNA序列信息並負費，作為回饋該公司提供對各基因進行RT-PCR所需的全部試劑。GeneChip⑧分析的優點在於一次能分析數千個基因。然而，該分析花費大且進行一次試驗要3天以上。RT-PCR—般一次只能分析一種基因，但廉價並且能在一天內完成。如果待分析的具體基因數量少於20，則RT-PCR是可選的基因表達分析方法。當需要同時分析許多基因時，GeneChip⑧或其它基因表達分析技術(例如Illumina珠陣列)是可選的方法。用於產生和分析GeneChip⑧數據與實時PCR的方法概述於下文。產生GeneChip⑧數據製備cDNA和cRNA以下用於從總RNA製備cDNA和cRNA的方法採用Affymetrix(www.affymetrix.com)提供和推薦的方法。步驟是總共3pg的總RNA用作模板來製備雙鏈cDNA。製備cRNA並用生物素化尿嘧啶(dUTP)作標記。純化(clean)生物素作標記的cRNA，利用分光光度計和MOPS凝膠分析定量測定。將作標記的cRNA片段化為300bp大小。利用Agilent"Lab陽on-a-Chip"系統(AgilentTechnologies)測定RNA含量。雜交、洗滌和染色步驟是製備含有0.05pgL作標記和片段化的cRNA、spike-in陽性雜交對照和Affymetrix寡核苷酸B2、bioB、bioC、bioD和cre的雜交混合物。將終體積(80pL)的雜交混合物加入GeneChipTM藥盒中。將該藥盒置於恆定轉速的雜交爐中，16小時。去除GeneChipTM中的液體並保存。將GeneChipTM置於流體站中。將各GeneChip的實驗條件以.EXP文件記錄。加入合適的溶液後，Affymetrix流體站執行所有的洗滌和染色過程。洗滌GeneChip,用鏈黴親和素-藻紅蛋白染料染色，然後用低鹽溶液再次洗滌。洗滌完成後，用雷射"激發"探針陣列上的染料，用Affymetrix掃描儀(Agilent製造)通過CCD照相機拍攝圖像。掃描和產生數據文件掃描儀和MAS5軟體產生一站GeneChipTM的圖像文件，稱為.DAT文件(參見背面的圖)。預處理.DAT文件後進行統計學分析。數據的預處理步驟(在任何統計學分析之前)包括.DAT文件的質量控制(QC)。產生.CEL文件。測量和標準化。.DAT文件的質量控制.DAT文件是一種圖像。手工檢査這些圖像有人為因素(artifact)(例如，高/低強度斑點，劃痕，高局部性或總背景)。(通過改變產生邊界的強度模式和陣列名稱不難鑑定B2寡核苷酸陣列的雜交性能)。MAS5軟體利用B2寡核苷酸邊界來比對圖像上的柵格從而可集中和鑑定各方塊的寡核苷酸。利用其它尖頭(spiked)雜交對照(bioB、bioC、bioD和cre)通過讀取隨信號值增加，反映它們相對濃度的"本"基因檢測呼叫來評估樣品的雜交效率。(如果.DAT文件具有合適的質量，用AffymetrixMAS5軟體將其轉化為強度數據文件(.CEL文件))。產生.CEL文件用MAS5軟體從.DAT文件產生的.CEL文件包含計算的該探針組的原始強度。從各細胞(測定)值中扣除計算的背景值得到基因表達數據。為除去陰性強度值，應用基於最低2%背景值的標準偏差的局部噪聲值的噪聲校正組分。將GeneChipTM產生的所有.CEL文件應用於特定的質量衡量標準參數。一些衡量標準由Affymetrix常規推薦，可從作為GeneChipTM的一部分提供的Affymetrix內部對照測定。其它衡量標準根據經驗和包括許多GeneChipTM的處理加工。分析GeneChip⑧數據可用於數據標準化的三種示範性方法是AffymetrixMAS5算法。Irizarry的可靠多晶片分析(RobustMulti-chipAnalysis)(RMA)算法(Wzarray等，2002，(印刷中))。可靠多晶片分析保留模型(RobustMulti-chipAnalysisSavedmodel)(RMAS)本領域技術人員應知道可採用許多其它方法而不會對本發明有實質影響。AffymetrixMAS5算法AffymetrixMAS5軟體利用.CEL文件來標準化或測量數據。將一塊晶片的測量數據與另一晶片的相似測量數據作比較。對.CEL文件應用MAS5算法的默認"球形定標(GlobalScaling)"選項來實現AffymetrixMAS5標準化。此方法扣除了探針值的分布中心的可靠估計值，再除以探針可變性的可靠估計值。這產生了在探針水平具有共同位置和量度的一組晶片。通過對某給定基因的所有探針對採用可靠求平均方法產生基因表達指數。將結果強制定為非陰性。鑑於在探針水平而不是在基因水平進行測量，那即使標準化後在總體基因表達水平上也可能存在晶片與晶片的差異。將標準MAS5標準化後，根據晶片強度中值使各基因值去趨勢(de-trend)。SP，各基因值根據晶片強度中值回歸，計算殘差。取這些殘差作為各基因表達去趨勢的估計值。用AffymetrixMAS5算法計算晶片強中值度，但量度因子固定為一。RMAS分析除了用chip.cel文件的長期文庫建立探針權重和耙分位數(quantile)，和不對這些具體晶片再重複計算外，此方法與RAM方法相同。在探針水平再次進行標準化。產生實時PCR數據在例如http:〃dorakmt.tripod.com/genetics/realtime.html禾卩BustinSA的綜述(2000，J7kfo/五/^/ocnV70/，25:169-193)中可獲得執行實時PCR的背景信息。TaqManTM引物和探針設計指南1.PrimerExpress(ABI)軟體設計了解鏈溫度(Tm)為58-60。C的引物和Tm值為l(TC以上的探針。兩種引物的Tm應該相同；2.引物應長15-30個鹼基；3.G+C含量優選30-80%。如果G+C含量較高無法避免，則需要採用高退火和解鏈溫度，用共溶劑，例如甘油、DMSO或7-脫氮雜-dGTP;4.應避免成串的相同核苷酸。這對G而言尤其重要，不可以有4個以上的G串；5.引物3'末端的最後5個核苷酸中G和C的總數應不超過2個(較新版本的該軟體具有自動執行此功能的選項)。這有助於在引物的3'末端引入相對不穩定性從而減少非特異性引發。引物條件與SYBRGreen試驗的相同；6.最大擴增子的長度不應超過400bp(優選50-150個鹼基)。較小的擴增子能得到更一致的結果，因為PCR更有效且對反應條件更耐受(長度短的需求與5'核酸酶活性的功能無關)；7.該探針不應含有成串的相同核苷酸(特別是4個以上的連續G)，G+C含量應為30-80%，C應比G多，5'末端不應是G。C的數量越多，產生的ARn越高。應先選擇探針；8.為避免因擴增了cDNA製劑中汙染性基因組DNA所致的假陽性，引物宜跨越外顯子-外顯子連接區。這樣不會擴增基因組DNA(用於人GAPDH擴增的PDAR試劑盒裝有這種引物)；9.如果用設計的TaqManTM探針來區別等位基因，錯配的核苷酸(多態性位點)應在探針中間而不是兩端；10.可利用3'末端附近含有dA核苷酸的引物從而可用AmpEraseUNG有效地降解所產生的任何引物二聚體(見EZRT-PCR試劑盒手冊的第9頁；P/N402877)。如果不能選擇在這些末端附近含有dA核苷酸的引物，則應考慮利用具有3'末端dU-核苷酸的引物。(也可參見Invitrogen的《PCR引物設計》(PCRPrimerDesign)的普遍原理)。通用方法1.用隨機六聚體(不含有寡聚-dT)將總RNA逆轉錄為cDNA。如果不得不用寡聚-dT，則應避免上遊大於兩千鹼基的長mRNA轉錄產物或擴增子，18SRNA不能用作標準品；2.多重PCR只在對照引物有限時可正確進行(ABI對照試劑不限制它們的引物)；3.靶cDNA用量範圍是10ng-lpg。如果用DNA(主要用於等位基因鑑別研究)，最佳用量是100ng-l叱；4.理想地是用不含RNA酶的DNA酶處理各RNA製品以避免基因組DNA汙染。即使是最佳的RNA提取方法也會產生一些基因組DNA。當然最好有根本不擴增基因組DNA的引物，但有時這不可能；5.為得到最佳結果，試劑(在製備PCR混合物之前)和PCR混合物本身(加樣之前)應充分振蕩(vortex)與混合。否則在PCR的早期輪次(0-5)中Rn值可能會有漂移。在配製試劑混合物之前將探針加入緩衝液組分使其在室溫下平衡也很重要。TaqManTM引物和探針定購自ABI的中等規模(midi-scale)TaqManTM探針收到時是100pM的混懸液。如果製備l/20稀釋液，則得到5^M溶液。此儲備溶液應分為等份、冷凍並閉光保存。在50pL反應體積中其用量為1^L得到推薦的100nM終濃度。引物收到時是凍幹的，含量以pmol標在試管上(例如150.000pmol等於150nmol)。如果將Xnmol的引物重懸在X^L水中，得到的溶液是1mM。最好將此儲備液分成等份冷凍。當將1mM儲備液稀釋IOO倍時，得到的工作溶液是10^M。為使50反應體積中的最終引物濃度為推薦的50-卯0nM，應每次反應用0.25-4.50fiL(500nM終濃度用2.5pL)。PDAR引物和探針以保存於一個試管中的混合物提供。它們在50pL反應體積中用量為2.5^L。設置一步TaqManTM反應一步實時PCR將RNA(與cDNA相反)用作模板。如果RNA溶液濃度低則優選此方法，但只是在進行單重反應時。缺點是防止酶AmpErase作用而剩下的RNA不能用於一步反應中。在此方法中，逆轉錄和實時PCR發生在同一試管中。下遊PCR引物的作用也是逆轉錄酶的引物(隨機六聚體或寡聚-dT不能用於一步RT-PCR中的逆轉錄)。一步反應需要較高的dNTP濃度(大於或等於300mM與200mM)，因為該反應合併了各自需要dNTP的兩種反應。GoldRT-PCR試劑盒的一步PCR所用的典型反應混合物如下tableseeoriginaldocumentpage102如果用PDAR，則用2.5的引物+探針。此反應優選用10pg-100ngRNA。注意將模板用量從100ng降低至50ng將使CT值增加1。為使&值降低3，起始的模板用量應增加8倍。ABI宣稱此系統可檢測到2皮克的RNA,RNA的最大用量可以是1微克。為進行常規分析，可用lOpg-100ng的RNA和100pg-1pg基因組DNA。一步PCR的循環參數逆轉錄(MuLV)，48°C30分鐘。AmpliT叫活化，95°CIO分鐘。PCR:95t:變性15秒，6(TC退火/延伸1分鐘(重複40次)(OnABI7700，最低維持時間是15秒)。最新介紹的EZone-stepRT-PCR試劑盒可利用UNG，因為利用了熱穩定性逆轉錄酶使得逆轉錄的培育時間是6CTC。此溫度也是避免48"C形成引物二聚體和非特異性結合的較好選擇。操作ABI7700:開始運行前應確認以下事項1.運行的循環參數正確；2.光譜補償的選擇正確(單重反應選0#，多重反應選O");3.AnalysisOptionsbox(分析選項框)(Analysis(分析)/Options(選項))中的"NumberofPCRStages(PCR階段數)"選擇正確。如果擴增圖中沒有數據，但在平面圖中可見，並且擴增(圖)的X-軸顯示O-l輪，則在運行一次後必須手動設定此(參數)。4.模板對照(TemplateControl)不如此標記(為精確計算ARn);5.數據分析前應正確選擇染料組分；6.你必須在運行開始前給予名稱(不能維持未命名)並保存；7.在運行結束時，先保存數據再開始分析；(使用)ABI軟體需要極其謹慎。撳下Run(運行)按鈕後不要試圖停止運行。你有問題並如果需要開關機器時，必須等至少1小時才能重新啟動運行。當分析數據時，記住默認的基線設置是3-5。如果任何CT值<15，應隨之改變基線(基線停止值應比最小的CT值小1-2)。此問題的有用討論見《ABI基線與閾值設置指南》(ABITutorialonSettingBaselinesandThresholds)。(有趣的是，此問題的最佳討論見TaqManTM人內源性對照板(HumanEndogenousControlPlate)的手冊中)。如果結果沒有意義，檢查原始光譜看運行期間CDC照相機(是否)可能飽和。利用光學蓋(opticalcap)而不是光學粘性罩(opticaladhesivecover)可防止CDC照相機飽和。當利用SYBRGreenI、多重(反應)和高濃度探針時，更可能發生(CDC照相機飽和)。結果解析每次反應結束時，所記錄的螢光強度用於以下計算Rn+是含所有組分的反應的Rn值；Rir是未反應樣品的Rn值(基線值或NTC中檢測的值)。ARn是Rn+與Rn-之間的差異。它是PCR產生的信號數量級指標。定量測定模板含量有三種示範性方法1.絕對標準方法:在此方法中，用含量已知的標準品，例如體外翻譯的RNA(cRNA)。2.相對標準方法:每次運行的試驗設計中包括己知量的靶核酸；3.比狡性Ct方法:此方法不用含量已知的標準品，而是比較靶序列的相對量與選擇的任何參比值，結果以相對於參比值(例如靜息淋巴細胞或標準細胞系的表達水平)給出。基因表達的相對定量測定的比較性CT方法(AACT):此方法在觀察相對於活性參比對照物(標準品)的表達水平時無需製作標準曲線即能相對地定量測定模板並增加樣品處理量。為成功實施此方法，應使靶標和參比物的動態範圍相似。控制此(動態範圍)的靈敏方法是觀察AC丁(同一起始模板用量作兩次PCR所得兩個CT值之間的差異)如何隨模板的稀釋度而變化。如果這兩種擴增子的效率大致相等，將輸入量的對數與ACT作圖得到接近水平的線(斜率〈0.10)。這表示在起始模板用量範圍內進行的兩次PCR效率相同。如果該圖顯示效率不相等，應採用標準曲線方法來定量測定基因表達。應測定(l)靶標的精確最低和最高濃度和(2)兩種基因含量的精確最低和最高比例這二者的動態範圍。在常規競爭性RT-PCR中，該動態範圍限制在靶標-競爭物比例約為10:1-1:10(1:1的比例可獲得最佳精確性)。實時PCR能實現更廣泛的動態範圍。在不同試管中擴增耙標和內源對照物與採用標準曲線方法幾乎不需要優化和驗證。採用比較性CT方法的優點在於無需製作標準曲線(樣品可利用更多的孔)。該方法也消除了製作標準曲線樣品可能產生的任何稀釋誤差的負面影響。只要靶標和標準品具有相似的動態範圍，比較性Ct方法(AACt方法)是最實用的方法。預計標準品比靶標的表達水平高(因此，Ct僮狡低)。從得到靶標和標準品的CT值之間的差異(ACT)開始定量計算ACT=CT(靶標)-CT(標準品)計算待定量的各樣品的此值(除非靶標的表達水平高於標準品，此值應為陽性值。如果是陰性也無害)。每次比較選擇這些樣品之一作為參比品(基線)。比較性AACT計算包括找到各樣品ACT與基線ACT之間的差異。如果基線值表示最低表達水平，則預計AACT值是陰性(因為基線樣品的ACT最大，由於它具有最大CT值)。如果一些樣品中表達增加，而另一些中減少，AACT值將是陰性和陽性數值的混合值。定量測定的最後一步是將這些數值轉化為絕對值。此計算公式是比較性表達水平=2_AACT與基線水平相比，(樣品)表達增加約23=8倍，而(樣品)表達降低約為參比品水平的2-3=1/8。通過簡單地輸入Ct值用微軟Excel進行這些計算(ABI在http:〃www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/7700amp/有關於利用擴展層程序(spreadsheetprogram)來產生擴增圖的在線指南；TaqMan人內源性對照板(HumanEndogenousControlPlate)方法也包括有關用MSExcel進行實時PCR數據分析的詳細說明)。其它(絕對)定量方法概述於ABI用戶公告(http:〃docs.appliedbiosystems.com/search.taf_UserReference=A8658327189850A13A0C598E)。公告#2和#5對全面理解實時PCR和定量最有用。推薦方法1.利用正位移移液管(positive-displacementpipette)以避免移液不精確；2.實時PCR的靈敏度可檢測出2pg總RNA中的靶標。反應中總RNA的拷貝數宜足夠從而可通過25-30輪即產生信號(優選低於100ng)。為實現此目的應降低或增加用量；3.各試劑的最佳濃度如下；i.氯化鎂的濃度應是4-7mM。對用PrimerExpresssoftware(引物表達軟體)設計的引物/探針而言最佳是5.5mM;ii.除dUTP夕卜(如果使用的話)，各dNTP的濃度應平衡。用dUTP取代dTTP來控制PCR產物殘留需要dUTP濃度是其它dNTP的兩倍。雖然dNTP濃度的最佳範圍是500mM(—步RT-PCR)，但典型的TaqMan反應(只是PCR)的各種dNTP採用200(400的dUTP);iii.通常向每50pL反應中加入0.25pL(1.25U)AmpliTaqDNA聚合酶(5.0UL)。這是最低要求。如果需要，可將此量增加0.25U達到最優；iv.最佳探針濃度是50-200nM，引物濃度是100-900nM。應對三種不同溫度(TaqMan引物的58、60和62。C)和三種濃度(50、300、900nM)的各種組合優化各對引物。這意味著設置了不同的三組(三種溫度)，每組利用固定量的靶模板有九種反應(50/50mM、50/300mM、50/卯0、300/50、300/300、300/，、900/50、900/300、900/900mM)。如果需要，可(進行)第二輪優化來改善結果。可通過選擇可提供最低CT和最高ARn的引物濃度來實現最佳性能。類似地，應將探針濃度優化為25-225nM;4.如果用AmpliTaqGoldDNA聚合酶，為實現此目的需要在PCR前於92-95T加熱9-12分鐘。如果用AmpliTaqGoldDNA聚合酶，無需將反應設置在冰上。典型的T叫Man反應包括50°C2分鐘UNG(參見下文)培育；95°C10分鐘活化聚合酶；和95°C15秒(變性)40輪與60°C1分鐘(退火與延伸)。如果起始材料是總RNA，在TaqMan反應之前應進行典型的逆轉錄循環，該循環(cDNA合成)由25。C10分鐘(引物培育)，48。C30分鐘(利用常規逆轉錄酶進行逆轉錄)和95°C5分鐘(滅活逆轉錄酶)；5.向該反應中加入AmpErase尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)來除去摻入擴增子中的任何尿嘧啶防止殘留的PCR產物再擴增。這是PCR反應中為何使用dUTP而不是dTTP的原因。UNG在55'C以上不起作用，不切割含末端dU核苷酸的單鏈DNA。除非逆轉錄和PCR使用rrADNA聚合酶，否則含UNG的主混合物不應與一步RT-PCR聯用(TaqManEZRT-PCR試劑盒)；6.每塊反應平板中必需包含至少三份非擴增對照(NAC)以及三份非模板對照^丁(:)(為在確定的耙標擴增+/-閾值這達到99.7%可信度水平，必須進行一式六份NTC)。NAC加樣板含有樣品，不含酶。需要排除樣品中或熱循環儀的加熱塊(heatingblock)中螢光汙染物的存在(這些汙染物可導致假陽性)。如果PCR後NAC的絕對螢光大於NTC，樣品中或熱循環儀的加熱塊中可能存在螢光汙染物。7.如果要將AACT方法用於相對定量測定，應核査引物/探針系統及其標準品的動態範圍。通過以5種RNA濃度(例如，0、80pgL、400pgL、2ng/^L和50ng/^iL)進行(一式三份)反應來實現此核查。相同的總RNA濃度範圍的靶標和標準品進行實時RT-PCR得到的起始含量的對數與CT值作圖(標準曲線)應該是(接近)直線；8.被動參比物是加入'反應中的染料(ROX)(存在於TaqMan通用PCR主混合物中)。它不參與5'核酸酶反應。它提供了背景發射螢光的內部參比物。可用此來標準化受體-染料信號。對孔與孔之間(濃度或體積差異)或隨時間變化發生的非PCR相關螢光波動進行此標準化，不同於對cDNA用量或PCR效率進行的標準化。將報導染料的發射光強度除以被動參比物的發射光強度實現標準化。得到的比值定義為Rn;9.如果進行多重(反應)，更豐富的靶標將在其它靶標得以擴增之前耗盡所有的反應成分。為避免此種情況，對更豐富靶物質應限制引物的濃度；10.TaqMan通用PCR主混合物應保存於2-8°C(不是-20°C);11.用JOE報導染料標記TaqManGoldRT-PCR試劑盒提供的GAPDH探針，用VIC標記Pre-DevelopedTaqManAssayReagents(PDAR)試劑盒提供的同一探針。設計的這些人GAPDH試驗的引物不會擴增基因組DNA;12.為防止酶殘留，需要在48t:培育的一步RT-PCR法不能用AmpEraseUNG，但EZRT-PCR試劑盒中可用；13.單重反應只能用一步RT-PCR法，逆轉錄法只能選擇下遊引物(非隨機六聚體或寡聚-dT);14.優選進行一式兩份(反應)來控制移液誤差，但這不可避免會增加成本；15.如果進行多重(反應)，在運行前應核查光譜補償選項(在AdvancedOptions(高級選項)中)；16.利用反應中的被動參比物(ROX)將螢光波動(值)標準化，和用內源性對照物(例如GAPDH，活性參比物)將cDNA/PCR用量的效率標準化是不同的方法；17.ABI7700不僅可用於定量RT-PCR也可用於終點PCR。後者包括存在/不存在的檢測試驗或等位基因鑑別試驗(例如SNP分型)；18.PCR的早期輪次(0-5輪)中Rn值漂移表示反應諸組分最初不平衡，但不影響最終結果，只要重新設置基線範圍的下限值；19.如果注意到擴增圖異常(CT值<15，在早期輪次中檢測到擴增信號)，應降低基線範圍的上限值，應稀釋樣品以提高CT值(汙染也可能提高CT值)；20.ARn值低(或高於預計的Ct值)表明PCR效率不佳或者耙標的拷貝數低；21.Ct值的標準偏差〉0.16表明移液不精確；22.純色彩設置(PureDyeSetup)中的SYBR綠色條目(SYBRGreenentry)以大寫字母縮寫為"SYBR"。任何其它縮寫或小寫字母會產生問題；23.ABI7700的SDS軟體與8.1版的Macintosh作業系統有衝突。不應在這種計算機上分析數據。24.ABI7700不應長期停用。如果將其關閉，在運行前應預熱至少1小時。推薦將儀器隨時開著，這對雷射有益。如果運行前剛開機，可能會出現顯示作業系統版本衝突的出錯框。如果發生此情況，選擇"AutoDownload(自動下載)"選項。25.ABI7700隻是可得到的實時PCR系統中的^種，其它包括BioRad、Cepheid、CorbettResearch、Roche禾卩Stratagene的系統。基因型分析許多方法可用於分析DNA的基因型。等位基因鑑別方法的綜述見Kristensen等(Biotechniques,30(2):318-322，(2001))。本文只描述了一種方法，等位基因特異性PCR法。引物設計可利用隨意得到的電腦程式，例如Primer3(http:〃frodo.wi.mit.edu/primer3/primer3—code.html)來設計對具體等位基因的特異性上遊和下遊PCR引物。或者，可利用諸如ClustalW(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/)程序和針對存在DNA序列差異但保持留足夠特異性而能確保擴增正確擴增子的區域設計的特異性引物，比對各等位基因的DNA序列。優選將PCR擴增子設計為在一個等位基因中具有限制性酶切位點，而在其它等位基因中沒有。引物通常長18-25個鹼基對，具有相似的解鏈溫度。PCR擴增對PCR反應組成的描述隨處可見(《PCR的臨床應用》(ClinicalApplicationsofPCR)，DennisLo(編)，BlackwellPublishing,1998)。簡言之，此反應含有引物、DNA、緩衝液和熱穩定性聚合酶。反應在熱循環儀，例如PTC-96V型MJResearch熱循環儀上通過變性、雜交和DNA延伸的溫度步驟進行循環(最多50次)。DNA分析可用各種方法，包括用質譜、毛細管凝膠電泳和瓊脂糖凝膠電泳進行分子大小鑑別來分析PCR產物。如果將PCR擴增子設計為含有不同的限制性酶切位點，可用DNA-結合柱或沉澱和用水重懸，然後用合適的限制性酶進行限制性切割來純化PCR反應中的DNA。然後將限制性切割的DNA作瓊脂糖凝膠電泳，利用電流對DNA進行大小分離。某基因的各種等位基因根據是否含有限制性位點而具有不同大小。實施例2基因鑑定和基因的優先排序按照EmpiricalBayes方法(Lonnstedt禾卩Speed,2002，5toZWca<S7m'c<3，12:3146)，根據第28天的所有動物與第0、2、4、7、9、11、14、17、21和24天的動物作比較對(表達變化)有統計學意義的基因排序。用經驗性Bayes方法提供各組內各基因方差的減少估算量(shrinkageestimator)。利用此減少估算量根據t檢驗計算各p值。採用Holms方法調整t檢驗的p值以有力控制基因家族I型誤差(familywisetypeIerrorrate)。在各天(表達變化)有統計學意義(pO.05)的總共783種基因是表5所列的基因。通過去除(表達變化)有統計學意義不到兩天並且pX).OOl的那些基因來修正此基因列表。然後按照它們的p值對剩餘的基因以升序排列。應注意此基因列表不排除可用於診斷應激的基因(也參見最低預測設置和基因本體論(geneontology))。表6所列基因按它們的統計學t檢驗值排序可解釋為信號-噪聲比。該表格也顯示了1og2倍變化(M值)與調整的p值。具有負t值(因此M也是負值)的基因表達下調。具有正的t和M值的基因表達上調。根據應激誘導後第一天(表達變化)有統計學意義(pO.001)的各基因和至少3次取樣時間檢測(表達變化)有統計學意義的基因的t值增加值進行基因的優先排序。實施例3證明對測定應激應答具有診斷潛力根據基因表達計算的主要組分評分(Jolliffe，I.T.，《主要組分分析》(Principalcomponentsanalysis),Springer-Verlag，1986)採用辨另U分析(Venables和Ripley，2002，《統計學在S中的現代應用》(ModernAppliedStatisticsinS)，Springer)評估了整組基因的診斷潛力。對遭遇應激之後立即獲得的和遭遇應激後第2、4、7、9、11、14、17、21、24和28天獲得的樣品作比較。整個方法經交叉驗證。靈敏度和特異性經計算均為優先級(uniformprior)。這可解釋為是一種對減少的調節，此減少的估算值位於減小範圍(reducedspace)內。然後利用辯別函數評分(discriminantfunctionscores)的交叉驗證估算值來構建ROC曲線(LloydC丄，1998，"採用平滑ROC曲線進行總結和比較的診斷系統"(TheuseofsmoothedROCcurvestosummarizeandcomparediagnosticsystems),Jowma/o/爿mm'ca"iSY加Wca/jmocZ油'ow，93:1356-1364)。ROC曲線根據具有用Lloyd方法(同上)選擇的平滑窗的經驗性累積分布函數與核心密度估算值製備。比較每天與第28天的ROC曲線分別見圖1-10。經歷運輸應激狀態後基因表達改變的數量級足以產生優秀的診斷潛力。實施例4具有預測功能的最小基因組雖然鑑定到大量具有診斷潛力的基因，但通常進行診斷所需可接受的只是很少數目的基因。表7顯示根據選自具有診斷潛力基因組的兩種基因進行線性辯別分析獲得交叉驗證分類結果、靈敏度和特異性。提出的諸對基因是能產生最高預測結果的基因，許多其它基因對得到可接受的分類結果。本領域技術人員不難鑑定其它基因對。鑑定基因對的技術包括(但不限於)正向可變性選擇(VenablesW.N.和RipleyB.D.，《統計學在S中的現代應用》(ModernAppliedStatisticsinS)，第四版，2002.，Springer)、最佳亞組選擇、反向(backward)消除(VenablesW.N.和RipleyB.D.，2002，同上)、逐步(stepwise)選擇(VenablesW.N.和RipleyB.D.，2002，同上)和隨機可變消除(FigueradoM.A.，《監督學習的適應性稀疏》(AdaptiveSparsenessforSupervisedLearning))。表8顯示根據用選自診斷組三種基因進行線性辯別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組三種基因。本領域技術人員不難明白可根據三種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。表9顯示根據選自診斷組的四種基因，線性判別分析得到的交叉驗證分類結果。只給出了20組四種基因。本領域技術人員不難明白根據四種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。表10顯示根據用選自診斷組五種基因進行線性辯別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組五種基因。本領域技術人員不難明白可根據五種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。表11顯示根據用選自診斷組六種基因進行線性辯別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組六種基因。本領域技術人員不難明白可根據六種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。表12顯示根據用選自診斷組七種基因進行線性辯別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組七種基因。本領域技術人員不難明白可根據七種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。表13顯示根據用選自診斷組八種基因進行線性辯別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組八種基因。本領域技術人員不難明白可根據八種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。表14顯示根據用選自診斷組九種基因進行線性辯別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組九種基因。本領域技術人員不難明白可根據九種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。表15顯示根據用選自診斷組十種基因進行線性辯別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組十種基因。本領域技術人員不難明白可根據十種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。表16顯示根據用選自診斷組二十種基因進行線性辯別分析得到的交叉驗證分類結果。只提供了20組二十種基因。本領域技術人員不難明白可根據二十種應激標記基因作出其它合適的診斷選擇。實施例5特異性的證實應激標記基因的特異性難以定義，因為這種測試是一種評估而不是診斷。然而，可將整組"應激基因"用於850GeneChipTM的基因表達資料庫的訓練組。資料庫中的基因表達結果得自患有以下各種疾病和病症的馬匹樣品慢性和極性誘導的EPM、EPM的臨床病例、皰疹病毒感染、退變性骨關節炎、紅球菌感染、內毒素血症、蹄葉炎、胃潰瘍症候群、田徑訓練動物和臨床上正常動物。這些動物的應激狀態事先未知。利用該訓練組中的基因計算各GeneChipTM中的應激指數評分。由於是從經調整的辨別函數計算該評分可將大評分值與產生應激狀態的高度可能性相關聯，評分的方差應約為1。根據此評分將GeneChipTM測定結果從最通過改變陽性診斷的閾值檢測了此法的特異性。各閾值的特異性定義為真陽性(樣品)陽性結果的比例(S卩，GeneChipTM指數評分高於該閾值)。採用2個閾值(即，兩個標準偏差)。當利用四種主要組分和整個基因組(3105)時，對不屬於該誘導應激試驗一部分的資料庫的59隻動物經鑑定具有應激相關的免疫應答改變與辨別函數的兩個標準差高於0。在這59隻動物中，10隻進行了蹄葉炎試驗，14隻有馬紅球菌(R.叫ui)感染，9隻患有胃炎。用作"對照"的13隻動物中3隻近期經歷轉運，兩隻處於試驗中，3隻臨床上不正常，5隻是接觸馬紅球菌的幼駒。12隻臨床上正常的動物進行了應激標記鑑定。根據此信息，可以說該應激標記用於含有850個以上樣品的資料庫時其特異性超過90%。當利用四種主要組分和表1所列獨特的應激標記基因時，對不屬於該誘導應激試驗一部分的資料庫的79隻動物經鑑定為具有應激相關的免疫應答改變，與辨別函數的兩個標準差高於O。在這79隻動物中，15隻進行了蹄葉炎試驗，8隻有馬紅球菌感染，24隻患有胃炎。用作"對照"的21隻動物中12隻處於試驗中，3隻臨床上不正常。9隻臨床上正常的動物進行了應激標記鑑定。根據此信息，可以說該應激標記用於含有850個以上樣品的資料庫時其特異性超過卯％。實施例7基因本體為根據功能、代謝過程或細胞組分對基因分組，採用BLAST算法(Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.和Lipman，D丄，(19卯)，"局部序列比對基本檢索工具"(Basiclocalalignmentsearchtool),M/.5/o/.，215:403-410)將基因序列與GeneBank資料庫作比較，並進行基因同源性和基因本體檢索。根據這些標準和當時可得到的信息，表17列出了這些基因的分組。也參見含有各基因序列信息的表1。本文引用的每篇專利、專利申請和出版物的內容全文納入本文作為參考。本文所引用的任何參考文獻不應理解為承認該參考文獻是可用於本申請的"現有技術"。整篇說明書的目的是描述本發明的優選實施方案而不是將本發明限制於某一實施方案或特徵的特定組合。本領域技術人員應知道藉助本文內容可對示例的具體實施方案作出各種改進與改變而不脫離本發明的範圍。所有這種改進與改變要包括在附加的權利要求書的範圍內。表ltableseeoriginaldocumentpage115tableseeoriginaldocumentpage116tableseeoriginaldocumentpage117tableseeoriginaldocumentpage118tableseeoriginaldocumentpage119tableseeoriginaldocumentpage120tableseeoriginaldocumentpage121tableseeoriginaldocumentpage122基因名稱imageseeoriginaldocumentpage123tableseeoriginaldocumentpage124tableseeoriginaldocumentpage125tableseeoriginaldocumentpage126tableseeoriginaldocumentpage127tableseeoriginaldocumentpage128tableseeoriginaldocumentpage129tableseeoriginaldocumentpage130tableseeoriginaldocumentpage131tableseeoriginaldocumentpage132tableseeoriginaldocumentpage133tableseeoriginaldocumentpage134tableseeoriginaldocumentpage135tableseeoriginaldocumentpage136tableseeoriginaldocumentpage137tableseeoriginaldocumentpage138tableseeoriginaldocumentpage139tableseeoriginaldocumentpage140tableseeoriginaldocumentpage141tableseeoriginaldocumentpage142tableseeoriginaldocumentpage143tableseeoriginaldocumentpage144tableseeoriginaldocumentpage145tableseeoriginaldocumentpage146tableseeoriginaldocumentpage147tableseeoriginaldocumentpage148tableseeoriginaldocumentpage149tableseeoriginaldocumentpage150formulaseeoriginaldocumentpage151tableseeoriginaldocumentpage152tableseeoriginaldocumentpage153tableseeoriginaldocumentpage154tableseeoriginaldocumentpage155tableseeoriginaldocumentpage156tableseeoriginaldocumentpage157.tableseeoriginaldocumentpage158tableseeoriginaldocumentpage159tableseeoriginaldocumentpage160tableseeoriginaldocumentpage161tableseeoriginaldocumentpage162tableseeoriginaldocumentpage163tableseeoriginaldocumentpage164tableseeoriginaldocumentpage165tableseeoriginaldocumentpage166tableseeoriginaldocumentpage167tableseeoriginaldocumentpage168tableseeoriginaldocumentpage169tableseeoriginaldocumentpage170tableseeoriginaldocumentpage171tableseeoriginaldocumentpage172tableseeoriginaldocumentpage173tableseeoriginaldocumentpage174基tableseeoriginaldocumentpage175基因名稱Gen^ank同源性『NA照!j/a斷的胺基酸序列，。,:6121GGAATTGAATTTCATTTATACACTAATTCCTTGGATTTTGCACAGTTACCTAACGGTTTT6181AGTCTGGAGTTAAATTCAGATGCATGGMTCCTGAAGG嵐ATGGTAGCTT丁TTAATCTT6241T丁丁GTGTGTGTGTGAGTCTTTTAAATCMGTACTGATTMCTATTAAGTACMCTTTGAG6301AnTTAGTTTTAACTCTTCAGAAGCCAGTGTG織TAGMTTGGTTATTCTCAAAGACTC6361AGGATMACTAAATAAGCTATATATAGAGTACATTTAMATGTACMCAC磁TTGGAAA6421TAAAATMGTTACMGATAAGTTTACAGGGATATATTGCTTACAATTTTTMAAGGCAGT6481TTGTTTTTTATGTGAATATGTTTCTTAGTGAMTTTTACATTCCTTTGTTTTGGAAGATT6541GGCGATATTTGAAGAGTTMAAATAGTACAGAAATGTGAAGTTTGGTATaCT磁TGTG6601TTGTACTTGACTTTCTTTTTTATTTTGTTTTTTTTTTTTTTTGACTACTTAGAATTTTCA6661CAATTCTAATAAGATTGTTTCCMGTCTCTCATGTGCMGCTTTAAAGGATGCACTCTTG6721CCATTTTATGTACTGGMGATCATTGGTCAGATGAATACTGTGTCTGACAAMATGTAAA6781CTGTATAAACTGAGGAACCTCAGCTAATCAGTATTACTTTGTAGATCACCATGCCCACCA6841CATTTCMACTCMACTATCTGTAGATTTCMMTCCATTGTGTTTGAGTTTGTTTGCAG6901TTCCCTCAGCTTGCTGGTAATTGTGGTGTTTTGTTTTTTGnTTGTTTTCAATGCAAATG6961TGATGTAATATTCTTATTTTCTTTGaTCAMGCTGGAC丁GGAMTTG丁ATCG丁GTAATT7021ATTTTTGTGTTCTTAATGTTATTTGGTACTCAAGTTGTAMTAACGTCTACTACTGTTTA7081TTCCAGTTTCTACTACCTCAGGTGTCCTATAGATTTTTCTTCTACCAMGTTCACTTTCA7141CMTGMATTATATTTGCTGTGTGACTATGATTCCTAAGATTTCCAGGGCTTAAGGGCTA7201ACTTCTATTAGCACCTTACTGTGTAAGCAMTGTTACAMAAAAAAAAMAAAMTCTCT7261GGGTTAAGMAATTTGGCTTAAATGTATCCTTTGTTATTT丁AMTATATTGAGATATT丁T7321MTTAAAATTTTTACCCCATTGMCCGATTTTATAGTATTTGTACCTATTTTGGTGTTTT7381TGTCTTTATAGTMATAAMGTTTTTGMC1MGSQALQEWGQREPGRWPDPSEQIDNO:581ATGGGCAGCCAGGCCC丁GCAGGAGTGGGGACAGAGGGMCCCGGCCGGTGGCCCGACCCT21AGKKDVRREASDSGRAGTWP61GCAGGGAAGMGGACGTGCGGCGAGMGCATCGGATTCGGGGAGGGCCGGGACCTGGCCG41RTAKEKLKIDGDTRLPSSPQ121AGGACAGCCAAGGAAAAACTAAAGATCGACGGGGACACCCGCCTCCCTTCCTCGCCCCM61RFLRGCGDLHQKPKLELILS181CGGTTTCTCAGAGGCTGTGGGGACTTGCACCAGAAACCCMGTTGGAACTMTTCTTTCT81FGRCNSPPASSAVPGRDCRE241TTCGGMGGTGCMCTCCCCTCCCGCGAGCTCCGCGGTGCCGGGCCGAGATTGCCGAGAG101已AAQRCRQGSSCRRCGRDYL301GMGCGGCGCAGCGCTGCCGCCMGGCTCCTCCTG丁CGCCGG丁GCGGCCGGGACTACCTGAARRGPSECSPREKMAAAAG361GCGGCGCGGCGCGGGCCGAGCGMTGTAGCCCGCGAGAGAAAATGGCGGCGGCGGCGGGG20058002624L2轉溢齒雜158/4455ttableseeoriginaldocumentpage177tableseeoriginaldocumentpage178tableseeoriginaldocumentpage179tableseeoriginaldocumentpage180tableseeoriginaldocumentpage181tableseeoriginaldocumentpage182tableseeoriginaldocumentpage183tableseeoriginaldocumentpage184tableseeoriginaldocumentpage185tableseeoriginaldocumentpage186tableseeoriginaldocumentpage187tableseeoriginaldocumentpage188tableseeoriginaldocumentpage189tableseeoriginaldocumentpage190tableseeoriginaldocumentpage191基因tableseeoriginaldocumentpage192tableseeoriginaldocumentpage193tableseeoriginaldocumentpage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、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補序列；(b)其具有的多核苷酸表達產物含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249；(c)其具有的多核苷酸表達產物含有編碼與以下序列至少一部分至少有50％序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO22、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)其具有的多核苷酸表達產物含有至少在低嚴謹條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的基因。2.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，包括檢測選自以下的應激標記多核苷酸的異常表達(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、17、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、2U、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。3.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，包括檢測選自以下的應激標記多肽的異常表達(i)含有與以下任一序列至少有50%序列相似性的胺基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(ii)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、135、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個連續胺基酸殘基；(iii)所含的胺基酸序列與以下任一序列的至少15個連續胺基酸殘基至少有30%相似性的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(iv)含有以下任一序列一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個連續胺基酸殘基，並且與和(i)、(ii)或(iii)的序列具有免疫相互作用活性的抗原結合分子具有免疫相互作用活性。4.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，通過以下步驟檢測所述的異常表達(1)檢測得自測試對象的生物學樣品中的至少一種應激標記基因表達產物的水平或功能活性，和(2)將所檢測到的各表達產物的水平或功能活性與得自一位或多位正常對象或一位或多位未處於應激狀態對象的參比樣品中相應表達產物的水平或功能活性作比較，其中與參比樣品中相應表達產物的水平或功能活性相比，該生物學樣品中該表達產物的水平或功能活性有差異表明該測試對象存在對應激的生理學應答。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，還包括當該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性比相應的該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性低10%時，診斷該測試對象中對應激的生理學應答的存在、階段或程度。6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，通過檢測至少一種選自以下的應激標記多核苷酸的水平或功能活性降低來確定是否存在對應激的生理學應答(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、4、7、9、II、19、21、24、25、33、34、38、39、40、41、42、50、51、56、57、59、62、63、66、70、71、73、75、79、81、83、89、90、91、92、93、97、99、105、107、108、111、119、121、122、123、129、130、137、139、140、141、142、143或185，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、8、10、12、20、22、43、58、60、67、71、72、74、76、80、82、84、94、98、100、106、112、120、122、123、124或138，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。7.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，還包括當該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性比相應的該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性高10%時，診斷該測試對象對應激的生理學應答的存在、階段或程度。8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，通過檢測至少一種選自以下的應激標記多核苷酸的水平或功能活性增加來確定是否存在對應激的生理學應答(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、13、15、16、17、23、26、28、29、30、32、35、37、44、46、48、52、54、55、64、68、77、85、87、95、96、101、103、113、115、117、118、125、126、131、133、135、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、183、184、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206或210，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、14、18、27、31、36、45、47、49、53、65、69、78、86、88、102、104、114、116、132、134、136、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、189、191、193、197、199、201、203、205、207或211，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。9.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，還包括當該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性與相應的該表達產物或各表達產物檢測到的水平或功能活性相同或相似時，診斷不存在對應激的生理學應答。10.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，各表達產物檢測到的水平或功能活性與相應的各表達產物檢測到的水平或功能活性的差異不超過5%。11.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，包括檢測至少約2種應激標記基因各表達產物的水平或功能活性。12.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，包括檢測至少一種選自以下的一級相關應激標記基因各表達產物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:89、90、103、125、126、163、178、182、184或l卯，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:104、179、183或189，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。13.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，包括檢測至少一種選自以下的二級相關應激標記基因各表達產物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:17、23、44、52、133、135、144、147、148、151、155、192、196、202或206，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:18、20、45、53、134、136、149、152、193、197或207，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。14.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，包括檢測至少一種選自以下的三級相關應激標記基因各表達產物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:5、30、37、48、54、55、64、66、70、77、79、85、91、92、95、96、101、115、117、118、121、150、153、158、164、170、180、186或198，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:6、31、49、65、67、78、80、86、102、116、122、154、159、181或199，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。15.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，包括檢測至少一種選自以下的四級相關應激標記基因各表達產物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:7、15、16、19、21、24、25、26、28、35、38、39、42、46、57、68、73、81、83、97、99、107、113、123、160、165、175、187、188、194、195或200，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:20、22、27、29、36、42、43、58、69、74、82、84、98、100、108、114、124、166、189或201，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。16.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，包括檢測至少一種選自以下的五級相關應激標記基因各表達產物的水平或功能活性(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:1、3、9、11、13、32、33、34、40、41、50、51、56、59、62、63、71、75、87、93、105、111、119、127、129、130、131、137、139、141、143、145、156、161、167、169、171、173、176、185、204或210，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、4、12、14、60、61、72、76、88、94、106、112、120、128、132、138、140、142、146、157、162、168、172、174、177、205或211，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。17.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述生物學樣品包括血液。18.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述生物學樣品包括外周血。19.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述生物學樣品包括白細胞。20.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述表達產物是RNA分子。21.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述表達產物是多肽。22.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述表達產物與相應的表達產物相同。23.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述表達產物是相應表達產物的變體。24.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述表達產物或相應表達產物是靶RNA或該靶RNA的DNA拷貝，其水平用至少在低嚴謹性條件下與該靶RNA或其DNA拷貝雜交的至少一種核酸探針來檢測，其中所述核酸探針含有應激標記多核苷酸的至少15個連續核苷酸。25.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述靶RNA或其DNA拷貝的所檢測水平或豐度按存在於同一樣品中的參比RNA或該參比RNA的DNA拷貝的水平或豐度標準化。26.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述核酸探針固定在固體或半固體支持物上。27.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述核酸探針形成核酸探針空間陣列的一部分。28.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，通過雜交檢測與該靶RNA或其DNA拷貝結合的核酸探針的水平。29.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，通過核酸擴增檢測與該耙RNA或其DNA拷貝結合的核酸探針的水平。30.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，通過核酸酶保護試驗檢測與該靶RNA或其DNA拷貝結合的核酸探針的水平。31.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，檢測應激標記多核苷酸的所述探針含有SEQIDNO:250-1807之一所示的序列。32.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述表達產物或相應的表達產物是靶多肽，其水平採用與該耙多肽具有免疫相互作用活性的至少一種抗原結合分子來檢測。33.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，包括將所述靶多肽檢測到的水平按存在於同一樣品中的參比多肽的水平標準化。34.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述抗原結合分子固定在固體或半固體支持物上。35.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，所述抗原結合分子形成抗原結合分子空間陣列的一部分。36.如權利要求24所述的方法，其特徵在於，通過免疫測定檢測與靶多肽結合的抗原結合分子的水平。37.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述表達產物或相應的表達產物是靶多肽，其水平採用與該靶多肽反應形成反應產物的至少一種底物來檢測。38.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，將所述靶多肽檢測到的功能活性按存在於同一樣品中的參比多肽的功能活性標準化。39.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，利用包括至少一個與基站相連接的終端站的系統來執行該方法，其中所述基站用於(a)通過通信網絡從所述終端站接受對象數據，其中所述對象數據提供了對應於生物學樣品中至少一種表達產物所檢測的或標準化的水平或功能活性參數值，和(b)將所述對象數據與代表參比樣品中至少一種相應表達產物所檢測的或標準化的水平或功能活性的預定數據作比較，從而確定與參比樣品中相應表達產物的水平或功能活性相比，該生物學樣品中該表達產物的水平或功能活性有無任何差異。40.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述基站還用於診斷對應激的生理學應答的存在或程度。41.如權利要求43所述的方法，其特徵在於，所述基站還經通信網絡將診斷出的適應症傳遞至所述終端站。42.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，檢測到異常表達表明對應激的生理學應答的存在或風險。43.如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述測試對象是馬。44.一種治療、預防或抑制對象中產生應激狀態的方法，所述方法包括檢測該對象中至少一種應激標記基因的異常表達，並給予該對象有效量藥物來治療或緩解症狀或者逆轉或抑制該對象中產生應激狀態，其中所述應激標記基因選自(a)其具有的多核苷酸表達產物含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的基因SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、卯、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、190、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補序列；(b)其具有的多核苷酸表達產物含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)其具有的多核苷酸表達產物含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的基因SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)其具有的多核苷酸表達產物含有至少在低嚴謹條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的基因。45.—種選自以下的分離的應激標記多核苷酸(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互補序列；(b)含有包含以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分含有該序列或互補序列的至少15個連續核苷酸；(c)至少在低嚴謹性條件下與(a)或(b)的序列或其互補序列雜交的多核苷酸；和(d)含有以下任一序列一部分的多核苷酸SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，或其互補序列，其中所述部分含有該序列或互補序列的至少15個連續核苷酸並至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)或(c)的序列或其互補序列雜交。46.—種含有與調控元件操作性相連的如權利要求45所述應激標記多核苷酸的核酸構建物，所述調控元件在宿主細胞中可操作。47.—種含有如權利要求46所述核酸構建物的分離的宿主細胞。48.—種含有至少在低嚴謹性條件下與如權利要求45所述多核苷酸雜交的核苷酸序列的探針。49.如權利要求48所述的探針，其特徵在於，所述探針含有能至少在低嚴謹性條件下與以下任一序列的至少一部分雜交的核苷酸序列SEQIDNO:15、16、23、24、25、28、29、32、33、34、37、38、39、40、41、50、51、54、55、62、63、89、90、91、92、95、96、107、108、117、118、125、126、129、130、143、144、147、150、155、163、164、169、170、175、184、185、186、187、194、195、232、233、238、239、240、241、242或243，其中所述部分的長度至少為15個核苷酸。50.如權利要求49所述的探針，其特徵在於，所述探針含有SEQIDNO:250-1807之一所示的序列。51.—種在其上固定有至少一種如權利要求48所述探針的固體或半固體支持物。52.以下物質在製備用於診斷對象中對應激的生理學應答的存在情況的試劑盒中的應用(i)一種或多種選自以下的應激標記多核苷酸(a)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、48、50、51、52、54、55、56、57、59、62、63、64、66、68、70、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、90、91、92、93、95、96、97、99、101、103、105、107、108、109、111、113、115、117、118、119、121、123、125、126、127、129、130、131、133、135、137、139、141、143、144、145、147、148、150、151、153、155、156、158、160、161、163、164、165、167、169、170、171、173、175、176、178、180、182、184、185、186、187、188、l卯、192、194、195、196、198、200、202、204、206、208、210、212、214、216、218、220、222、224、226、228、230、232、233、234、236、238、239、240、241、242、243、244、246或248，或其互補序列;(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%(和至少51°/。-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、,58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、2H、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸；或(ii)一種或多種含有至少在低嚴謹性條件下與(i)所述應激標記多核苷酸雜交的核苷酸序列的探針；(iii)一種或多種選自以下的應激標記多肽(1)含有與以下任一序列至少有50%(和至少51%-至少99%及其之間所有整數百分比)序列相似性的胺基酸序列的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、M6、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(2)含有以下任一序列的一部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個連續胺基酸殘基；(3)所含有的胺基酸序列與以下任一序列的至少15個連續胺基酸殘基至少有30%(和至少31%-至少99%及其之間所有整數百分比)相似性的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;和(4)含有以下任一序列的—部分的多肽SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、LV1、，A2;U、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249，其中所述部分含有該序列的至少5個連續的胺基酸殘基，並且與和(l)、(2)或(3)的序列具有免疫相互作用活性的抗原結合分子具有免疫相互作用活性；或(iv)—種或多種與(iii)所述應激標記多肽具有免疫相互作用活性的抗原結合分子。53.如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述針對應激的生理學應答選自身體應激；情感障礙；焦慮症；炎症；疼痛；慢性疲勞症候群；應激誘導的頭痛；癌症；人免疫缺陷病毒(HIV)感染；神經退變性疾病；腸胃道疾病；核上麻痺；肌萎縮性側索硬化症；免疫功能降低或免疫抑制；出血性應激；應激誘導的精神病發作；甲狀腺機能不正常症候群；抗腹瀉激素(ADH)不適當症候群；暴食或肥胖症；不育症；頭部創傷；脊髓創傷；缺血性神經元損傷；興奮性中毒神經元損傷；癲癇；心血管疾病；中風；免疫功能失調；抑制；行為(自發性)調節；肌肉痙攣；尿失禁；阿爾茨海默型早老性痴呆；多發性腦梗死性痴呆；肌萎縮性側索硬化症；化學物質依賴性和成癮；藥物和酒精戒除症狀；骨質疏鬆症；社會心理侏儒症；低血糖症；脫髮；晝夜節律異常；和晝夜節律異常相關疾病。54.—種診斷測試對象中是否存在對應激的生理學應答的方法，包括檢測測試對象中至少一種選自以下的應激標記多核苷酸的異常表達(a)含有與以下任一序列至少有50%序列相同性的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:l、3、4、5、7、9、11、13、15、16、17、19、21、23、24、25、26、28、29、30、32、33、34、35、37、38、39、40、41、42、44、46、或248，或其互補序列；(b)含有編碼包含以下任一胺基酸序列的多肽的核苷酸序列的多核苷酸SEQIDNO:2、6、8、10、12、14、18、20、22、27、31、36、43、45、47、49、53、58、60、61、65、67、69、72、74、76、78、80、82、84、86、88、94、98、100、102、104、106、110、112、114、116、120、122、124、128、132、134、136、138、140、142、146、149、152、154、157、159、162、166、168、172、174、177、179、181、183、189、191、193、197、199、201、203、205、207、209、211、213、215、217、219、221、223、225、227、229、231、235、237、245、247或249;(c)含有編碼與以下序列至少一部分至少有50%序列相似性的多肽的核苷酸序列的多核苷酸tableseeoriginaldocumentpage18247或249，其中所述部分含有該序列的至少15個連續胺基酸殘基；和(d)含有至少在低嚴謹性條件下與(a)、(b)、(c)的序列或其互補序列雜交的核苷酸序列的多核苷酸。全文摘要本發明公開了定性或定量測定應激對免疫系統影響，因應激導致免疫系統失調而對發生疾病或病症易感性和監測動物對付應激的能力的分子和試驗。本發明可用於檢測對免疫調節治療的應答，和監測在應激狀態下對天然疾病的免疫應答。文檔編號C07K14/47GK101133157SQ200580026241公開日2008年2月27日申請日期2005年6月3日優先權日2004年6月3日發明者M·R·託馬斯,R·B·布蘭登申請人:阿什洛米克斯控股有限公司