一種含有TGF-β1siRNA的細胞微泡的應用的製作方法
2023-12-10 10:19:02 2
專利名稱：一種含有TGF-β1 siRNA的細胞微泡的應用的製作方法
—種含有TGF-P IsiRNA的細胞微泡的應用技術領域
本發明屬於生物技術領域，涉及一種含有TGF-e IsiRNA的細胞微泡的應用。
背景技術：
轉化生長因子P (transforming growth factor beta, TGF-P)屬於一類多功能多肽性的生長因子超家族。該家族主要包括轉化生長因子P (TGF-P)、骨形成蛋白(bone morphology protein,BMP)、生長轉化因子(growth and differentiation factors,GDF)、繆氏抑制因子(Mullerian inhibitory factor, MIF)和激活素(Activins) / 抑制素(inhibins)等，其中在哺乳動物細胞中，TGF-P主要包括TGF-^ 1、TGF-3 2和TGF- ^ 3三種亞型，其中TGF-P I與腫瘤的發生發展密切相關。其主要表現為以下幾個階段:(I)在腫瘤發生的初期，由於TGF-P可使細胞停滯在Gl期或延長Gl期，進而可作為腫瘤抑制物抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的分化和凋亡；(2)在腫瘤發展的中期階段，此時腫瘤細胞及腫瘤微環境中的基質細胞都可自分泌產生TGF-P，且TGF-P對腫瘤細胞的增殖抑制作用降低或消失，進而導致腫瘤細胞急劇分裂增殖；(3)到了腫瘤發生的晚期，此時微環境中的TGF-P含量增加，並且它作為一促進腫瘤的細胞因子發揮功能，即:可通過刺激血管生成、促進癌細胞擴散、逃避免疫細胞的監視及促進肌成纖維細胞的形成，進而合成細胞外基質等促進腫瘤細胞的生長、 浸潤和轉移。
此外，除了 TGF-P外，TGF-P信號通路中的受體及信號通路下遊的smad蛋白複合物也都已成為近年來研究腫瘤的熱點對象。鑑於TGF-P及其信號通路中的成員在致癌過程中的作用，目前它們已被作為有力的治療靶點，用於治療腫瘤。如:針對TPR的可溶性蛋白受體抑制劑、針對三種TGF- ^單體的抗體和siRNA抑制劑、針對TPRI激酶的小分子抑制劑及針對TGF-P 2的疫苗等。
上述的抑制劑雖在治療腫瘤方面取得了突破性的進展，但運用TGF-P siRNA作為基因類藥物在生物體內進行腫瘤治療時，仍存在以下缺點，如:容易被核酸酶降解、穩定性較差、細胞內轉染效率低、安全性不明確等。因而，運用TGF-P及其通路中的信號分子的寡聚核苷酸治療腫瘤的方法還有待於進一步改進。
細胞微泡(Microvesicles (MVs))是一類在正常和病理狀態下，機體細胞都可分泌的一種小囊泡，其直徑約為30 lOOOnrn。該類微小囊泡大都是具雙層膜結構的球狀小泡，且除了在其膜表面有蛋白分布外，在球狀小泡的內部也含有一些蛋白、mRNA、miRNA和細胞因子等物質。目前發現，micixwesicles不僅可與其周圍的靶細胞相互作用，也可通過脈管系統作用於較遠的組織細胞。當MVs與其靶細胞相互作用發生融合後，便可將其包裹轉運的諸如細胞因子、趨化因子、酶、核酸、生長因子和信號分子等物質釋放到受體細胞內部。這些生物分子在細胞的增殖、分化、凋亡等過程中發揮作用。發明內容
本發明的目的是針對現有技術的上述缺陷，提供一種含有TGF-P IsiRNA的細胞微泡的應用。
本發明的另一目的是提供一種抑制腫瘤的藥物。
本發明的目的可通過如下技術方案實現:
包裹TGF-P IsiRNA的細胞微泡在製備抑制腫瘤的藥物中的應用。
其中，所述的腫瘤為TGF-P表達較高的腫瘤。
所述的TGF-@ IsiRNA 優選反義鏈序列為 SEQ ID N0.1 的 TGF-@ IsiRNA。
所述的細胞微泡來源於細胞或組織的分泌，優選來源於L929細胞的分泌。
一種抑制腫瘤的藥物，所述的藥物為包裹TGF-P IsiRNA的細胞微泡。
所述的腫瘤為TGF-P表達較高的腫瘤。
所述的TGF-P IsiRNA的反義鏈序列優選SEQ ID N0.1。
所述的細胞微泡來源於細胞或組織的分泌，優選來源於L929細胞的分泌。
本發明中所述的包裹TGF- P IsiRNA的細胞微泡(microvesicles)可通過將TGF-^ IsiRNA利用本領域常規手段轉染細胞，並提取細胞培液中的microvesicles所得。microvesicles的提取也是本領域的常規技術手段。
有益效果:
本發明所述 的microvesicles是生物細胞自身分泌的、可作為運載體轉運蛋白、核酸及其他物質的小囊泡。並且，尤為重要的是，Microvesicles作為TGF-P IsiRNA的運載工具，同其他運載體相比，在治療腫瘤方面主要表現為以下幾方面的優點:(1)由於microvesicles是機體細胞自身分泌的，因而相對於病毒、脂質體納米顆粒和多聚納米顆粒這些外源性運載體轉運siRNA而言，microvesicles轉運體在循環系統中不易被調理素(opsonins)、補體(complement)、凝集因子(coagulation factor)或抗體識別予以清除，從而保證TGF-0 IsiRNA在循環系統中的穩定性；(2)細胞分泌的microvesicles經膜融合或內吞作用將包裹轉運的TGF-P IsiRNA釋放到腫瘤細胞中，通過直接與目的基因TGF-^ I結合發揮功能，從而減少了 siRNA分子的突變，保證siRNA作用的有效發揮；優於TGF-P IsiRNA，本發明TGF-P IMVs在體內可明顯抑制小鼠腫瘤的生長及提高小鼠的存活率；(3)同其他運載體相比，microvesicles轉運體不易引起機體的免疫反應,具有更好的生物安全性。因而，運用microvesicles運載體進行物質轉運有助於降低用其在臨床上治療疾病時對患者造成的一系列不良後果和傷咅。
圖1本發明細胞分泌的MVs包裹TGF-P IsiRNA在體內外抑制腫瘤生長的主要流程。
圖2顯示鑑定TGF-P三種變體在小鼠纖維肉瘤細胞S180中的相對含量的結果。
圖3顯示以TGF-P I為靶標，合成其siRNA轉染S180，篩選幹擾效率較好的一種siRNA的結果。
圖4顯示以篩選出來的幹擾效率較好的一種TGF-P IsiRNA轉染L929細胞後，收取細胞的MVs (TGF-^ IMV)與S180細胞共培養24h，檢測S180細胞中TGF-P I表達的結果。
圖5顯示TGF-P IMV與S180細胞共培養24h，檢測S180細胞的凋亡和生長的結果。
圖6顯示給小鼠皮下植瘤，將腫瘤生長均一的小鼠進行分組，隨後分別經尾靜脈注射TGF-P IMV及其他對照組，於不同時間點檢測小鼠血細胞及腫瘤組織中TGF-P IsiRNA含量的結果。
圖7顯示經尾靜脈注射TGF-P IMV及其他對照組後，各組小鼠腫瘤組織的大小、生長速率及重量的結果。
圖8顯示經尾靜脈注射TGF- ^ IMV及其他對照組後，各組小鼠腫瘤組織中TGF- ^ I表達的結果。
圖9顯示經上述處理小鼠後，各組小鼠血清中TGF- ^ I的含量及各組小鼠存活率的結果。
圖10顯示經上述處理小鼠後，各組小鼠腫瘤組織中TGF-P信號通路下遊的磷酸化smad2蛋白表達的結果。
具體實施方式
以下通過實施例對本發明作進一步的闡述。
實施例1以S180為研究對象，檢測該細胞中TGF-P三種變體的表達水平
使用qRT-PCR和Western blot技術發現並證明了在小鼠纖維肉瘤S180 (購於中科院上海細胞庫(所))中TGF-P I的表達最高。具體步驟為:
1.qRT-PCR
(I) Trizol法提取組織或細胞總RNA
a)將適量組織或細胞溶於Iml RNA提取試劑Trizol中，後加入200ul氯仿，充分震蕩，室溫靜置5min後4°C、12，000g離心15min ；
b)小心吸取上清液加入到等體積的異丙醇中，充分混勻後_20°C靜置30min，12，000g，4°C離心 20min ；
c)充分棄上清後，加入75%DEPC-乙醇Iml，輕柔顛倒數次，12，000g, 4 °C離心IOmin ；
d)充分棄上清，室溫乾燥後，加入適量的DEPC水溶解沉澱，得到RNA樣品。
(2)製備cDNA樣品:將上一步得到的RNA樣品通過RNA逆轉錄反應得到cDNA:
逆轉錄的反應體系包括2 U 15 X AMV buffer、I U IlOmM each dNTP mixture(Takara 公司)、 0.1 AMV (Takara 公司)、0.25 y I RRI (Takara 公司)、3.75ul DEPC 水、0.5u I oligodT(Takara 公司)以及 2ul(lii g)RNA 樣品。反應步驟為 42°C 反應 60min，72°C孵育 IOmin0 (3)qRT-PCR:用 20ii I 體系進行 qRT-PCR，體系包括 13.4u I H2O, 2 U 110 X PCRbuffer (Takara 公司)，1.6 u 125mM MgCl2 (Takara 公司)，0.4 u IlOmM each dNTP mixture(Takara 公司)，I u I SYBR Green (Takara 公司)0.2 U I Taq 酶(Takara 公司)，0.4 U I 正反向引物(分另Ij為TGF- P 1、TGF- P 2、TGF- P 3和P -actin的正反向引物，見表I)(Invitrogen公司)，lyl 00嫩。所用的儀器是481 Prism7300螢光定量PCR儀，PCR的反應條件是:95°C、5min進行I個循環一95°C、15s，58°C、30s，72°C、30s進行40個循環一融解曲線。
(4)數據分析與處理:擴增結束後根據擴增曲線設定統一的閾值，隨後根據A ACT法處理數據，即:CT設為反應達到域值時的循環數，則TGF- ^ mRNA相對於標準內參3-actin的表達量可以用方程2-A CT表示，其中A CT=CT樣品-CT內參，結果見圖2-A。
2.Western blot
(I)蛋白樣品的製備:
a)在細胞或組織塊中加入適量的裂解液，若是組織則需在冰上研磨至組織破碎，然後在冰上適當超聲，12，000g，4°C離心15min ；
b)小心吸取上清，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，加入SDS-PAGE上樣緩衝液，100°C孵育5min，樣品保存在-20°C或_70°C中。
(2)制膠與電泳:
a)玻璃板對齊後放入夾中卡緊。然後垂直卡在架子上準備灌膠；
b)按配方配10%分離膠，加入TEMED後立即搖勻即可灌膠，然後膠上加一層無水乙醇封膠；
c)當分離膠凝好後，按照配方配製濃縮膠，將剩餘空間灌滿濃縮膠然後插入梳子。待月父凝固後開始電泳。
(3)轉膜與封閉:
a)將電泳完畢後的膠切割好，浸泡在轉膜緩衝液中；
b)將PVDF膜剪好，用甲醇活化15s，浸泡在轉膜緩衝液中；
c)按照(_)海綿一膠一膜一海綿(+ )的順序，做好夾板，按照300mA電流轉1.5h，整個過程要在冰上進行；
d)結束後取出膜，按照分子量大小將相應的條帶剪下，在5%的脫脂牛奶中封閉Ih0
(4)免疫標記及顯影:
a)按照1:1000的比例稀釋抗體，與膜在4°C共孵過夜；
b)取出膜用清洗緩衝液清洗4遍,每遍10_15min ；
c)按照1:2000的比例稀釋抗體，與膜在室溫下共孵Ih ；
d)按照比例混合發光底物，與膜共孵lmin，將膜放入暗盒中進入暗室曝光，結果見圖2-B。隨後運用Bandscan軟體對各個目的條帶進行灰度分析，結果見圖2-C。我們得出:在S180細胞中TGF-P I表達量最高。
表I
權利要求
1.包裹TGF-PIsiRNA的細胞微泡在製備抑制腫瘤的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的腫瘤為TGF-P表達較高的腫瘤。
3.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的TGF-PIsiRNA的反義鏈序列為SEQID N0.1。
4.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於所述的細胞微泡來源於細胞或組織的分泌。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於所述的細胞微泡來源於L929細胞的分泌。
6.一種抑制腫瘤的藥物，其特徵在於所述的藥物為包裹TGF-P IsiRNA的細胞微泡。
7.根據權利要求6所述的藥物，其特徵在於所述的腫瘤為TGF-P表達較高的腫瘤。
8.根據權利要求6所述的藥物，其特徵在於所述的TGF-PIsiRNA的反義鏈序列為SEQID N0.1。
9.根據權利要求6所述的藥物，其特徵在於所述的細胞微泡來源於細胞或組織的分泌。
10.根據權利要求 9所述的藥物，其特徵在於所述的細胞微泡來源於L929細胞的分泌。
全文摘要
本發明屬於生物技術領域，涉及一種含有TGF-β1siRNA的細胞微泡的應用。一種抑制腫瘤的藥物，所述的藥物為包裹TGF-β1siRNA的細胞微泡。包裹TGF-β1siRNA的細胞微泡在製備抑制腫瘤的藥物中的應用。本發明針對腫瘤中高表達的TGF-β1設計併合成其siRNA，轉染細胞後通過提取細胞分泌的包裹siRNA的microvesicles，經靜脈注射入皮下植瘤小鼠模型的體內，對小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制作用，使得RNAi在體內功能有效發揮提供了幫助，同時也為臨床上治療腫瘤及其他疾病提供支持。
文檔編號A61K47/46GK103212090SQ20131013709
公開日2013年7月24日 申請日期2013年4月18日 優先權日2013年4月18日
發明者曾科, 張亞琴, 李麗民, 顧宏偉, 朱地罕, 俞健雄, 張辰宇 申請人:南京大學