一種包含hcv和hiv核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法

2023-12-10 06:24:37 1

一種包含hcv和hiv核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法
【專利摘要】一種應用於生物醫學臨床診斷領域中的包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，該製備方法包括如下步驟：設計合成大腸桿菌噬菌體MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac?site的上下遊引物，以MS2噬菌體RNA作為模板，用上述引物進行RT-PCR擴增，最後將擴增產物連接到pMD18-T載體上進行測序，驗證克隆的正確性；提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac?site的pMD18-T質粒，使用NcoI和BamHI限制性內切酶將插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac?site片段分離下來，與經過NcoI和BamHI雙酶切後的pET-28b載體進行連接，得到連接產物。該發明製備的含有HCV和HIV-1RNA片段的假病毒顆粒方法簡單、容易操作、獲得的假病毒克隆純度高、是C型肝炎病毒和愛滋病核酸診斷試劑盒的工作標準品和質控品的理想原料。
【專利說明】—種包含HCV和Hl V核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及生物醫學臨床診斷領域中的一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法。
【背景技術】
[0002]C型肝炎和愛滋病是我國最為重視的兩種重大傳染病。其中C型肝炎是由C型肝炎病毒(Hepatitis C, HCV)誘發,愛滋病由人免疫缺陷病毒(Human ImmunodeficiencyVirus, HIV)誘發，這兩種病毒均為RNA病毒。HCV RNA和HIV RNA載量檢測對於病毒感染的早期診斷，以及抗病毒治療療效和病人治療效果評判，是一個非常重要的手段。目前，人們逐漸米用突光定量 RT-PCR 法(real time reaverse transcription PCR, RT-PCR)來檢測RNA病毒載量，此類方法靈敏度高，特異性強，動力學線性範圍寬，已經成為該類病毒RNA檢測的主要方式。由於裸露的RNA分子特別不穩定，因此使用螢光定量RT-PCR法檢測RNA病毒載量，必須要有嚴格的質量控制措施。很關鍵的一點就是要有高穩定性且無傳染性的RNA病毒標準品和質控品。目前，商業化的HCV和HIV螢光定量檢測試劑盒的標準品和質控品，主要包括裸露RNA片段，病毒顆粒以及人工假病毒顆粒(armored RNA)。裸露RNA片段容易受到環境中廣泛存在的核糖核酸酶(RNase)的降解，而且裸露的RNA標準品和質控品不能參與樣本的提取過程，因此導致定量結果偏差過大。用病毒顆粒作為標準品和質控品，其本身也不易降解，可是在試驗中應用病毒顆粒無疑增加了生物風險，並且對各種病毒顆粒操作和使用國家有嚴格的法規要求，這在無形中增加科研和生產的經濟成本，提高了分子診斷試劑的準入門檻。因此，研究開發一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法是目 前急待解決的新課題。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在於提供一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，該發明安全簡便，可同時用於實時螢光定量PCR檢測，該雙元假病毒顆粒具有耐核糖核酸酶、穩定性好，易於保存和運輸，對於C型肝炎病毒和愛滋病核酸診斷試劑盒的開發具有較強的實用價值。
[0004]本發明的目的是這樣實現的:一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，該製備方法包括如下步驟:
[0005](一)MS2成熟蛋白基因和包膜蛋白基因的克隆
[0006](I)設計合成大腸桿菌噬菌體MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的上下遊引物，上遊引物序列為 5』-CCATGG TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGC-』3 (SEQ N0.1);下遊引物序列為 5』 -GGATCC TGTCTTCGACATGGGTAATCC-』 3 (SEQ N0.2)；
[0007](2)以MS2噬菌體RNA作為模板，用上述引物進行RT-PCR擴增，最後將擴增產物連接到pMD18-T載體上進行測序，驗證克隆的正確性；[0008](二)假病毒表達載體pET_28b/MS2的構建
[0009](I)提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site的pMD18_T質粒，然後使用NcoI和BamHI限制性內切酶將插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac site片段分離下來，將其與經過NcoI和BamHI雙酶切後的pET_28b載體進行連接，得到連接產物；
[0010](2)將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆進行培養，然後提取質粒用NcoI和BamHI進行雙酶切鑑定，酶切結果能夠分離出1700bp左右片段的，為正確的陽性克隆;
[0011 ](三)雙元假病毒表達載體pET-28b/MS2/HCV+HIV的構建
[0012](I)以HCV5』 UTR和HIV-15』 LTR區域序列為製備假病毒的目標序列，其中HCV5』 UTR序列長度為230bp, HIV-15』 LTR序列長度為250bp ；
[0013](2)人工合成含有HCV和HIV-1的基因片段，片段序列為:
【權利要求】
1.一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，其特徵在於:該製備方法包括如下步驟: (一)MS2成熟蛋白基因和包膜蛋白基因的克隆 (1)設計合成大腸桿菌噬菌體MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pacsite的上下遊引物，上遊引物序列為 5』-CCATGG TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAGC-』3 (SEQ N0.1);下遊引物序列為 5』 -GGATCC TGTCTTCGACATGGGTAATCC」3 (SEQ N0.2)； (2)以MS2噬菌體RNA作為模板，用上述引物進行RT-PCR擴增，最後將擴增產物連接到PMD18-T載體上進行測序，驗證克隆的正確性； (二)假病毒表達載體pET-28b/MS2的構建 (1)提取上述含有MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pacsite的pMD18_T質粒，然後使用NcoI和BamHI限制性內切酶將插入的成熟蛋白基因+包膜蛋白基因+Pac site片段分離下來，將其與經過NcoI和BamHI雙酶切後的pET_28b載體進行連接，得到連接產物； (2)將上述連接產物轉化大腸桿菌DH5a，挑取陽性克隆進行培養，然後提取質粒用NcoI和BamHI進行雙酶切鑑定，酶切結果能夠分離出1700bp左右片段的，為正確的陽性克隆; (三)雙元假病毒表達載體pET-28b/MS2/HCV+HIV的構建 (1)以HCV5』UTR和HIV-15』 LTR區域序列為製備假病毒的目標序列，其中HCV5』 UTR序列長度為230bp，HIV-15』 LTR序列長度為250bp ； (2)人工合成含有HCV和HIV-1的基因片段，片段序列為:
5』-ATGGATCCCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCTAGGAAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTTAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGGGATCCAT-，3 (SEQ N0.3)，其中 CAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATCAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTG 為 HCV5，UTR 序列，其他為HIV-15』LTR序列； (3)使用BamHI限制性內切酶將上述片段進行酶切，然後將其正向連接進入經過BamHI酶切後的pET-28b/MS2載體中，得到連接產物； (4)將上述連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)中，挑取陽性克隆進行培養，然後提取質粒用BamHI和SacI進行雙酶切鑑定，將正向連接的克隆作為正確的陽性克隆； (四)誘導表達和純化 將上述含有pET-28b/MS2/HCV+HIV的陽性克隆接種在含卡那黴素的SOB液體培養基中振蕩培養過夜，在培養 基中添加IPTG來進行誘導表達；離心收集菌體,再進行超聲碎菌處理，將細菌破碎物在進行14000r/min離心20min，取上清轉移到另一乾淨離心管中；在上清中加入IOOU RNase A和50U DNase I酶，37°C消化lh，將消化後的產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢驗，核實上清液中的內源性DNA和RNA的是否消化徹底；將消化徹底的上清液貯存於_20°C條件下，這些上清液就是製備的含有HCV和HIV-1RNA的假病毒溶液。
2.如權利要求1所述的一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，其特徵在於:所述MS2噬菌體基因包含MS2成熟蛋白基因、包膜蛋白基因和Pac site位點。
3.如權利要求1所述的一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，其特徵在於:所述人工合成含有HCV和HIV-1的基因片段，該串聯的核苷酸片段被插入到假病毒表達載體Pac site位點下遊。
4.如權利要求1或3所述的一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，其特徵在於:所述人工合成HCV的核苷酸序列為SEQ N0.3 ;所述人工合成的HIV-1的核苷酸序列為SEQ N0.4。
5.如權利要求1所述的一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，其特徵在於:所述表達假病毒顆粒的菌種為大腸桿菌BL21 (DE3)，使用的表達載體為pET_28b0
6.如權利要求1所述的一種包含HCV和HIV核酸片段的人工雙元假病毒顆粒的製備方法，其特徵在於:所述 假病毒顆粒是由噬菌體外膜蛋白包裹HCV和HIV-1轉錄的RNA而成的。
【文檔編號】C12N7/04GK103789277SQ201410019868
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月16日 優先權日:2014年1月16日
【發明者】李望豐, 蔡一榮, 關爾鑫, 趙世源, 王丹, 肖樊, 周凱, 任旭 申請人:東北製藥集團遼寧生物醫藥有限公司