用於多肽重組表達的基於t7雙啟動子的載體系統的製作方法

2023-12-10 06:27:57

專利名稱：用於多肽重組表達的基於t7雙啟動子的載體系統的製作方法
用於多肽重組表達的基於T7雙啟動子的載體系統利用多種表達系統，可以在原核宿主系統中重組表達目的多肽。在大腸桿菌(E.coli)中廣泛使用T7-表達系統。克隆靶基因，使其處於T7啟動子的控制之下，該T7啟動子由T7RNA聚合酶識別而不由大腸桿菌RNA聚合酶識別。T7RNA 聚合酶是一種噬菌體-來源的聚合酶，其不內源存在於大腸桿菌中。然而，已經開發了表達 T7RNA聚合酶的大腸桿菌宿主細胞。一個實例是包含攜帶編碼T7RNA聚合酶的基因的λ噬菌體的大腸桿菌^在另一種系統中，T7RNA聚合酶基因被插入到宿主大腸桿菌染色體(例如，大腸桿菌菌株BL212)中。通常使用處於可誘導的啟動子的控制下的ρΕΤ表達系統。由Iac操縱子調控的Τ7 啟動子是目前最廣泛使用的可誘導的蛋白表達系統。在該系統中，Τ7啟動子和Iac操縱子位於要表達的多肽的5』。Iac抑制劑與Iac操縱子的結合防止由Τ7啟動子轉錄。在存在乳糖類似物IPTG時，IPTG結合Iac抑制劑並且使其從Iac操縱子上脫離。因此，在存在IPTG 的條件下，T7RNA聚合酶可以結合Τ7啟動子並且可以繼續轉錄目的基因。不幸的是，lac/IPTG調控的系統僅能夠在某些大腸桿菌菌株(例如，在BL21 中)使用。除大腸桿菌外多種原核細胞是適於重組多肽表達的宿主，例如，發光光杆狀菌 (Photorhabdus luminescens),銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),焚光假單胞菌 (Pseudomonas fluorencens)，豬霍舌L^少|、二氏菌(Salmonella choleraesuis)，古月蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora),根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)禾口類鼻痕伯克霍爾德氏菌(BurWiolderia pseudomalleri)。具有也可以用在其它宿主細胞諸如這些中的用於重組多肽表達的高度調控性系統將是有效的。當多肽對細胞是毒性的時，不管是由於其先天的特性還是由於其以大量存在的事實，在特定的原核宿主中生產某些多肽可能導致宿主死亡。對原核宿主細胞有毒性的多肽的實例是抗微生物肽(「AMP(s) 」)。由於其用作治療性抗生素的潛在用途，對抗微生物肽的興趣日益增多。常規抗生素已經成功地應用了大於一個世紀，並且廣泛地用於在人、動物和植物中的多種應用。儘管抗生素抗性是日益增加的問題，但是已經存在新抗生素開發的令人擔憂的下降。M因此，禁止先前的抗生素的沒有限制的和非必要的應用，諸如其用作家畜的食品添加劑。另外，在農業中常用的多種抗生素對人類消費具有副作用。為了克服常規抗生素的問題，需要新一代的抗生素。先天免疫性是幾乎所有活生物體的主要防禦5，並且是針對微生物的快速且多功能性的防禦。678大部分先天免疫性的抗微生物功能由小的陽離子肽介導，其具有針對革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌、真菌、寄生蟲、病毒，且在某些情形中，甚至針對哺乳動物細胞的有效活性。91°"這些天然產物AMPs是常規抗生素的潛在後繼者，因為其抗微生物機制基本上不同。12通過AMI^s快速殺死微生物病原體的主要機制歸因於微生物細胞膜的穿孔。⑶4因此，生物很難建立抗性。最有希望用於哺乳動物的AMPs是具有針對微生物而非哺乳動物細胞的強活性的那些AMPs。因此，動物來源的AMI^s將是替代常規抗生素的良好候選物。來源於牛奶中的牛乳鐵蛋白(Iactoferrin)的乳鐵蛋白素B(Lactoferricin B) (LfcinB)151617和來源於豬腸的
3天蠶素PKcecropin Pl)1819是這些AMI^s中的兩種，並且它們可以作為用於動物治療的備用抗生素。天然AMI^s具有寬泛的針對微生物的活性，但是有一些，諸如LfcinB，需要高濃度才能有效。AMPs的大規模應用是受限的，因為其製備可能是複雜的、費時的和成本高的。目前，通過化學合成生成AMI^s成本太高以致它們不能用作用於動物(例如有蹄動物、豬、魚或人)治療的備用抗生素。因此，在它們可以替代大規模的抗生素應用之前，需要工業規模的成本有效的AMP生產方法。因為AMI3S可以穿透細菌膜並且引起細胞裂解，所以難以直接在細菌細胞中生產它們。因此，尚沒有實現便利的且成本有效的細菌生產。因此，本發明的一個目的是提供一種用於多肽重組表達的系統，該系統可以在寬泛的宿主範圍中使用。在lac/IPTG調控的系統中的誘導依賴IPTG，IPTG對於工業應用是昂貴的。本發明還有一個目的是提供一種較目前使用IPTG的系統廉價的用於多肽重組表達的系統。本發明還有一個目的是提供一種高度可調控的用於重組表達的系統。本發明還有一個目的是提供一種改進的AMP生產方法，該方法是成本有效的且規模可至工業水平。因此，本發明提供一種用於寬泛宿主範圍可誘導表達目的多肽的雙載體系統，其包括i).第一載體，其包括(a)位於可誘導的啟動子的5』的T7啟動子；和(b)位於可誘導的啟動子的3』的克隆位點，其用於插入編碼所述目的多肽的基因；和ii).使得宿主細胞能夠進行T7RNA聚合酶表達的第二載體，其中所述載體包括處於可誘導的啟動子控制之下的編碼該T7RNA聚合酶的基因。在一些實施方案中，目的多肽是對原核宿主有毒性的多肽，例如，是人殺菌滲透性增加的蛋白出 1屍9或々1^。在另一個實施方案中，目的多肽是難以以非常高的水平表達的蛋白，例如，使用本領域已知的標準重組表達法，其在原核宿主中很難以非常高的水平表達。在優選的實施方案中，目的多肽是AMP。在一些實施方案中，AMP是GB-LfcinB或GB-天蠶素P1。在該系統中，除了處於T7啟動子的控制下，目的多肽還處於其它的可誘導的啟動子的控制下。這減少了多肽表達的可能的毒性作用，特別是當目的多肽是對原核宿主有毒性的蛋白時。因此，編碼該目的多肽的DNA由兩種RNA聚合酶轉錄T7RNA聚合酶和內源性宿主RNA聚合酶。這是我們所知的使用兩種獨立的RNA聚合酶轉錄基因的第一個系統。所述可誘導的啟動子優選地具有活性狀態和無活性狀態，在活性狀態下，RNA聚合酶可以結合該啟動子並且由該啟動子轉錄，並且在無活性狀態下，相同的RNA聚合酶不能由該啟動子轉錄。在一些實施方案中，可誘導的啟動子被阻抑物結合，此時啟動子處於其無活性狀態。接著，從啟動子上去除阻抑物使得可誘導的啟動子轉為其活性狀態。去除阻抑物可以通過用誘導物結合該阻抑物的方式進行。阻抑物可以是宿主細胞中內源表達的。備選地，宿主細胞可以轉化編碼該阻抑物的基因。在優選的實施方案中，編碼可誘導的啟動子的阻抑物的基因存在於本發明的第一載體和/或第二載體上。可誘導的啟動子優選是在寬泛宿主範圍內起作用的啟動子。四環素可誘導的啟動子，諸如Ptef°是特別優選的。使用四環素替代IPTG作為誘導物，能夠使得該系統用在寬泛的宿主範圍中，並且因為四環素比IPTG廉價，還導致較廉價的系統。實際上，目前，四環素或其衍生物(例如，四環素酐(anhydride-tetracycline)和多西環素(doxycycline)) 比IPTG便宜100多倍。另外，誘導所用的四環素的量比誘導所用的IPTG的量少100多倍。 因此，四環素的總成本比IPTG少至少IO4倍。在其它實施方案中，可以使用任何其它合適的可誘導的啟動子，例如，多西環素-調控的T7啟動子或可糖誘導的啟動子如Iac操縱子， BAD啟動子(可阿拉伯糖(arabinose)誘導的)或可鼠李糖(lihamnose)誘導的啟動子。然而，使用可糖誘導的啟動子引起兩個問題1)它們不像四環素誘導的啟動子那樣在寬範圍的細菌宿主菌株中起作用，和2)誘導物比四環素更昂貴。專業人員能夠確定對特定的宿主細胞所用的誘導物的量，如四環素或其衍生物的量。優選地，所述宿主細胞是原核細胞。當以高劑量使用，諸如3 μ g/ml細菌培養物使用時， 四環素或其衍生物對一些原核細胞有毒性。不同的原核菌株對四環素及其衍生物具有不同的抗性特性。通過檢測四環素及其衍生物，專業人員可以發現最適合用於特定原核菌株誘導的一種。因此，本發明以低於對宿主細胞有毒性所需要的最低劑量的劑量使用四環素或其衍生物。四環素或其衍生物的優選的量為0. 5-1 μ g/ml細菌培養物。克隆位點位於可誘導的啟動子的3』，用於插入編碼目的多肽的基因。可以通過任何合適的方法將編碼目的多肽的基因插入到克隆位點中。在一些實施方案中，克隆位點包括用於克隆編碼目的多肽的基因的兩個限制性位點。這兩個限制性位點可以是任何適當的限制性位點。優選使用在5』末端的保持核糖體結合位點距離的限制性位點，和在目的基因的ATG前的AT 二核苷酸。因此，EcoRV是用在5』末端的特別優選的限制性位點。對於在大腸桿菌中的肽表達，在ATG前存在AT 二核苷酸是特別優選的。可以用在3』末端的合適的限制性位點的實例是PvuII。在其它實施方案中，克隆位點包括可以用於使載體線性化的限制性位點。然後， 利用同源重組，例如，利用重組工程(recombineering)技術，可以將攜帶編碼目的多肽的基因和基因兩側的與載體同源的序列的線性DNA片段與已被線性化的載體組合，從而形成載體。在一些實施方案中，克隆位點包括與攜帶編碼目的多肽的基因的線性DNA片段同源的兩個區域，並且將該線性DNA片段通過同源重組插入到載體中，例如，利用重組工程技術。重組工程技術在本領域中是已知的，例如，參見，W099/29837，WO 01/04288, WO 02/062988 和 Wang J 等·2006，Μο1 Biotechnol.(分子生物技術)32 (1) :43-53 ；Muyrers, J. P. P.等· 2001，Trends in Biochemical Sciences (生物化學科學趨勢)，洸，325-31.)。 在克隆位點包括一個或多個限制性位點的實施方案中，所述一個或多個限制性位點優選不在載體的其它地方存在。在優選實施方案中，第一載體在克隆位點包含目的多肽。例如，在一些實施方案中，第一載體在兩個限制性位點之間包含目的多肽。在一些實施方案中，第一載體有利地包含位於克隆位點的3』的終止子序列。在克隆位點的3』存在終止子序列確保，當從T7啟動子發生轉錄時，其在終止子序列處終止，並且不超過該序列運行。因此，由於不存在無終止的轉錄，與不存在終止子序列時相比，終止子序列的存在導致蛋白表達效率的增加。在一些實施方案中，終止子是T7終止子。T7終止子的序列顯示在圖2中。優選地，第一載體包含盒(還已知為構建體)T7啟動子-可誘導的啟動子-克隆位點-終止子。更優選地，第一載體包含盒Τ7啟動子-Ptet-Ec0RV-[3，限制性位點]_T7 終止子。甚至更優選地，這些載體包含在克隆位點插入的編碼目的多肽的基因。這些載體還優選地包含編碼針對可誘導的啟動子的阻抑物的基因，所述阻抑物諸如tetR阻抑物。優選地，第一載體包含圖2或圖3所示的序列。更優選地，第一載體是圖2或圖3所示的質粒。第二載體用來確保宿主細胞能夠進行T7RNA聚合酶表達。優選地，編碼T7RNA聚合酶的基因包括GenBank No. M38308提供的序列或由其組成，更優選地如圖7所示，或者編碼具有M38308所提供的序列的T7RNA聚合酶，更優選地如圖8所示。在一些實施方案中，編碼 T7RNA聚合酶的基因是M38308或圖7所示的序列的變體，例如，其與M38308或圖7所示的序列有至少70 %，至少80 %，至少90 %，至少95 %，至少98 %，至少99 %的同一性，並且編碼功能性T7 RNA聚合酶。蛋白之間的同一性優選地通過在MPSRCH程序(Oxford Molecular) 中實施的史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法確定，用下列參數缺口開放罰分=12和缺口延伸罰分=1，用仿射缺口(affine gap)搜索進行。在一些實施方案中， 編碼T7RNA聚合酶的基因編碼M38308或圖8的T7RNA聚合酶的片段或變體。例如，編碼T7 RNA聚合酶的基因可以是M38308或圖7所示的序列的片段或其變體，其中所述片段編碼功能性T7 RNA聚合酶。例如，所述片段至少2100個核苷酸長，至少MOO個核苷酸長，至少 2700個核苷酸長，至少2772個核苷酸長，至少觀00個核苷酸長，至少觀12個核苷酸長，或至少觀18個核苷酸長。編碼T7 RNA聚合酶的基因處於可誘導的啟動子的控制下。這確保僅在所述可誘導的啟動子處於其活性狀態時，編碼T7 RNA聚合酶的基因轉錄並且隨後表達，並且與組成型表達T7 RNA聚合酶的系統相比，有利地產生另外的調控水平。在一些實施方案中，在第二載體上的可誘導的啟動子與在第一載體上存在的可誘導的啟動子相同。在其它實施方案中，第二載體上的可誘導的啟動子與在第一載體上存在的可誘導的啟動子不同。使編碼T7 RNA聚合酶的基因和編碼目的多肽的基因處於相同可誘導的啟動子的控制下有利地確保目的多肽的表達由該可誘導的啟動子的特定狀態高度調控。在兩種載體中使用相同的可誘導的啟動子還在所述可誘導的啟動子處於活性狀態時導致目的多肽的迅速轉錄和隨後的表達。優選地，在兩種載體中的可誘導的啟動子的誘導物是四環素或其衍生物。在第一和第二載體上存在的盒可以通過任何適當的方法保留在宿主細胞中。例如，每種載體可以包含在宿主細胞中有功能的複製起點，或者所述盒可以通過整合到宿主染色體中或整合到內源性移動載體中而保留在宿主細胞中。第一載體包含T7啟動子-可誘導的啟動子-克隆位點的盒的部分可以通過與第二載體包含編碼受控於可誘導的啟動子的T7 RNA聚合酶的基因的部分不同的機制保留在宿主中。在第一載體中的複製起點可以與第二載體中的複製起點相同或不同。複製起點可以是任何合適的起點，諸如質粒起點或噬菌體起點。在一些實施方案中，所述複製起點在宿主細胞中是有功能的。例如，在一些實施方案中，第一載體包含在宿主細胞中有功能的複製起點，如colEl ori。在一些實施方案中，第二載體包含在宿主細胞中有功能的複製起點，因此，載體保留在宿主細胞中，並且由該載體表達T7 RNA聚合酶。然而，在優選實施方案中，第二載體中的複製起點在能夠進行T7RNA聚合酶表達的宿主細胞中是無功能的。這確保第二載體不在宿主細胞中複製，所述載體預定使得所述宿主細胞能夠進行T7 RNA聚合酶表達，以致保持包含編碼T7 RNA聚合酶的基因的區域存在於兩個反向重複區(「IR(s) 」)之間需要將該區域整合在宿主染色體中。可以使用在宿主細胞中無功能的任何適當的複製起點。然而，優選地，該起點在其它細胞中是有功能的， 以致在用於本發明之前，可以製備所述載體和/或可以複製並且保存所述載體。在一些實施方案中，第二載體中的複製起點是R6K複製起點。R6K複製起點需要pir蛋白21進行複製，並且可以構建第二載體，並在用於本發明的宿主細胞之前保存在表達Pir蛋白的另一種細胞中。然而，具有ori R6K作為唯一的複製起點的載體不在不表達pir蛋白的細胞中複製。在第二載體中可以使用任何其它適當的複製起點，例如，RK2。22在一些實施方案中，第二載體中的複製起點是位於在反向重複之間的包含編碼 T7RNA聚合酶的基因的區域中。有時，確定盒整合在宿主染色體中的位置是合乎需要的。進行此的簡單方式是製備基因組DNA，用一種限制性酶消化，然後連接並轉化到pir菌株中以拯救包含R6K ori的載體。現在，該載體將包含其所整合的部分基因組DNA。通過測序接頭 (junction)，人們可以找到在染色體中的整合位置。因此，複製起點存在於反向重複之間是有利的，因為這使得更加容易地通過質粒拯救檢測插入位置。編碼T7 RNA聚合酶的基因優選地位於轉座酶識別的兩個反向重複區之間，以使在該兩個反向重複之間的序列通過轉座酶整合到染色體中。可以使用被轉座酶識別的任何適當的反向重複區。由MycoMar轉座酶識別的適當的反向重複區的實例為5』ACAGGTTGGCTGA TAAGTCCCCGGTCT. . . AGACCGGGGACTTATCAGCCAACCTGT 3，。優選地，轉座酶的表達是瞬時的，以致一旦反向重複盒區已經整合到宿主染色體中，轉座酶便不再表達。在一些實施方案中，轉座酶由第二或第一載體編碼。在優選的實施方案中，編碼轉座酶的基因存在於第二載體中，但是不存在於在兩個反向重複之間的包含編碼T7 RNA聚合酶的基因的區域中。這確保編碼轉座酶的基因不整合到宿主細胞染色體中。可以使用任何適當的轉座酶。在一些實施方案中，所述轉座酶是MycoMar轉座酶23。在一些實施方案中，第一和/或第二載體有利地包含選擇基因。兩種載體優選地都包含選擇基因。在第一載體上的選擇基因優選地不同於第二載體上的選擇基因。在第二載體中的選擇基因優選地位於兩個反向重複之間，在存在的情形中，位於包含編碼T7 RNA 聚合酶的基因的區域中，以便可以選擇已將該區域整合到其染色體中的宿主細胞。可以使用任何適當的選擇基因，例如，抗生素抗性基因諸如慶大黴素(gentamycin)抗性、新黴素 (neomycin)抗性、氨苄青黴素(ampicillin)抗性或潮黴素(hygromycin)抗性的基因，或宿主互補基因。選擇基因優選是可去除的，特別在盒整合到宿主染色體中的情形中。例如，選擇基因可以側連用於切除該選擇基因的位點。在一些實施方案中，可以用來切除選擇基因的位點為IoxP位點，例如，突變的IoxP位點(IoxP*)，優選1οχ66和71。24在選擇基因側連 IoxP位點的實施方案中，在整合後可以利用Cre重組來去除選擇基因。M因此，在優選的實施方案中，第二載體包括側連突變的IoxP位點的選擇基因的去除，並且其中選擇基因位於在反向重複之間的包含編碼T7RNA聚合酶的基因的區域中。在一些實施方案中，第二載體包含盒IR_[複製起點]-1οχΡ*-[選擇基因]-l0XP*-tetR-Ptet-T7RNAp0l-IR。該載體優選地還包含編碼轉座酶的基因，其中所述轉座酶不存在於在兩個反向重複之間的包含編碼T7RNA聚合酶的基因的區域中。在優選的實施方案中，第二載體包含盒IR-oriR6K-loxP*-genta-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol-IR。優選地，第二載體是

圖1所示的質粒。在一些實施方案中，T7啟動子緊接著可誘導的啟動子的5'，從而在它們之間沒有間插序列。兩個限制性位點這樣放置，以使編碼目的多肽的基因的轉錄可以從T7啟動子和從PTet發生。在一些實施方案中，克隆位點(例如，這兩個限制性位點)緊接著可誘導的啟動子的3』，從而在它們之間沒有間插序列。此外，在一些實施方案中，T7終止子序列緊接著克隆位點的3』，從而在它們之間沒有間插序列。在備選實施方案中，間插序列存在於T7 啟動子和可誘導的啟動子之間和/或存在於克隆位點和可誘導的啟動子之間和/或存在於 T7終止子序列和克隆位點之間。在存在間插序列的實施方案中，優選地所述間插序列長度小於400bp，長度小於250bp，長度小於lOObp，長度小於50bp，長度小於20bp，長度小於5bp 或長度小於:3bp。T7啟動子和T7終止子的序列顯示在圖2，3A和中和在它們的描述中。用於本發明的載體可以是可以用來轉化宿主細胞、優選轉化原核宿主細胞的任何適當的載體。在一些實施方案中，第一和/或第二載體是質粒載體。在一些實施方案中，第一和/或第二載體是噬菌體載體。在一些實施方案中，第一載體是質粒載體且第二載體是噬菌體載體。在一些實施方案中，第一載體是噬菌體載體且第二載體是質粒載體。目的多肽可以是融合蛋白的一部分。特別優選的目的蛋白是目的多肽與內含體蛋白或與形成晶體的內含體蛋白的融合體。形成晶體的內含體蛋白以規則的結構形式聚集。目的多肽結合到內含體中允許表達該目的多肽，同時掩蔽所述多肽對宿主細胞的任何潛在的毒性作用。例如，如果目的多肽具有抗生素活性，則與內含體蛋白融合掩蔽所述抗生素活性。如果目的多肽對宿主細胞有毒性，例如，如果其是AMP，這是特別有利的。當毒性活性被掩蔽時，本發明提供的系統允許獲得非常高水平的目的多肽的表達。因此，本發明的系統可以用來以工業規模製備AMPs。適合用於本發明的內含體蛋白的實例是來自發光光杆狀菌、嗜線蟲致病桿菌 (Xenorhabdus nematophilus)禾口蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的晶體蛋白。
25形成晶體的內含體蛋白是特別優選的內含體蛋白融合配偶體。可以使用任何適當的形成晶體的內含體蛋白。可獲自光杆狀菌屬或致病桿菌屬(Xenorhabdus)的這些是良好的實例，因為它們以非常高的水平表達。另外，它們天然聚集形成不溶解的粒子，並且通過收集它們的內含體非常容易純化。在優選的實施方案中，所述形成晶體的內含體蛋白是光杆狀菌屬CipB。％該100個胺基酸的小蛋白可以在細胞中累積至多至總蛋白的40%。27本發明人已經發現，使用本發明的雙載體系統，當多肽與CipB融合時，獲得非常高水平的目的多肽表達。在一些使用CipB的實施方案中，多至70%的總蛋白包括該多肽。在其它實施方案中，可以使用任何其它適當的形成晶體的內含體，諸如光杆狀菌屬CipA27或嗜線蟲致病桿菌PixA28。也可以使用內含體蛋白的片段和變體，其中所述片段或變體保留全長或天然序列蛋白的功能，只要到其形成內含體的程度。內含體蛋白優選地融合在目的多肽的5』。在優選實施方案中，內含體蛋白通過可裂解的接頭與目的多肽融合，所述可裂解的接頭允許從該內含體蛋白快速而簡單的釋放目的多肽。在優選實施方案中，所述可裂解的接頭是在內含體蛋白和目的多肽的N端之間的 Asp-Pro 二肽接頭。所述Asp-Pro 二肽接頭可以使用HCl裂解29。在其它實施方案中，可以使用任何其它適當的可裂解的接頭。因此，在目的多肽具有毒性活性的實施方案中，例如，在目的多肽對宿主細胞有毒性的情形中(例如，在其為AMP的情形中)，目的多肽結合到內含體中允許沒有毒性活性的非常高水平的表達，並且還允許快速簡單的純化。因此，第一載體優選地包含盒5』-T7啟動子-可誘導的啟動子-融合在編碼目的多肽的基因5』的編碼內含體蛋白的基因-終止子_3』。本發明的系統的應用還有利地允許在工業上便利的原核宿主中表達AMPs，而不幹擾宿主的生長。因此，本發明提供編碼融合蛋白的多核苷酸，該融合蛋白包含與目的多肽融合的形成晶體的內含體蛋白。已經發現，在本發明的系統中，與較長的多肽相比，短的多肽可以以更高的產量表達。因此，在優選實施方案中，目的多肽長度小於500個胺基酸，例如，長度小於200個胺基酸，小於150個胺基酸，小於100個胺基酸，小於80個胺基酸，小於60個胺基酸，小於50個
胺基酸，小於30個胺基酸或長度小於20個胺基酸。優選地，目的多肽是AMP。可以使用的AMPs的實例是乳鐵蛋白素B或天蠶素P1。 本發明提供與天然AMP序列相比在其5』末端具有另外的脯氨酸的AMPs。脯氨酸的存在是融合蛋白中的Asp-Pro 二肽接頭的裂解的人為產物。本發明人已經發現，令人驚訝地，該5』 脯氨酸的存在不影響AMP的抗生素活性。可以用在本發明中並且由本發明提供的目的多肽的一個具體實例是乳鐵蛋白的 GB-LfcinB 衍生物，其具有序列PAWH(CWRWQWRWKKLGA。本發明還提供與上述形成晶體的內含體蛋白融合的目的多肽。還提供的是如上述的第一載體或第二載體。本發明還提供用於表達目的多肽的方法，所述方法包括(i).用本發明的第一載體轉化宿主細胞，其中所述宿主細胞包含處於可誘導的啟動子控制下的T7RNA聚合酶；和(ii).為所述宿主細胞提供所述可誘導的啟動子的誘導物。優選地，所述T7 RNA聚合酶處於與第一載體中存在的可誘導的啟動子相同的可誘導的啟動子的控制下。宿主細胞可以已經包含T7 RNA聚合酶。備選地，可以必要地為所述細胞提供T7 RNA聚合酶，並且因此，用於表達目的多肽的方法可以包括(i).用本發明所述的第一載體和本發明所述的第二載體轉化宿主細胞，和(ii).為所述宿主細胞提供所述可誘導的啟動子的誘導物。所述第一和第二載體可以同時或以任何順序轉化到宿主細胞中。例如，第一載體可以在第二載體之前轉化到宿主中。備選地，第二載體可以在第一載體之前轉化到宿主中。在轉化宿主細胞之後，宿主細胞優選地生長至適宜的細胞密度，然後加入可誘導的啟動子的誘導物。適宜的細胞密度是這樣的密度，即在該密度下，存在足夠的細胞，從而以所需要的水平表達目的多肽。在一些實施方案中，適宜的細胞密度在0D600 0. 4至0D600 2. 0之間，例如，0D600 0. 7。細胞優選地生長至終濃度0. lmg/ml-1. 5mg/ml，更優選地約0.5mg/ml，然後加入誘導物(優選四環素)。然後，在用第一(並且，在一些實施方案中，第二)載體轉化後允許生產目的多肽的適當時間後，例如，12-20小時，更優選約16 小時後，可以收穫細胞。在目的多肽融合到內含體蛋白上的實施方案中，內含體蛋白的存在使得在蛋白表達後目的多肽結合到內含體中。因此，為了純化目的多肽，所述方法可以另外包括下述步驟純化包含融合蛋白的內含體並且裂解在內含體蛋白和目的多肽之間的可裂解的接頭， 從而釋放目的多肽。例如，在可裂解的接頭是Asp-Pro 二肽接頭的實施方案中，所述方法可以包括向宿主細胞中加入HC1，以裂解所述接頭。裂解步驟優選地在收穫細胞後進行。以適當的濃度加入HCl到細胞中，以裂解接頭。有利地，加入HCl還起裂解細胞的作用，這在一個單一的步驟中導致目的多肽從內含體蛋白上裂解下來並且目的多肽從宿主細胞的釋放。 在一些實施方案中，使用0. 05-0. 2N HCl裂解細胞。優選使用0. IN HCl0使用HCl的溫育期間取決於所用的HCl的濃度而不同。要用的溫育時間將是專業人員所清楚的。優選地， 將細胞用HCl (優選地用0. IN HCl)在較高溫度下溫育足以裂解接頭並且裂解細胞的時間階段。在一些實施方案中，將細胞用HCl在70°C -95°C的溫度下溫育約30分鐘至4小時。 優選在約85°C約2小時的溫育時間。所述方法還可以進一步包括層析步驟，以在其從宿主細胞釋放後進一步純化目的多肽。所述宿主細胞可以是原核的或真核的。優選地，所述宿主細胞是原核的。在第二載體中的複製起點是R6K的實施方案中，所述宿主細胞優選不表達pir蛋白。在一些實施方案中，所述宿主細胞選自大腸桿菌K12，大腸桿菌Mssle 1917，光杆狀菌屬，假單胞菌屬(Pseudomonas), 土壤桿菌屬(Agrobacterium),粘球菌屬(Myxococcus)禾口伯克霍爾德氏菌屬(BurWiolderia)。例如，所述細胞可以是發光光杆狀菌(Photorhabdus luminescens)，f同參錄單 1 (Pseudomonas aeruginosa), 5 7 IixIfi lif (Pseudomonas fluorencens),根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或類鼻疽伯克霍爾德氏菌 (Burldiolderiapseudomalleri)。在一些實施方案中，所述宿主細胞是豬霍亂沙門氏菌 (Salmonella choleraesuis)或胡蘿蔔軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)。在其它實施方案中，所述宿主細胞是釀酒酵母(S. cerevisiae)。本發明還提供一種試劑盒，其包括本發明所述的第一載體和本發明所述的第二載體。如上文提及，目的多肽優選是對原核宿主有毒性的多肽，諸如AMP。本發明的系統有利地允許AMPs以大量生產，以致其可以用於工業應用。最近，歐盟(European Union)已經禁止用常規抗生素治療動物。因此，由於細菌感染引起的動物損失再一次成為農民的主要問題。對於小豬培育存在特定的問題。在用母乳餵養一個月後，小豬與其母親分離，並且與其它小豬一起開始正常飲食。此時，小豬面臨一些壓力沒有母親，沒有母乳，新的夥伴和新的食物。一些小豬在這些壓力下生病，體重減輕，並且在最初的10天之內死亡。小豬的主要問題是由微生物感染引起的腹瀉。這段時期是最危險的時期，並且治療小豬的常規方法是給予抗生素數天。對於為小豬尋找抗生素的替代品存在緊急需求，因為EU即將不允許農民使用常規抗生素。
同樣地，由傳染病引起的魚類損失也是全世界水產業的重要問題。抗微生物肽保護魚類抵抗由魚類病原體引起的感染的能力正在研究中，並且早期結果揭示AMR保護魚類抵抗感染的潛力。3°但是，在這些肽可以用於魚類養殖之前，這些肽的製備成本必須減少。這些應用，以及其它的應用，需要成本有效的、工業規模的、生產方案。本發明的方法首次允許AMPs的大規模生產，這使得AMPs能夠大規模用在農業和水產業中，這在本發明之前是不可能的。因此，本發明提供用於治療或預防動物中的細菌感染的方法，所述方法包括使用由本發明的系統生產的AMP。在一些實施方案中，所述動物是人類或其他哺乳動物， 諸如動物幼崽，例如小豬或小牛，特別是已經離開母親的那些動物幼崽。具體地，本發明提供用於治療或預防小豬中的細菌感染的方法，所述方法包括施用GB-LfcinB或GB-天蠶素Pl。優選地，小豬是在過去10天內，更優選在過去5天內，更優選在過去1或2天內，離開其母親的那些小豬，或例如是將在未來1-10天內離開其母親的那些小豬。所述細菌感染優選是大腸桿菌感染。使用AMP優選地預防小豬的腹瀉和/或導致小豬體重增重。優選地，將Img GB-LfcinB或GB-天蠶素Pl以單一劑量施用給小豬。備選地，可以以單一劑量施用0. 5-2mg或2-;3mg。在一些實施方案中，2mg或多於^iig以單一劑量給予，例如，3-5mg，5-8mg或8-lOmg以單一劑量給予。在一些實施方案中，僅給予單一劑量。在其它實施方案中，每隻小豬給予多次劑量，例如，以連續每天給予或每隔一天給予。在其它實施方案中，所述動物是魚類。在優選的實施方案中，提供用於治療或預防魚類中細菌感染的方法，所述方法包括向所述魚類遊動的水中添加通過本發明的方法產生的AMPs。在一些實施方案中，治療或預防魚類中的細菌感染包括向所述魚類遊動的水中添加至少0. Img,至少0. 5mg,至少Img,至少2mg,至少5mg,至少500mg,至少Ig,至少5g,至少 IOg,至少50g,至少IOOg,至少300g,至少500g,至少750g,至少Ikg,至少2kg的量的AMPs。 優選地，向水中添加AMP獲得至少0. OOlmgAMP/升，至少0. Olmg/升，至少0. Img/升，至少 Img/升，至少IOmg/升，至少IOOmg/升，至少500mg/升，或至少Ig/升的濃度。在魚類存在的水是湖泊、池塘、河流、海洋、大洋、或其它巨大的水體的一部分的實施方案中，製備大量的AMPs的能力是特別有利的。然而，所述方法還適用於治療或預防在其它水體如在盆或桶中存在的魚類中的細菌感染。專業人員能夠根據存在的水的體積，AMP在該體積的水中分散的潛能，特定的AMP的功效和存在的魚類的數目，來確定加入多少AMP。AMI^s還具有作為食品防腐劑的潛能，並且因此，本發明提供由本發明方法生產的 AMP用作食品防腐劑的應用。優選地，將AMP加入到食品中，以獲得至少0. OOOlmg AMP/cm3 食品，至少0. OOlmg AMP/cm3食品，至少0. Olmg AMP/cm3食品，至少0. Img AMP/cm3食品，至少lmgAMP/cm3食品，或至少5mg AMP/cm3食品的濃度。本發明還提供本發明的AMPs在這些方法的任一種中的應用。現在，將參考下述附圖，通過實施例，進一步描述本發明，在所述附圖中圖1 通用的T7 RNA聚合酶表達系統；圖2 寬泛宿主範圍的可誘導表達的載體；顯示了 T7啟動子的序列 (TAATACGACTCACTATA)，Ptet 啟動子序列(GTTGACACTCTATCATTGATAGAGTTATTTTACCACTCCCT ATCAGTGATAGAGAAAAGTGAA)和 T7 終止子序列(CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAG GGGTTTTTG)。為清楚起見，在圖2中所示的註解的序列又用純文本形式顯示；圖3A和3B.作為在微生物中進行AMP表達的實例的GB-天蠶素Pl。與AMP (此處GB-天蠶素 Pl :TCTTGGCTGTCCAAAACCGCGAAAAAACTGGAAAACTCTGCGAAAAAACGTATCTCCGAAGGTA TCGCGATCGCGATCCAGGGTGGTCCGCGT)融合的 CipB 基因(ATGATAATTAAGAAAGATATTTTGTTAAATGAAGAGCTGATTGTCGATGATGATCTTAAAGTGGGTA AAGTAGAGAAGGTCAATATTGATATTCTGTCACCCAGCTCAGTCATTGTTAGTCTGAATATTTTAGGCGTAGTTGA TGATTTTCATCTATTACTAGTTGATGATAAAGATAAAGATAAGATTGTGCTGCTCTATCTTTCTCTTTTACGTGT TCTTCATGAAAAATTAGATGTAAAAGTAAAAGTCGCAAAAAGTAAACTTACTAAGATAAAATATATAGTAGGTGT TGAAATT)處在四環素調控的T7+Ptet啟動子的控制下。兩個胺基酸，D-P (粗體，GACCCG)， 位於在CipB和AMP之間的編碼序列中。為清楚起見，在圖3A中所示的註解的序列又在圖 :3B中以純文本形式顯示；圖 4 在染色體中具有 oriR6K-loxP*-genta-loxP*-tetR-Ptet_T7RNApol 盒的大腸桿菌中表達AMPs ；圖5 由配偶體CipB釋放AMPs ；圖6 在用大腸桿菌攻擊後小豬的體重。將未進行任何處理的宰殺的小豬的體重作為基線(0)。標記1-5(即1-5 「天」)意指在第33天(在攻擊和AMPs後5天)測量的體重，標記6-11意指在第39天(在攻擊和AMPs後11天)測量的體重。標記1_11表示增加的平均體重；圖7 :T7RNA聚合酶核苷酸序列(編碼序列和核糖體結合位點)；和圖8 :T7 RNA聚合酶胺基酸序列。實施例1 構建通用Τ7 RNA聚合酶表達系統第一載體由四環素調控的啟動子表達Τ7聚合酶。該載體是基於R6K起點的質粒， 並且僅可以在存在Pir蛋白的條件下複製。當將其轉化到不存在pir的任何宿主中時，由於作用在反向重複(IRs)上的TPase (MycoMar轉座酶(MycoMar Transposase))介導的轉座作用，IR-oriR6K-loxP*-genta-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol-IR 盒將整合到染色體中。M 具體地，T7 RNA聚合酶由四環素可誘導的啟動子Ptet驅動。利用IR(反向重複盒通過由編碼的轉座酶(Tpase，其未被整合)介導的轉座作用進行染色體整合。在IRs之間，除了 T7基因，還存在下述特徵ori R6K，其需要pir蛋白進行複製；慶大黴素抗性基因，其用於進行整合選擇並且側連突變的IoxP*位點(1οχ66和71)，該位點可以用於切下慶大黴素抗性基因，以使慶大黴素可以再次用於宿主選擇；和四環素阻抑物(tetR)基因。儘管本實施例使用慶大黴素抗性基因進行舉例說明，但是在該載體中可以使用任何選擇基因。已經通過該載體轉化了大腸桿菌K12，大腸桿菌Nissle 1917，光杆狀菌屬，假單胞菌屬，土壤桿菌屬，粘球菌屬和伯克霍爾德氏菌屬。在四環素誘導之後，T7 RNA聚合酶可以在這些轉化體中表達。第二載體是攜帶目的基因(S卩，CipB-AMP融合體；圖3)的質粒。該基因在雙重即 T7和Ptet雙重啟動子下克隆，其由四環素雙重調控，一個是通過四環素誘導T7聚合酶，一個是直接通過四環素阻抑物(TetR)的去阻遏作用。我們發現，該雙重啟動子是高度可誘導的並且非常強。具體地，如圖所示，將T7啟動子插入到Ptet前方。在啟動子末端有兩個用於克隆目的基因的限制性位點，然後是用於轉錄終止的T7終止子。當表達載體轉化到由圖1所示的構建體的整合產生的細菌菌株中時，目的基因由於T7RNA聚合酶基因和Ptet被 tetR阻抑而沉默。在加入四環素後，對兩個啟動子進行抑制去除，並且T7啟動子由T7聚合酶激活，導致大量的誘導。用於外源基因表達的這一系統比常規T7表達系統具有一些優點1，T7 RNA聚合酶處在更可控的啟動子-可四環素誘導的啟動子的控制下；2，所述可四環素誘導的啟動子是寬泛範圍的啟動子，並且可以用於多種細菌菌株；3，誘導物，即四環素，比IPTG便宜超過 IO4倍，因此可以以工業規模使用。實施例2 融合蛋白的結構和表汰使用圖2所示的表達載體已經克隆和表達了超過20種AMPs。圖3顯示在克隆 CipB-AMP (此處為GB-天蠶素Pl)融合蛋白基因後的一個這樣的實例。我們已經在大腸桿菌K12、大腸桿菌nissle和光杆狀菌屬中使用了這一 AMP表達系統。理論上，其可以在所有細菌菌株中使用。為了在純化內含體後由CipB釋放AMP，兩個胺基酸Asp-Pro位於CipB和AMP之間。這允許通過HCl消化由CipB釋放AMP31，HCl消化還具有使得該AMP激活步驟簡單、便宜和易於以工業生產規模進行的優點。在大腸桿菌(圖4)和光杆狀菌屬(數據未顯示)中獲得融合蛋白的可誘導表達。 誘導前-；四環素誘導後+。泳道1和2是GB-天蠶素Pl ；泳道3和4是GB-Buforin II，其來源於中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans)；泳道5和6是GB-LfcinBl。為了誘導，將四環素加入到生長至0D600 0. 7的大腸桿菌中至終濃度0. 5 μ g/ml，並且在16小時後收集細胞。將來自大腸桿菌細胞裂解物的蛋白提取物加載在SDS-PAGE上。在圖4中，在誘導後獲得多至總細胞蛋白70%的CipB-AMPs的表達。這驗證了兩種策略(i)通過與CipB融合使AMP失活；和(ii)使用雙重啟動子，以非常高的水平可誘導性表達蛋白。在收穫含有CipB-AMP內含體的細菌細胞後，將細胞直接溶解在0. INHCl中進行消化。圖5顯示，在85°C用0. IN HCl處理2小時後，AMPs可以從CipB釋放。將在 0. IN HCL中的細菌細胞在85°C溫育2小時。在0. 5小時、1. 0小時和2小時取出樣品進行 SDS-PAGE檢驗。樣品1，2和3為圖4中的泳道2，4和6。樣品1為GB-天蠶素P1，樣品2 為GB-Buforin II和樣品3為GB_LfcinB。釋放的AMPs可以通過層析步驟進一步純化。儘管在生物合成的AMPs的開頭總有脯氨酸，但是其不幹擾AMPs的活性。在體外檢測具有和不具有第一脯氨酸殘基的一些合成的AMI^s對大腸桿菌Nissle 1917的殺傷。數據支持在所檢測的AMPs中，在具有脯氨酸的AMPs和不具有脯氨酸的AMPs之間沒有區別。 通過這一系統表達了多於20種AMPs。實施例3 小豬的攻擊實驗AMPs GB-天蠶素Pl (GB-Ce Pl)和GB-乳鐵蛋白素B(LfcinB15)用在小豬攻擊實驗中。· GB-天蠶素 Pl (GB-Ce Pl)天蠶素18』19是由31個胺基酸組成的多肽，並且其序列為SW LSK TAK KLE NSA KKR ISE GIA IAI QGG PR (Ser-Trp-Leu-Ser-Lys-Thr-Ala-Lys-Lys-Leu-Glu-Asn-Ser-Ala-Ly s-Lys-Arg-IIe-Ser-Glu-Gly-IIe-Ala-IIe-Ala-IIe-Gln-Gly-Gly-Pro-Arg)。GB-Ce Pl是加上一個脯氨酸的天蠶素Pl，並且具有序列PSW LSK TAK KLE NSA KKR ISE GIA IAI QGG PR。
· GB-LcfinB乳鐵蛋白素B(LfcinB)通過胃蛋白酶消化牛的乳鐵蛋白(Lf)而分離。在胃蛋白酶消化後分離的肽LfcinB具有比Lf好得多的抗微生物活性。LfcinB是由牛Lf的胺基酸17 至胺基酸41的25個胺基酸的序列。因此，LfcinB具有序列n(CRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF ( Phe-Lys-Cys-Arg-Arg-Trp-Gln-Trp-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Gly-Ala-Pro-Ser-Ile-Thr-Cy s-Val-Arg-Arg-Ala-Phe)。更近地，發現 LfcinB 的前 15 個胺基酸(FKCRRWQWRMKKLGA)是活性區。儘管來自其它生物體的乳中包含相似的LfcinB肽，但是來自牛的這種(LfcinB)具有針對細菌、真菌、甚至是病毒的最強的活性。LfcinB具有中等針對微生物的活性(MIC在 12-100 μ g/ml之間)。通過改變LfcinB中的一些胺基酸，其它LfcinB衍生物具有比原始 LfcinB肽更好的活性32。GB-LfcinB是通過按照活性預測交換胺基酸產生的肽。33在第一位的脯氨酸通過生物合成步驟產生。因此，GB-LfcinB的序列是PAWFKCWRWQWRWKKLGA。使用表1所述的實驗流程將GB-天蠶素Pl和GB-LfcinBl用於動物實驗。表1動物攻擊實騎
權利要求
1.用於寬泛宿主範圍的可誘導表達目的多肽的雙載體系統，所述雙載體系統包括 i).第一載體，其包括(a)位於可誘導的啟動子的5』的T7啟動子；(b)位於可誘導的啟動子的3』的克隆位點，其用於插入編碼所述目的多肽的基因；和 ).使得宿主細胞能夠進行T7 RNA聚合酶表達的第二載體，其中所述載體包括處於可誘導的啟動子控制之下的編碼所述T7RNA聚合酶的基因。
2.根據權利要求1的系統，其中在所述第一和/或第二載體中的所述可誘導的啟動子是四環素誘導啟動子Ptet。
3.根據權利要求1或權利要求2的系統，其中所述第二載體另外包含可去除的選擇基因和在宿主細胞中無功能的複製起點。
4.根據權利要求1-3中任一項的系統，其中所述第二載體包含盒oriR6K-loXP*-gent a-loxP*-tetR-Ptet-T7RNApol，其位於由轉座酶識別的兩個反向重複區之間。
5.根據權利要求1-4中任一項的系統，其中所述第一載體包含位於所述克隆位點3』的 T7終止子序列。
6.根據權利要求1-5中任一項的系統，其中所述第一載體包含已經插入到所述克隆位點的目的多肽。
7.根據權利要求6的系統，其中所述目的多肽與內含體蛋白融合。
8.根據權利要求7的系統，其中所述內含體蛋白是光杆狀菌屬(Photorhabdus)CipB或來自蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的晶體蛋白。
9.根據權利要求7或權利要求8的系統，其中所述目的多肽通過Asp-Pro二肽接頭與所述內含體蛋白融合。
10.根據權利要求1-9中任一項的系統，其中所述目的多肽是對宿主細胞有毒性的多肽。
11.根據權利要求10的系統，其中所述目的多肽是抗微生物多肽。
12.—種試劑盒，其包含按照前述權利要求中任一項的第一載體和第二載體。
13.用於表達目的多肽的方法，所述方法包括i.用權利要求1-11中任一項所述的第一載體轉化原核宿主細胞，其中所述宿主細胞包含處於可誘導的啟動子控制下的T7 RNA聚合酶；和 為所述宿主細胞提供所述可誘導的啟動子的誘導物。
14.根據權利要求13的方法，其中所述原核宿主細胞選自大腸桿菌(E.coli) K12，大腸桿菌Nissle 1917，光杆狀菌屬，假單胞菌屬(I^eudomonas)，土壤桿菌屬 (Agrobacterium),粘球菌屬(Myxococcus)禾口伯克霍爾德氏菌屬(Burkholderia)0
15.按照權利要求13或14的方法，其還包括純化包含融合蛋白的內含體，並且裂解可裂解的接頭以釋放目的多肽。
16.一種抗微生物肽，其具有序列PAWFKCWRWQWRWKKLGA。
17.一種用於治療或預防小豬中的細菌感染的方法，其包括施用GB-LfcinB或GB-天蠶素P1。
18.一種用於治療或預防魚類中的細菌感染的方法，其包括向所述魚類遊動的水中添加通過按照權利要求13-15中任一項的方法產生的AMPs。
全文摘要
用於寬泛宿主範圍的可誘導表達目的多肽的雙載體系統，其包括i)第一載體，其包括(a)位於可誘導的啟動子的5』的T7啟動子；(b)位於可誘導的啟動子的3』的克隆位點，其用於插入編碼所述目的多肽的基因；和ii)使得宿主細胞能夠進行T7RNA聚合酶表達的第二載體，其中所述載體包括處於可誘導的啟動子控制之下的編碼該T7RNA聚合酶的基因。
文檔編號C12N15/73GK102264905SQ200980152893
公開日2011年11月30日 申請日期2009年10月29日 優先權日2008年10月30日
發明者張佑明 申請人:基因橋有限責任公司