一種用於腫瘤治療的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑及其製備方法與流程

2023-12-10 07:44:47 2

本發明屬生物醫療領域，涉及一種用於腫瘤治療的新型多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑及製備方法，特別是涉及一種提高抗腫瘤藥物及多孔納米碳纖維基光熱試劑對腫瘤抑制效率的方法，具體地說，是一種採用由多孔納米碳纖維作為光熱試劑並通過負載抗腫瘤藥物製備成載藥光熱試劑以達到對腫瘤的化學-光熱聯合治療來提高腫瘤抑制效率的方法。

背景技術：

近年來，腫瘤的發病率逐漸變高，嚴重影響到人們的日常生活，其治療手段包括化療、放療及手術切除等，然而手術切除會出現手術切除不完全，部分微小腫瘤組織的殘留會造成復發且不斷惡化，化療對身體傷害極大且伴隨著潛在的弊端，如效率較低、藥物抗性及伴隨某些副作用等。

光熱治療是一種新型腫瘤治療方法，具備可控、微創、副作用低等特性。其主要依靠近紅外雷射的輻照將光能轉換為熱能，進而產生高溫來進行腫瘤治療。近紅外光的波長範圍在700～1100nm，由於人體對近紅外光的吸收較少，因此近紅外光在人體組織中的穿透距離較深，從而適合實際臨床應用。現有許多光熱藥物，尤其是無機納米材料，如金納米棒、銀納米顆粒、硫化銅納米顆粒、碳基納米材料等，由於其良好的光熱轉換效率，已經得到了廣泛的應用。

專利cn103611170b提供了一種具有光熱治療能力的w18o9納米顆粒的製備方法，該方法製備過程簡單易操作，製得的產品光熱轉換效率高，但其和許多金屬類光熱藥物一樣在人體內的生物相容性不佳，長期在人體內會出現一定的毒性。

專利cn103721256a公開了一種用於腫瘤光熱切除治療的近紅外光熱轉換劑，其利用普魯士藍在近紅外區的較強吸收能力，將吸收的光能轉化為熱能用以殺死癌細胞，該光熱試劑具有成本低、價格低廉、表面易修飾、可塑性好、光熱轉換效率好等優點，但其目前僅被作為解毒劑小劑量使用，其在人體內的生物相容性並未經受過實驗的檢驗，目前並不清楚大量使用是否有其他副作用。

專利cn106008525a公開了一種有機小分子納米腫瘤光熱治療試劑及其製備方法，該發明的光熱治療試劑的主要成分為3，6-二(2-噻吩基)-2，5-二氫吡咯並[3，4-c]吡咯-1，4-二酮(dpp)衍生物，該方法製備的光熱治療試劑結構清楚、合成工藝簡單易行、生物相容性好，但其疏水性強導致其水中結構穩定性差，由於其對光吸收較強範圍為低波長區，造成了光熱轉換效率不佳。

為了追求抗癌效果的最優化，人們提出了化療與光熱療法結合的設想，專利cn104324376a公開了一種透明質酸偶聯二硫化鉬/碳納米管複合載藥光熱劑的製備方法，通過使用二硫化鉬包裹碳納米管，碳納米管內負載抗癌化學藥物，直接用於患處治療癌症，該方法不僅光熱轉換效率好，而且實現了癌症治療手段的多樣性，極大的提升了癌症治療效果，但其生物相容性不佳，對人體有一定副作用。

因此開發一種製備簡單、光熱轉化效率高、生物相容性好且負載能力強的光熱藥物極具現實意義。

技術實現要素：

本發明的目的是為了克服現有光熱治療中所採用的光熱劑藥物負載能力不好、光熱轉換效率不佳且副作用明顯的缺點，提供一種用於腫瘤治療的各方面性能優秀的新型多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑及其製備方法，該試劑不僅性能優良，還對藥物釋放行為具有一定的ph敏感性和溫度響應性，能夠控制所負載的抗癌化學藥物的釋放，提高了化學-光熱聯合治療的治療效果。

為達到上述目的，本發明採用如下技術方案：

一種用於腫瘤治療的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，多孔納米碳纖維包括一表面酸化的納米碳纖維芯層和一依次由殼聚糖和海藻酸鈉層層自組裝形成的包層，所述包層為2層以上的結構(可以為單數層也可以為偶數層)，所述多孔納米碳纖維的最大吸收波長為925～1100nm。由於人體對近紅外光(700～1100nm)的吸收較少，因此近紅外光在人體內穿透距離較遠，更適合光熱治療的臨床應用，光熱治療的最佳波段即為700～1100nm，由於碳基材料具有良好的生物相容性和較高的光熱轉換效率是理想的光熱試劑材料，但目前大多數碳基材料的最大吸收波長均低於700nm，無法在光熱治療的最佳波段內達到最高光熱轉換效率。本發明提供的多孔納米碳纖維的最大吸收波長在該波段內，本發明通過酸化處理多孔納米碳纖維，在其表面引入大量親水性基團，這些親水性基團可發生電離而使其表面帶有負電荷，將其先與帶有正電荷的殼聚糖進行靜電吸引而使其包覆在多孔納米碳纖維表面，且此時表面電荷由負電荷轉變為正電荷，然後帶有正電荷的多孔納米碳纖維同樣可以與帶有負電荷的海藻酸鈉發生靜電吸引而使其包覆在多孔納米碳纖維表面，如此往復即可完成多次交替包覆，並實現層層自組裝過程，本發明通過層層自組裝對碳纖維的表觀結構和性能進行了改進，使得其吸收光譜發生較大地紅移，進而最大吸收波長高達925～1100nm。

作為優選的技術方案：

如上所述的一種用於腫瘤治療的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，所述表面酸化的納米碳纖維的長度為0.3～5μm。

如上所述的一種用於腫瘤治療的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，所述表面酸化的納米碳纖維的表面含有親水性基團，親水性基團為羧基和/或羥基；所述殼聚糖的分子量為190kda～370kda，脫乙醯度為75％～95％；所述海藻酸鈉的分子量為32kda～250kda。

如上所述的一種用於腫瘤治療的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，所述多孔納米碳纖維在無機鹽溶液或蛋白質溶液分散穩定，無機鹽溶液為質量濃度≤0.9％的氯化鈉水溶液，蛋白質溶液濃度為0.05～0.15mm，蛋白質為牛血清蛋白，所述分散穩定是指將分散液在常溫常壓下靜置12～24h不發生明顯的沉降現象；

所述多孔納米碳纖維的光熱轉換性能優良，當多孔納米碳纖維的分散液的濃度為25μg/mg～400μg/mg時，在波長為808nm的近紅外雷射下照射5min後分散液的溫度從室溫升高至34.6℃～56.7℃；

所述多孔納米碳纖維的的生物相容性良好，當多孔納米碳纖維的分散液濃度為3.125μg/mg～50μg/mg時，細胞存活率>80％；

所述多孔納米碳纖維的分散液中的溶劑為生理鹽水或磷酸緩衝溶液。

如上所述的一種用於腫瘤治療的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，所述多孔納米碳纖維為三層結構，由內向外依次為表面酸化的納米碳纖維、殼聚糖和海藻酸鈉。

如上所述的一種用於腫瘤治療的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，所述多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的藥物負載量為200～400μg/mg；

所述多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的藥物釋放具有一定的ph敏感性和溫度響應性，在波長為808nm的近紅外雷射照射條件下ph為5.0的緩釋體系在0～18天內的藥物累計釋放量相對於ph為5.0的緩釋體系提高2.4％～13.6％，相對于波長為808nm的近紅外雷射照射條件下的緩釋體系提高7.7％～40.3％；

所述多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤共培養後，能夠釋放抗腫瘤藥物被細胞吸收，抑制腫瘤活性，且在波長為808nm的近紅外光照射下能夠明顯殺死光照區域的腫瘤細胞，實現對腫瘤細胞的化學-光熱聯合治療，其抑制效果顯著高於化學或光熱單獨治療，將所述多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑分散在細胞培養基中且其濃度為3.125～25μg/ml時，在波長為808nm的近紅外光照射下的協同治療對腫瘤細胞的抑制效果為24.6％～80.1％，相對於單純化學治療抑制效果(9.2％～24.7％)提高了15.4％～55.4％，且相對於單純光熱治療效果(10.4％～28.3％)提高了14.2％～51.8％，在相同濃度下的治療效果高於化學及光熱單獨治療效果的簡單疊加(19.6％～53％)，本發明中的治療效果通過抑制效率來體現，抑制效率＝(1-處理後腫瘤細胞存活率/未處理腫瘤細胞存活率)*100％。

本發明還提供了一種多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的製備方法，首先將納米碳纖維進行表面酸化處理後依次浸入殼聚糖溶液和海藻酸鈉溶液進行層層自組裝得到多孔納米碳纖維，然後將多孔納米碳纖維分散在抗腫瘤藥物溶液中，最後經後處理得到多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑。

作為優選的技術方案：

如上所述的製備方法，所述多孔納米碳纖維的具體製備步驟如下：

(1)將納米碳纖維以0.1～5mg/ml的濃度分散在60～80℃的濃硫酸/濃硝酸中3～5h，濃硫酸與濃硝酸的體積比為2～4:1，冷卻後投入去離子水中並不斷攪拌，使用高速離心機以8000～10000rpm的轉速離心5～10min，去掉上清液，並用去離子水不斷清洗直至上清液ph為中性得到表面酸化的納米碳纖維；

(2)將表面酸化的納米碳纖維分散在濃度為1～5mg/ml的殼聚糖溶液中，表面酸化的納米碳纖維與殼聚糖的質量比為1:10～1:1，在室溫下持續攪拌1～2h後經後處理去除多餘的殼聚糖；

(3)將步驟(2)得到的納米碳纖維分散在與殼聚糖溶液等濃度且等體積的海藻酸鈉溶液中，在室溫下持續攪拌1～2h後經後處理去除多餘的海藻酸鈉得到多孔納米碳纖維；

步驟(2)和(3)中後處理是指將分散液以8000～10000rpm轉速離心5～10min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱。

如上所述的製備方法，所述將多孔納米碳纖維分散在抗腫瘤藥物溶液中具體為：分別配製濃度相同都為0.25～1mg/ml的藥物水溶液和多孔納米碳纖維的分散液，多孔納米碳纖維的分散液中的溶劑為生理鹽水或磷酸緩衝溶液，將二者等體積混合後經過超聲處理充分分散後，在室溫且避光條件下放置6～24h後離心清洗；所述後處理為冷凍乾燥。

如上所述的製備方法，所述抗腫瘤藥物為阿黴素、紫杉醇和順鉑中的一種以上。

有益效果：

(1)本發明中的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，製備工藝簡單且無汙染，原料成本低廉。

(2)本發明中的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，具有良好的分散穩定性、光熱轉換效率及血液相容性。

(3)本發明中的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，對腫瘤具有化學—光熱聯合治療效果，提高治療效果，作為一種新型腫瘤治療試劑具有十分光明的應用前景。

(4)本發明中的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑，其藥物的釋放行為具有一定的ph敏感性及溫度響應性，提升了聯合治療的治療效果。

附圖說明

圖1為表面羧酸化的多孔納米碳纖維的透射電鏡照片；

圖2為表面層層自組裝改性的多孔納米碳纖維的透射電鏡照片；

圖3為不同濃度多孔納米碳纖維的分散液在功率為1w的808nm紅外雷射照射下的升溫曲線；

圖4為多孔納米碳纖維的分散液濃度為100μg/ml時在不同功率的808nm紅外雷射照射下的升溫曲線；

圖5為不同濃度多孔納米碳纖維的分散液的血液相容性表徵；

圖6為多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑在不同ph環境及有無紅外光照條件下的藥物釋放曲線；

圖7為不同濃度多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤細胞共培養後的細胞存活率表徵；

圖8為多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤細胞共培養後的細胞形態表徵。

具體實施方式

下面結合具體實施方式來進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。

實施例1

一種多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的製備方法，其具體步驟如下：

(1)將多孔納米碳纖維以0.1mg/ml的濃度分散在70℃的濃硫酸/濃硝酸中4h，其中濃硫酸與濃硝酸的體積比為3:1，冷卻到室溫後投入去離子水中並不斷攪拌，使用高速離心機以9000rpm的轉速離心5min，去掉上清液，並用去離子水不斷清洗直至上清液ph為中性得到如圖1所示的表面酸化的多孔納米碳纖維，該纖維表面含有羧基和羥基；

(2)將表面酸化的多孔納米碳纖維分散在濃度為2mg/ml的殼聚糖溶液中，殼聚糖的分子量為190kda，脫乙醯度為75％，表面酸化的多孔納米碳纖維與殼聚糖的質量比為1:1，在室溫下持續攪拌2h後，分散液以9000rpm轉速離心10min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的殼聚糖得到洗滌後的沉澱；

(3)將洗滌後的沉澱投入與殼聚糖溶液等濃度且等體積的海藻酸鈉溶液中，海藻酸鈉的分子量為32kda，在室溫下持續攪拌2h後，分散液以9000rpm轉速離心10min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的海藻酸鈉，得到如圖2所示的層層自組裝表面修飾的多孔納米碳纖維；

(4)將多孔納米碳纖維分散於生理鹽水中，製成0.5mg/ml的多孔納米碳纖維的分散液，將藥物溶於去離子水，製成0.5mg/ml的阿黴素水溶液，將兩溶液等體積混合後經過以50khz的功率超聲處理30min充分分散後，在室溫且避光條件下放置6h後離心清洗，最後在-50℃下冷凍乾燥10h得到多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑。

本方法製得的多孔納米碳纖維，為三層結構，由內向外依次為表面酸化的納米碳纖維、殼聚糖和海藻酸鈉，該多孔納米碳纖維的最大吸收波長為960nm；該多孔納米碳纖維分散性好，常溫常壓下，該多孔納米碳纖維在質量濃度為10mm的磷酸緩衝溶液靜置24h不發生明顯的沉降現象，其沉降效果與僅經酸化處理得到的多孔納米碳纖維在同樣條件下靜置1h的效果相當，其相較僅經酸化處理得到的多孔納米碳纖維分散性提高明顯，相同條件下僅經酸化處理得到的多孔納米碳纖維在質量濃度為10mm的磷酸緩衝溶液中靜置3h後即發生明顯分層現象；該多孔納米碳纖維的光熱轉換性能優良，如圖3所示，當多孔納米碳纖維的分散液的濃度為400μg/mg時，在波長為808nm及功率為1w的近紅外雷射下照射5min後分散液的溫度從室溫升高至56.7℃，該多孔納米碳纖維的分散液溶劑為磷酸緩衝溶液，其在不同功率的808nm紅外雷射照射下的升溫曲線如圖4所示；該多孔納米碳纖維的的生物相容性良好，如圖7所示，當多孔納米碳纖維在細胞培養基溶液中濃度為50μg/mg時，細胞存活率為84％，其血液相容性如圖5所示。

最終製得的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的藥物負載量為334μg/mg，由圖6可以看出該光熱試劑的藥物釋放具有一定的ph敏感性和溫度響應性，在波長為808nm的近紅外雷射照射條件下ph為5.0的緩釋體系在0～18天內的藥物累計釋放量相對於ph為5.0的緩釋體系提高2.4％～13.6％，相對于波長為808nm的近紅外雷射照射條件下的緩釋體系提高7.7％～40.3％；將該多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑分散在細胞培養基中且其濃度為25μg/ml時，在波長為808nm的近紅外光照射下的協同治療對腫瘤細胞的抑制效果為80.1％，如圖7所示，可以看出多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑表現出對腫瘤細胞的化學—光熱聯合治療效果，極大的提升了對腫瘤細胞的殺死率；多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤細胞共培養後的細胞形態表徵如圖8所示，光照區域(弧線)內的細胞均被殺死而脫落，細胞核內富集所釋放的阿黴素，且細胞質表現為萎縮狀。

實施例2

一種多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的製備方法，其具體步驟如下：

(1)將多孔納米碳纖維以5mg/ml的濃度分散在60℃的濃硫酸/濃硝酸中5h，其中濃硫酸與濃硝酸的體積比為4:1，冷卻到室溫後投入去離子水中並不斷攪拌，使用高速離心機以8000rpm的轉速離心10min，去掉上清液，並用去離子水不斷清洗直至上清液ph為中性得到表面酸化的多孔納米碳纖維；

(2)將表面酸化的多孔納米碳纖維分散在濃度為5mg/ml的殼聚糖溶液中，殼聚糖的分子量為370kda，脫乙醯度為95％，表面酸化的納米碳纖維與殼聚糖的質量比為1:10，在室溫下持續攪拌1h後，分散液以10000rpm轉速離心5min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的殼聚糖得到洗滌後的沉澱；

(3)將洗滌後的沉澱投入與殼聚糖溶液等濃度且等體積的海藻酸鈉溶液中，海藻酸鈉的分子量為250kda，在室溫下持續攪拌1h後，分散液以10000rpm轉速離心5min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的海藻酸鈉，得到層層自組裝表面修飾的多孔納米碳纖維；

(4)將多孔納米碳纖維分散於乙醇溶液，製成0.25mg/ml的多孔納米碳纖維的分散液，將藥物溶於乙醇，製成0.25mg/ml的紫杉醇乙醇溶液，將兩溶液等體積混合後經過以50khz的功率超聲處理25min充分分散後，在室溫且避光條件下放置24h後離心清洗，最後在-48℃下冷凍乾燥10h得到多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑。

本方法製得的多孔納米碳纖維為三層結構，由內向外依次為表面酸化的納米碳纖維、殼聚糖和海藻酸鈉，該多孔納米碳纖維的最大吸收波長為965nm，該多孔納米碳纖維分散性好，常溫常壓下，該多孔納米碳纖維在0.05mm的牛血清蛋白溶液靜置12h不發生明顯的沉降現象；該多孔納米碳纖維的光熱轉換性能優良，當多孔納米碳纖維的分散液的濃度為25μg/mg時，在波長為808nm、功率為1w的近紅外雷射下照射5min後分散液的溫度從室溫升高至33.7℃，多孔納米碳纖維的分散液溶劑為磷酸緩衝溶液；當多孔納米碳纖維在細胞培養基溶液中濃度為3.125μg/mg時，細胞存活率為98.1％。

最終製得的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的藥物負載量為286μg/mg，在波長為808nm的近紅外雷射照射條件下ph為5.0的緩釋體系在0～18天內的藥物累計釋放量相對於ph為5.0的緩釋體系提高3.8％～17.9％，相對于波長為808nm的近紅外雷射照射條件下的緩釋體系提高7.1％～36.4％；將該多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑分散在細胞培養基中且其濃度為25μg/ml時，在波長為808nm的近紅外光照射下的協同治療對腫瘤細胞的抑制效果為76.3％，可以看出多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑表現出對腫瘤細胞的化學—光熱聯合治療效果，極大的提升了對腫瘤細胞的殺死率；多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤細胞共培養後，近紅外光光照區域內的細胞均被殺死而脫落，細胞質表現為萎縮狀。

實施例3

一種多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的製備方法，其具體步驟如下：

(1)將納米碳纖維以2.5mg/ml的濃度分散在80℃的濃硫酸/濃硝酸中3h，其中濃硫酸與濃硝酸的體積比為2:1，冷卻到室溫後投入去離子水中並不斷攪拌，使用高速離心機以10000rpm的轉速離心7.5min，去掉上清液，並用去離子水不斷清洗直至上清液ph為中性得到表面酸化的多孔納米碳纖維；

(2)將表面酸化的多孔納米碳纖維分散在濃度為1mg/ml的殼聚糖溶液中，殼聚糖的分子量為280kda，脫乙醯度為85％，表面酸化的多孔納米碳纖維與殼聚糖的質量比為1:5，在室溫下持續攪拌1.5h後，分散液以8000rpm轉速離心7.5min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的殼聚糖得到洗滌後的沉澱；

(3)將洗滌後的沉澱投入與殼聚糖溶液等濃度且等體積的海藻酸鈉溶液中，海藻酸鈉的分子量為141kda，在室溫下持續攪拌1.5h後，分散液以8000rpm轉速離心7.5min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的海藻酸鈉，得到層層自組裝表面修飾的多孔納米碳纖維；

(4)將多孔納米碳纖維分散於磷酸緩衝溶液，製成1mg/ml的多孔納米碳纖維的分散液，將藥物溶於水，製成1mg/ml的順鉑水溶液，將兩溶液等體積混合後經過以55khz的功率超聲處理28min充分分散後，在室溫且避光條件下放置15h後離心清洗，最後在-50℃下冷凍乾燥11h得到多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑。

本方法製得的多孔納米碳纖維為三層結構，由內向外依次為表面酸化的納米碳纖維、殼聚糖和海藻酸鈉，該多孔納米碳纖維的最大吸收波長為1100nm，該多孔納米碳纖維分散性好，常溫常壓下，該多孔納米碳纖維在0.1mm牛血清蛋白溶液靜置18h不發生明顯的沉降現象；該多孔納米碳纖維的光熱轉換性能優良，當多孔納米碳纖維的分散液的濃度為200μg/mg時，在波長為808nm、功率為1w的近紅外雷射下照射5min後分散液的溫度從室溫升高至50.4℃，多孔納米碳纖維的分散液溶劑為生理鹽水；該多孔納米碳纖維的的生物相容性良好，當多孔納米碳纖維在細胞培養基溶液中濃度為25μg/mg時，細胞存活率為91.7％。

最終製得的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的藥物負載量為308μg/mg，在波長為808nm的近紅外雷射照射條件下ph為5.0的緩釋體系在0～18天內的藥物累計釋放量相對於ph為5.0的緩釋體系提高5.5％～18.4％，相對于波長為808nm的近紅外雷射照射條件下的緩釋體系提高8.6％～47.1％；將該多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑分散在細胞培養基中且其濃度為12.5μg/ml時，在波長為808nm的近紅外光照射下的協同治療對腫瘤細胞的抑制效果為69.4％，可以看出多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑表現出對腫瘤細胞的化學—光熱聯合治療效果，極大的提升了對腫瘤細胞的殺死率；多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤細胞共培養後，近紅外光光照區域內的細胞均被殺死而脫落，細胞質表現為萎縮狀。

實施例4

一種多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的製備方法，其具體步驟如下：

(1)將多孔納米碳纖維以0.5mg/ml的濃度分散在68℃的濃硫酸/濃硝酸中3.5h，其中濃硫酸與濃硝酸的體積比為2.4:1，冷卻到室溫後投入去離子水中並不斷攪拌，使用高速離心機以8800rpm的轉速離心6min，去掉上清液，並用去離子水不斷清洗直至上清液ph為中性得到表面酸化的多孔納米碳纖維；

(2)將表面酸化的多孔納米碳纖維分散在濃度為3mg/ml的殼聚糖溶液中，殼聚糖的分子量為200kda，脫乙醯度為79％，表面酸化的納米碳纖維與殼聚糖的質量比為1:3，在室溫下持續攪拌1.2h後，分散液以8800rpm轉速離心7min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的殼聚糖得到洗滌後的沉澱；

(3)將洗滌後的沉澱投入與殼聚糖溶液等濃度且等體積的海藻酸鈉溶液中，海藻酸鈉的分子量為200kda，在室溫下持續攪拌1.8h後，分散液以9000rpm轉速離心8min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱去除多餘的海藻酸鈉，得到層層自組裝表面修飾的多孔納米碳纖維；

(4)將多孔納米碳纖維分散於生理鹽水溶液，製成0.4mg/ml的多孔納米碳纖維的分散液，將藥物溶於水，製成0.4mg/ml的抗腫瘤藥物水溶液，抗腫瘤藥物為阿黴素與順鉑質量比1：1的混合物，將兩溶液等體積混合後經過以50khz的功率超聲處理32min充分分散後，在室溫且避光條件下放置12h後離心清洗，最後在-44℃下冷凍乾燥10h得到多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑。

本方法製得的多孔納米碳纖維為三層結構，由內向外依次為表面酸化的納米碳纖維、殼聚糖和海藻酸鈉，該多孔納米碳纖維的最大吸收波長為925nm，該多孔納米碳纖維分散性好，常溫常壓下，該多孔納米碳纖維在0.15mm牛血清蛋白溶液靜置10h不發生明顯的沉降現象；該多孔納米碳纖維的光熱轉換性能優良，當多孔納米碳纖維的分散液的濃度為100μg/mg時，在波長為808nm、功率為1w的近紅外雷射下照射5min後分散液的溫度從室溫升高至43.3℃，多孔納米碳纖維的分散液溶劑為磷酸緩衝溶液；該多孔納米碳纖維的的生物相容性良好，當多孔納米碳纖維在細胞培養基溶液中濃度為6.25μg/mg時，細胞存活率為94.6％。

最終製得的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的藥物負載量為282μg/mg，在波長為808nm的近紅外雷射照射條件下ph為5.0的緩釋體系在0～18天內的藥物累計釋放量相對於ph為5.0的緩釋體系提高6.1％～15.8％，相對于波長為808nm的近紅外雷射照射條件下的緩釋體系提高8.7％～44.7％；將該多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑分散在細胞培養基中且其濃度為6.25μg/ml時，在波長為808nm的近紅外光照射下的協同治療對腫瘤細胞的抑制效果為53.2％，可以看出多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑表現出對腫瘤細胞的化學—光熱聯合治療效果，極大的提升了對腫瘤細胞的殺死率；多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤細胞共培養後，近紅外光光照區域內的細胞均被殺死而脫落，細胞質表現為萎縮狀。

實施例5

一種多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的製備方法，其具體步驟如下：

(1)將多孔納米碳纖維以4mg/ml的濃度分散在75℃的濃硫酸/濃硝酸中4.5h，其中濃硫酸與濃硝酸的體積比為3:1，冷卻到室溫後投入去離子水中並不斷攪拌，使用高速離心機以9300rpm的轉速離心5min，去掉上清液，並用去離子水不斷清洗直至上清液ph為中性得到表面酸化的多孔納米碳纖維；

(2)將表面酸化的多孔納米碳纖維分散在濃度為4mg/ml的殼聚糖溶液中，殼聚糖的分子量為300kda，脫乙醯度為78％，表面酸化的納米碳纖維與殼聚糖的質量比為1:6，在室溫下持續攪拌1h後，分散液以9200rpm轉速離心9min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的殼聚糖得到洗滌後的沉澱；

(3)將洗滌後的沉澱投入與殼聚糖溶液等濃度且等體積的海藻酸鈉溶液中，海藻酸鈉的分子量為240kda，在室溫下持續攪拌2h後，分散液以9200rpm轉速離心9min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的海藻酸鈉，得到層層自組裝表面修飾的多孔納米碳纖維；

(4)將多孔納米碳纖維分散於乙醇，製成0.8mg/ml的多孔納米碳纖維的分散液，將藥物溶於水，製成0.8mg/ml的抗腫瘤藥物水溶液，抗腫瘤藥物為阿黴素與紫杉醇質量比為1：1的混合物，將兩溶液等體積混合後經過以50khz的功率超聲處理28min充分分散後，在室溫且避光條件下放置14h後離心清洗，最後在-47℃下冷凍乾燥8h得到多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑。

本方法製得的多孔納米碳纖維為三層結構，由內向外依次為表面酸化的納米碳纖維、殼聚糖和海藻酸鈉，該多孔納米碳纖維的最大吸收波長為1000nm，該多孔納米碳纖維分散性好，常溫常壓下，該多孔納米碳纖維在質量濃度為0.9％的氯化鈉水溶液靜置14h不發生明顯的沉降現象；該多孔納米碳纖維的光熱轉換性能優良，當多孔納米碳纖維的分散液的濃度為50μg/mg時，在波長為808nm、功率為1w的近紅外雷射下照射5min後分散液的溫度從室溫升高至43.9℃，多孔納米碳纖維的分散液溶劑為生理鹽水；該多孔納米碳纖維的的生物相容性良好，當多孔納米碳纖維在細胞培養基溶液中濃度為6.25μg/mg時，細胞存活率為94.5％。

最終製得的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的藥物負載量為239μg/mg，在波長為808nm的近紅外雷射照射條件下ph為5.0的緩釋體系在0～18天內的藥物累計釋放量相對於ph為5.0的緩釋體系提高3.3％～13.4％，相對于波長為808nm的近紅外雷射照射條件下的緩釋體系提高5.2％～35.5％；將該多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑分散在細胞培養基中且其濃度為25μg/ml時，在波長為808nm的近紅外光照射下的協同治療對腫瘤細胞的抑制效果為71.3％，可以看出多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑表現出對腫瘤細胞的化學—光熱聯合治療效果，極大的提升了對腫瘤細胞的殺死率；多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤細胞共培養後，近紅外光光照區域內的細胞均被殺死而脫落，細胞質表現為萎縮狀。

實施例6

一種多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的製備方法，其具體步驟如下：

(1)將納米碳纖維以2.5mg/ml的濃度分散在72℃的濃硫酸/濃硝酸中4h，其中濃硫酸與濃硝酸的體積比為2.5:1，冷卻到室溫後投入去離子水中並不斷攪拌，使用高速離心機以8500rpm的轉速離心6min，去掉上清液，並用去離子水不斷清洗直至上清液ph為中性得到表面酸化的納米碳纖維；

(2)將表面酸化的納米碳纖維分散在濃度為2.5mg/ml的殼聚糖溶液中，殼聚糖的分子量為198kda，脫乙醯度為88％，表面酸化的納米碳纖維與殼聚糖的質量比為1:4，在室溫下持續攪拌2h後，分散液以8700rpm轉速離心6min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的殼聚糖得到洗滌後的沉澱；

(3)將洗滌後的沉澱投入與殼聚糖溶液等濃度且等體積的海藻酸鈉溶液中，海藻酸鈉的分子量為232kda，在室溫下持續攪拌2h後，分散液以8700rpm轉速離心6min得到沉澱，然後用去離子水洗滌沉澱以去除多餘的海藻酸鈉得到洗滌後的沉澱；

(4)將步驟(3)所得沉澱重複進行步驟(2)和步驟(3)各一次，得到層層自組裝表面修飾的多孔納米碳纖維，並將其分散於磷酸緩衝溶液，製成1mg/ml的多孔納米碳纖維的分散液，將藥物溶於水，製成1mg/ml的阿黴素水溶液，將兩溶液等體積混合後經過以55khz的功率超聲處理26min充分分散後，在室溫且避光條件下放置20h後離心清洗，最後在-60℃下冷凍乾燥2h得到多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑。

本方法製得的多孔納米碳纖維為五層結構，由內向外依次為表面酸化的納米碳纖維、殼聚糖、海藻酸鈉、殼聚糖和海藻酸鈉，該多孔納米碳纖維的最大吸收波長為943nm，該多孔納米碳纖維分散性好，常溫常壓下，該多孔納米碳纖維在質量濃度為5mm的磷酸緩衝溶液靜置22h不發生明顯的沉降現象，該多孔納米碳纖維的光熱轉換性能優良，當多孔納米碳纖維的分散液的濃度為200μg/mg時，在波長為808nm、功率為1w的近紅外雷射下照射5min後分散液的溫度從室溫升高至48.7℃，多孔納米碳纖維的分散液溶劑為磷酸緩衝溶液；該多孔納米碳纖維的的生物相容性良好，當多孔納米碳纖維在細胞培養基溶液中濃度為50μg/mg時，細胞存活率為76％。

最終製得的多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑的藥物負載量為313μg/mg，在波長為808nm的近紅外雷射照射條件下ph為5.0的緩釋體系在0～18天內的藥物累計釋放量相對於ph為5.0的緩釋體系提高2.1％～15.5％，相對于波長為808nm的近紅外雷射照射條件下的緩釋體系提高6.1％～37.2％；將該多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑分散在細胞培養基中且其濃度為25μg/ml時，在波長為808nm的近紅外光照射下的協同治療對腫瘤細胞的抑制效果為76.2％，可以看出多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑表現出對腫瘤細胞的化學—光熱聯合治療效果，極大的提升了對腫瘤細胞的殺死率；多孔納米碳纖維基載藥光熱試劑與腫瘤細胞共培養後，近紅外光光照區域內的細胞均被殺死而脫落，細胞質表現為萎縮狀。