交聯蛋白納米晶體、交聯蛋白納米聚集體及其製備方法

2023-12-09 19:22:11 1

專利名稱：交聯蛋白納米晶體、交聯蛋白納米聚集體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及交聯蛋白納米顆粒，以及生產交聯蛋白納米顆粒的納米化方法。
背景技術：
基於蛋白的應用，主要但非必要地限制於酶、抗體、受體、激素和結構蛋白的使用， 其很好地建立在生物技術、生物醫學、製藥業、生物材料和化妝品產業中。通過交聯蛋白晶體和聚集體的使用，至少部分地解決了涉及單個蛋白質應用的一些普遍性問題，例如半衰期短、穩定性差、可恢復性差、使用範圍窄、成本高、水解不穩定以及生物利用度差。包括微米或更大尺寸的顆粒的所述晶體和聚集體提供了結構和化學上耐用的、壽命長的材料，其避免了單個蛋白質共有的許多限制，並且因此改善了一些主要的問題。儘管如此，所述材料的微米和更大的尺寸引入了單個蛋白質非原有的多種問題，例如傳質限制，減少的接近催化中心的機會，由交聯產生的受限的催化劑轉換和差的生物吸收率。在一些情況中，儘管所述製備是可重複的，但是成本也很高。存在著持續的推動力以通過實施納米技術來優化蛋白質產品的生物活性、穩定性、保存期限、使用範圍以及生物利用度。作為在這裡統稱為蛋白質納米顆粒(即在每個維度中的截面長度小於1微米的蛋白質材料)，至今被報導的少數例子包括蛋白質納米聚集體(即包括二聚體和甚至更高聯合體的非晶體蛋白質納米簇)和蛋白質納米晶體(即結晶的蛋白質納米顆粒)。製備和使用尤其是交聯類型的新穎的納米尺寸的蛋白質聚集體和晶體仍處於學習階段，成功的例子很少。由於基於蛋白質的產品的有限的利用率、範圍和生產的限制，存在著能獲得諸如新穎交聯蛋白納米顆粒的材料的需求。類似的，也存在對建立方便的製備方法的需求，以便能更好地利用所述交聯蛋白納米顆粒，從而大體上解決工業和醫學上的許多當前問題。令人遺憾的是，新型交聯蛋白納米顆粒的發展和製備被一些技術問題所減緩，對於這些技術問題缺乏通用的和易實現的解決方案。顯著存在於納米級材料中的物理化學特徵、例如固有的高表面能和反應性是引起這些難點的一項因素。在已建立的基於蛋白質的產品之中， 只有自下而上的策略已被用來製備交聯蛋白納米顆粒，其中將單個天然態蛋白質集合在一起，形成更大的聯合體。相比而言，沒有報導過通過在較大的交聯蛋白材料上採用物理尺寸縮減方法(即自上而下的途徑)來製備交聯蛋白納米顆粒的途徑。實際上，納米化(即較大材料的尺寸縮減至納米級)或納米碎裂(即較大材料碎裂至產生納米尺寸的碎片或者「納米碎片」)在交聯蛋白上仍有待檢驗。普遍聲稱蛋白質容易被「非自然的」過程條件損害的看法是一項阻礙對尺寸縮減的優點的早期評估的因素。此外，已經知道使軟材料(意指基於蛋白質的材料)碎裂的行為因顆粒的尺寸變小而變得愈加困難。這種普遍的觀念很可能充當了另一個阻礙因素。在本發明中，製備交聯蛋白納米顆粒的挑戰是通過對交聯的微米或更大尺寸的蛋白質材料(以下稱為前體材料)施加物理尺寸縮減方法來解決。此方法能產生出尺寸可控的、耐用的基於蛋白質的納米顆粒材料。同樣地，所述方法避免了涉及從溶液中的單個蛋白質直接製備交聯蛋白聯合體的已確定的或似然性的技術問題。所生成的交聯蛋白是所述前體材料的納米碎片或者納米碎裂產品，其形成納米級交聯蛋白產品的全新種類，在此稱為交聯蛋納米顆粒(即在每個維度中的截面長度小於1微米的交聯蛋白納米晶體和交聯蛋白納米聚集體)可能會被無心地誤認為是所報導的相當產品(即依據相似的技術，例如為蛋白質納米顆粒)的現有技術例子實際上描述了交聯蛋白產品的另一種類。這些產品是從單個的、天然的蛋白質(即非交聯的前體)中製備的，其明顯指的是相比於本發明的不同來源的前體。再者，本發明的產品是交聯的和相對更大的結構的納米碎片。本發明的所述交聯納米顆粒顯示出高的生物利用度，這是因為其能通過醫療從業者熟知的多種常規方式容易地進入細胞內，並且相比於單個蛋白質其在體內的壽命更長。此外，因其有顯著的水解穩定性，這些納米顆粒是可攝取的，並因此它們為吸收進入體內提供了新的渠道，例如通過 GALT (腸相關淋巴組織)系統。所述納米顆粒由於它們有利的表面和擴散/傳質特性而顯示出高的生物活性，以及本領域技術人員所知的因交聯作用產生的改進的操作穩定性。交聯蛋白納米顆粒的前體材料可從商業上獲得。備選的是，製備所述交聯蛋白納米顆粒的前體的方法對於本領域技術人員是可獲得的。所述前體材料由兩個步驟製備。首先，在目標蛋白質上實施合適的溶劑/抗溶劑沉澱或凍幹方法，形成微米或更大尺寸的蛋白質聚集體，或者實施結晶化方法，形成微米或更大尺寸的蛋白質晶體；隨後，實施任何常規的化學交聯方法(即化學試劑引發、化學反應交聯劑引發和/或酶引發)或去水熱交聯方法(即熱引發縮合)，形成共價交聯蛋白材料(即本發明的前體材料)。為製備交聯納米顆粒產品，所述前體的尺寸被物理性縮減，直接產生相應的交聯蛋白納米聚集體或納米晶體，並且避免了典型地和已建立的自下而上方法聯繫在一起的任何問題。因此，本發明提供了一種共價交聯的蛋白納米顆粒，其大小為10-999nm且優選為 50-200nm，其適用於生物技術、化妝品、製藥和生物醫學的應用，其特徵在於，所述納米顆粒包含一種或多種蛋白質和至少一種零或更大長度的蛋白質間交聯，並作為在每個維度中的最小長度為1微米、成分相同或近似相同的前體材料的納米碎裂產品而獲得。本發明的另一個實施方案涉及一種通過將購買的或容易地自製出的前體材料 (即交聯的微米或更大尺寸的蛋白質聚集體或晶體)納米化(即將物理尺寸縮減至納米級)來製備交聯蛋白納米顆粒的非常簡單的方法。本發明的另一個實施方案涉及由所述方法生產的交聯蛋白納米顆粒在提高通過任何局部的或全身的給藥途徑的性能中的應用，這些給藥途徑包括經皮式的、口服式的 (和最終GALT式的)、轉化粘液質式的(例如口腔式的、舌下式的)、吸入式的和注射式的 (例如腹膜內式的、肌肉式的、皮下式的、鞘內式的、薄壁組織內的(intraparenchymal)和輸液式的)。本發明的另一個實施方案涉及由所述方法生產的交聯蛋白納米顆粒在修復由任何一種已知的溶酶體儲存紊亂所引起的新陳代謝失衡中的應用。如下所示，通過物理式地集合單個蛋白質單元、然後同時地或之後地調用化學式的、酶式的或去水熱式的交聯方法，已經可以得到交聯蛋白聯合體。交聯的行為已被深入地探究，且它的作用已經改變。例如，在很多情況下蛋白質聯合體形成納米聚集體並不是自發的或可預測的過程。因此，共價交聯方法已被用來物理性地驅動和微調蛋白質納米聚集體
6的集合。美國專利4001401公開了溶液相血紅蛋白的遞增化學交聯，其產生可溶性的納米尺寸顆粒形式的「聚血紅蛋白」(所述「聚血紅蛋白」術語可視為一種誤稱，因為每一個簇形成至多13個蛋白質聯合體)。可發現類似的例子和多蛋白質血紅蛋白聯合體，其作為潛在的血液替代品而處於研究中(F D' Agnillo和TMS Chang(1998) 〃 Polyhemog lobin-superoxide dismutase-catalase as a blood substitute with antioxidant properties " Nature Biotechnology 16,667-671;以及 Robert Winslow(2006)Blood Substitutes, Chp. 38, Elsevier, London, GB)。美國專利申請2008/(^96231Al公開了使用化學交聯來在蛋白質聯合完成後使微米尺寸的蛋白質顆粒減溶。J Lee等人公開了在無機載體媒介的孔內形成化學交聯的酶聚集體("Simple Synthesis of Hierarchically Ordered Mesocellular Mesoporous Silica Materials Hosting Crosslinked Enzyme Aggregates" Small 1，744—753，2005)。在此，孑L的尺寸決定聚集體的尺寸。美國專利申請2009/0004278公開了酶交聯的蛋白質納米顆粒的製備，其用自下而上的方法獲得。BL Simons等人公開了用於形成共價交聯的蛋白凍乾物的去水熱方法 (「Covalent cross-linking of proteins without chemical reagents " Protein Science 11，1558-1564，2002)。Rff Matin和KW Zilm用依賴於快速分批結晶化技術的自下而上的方法來製備蛋白質納米晶體(艮口非交聯的)(〃 Preparation of protein nanocrystals and their characterization by solid state NMR " Journal of Magnetic Resonance 165, 162-174,2003)。JC Falkner等人用自下而上的方法並隨後與戊二醛進行化學交聯來製備交聯蛋白納米晶體(「Generation of size-controlled, submicrometer protein crystals" Chem. Mater. 17，2679-2686，2005)。如上所暗示的那樣，現有技術的產品與本發明的產品不同。尤其是，所有現有技術的納米級蛋白質材料可定義為單個蛋白質的群集和交聯的產品。形成鮮明對比的是，本發明提供的交聯蛋白納米顆粒可定義為交聯蛋白材料(即前體材料)的納米碎片或納米碎裂產品。本發明所描述的方法對比以上現有技術的區別在於，每個現有技術的例子均調用自下而上的定製方法來形成特定的交聯納米聚集體(無定型的納米簇)或者非交聯的納米晶體，而本發明使用通用的尺寸縮減技術來縮減任何前體材料(同樣在此定義為微米或更大尺寸的交聯蛋白聚集體或晶體)的尺寸至納米級。這樣，在本發明中通過一種截然不同且概念相反的方法而獲得了新穎的交聯蛋白產品。本發明的一處主要新穎性是尺寸縮減步驟，其用於將大的前體材料轉化成納米尺寸的交聯顆粒。本發明的交聯蛋白納米顆粒的新穎前體材料可通過如文獻中詳細說明的用於製備交聯的微米或更大尺寸的蛋白質晶體或交聯蛋白聚集體的任何常規方法獲得。備選的是，合適的前體材料可以購買得到。美國麻塞諸塞州劍橋的Vertex Pharmaceuticals Inc.的CLEC 和AlthusBiologicalsdnc.的CLEC均有售嗜熱菌蛋白酶、彈性蛋白酶、酯酶、脂肪酶、溶菌酶、天冬醯胺酶、尿素酶、腈水解酶、海因酶和卵白酶的交聯的微米尺寸晶體；類似地，荷蘭代爾夫特的CLEA Technologies BV已出售作為交聯聚集體的減溶的卵白酶和脂肪酶。本發明的方法顯著地區別於現有技術，並產出具有明顯不同的物理化學性能特點的交聯蛋白納米顆粒。本發明的許多納米顆粒特性、例如在交聯中的失活程度很容易根據前體材料來預知；所述交聯蛋白納米顆粒在操作條件下通常是長壽的，並且其儲存如乾燥粉末一樣簡單。其前體材料也具有延長的保存期限。現有技術的前體不存在這樣的優點， 因為現有技術是始於單個蛋白質經自下而上的方法來提供產品的。在現有技術中，在交聯之前並未使用蛋白質沉澱的技術來產生大尺度的聚集體。相反，溶劑環境內的單個溶解的蛋白質分子連接起來，形成納米尺寸的蛋白質聯合體，其或保持在懸浮液中，或因其微小的尺寸而容易分散開。因此，在前體材料的歷程中先於交聯的大量蛋白質沉澱限定了相對於現有技術的一項界定步驟，以及本發明的一個最終實施方案。本領域的技術人員知道，被適當操控的從溶液中析出蛋白質的行為具有能細微改變蛋白質結構、最終聚集體的組織和蛋白質間的空間的效果。因此，交聯處於溶液中的單個蛋白質(或最好是納米簇)的行為並不能等同於交聯已沉澱的大聚集體的動力學。後者的例子被用來形成本發明的前體材料，遵循完全不同的交聯動力學、交聯分布和空間依賴性， 並在反應完成後顯示出本質上不同的產品成分。這兩種交聯方法還存在概念上的區別，因為其中一種描述了均相的過程(即現有技術)，而另外一種確實為非均相的過程(即本發明)。蛋白質和交聯劑的成分、蛋白質-蛋白質堆積的密度、交聯的密度和空間分布(即整體上可量化為空間密度分級的交聯非均一性)、交聯的化學本質(化學的、酶的或脫水熱化的)，以及每個蛋白質的交聯的精確位點，在本發明和現有技術之間都有不同。即使是相同基礎蛋白質構成每一種材料，情況也是如此；顆粒的最終化學組成、顆粒內部的蛋白質間連接性以及蛋白質的相對空間方位將會不同。這樣，本發明所描述的交聯蛋白納米顆粒的特性不同於現有技術中描述的納米尺寸的交聯蛋白材料。因此，由自下而上的和自上而下的策略得到的交聯納米聚集體實際上限定了兩種截然不同的、可區別的產品種類。在本發明的交聯蛋白納米晶體產品的情況中，空間密度分級的交聯非均一性、顆粒形狀及其表面拓撲性和能量(由納米化引起)、材料應力(其改變材料的性質)以及可能的多態性(結晶化過程的特點)與現有技術中所描述的納米尺寸的交聯蛋白質材料相比將會不同。關於微米尺寸的交聯蛋白聚集體和晶體，本發明提供了改善的生物活性(歸因於高表面區域，其允許更好的交互作用和適用之處的傳質)和優良的生物利用度(已知納米顆粒可通過各種途徑被吸收並進入體內)的明顯益處。實際上，本發明的交聯蛋白納米顆粒的特性顯然不同於其前體材料。鑑於以上兩個段落的描述，本發明提供了新型的交聯蛋白納米顆粒產品，其顯示出一套有益的特點。所述納米顆粒是交聯的微米或更大尺寸的蛋白質聚集體和晶體的納米碎片產品。


圖1顯示了交聯蛋白納米顆粒(描述中的納米晶體)在溶酶體儲存紊亂的治療/徵兆處理中的應用。圖2顯示了愛爾卡酶(Alcalase)交聯酶納米聚集體以及所述納米顆粒與碘化鉀顆粒的再聚集體的圖像(白色碘化鉀背景上的黑色納米顆粒和再聚集體)。所述圖像用設置在背散射模式(5kV)的SEM拍攝。在碘化鉀存在下用機械剪切將前體(愛爾卡酶CLEA) 在幹態下納米化。圖3顯示了賽威蛋白酶(Savinase)交聯酶納米聚集體以及所述納米顆粒與碘化鉀晶體的再聚集體的圖像，碘化鉀晶體在溼態納米化期間先充當穩定劑。用設置在背散射電子模式GkV)的SEM拍攝的所述圖像示出了賽威蛋白酶的納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色納米顆粒)和再聚集的納米顆粒(參考DLS結果部分)。使用均化器裝置使懸浮在碘化鉀水溶液中的前體(賽威蛋白酶CLEA)納米化。圖4顯示了賽威蛋白酶納米聚集體和所述納米顆粒的大量再聚集體的圖像。用設置於二次電子模式OkV)的SEM拍攝的所述圖像顯示了以碳背襯為背景的納米顆粒和再聚集體。使用均化器裝置使懸浮在水中的前體(賽威蛋白酶CLEA)納米化。不加入穩定劑。圖5顯示了賽威蛋白酶納米聚集體以及所述納米顆粒與碘化鉀顆粒的少量再聚集體的圖像。用設置於背散射電子模式GkV)的SEM拍攝的所述圖像顯示了一種被非常有效地納米化的材料。在研缽中無防溼地手動研磨前體。在存在作為助磨劑、載體和納米顆粒穩定劑的碘化鉀的情況下實現機械粉碎。前體材料是賽威蛋白酶CLEA。圖6顯示了採用設置於二次電子模式在2kV下的SEM所拍攝的以碳為背景的賽威蛋白酶CLEA(非納米化控制)的圖像。圖7顯示了交聯血紅蛋白納米聚集體和潛在地包括所述材料的再聚集的納米顆粒或微米尺寸的交聯血紅蛋白聚集體(意味著不完全納米化)的一種或兩種可能性的圖像。該圖像是用設置於背散射電子模式(5kV)的SEM拍攝。前體是自製的，如在實施例部分中所詳細說明的那樣。圖8顯示了與碘化鉀一起在Gelimat G-I儀器中研磨的愛爾卡酶CLEA的平均數尺寸分布圖(參考實施例1)。數據用Malvern Instruments公司的納米系列粒度儀(即配置有633nm雷射的NanojS品牌)收集。圖9顯示了與碘化鉀一起在研缽中被手動研磨的的賽威蛋白酶CLEA的平均數尺寸分布圖(參考實施例4)。同樣，數據通過使用所述Malvernlnstruments公司的納米系列粒度儀收集。本發明的詳細描述本發明的新穎性涉及微米或更大尺寸的交聯蛋白材料的物理尺寸縮減，以及所述納米化(即尺寸縮減至納米級)方法實現新型交聯蛋白納米顆粒產品的製備的事實。與溶液相蛋白質和非交聯蛋白晶體相比，交聯蛋白晶體(微米尺寸的)因其性能的穩定性而尤其聞名。因交聯而改善的耐用性在微米或更大尺寸的交聯蛋白聚集體(即交聯蛋白沉澱物和凍幹品)的情況中也已有所體現。所述交聯蛋白產品在有機溶劑和接近 100°C的溫度下還有生物活性。依據觀察到的伴隨交聯的「韌化」作用，特別驚奇地表明了交聯蛋白聚集體比相應的未交聯材料更易於納米化。更系統地評定，發現共價交聯蛋白聚集體和晶體的行為直接促進了尺寸縮減過程。較小的顆粒不僅通過交聯的材料形成，而且這些顆粒也能在同樣的力和碎裂條件的場合下在較短的時間內形成。當使用本發明所述的前體材料時，甚至手動研磨(即用手的)也很容易產生交聯蛋白納米顆粒。納米化情況包括施加機械或水力剪切、粉碎機械力和/或聲波或水力空化，應用低溫以減少材料的塑性和化學降解，添加清除劑分子以減少化學降解，加入固體以幫助尺寸縮減(如果是有利的)，以及添加穩定劑分子以防止/限制碎裂後的再凝聚。通過對前體材料施加物理應力，使宏觀尺寸的交聯蛋白顆粒碎裂，產生理想地處於50-200nm範圍內的亞微米尺寸的顆粒分布。存在於納米化媒介中的化學品可被針對性地調整，以促進可控的顆粒碎裂，防止納米化顆粒的再聯合，以及保持構成每個顆粒的單個蛋白質組分的生物完整性。用所述方法得到的產品將展示出生物活性、提高的生物利用度和突出的傳質特點。 任選地，通過用各種物理方法可將這些交聯的納米尺寸的蛋白質產品歸類到更加具體的尺寸範圍中。同樣地，可在隨後的任務中將所述蛋白質產品表面功能化。如前所述，通過調節加工選項可以微調尺寸縮減過程。在納米化媒介中使用附加的化學品、尤其是可磨碎但化學上惰性的固體，可以促進可控的顆粒碎裂。在例如交聯蛋白粉末的乾燥研磨的一些情況中，這些附加的固體應比交聯蛋白在物理學上更堅硬。理想地， 它們應足夠堅硬以促進交聯蛋白的納米化，但並不過度堅硬而破壞蛋白質組分或減緩納米化過程。當研磨很少量的蛋白質時，惰性固體的加入是特別有益的；在這種情況中，所述固體具有三重作用，即向系統中加入額外材料(具有載體的作用)、輔助研磨過程以及使形成的納米顆粒穩定。在液氮中冷卻、隨後手動研磨蛋白質和所述粉末狀研磨添加劑(在瑪瑙研缽中)也可以產生納米顆粒。所述方案尤其適於容易被破壞的蛋白質。有趣的是，冷卻並不是必須需要的，因為在室溫中的手動研磨也能在非常短的時間內產出納米顆粒。在例如交聯蛋白顆粒的「溼」研磨(如懸浮在水相或有機相媒介中的顆粒的機械均質化作用)的一些情況中，需要使用穩定劑來限制再聚集。這些試劑應該存在於水力剪切誘導的研磨過程的期間和之後，從而優化以納米顆粒的形式重新獲得的碎片。若供給足夠的功率密度，則空化方法也可以促進所述前體材料的溼「研磨」(即尺寸縮減)。在所述條件下特別推薦自由基清除劑，因為空化會從溶劑分子中產生起反應性化學物種。作為在連續流過程中實現微米尺寸的交聯蛋白顆粒的碎裂的技術，水力空化尤其引人關注。從生物利用度的角度來看，本發明的所述產品優於非塗布的非交聯蛋白顆粒、交聯的微米或更大尺寸的蛋白質顆粒和單個蛋白質。首先，該交聯蛋白納米顆粒可以通過腸和GALT系統吸收，然而交聯的微米尺寸的顆粒太大。其次，胃酸將不能顯著地破壞該交聯納米顆粒，然而被重新溶解的單個蛋白質無法在到達小腸的行程中倖存。圖1描述了通過所述方法生產的特定的交聯酶納米晶體，作為用以修復溶酶體儲存紊亂的新陳代謝平衡的療法，如酶替換策略領域的技術人員所熟知的機理那樣。也就是說，本發明實施方案的潛在應用不限於藥物。本發明還有許多其他的優點。研磨前體材料的能力允許能夠微調顆粒尺寸。與自下而上的方法相比較，尺寸縮減過程的變量要少得多，以至於一種完善的體系能容易地產生具有可重現的尺寸分布的納米顆粒。對於自下而上的方法而言，不容易獲得同樣的效用。 溶液中的自下而上過程在顆粒尺寸的控制上通常會遭受固有的限制。就像許多溶質分子， 在溶液中偶然形成納米簇的非交聯蛋白會趨於進一步集合，產生高分子量的、微米級的複合體。穩定劑的使用在保持新形成的蛋白質聯合體的納米尺寸上取得了一些成功。相反，已使用了原位化學交聯劑來促進緩慢集合的蛋白質分子的直接溶液相集合；令人遺憾的是，這些試劑也促進了非常高分子量的複合體的形成，即便是在穩定劑的存在下。製備交聯蛋白納米顆粒有類似的挑戰，在其中化學交聯劑只有在蛋白質納米顆粒形成後才被引入；如先前所暗示的，納米級蛋白質複合體進一步聯合(或重新溶解)的固有趨向會在開始此下一步操作之前所消逝的時間段內改變顆粒的尺寸。最後，當使用化學交聯劑時，顆粒間交聯一直是需要考慮的風險；在許多情況下，顆粒間交聯與顆粒內交聯競爭(即一個顆粒內的蛋白質間交聯和蛋白質內交聯)，產生無法控制的尺寸增長，其超過納米級並產生交聯的微米級顆粒。如前面所討論的，前體材料歷程中的交聯過程給出驚人的和顯著有效的易磨性特點，證明其比非交聯蛋白材料更具優勢。交聯似乎產生了順應性更差的蛋白質顆粒。顆粒的順應性更差的事實允許碎裂能夠在更小長度的尺度上有效地延續。對於被高度溶劑化的結晶蛋白質來說，交聯有助於在碎裂時保護結晶性。交聯也保護構成納米顆粒的蛋白質單元的結構穩定性，因此在碎裂階段中促進生物活性的保留。交聯蛋白納米晶體尚未被工業化製備，但在現有技術中有一篇用自下而上方法的出版文獻。類似的，對於一些非常特殊的應用，已經僅使用自下而上集合的方法製備了交聯的納米尺寸的蛋白質聯合體，例如納米聚集體。本發明的實施方案解決了可用的交聯納米顆粒及其生產技術的這種匱乏。特別是，本發明的實施方案擴展了尺寸縮減的原理，並具體地描述了採用基於施加應力以導致碎裂的物理手段的交聯蛋白納米顆粒的製備。用容易製備的起始材料，本發明的尺寸縮減方法是通用的、工業上可採用的、容易拓展的以及便於控制的。因此，大量的交聯蛋白納米顆粒可通過本發明來可控地和方便地製備。當將交聯的微米尺寸的蛋白質材料和在溶液中的相應單個蛋白質的性能相比較時，前者表現出更長的壽命，易於復原，對水解和蛋白酶更穩定，並且更耐受溫度、有機溶劑和PH極端條件。本發明的交聯蛋白納米顆粒展示出類似的、優於單個蛋白質的優點。這些顆粒還擁有優於已建立的微米級顆粒的特定優點，例如增強的傳質，增強的反應性，以及改善的生物利用度和效能。根據已觀察到這些顆粒的納米尺寸會直接影響性能特點，可以合理推斷的是，這種納米顆粒可以替代多種單個蛋白質和多種微米尺寸的交聯蛋白顆粒的作用。在此描述的實施例部分的試驗將顯示根據尺寸縮減的生物活性的顯著改善。更重要的是，這些顆粒的納米尺寸在例如酶替代療法的治療應用中表現出非常有用。此斷言的基本原理建立在基於其他納米顆粒的文獻的研究結果上，其鮮明地提出被適當處理過的酶納米顆粒將保持其生物活性，適應於多種攝入途徑，並在與單體酶或可溶性酶衍生物相比時具有良好的系統生物利用度、改進的大腦進入、快速的細胞內在化、向溶酶體的定向傳遞，以及大大改善的體內穩定性。由於溶酶體儲存紊亂凸顯出細胞器官內的酶缺乏，本發明可修復體內平衡，並作為已建立的藥物輸送策略的改善的和更通用的備選方法。圖1說明了此療法的基本原理。本發明的實施方案可改良用於多種形式的酶療法。酶缺乏可以直接被補償，正如在已建立的替代療法中的情況，或者酶缺乏可以簡單地通過封鎖額外底物的供給路線來進行處理，正如在底物縮減/抑制療法中的情況。可以將這些療法延伸到溶酶體儲存紊亂的範圍以外，因為交聯納米顆粒可以抵抗酸性蛋白質水解的作用和其他出現在胞液和細胞間液中的水解過程。所述納米顆粒的小尺寸意味著容易注射，通過舌下的、口腔的和GALT (與腸關聯的淋巴組織)黏膜途徑的良好吸收，以及無限制地進入諸如染病血管和受損胞間隙的流動受限區域。接著可以推斷的是，交聯蛋白納米顆粒在醫治多種如溶酶體儲存紊亂和囊胞性纖維症的罕見病中能展示出優點。同樣地，它可用來幫助消化失調、酶響應癌症、糖尿病和缺氧症狀、與再灌注相關的損傷和慢性創傷。在充分考慮以上羅列的固有潛在優點後，多種關鍵的療法可以遵循此方法，尤其是以大腦為靶向的基於蛋白質的藥物。產品詳沭本發明提供一種共價交聯蛋白納米顆粒，大小為10-999nm並優選為 50-200nm，適用於生物技術、化妝品、製藥和生物醫學的應用，其特徵在於，所述納米顆粒包含一種或多種蛋白質、吸附物和至少一種零或更大長度的蛋白間交聯，並且以在各空間軸上有至少1微米的物理長度的、成分上相同或近似相同的前體材料的納米碎裂產品(即其是納米碎裂產品)的形式獲得。術語「近似相同」的使用是考慮到可能在尺寸縮減期間產生的微小變化，例如溶劑交換、溶劑替代或改變的蛋白質間堆積。術語「納米碎裂」用來傳達這樣的思想，即本發明的微米或更大尺寸的前體材料被碎裂或再細化成納米尺寸的碎片 (因此捏合成該術語「納米碎裂」)。蛋白質組分可包含酶、激素、受體、結構類、傳輸類或抗體類的蛋白質中的一種或多種。更具體地說，蛋白質組分可包括水解酶、水解酶原、異構酶、 轉移酶、氧化還原酶、裂解酶、連接酶、胰島素、胰增血糖素、胰高血糖素樣肽、促胰島素分泌素(extendin)、促胰島素分泌素衍生物、普蘭林肽、胰島素樣生長因子、胰島素抗體、胰島素原抗體、幹擾素、抗癌單克隆抗體、抗癌疫苗、奈西立肽、抗血小板劑、細胞因子、腫瘤壞死因子α、白介素1受體拮抗劑、HIV-I抑制肽Τ20、人造蛋白質5H_eX、促生長素抑制素、HIV融合抑制劑T-1M9、抗菌蛋白質、溶菌酶、乳鐵傳遞蛋白、細菌素、白介素_2、血管緊縮素原、 血管緊縮素、血管緊縮素轉化酶抑制劑、明膠、膠原質、原骨膠原、殼聚糖、絲蛋白、角蛋白、 肌漿球蛋白、肌動蛋白、生長激素、清蛋白、球蛋白、血紅蛋白、肌球素和/或細胞色素。留心製備的方法，顯然在尺寸縮減方面，每一個交聯蛋白納米顆粒將反映出其前體材料的化學成分和交聯歷程。前體是後來被交聯的微米或更大尺寸的蛋白質聚集體(來自蛋白質沉澱的情況或凍幹的情況)或蛋白質晶體。前體的交聯本質可以是化學的、酶的或去水熱的，並且在各種情況中都是共價的。交聯可從零長度，正如在用碳化二亞胺或真空下加熱(去水熱地)處理的直接連接的蛋白質的情況，變化到使用2-、3_或聚合連接物的20或更大碳單元的蛋白間交聯。在前體材料中構成或促進交聯形成的化學試劑能溶於或分散於水或有機溶劑中。化學試劑不限於下列物質並可為其中的任何一種碳化二醯亞胺、右旋糖酐醛、二烴基二醯亞胺鹽 (dialkyl diimidates)和擁有多達20個橋碳原子的其他雙功能或三功能的交聯劑，和/或戊二醛聚合體、澱粉醛、聚胺、有機矽化合物以及有至少5個功能基團的其他聚合連接物。 在酶法形成交聯的情況中，前體可用任何合適的水解酶、轉移酶和/或氧化還原酶，以及可能的轉移酶例如轉谷醯胺酶來處理。在去水熱法形成交聯的情況中，前體材料可於真空條件下在70-120°C下加熱6-48h。然而，希望交聯蛋白納米顆粒和主要基於蛋白質的前體沿著表面容納吸附物。吸附物的本質會反映前體材料的製備歷程和導致納米顆粒的加工歷程。納米顆粒和前體將負載吸附物，其包含水、有機溶劑、鹽、凍幹保護劑、冷凍保護劑和/ 或表面活性劑中的一種或多種。方法詳沭本發明公開了一種製備交聯蛋白納米顆粒的方法。其步驟包括製備微米或更大尺寸的蛋白質聚集體或晶體，以及交聯該聚集體或晶體以產生前體材料。然後對該前體進行實現納米化的尺寸縮減過程，產生交聯蛋白納米顆粒。尺寸縮減過程可沿著前體材料施加機械剪切力。例如，必需的機械剪切力可用在100-15000rpm、優選在 1000-6000rpm下運行的常規的高剪切混和器/複合裝置產生，其在低於120°C的溫度下的作用時間為30s-10min。尺寸縮減過程也可施加水力剪切應力，其中所述的水力剪切應力使用例如均質器作為分散/混合儀器而施加到水或有機介質中的前體材料上。在均質的情況中，規定的操作條件是100-500rpm並優選1000-2000rpm、5min-3h並優選30min_l. 5h，以及低於100°C的溫度。未預料到的是，儀器並不是必須需要的，因為通過本發明，使用研缽和研杵在過量碘化鉀存在下的手動研磨(粉碎機械力)也能產生交聯蛋白納米顆粒。前體/粉末(即助磨劑)的重量比例處於從2 1到1 1000 (以重量計)的範圍內。最後，納米化也可使用壓力梯度應力來實現，其可在低於80°C的溫度下通過音波或水力空化產生。尺寸縮減方法的又一個方面是研磨過程之前和期間選擇性使用冷卻，其可使前體材料變脆並減少不需要的分解。冷卻的一種方便來源是液氮。尺寸縮減方法的又一個方面是在適當的情況下選擇引入清除劑分子，以便減少由自由基過程、異裂反應過程以及氧化過程引起的蛋白質分解。加入這樣的預防措施在已知會產生大量自由基的空化過程中證明是有用的。 所加入的清除試劑的有益量是相對於前體材料的0. 01-2%重量。所述清除劑無需限於以下物質且可包含其中的一種或多種α -生育酚、柚皮素、視黃醇、碘化物、輔酶Q10、褪黑激素、類胡蘿蔔素萜類化合物、黃酮類多酚、酚酸和酯、穀胱甘肽、N-乙醯基半胱氨酸、植酸、草酸、檸檬酸、丁子香酚、氧雜蒽酮、薑黃色素、黃酮並木脂素、右旋硫辛酸、尿酸、胡蘿蔔素、對苯二酚、抗壞血酸、丁基羥基甲苯、重亞硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽。也推薦用固體粉末添加劑來促進物理尺寸縮減的過程。前體和固體粉末可在尺寸縮減之前以各自的重量比例從 2 1到1 1000地相混合。固體粉末的選擇可包括碘化鉀、碘化鈉、氯化鈉、其他鹼金屬鹽、鹼土金屬鹽、活性炭、二氧化矽、氧化鋁、二氧化鈦、甲殼質、角蛋白和/或聚醯亞胺。尺寸縮減方法的另一個方面是添加以重量計2-100倍過量的穩定劑分子以防止/限制再凝聚。穩定劑分子的選擇無需限於以下物質並可以是其中的一種或多種碘化鉀、碘化鈉、氯化鈉，或任何鹼金屬或鹼土金屬鹽，銨鹽、糖類、多羥基化合物、聚乙烯基吡啶、聚乙烯吡啶烷酮、聚醯胺、檸檬酸、抗壞血酸、清蛋白、羥丙甲纖維素和/或明膠。用本發明的方法生產的交聯蛋白納米顆粒將通過改善生物活性和生物利用度來改善基於蛋白質療法的性能。幾乎所有的給藥途徑均可從本發明中受益，包括口服的、 口腔的、舌下的、GALT的、腹膜內的、肌肉的、皮膚的、皮下的、鞘內的、薄壁組織內的和靜脈內的。本發明的一個特殊目的是修復由溶酶體儲存紊亂引起的新陳代謝失衡。納米顆粒進入細胞內的事實和外來材料引入溶酶體的事實用於提議一種對所述缺陷細胞器官的有效療法。交聯能阻止快速蛋白質水解的事實將有助於促進所述交聯蛋白納米顆粒的口服藥物輸送(對幼童尤佳)。所述納米顆粒的蛋白質水解阻力也將允許在溶酶體內或在其他染病區域內的長期體內活性。實施例實施例1 愛爾卡酶CLEA (CLEA即交聯酶聚集體)的納米化。將愛爾卡酶CLEA (化， CLEA Technologies BV)以及作為助磨劑和穩定劑的碘化鉀(69g)緩慢地混合。用從美國新澤西州Mahwah的Draiswerke，Inc.獲得的G系列的GELIMAT Gl攪拌器/混合器將混合物在機械剪切下研磨。為此，將材料通過帶有閉鎖滑塊的頂部進料鬥送入腔室內。這個機器具有帶中心軸的水平延伸的圓柱形腔室，在中心軸上設有錯列的、大致徑向延伸的混
13合件。該腔室裝備有可測量能量輸入或功率消耗的電錶軸驅動器和溫度傳感器。使軸旋轉 (5000rpm,5min)並使樣品溫度不超過63°C。一旦完成，將精磨過的混合物在離心力的作用下從腔室中快速排出。使用設定在背散射電子模式(5kV)的LEO Supra 35VP儀所進行的 SEM微觀分析(圖2)示出了愛爾卡酶的納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色顆粒)和再聚集的納米顆粒(參考DLS結果部分)。所述混合物被發現保留有生物活性。在未處理的前體材料中未觀察到納米顆粒(圖像未示出)。實施例2 :賽威蛋白酶CLEA的納米化。將賽威蛋白酶CLEA(10mg， CLEATechnologies BV)放入50ml的Falcon管中，並懸浮在含有預溶的碘化鉀(200mg) 作為穩定劑的蒸餾水(IOml)中。使用配備PT-DA 6050/2TM分散頭的1600WPT-MR 6100Polytron均質機(Kinematica的分散和混合技術)將水力剪切應力施加到懸浮液 (1500rpm,1.5h,30-35°C )中。將樣品取出，在液氮中瞬間凍結，然後凍幹。使用設定在背散射電子模式(4kV)的LEO Supra 35VP儀的SEM樣品微觀分析(圖3)示出了賽威蛋白酶的納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色顆粒)和再聚集的納米顆粒(參考DLS結果部分)。 所述混合物展示出相對於來自原料瓶的未經處理的賽威蛋白酶的340%的生物活性。在未處理的前體材料中未觀察到納米顆粒(圖像未示出)。實施例3 賽威蛋白酶CLEA的納米化。重複實施例2的步驟，不同之處是未加入碘化鉀作為穩定劑，並且SEM分析是以碳背襯為背景在二次電子模式(2kV)下進行。獲得很少的自由納米顆粒。事實上，大部分的產品由微米尺寸的再聚集的納米顆粒組成(圖4)。有趣的是，即便這些聚集體也只是微弱地聯合，正如DLS結果所暗示的那樣(見DLS部分)。而且，觀察到相對於未處理過的微米尺寸前體的590%的令人震撼的生物活性(SEM未顯示)， 證實了所述納米顆粒的存活和有益特徵。實施例4 賽威蛋白酶CLEA的納米化。在瑪瑙研缽中無防溼地手動研磨(20min， RT)賽威蛋白酶CLEA (20mg，CLEA Technologies BV)。使用碘化鉀(400mg)作為助磨劑和穩定劑。一旦肉眼不再能看到參差的區域就停止碾壓機械作用。用背散射電子(4kV)的SEM 微觀分析(圖5)示出了賽威蛋白酶的納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色顆粒)。觀察到很少的再聚集納米顆粒(參考DLS結果部分以進一步討論)，證實了手動研磨方法的潛在效用。相對於未處理的CLEA原料，定量了 265%的生物活性(在圖6中顯示，其以碳為背景， 使用在2kV下的二次電子模式)。實施例5 交聯血紅蛋白聚集體的納米化。所有的交聯和檢杳的步驟都在4°C下完成。將牛血紅蛋白(Sigma)與戊二醛交聯。將溶液(5ml，IOOmg Hb/ml)倒入硫酸銨溶液(45ml，3M)，然後靜置(Ih)以產生不溶性聚集體。將新制的戊二醛溶液(lml，25%)加入反應容器中，施加渦旋(3s)，然後在溫和的搖動下培養混合物(20h)。其後加入三羥甲基氨基甲烷(TRIS)緩衝液(2ml，2M，pH8)，並在機械搖動器上緩緩地培養反應(2h)。通過離心作用(10min，7000rpm)重新獲得蛋白質樣品，用0. IM TRIS緩衝液(pH8)清洗三次，用水清洗一次(清洗表示15-20min的搖動；每次清洗完成後將樣品在7000rpm下旋轉IOmin)。 將交聯血紅蛋白聚集體產品在真空條件下乾燥(RT)。蛋白質(0.5g)和碘化鉀(69g) —起被篩分。使用如實施例1中所述的Gelimat混合器將混合物在機械剪切下研磨。SEM分析 (圖7，背散射電子模式，5kV)示出了納米顆粒(白色碘化鉀背景上的黑色顆粒)和微米尺寸的顆粒或納米尺寸的聚集體的存在。對照品和機械加工過的交聯血紅蛋白樣品具有生物活性，後者略強。蛋白酶牛物檢驗。用明膠(磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)緩衝液中的Iwt% )作為底物檢驗尺寸縮減的賽威蛋白酶CLEA和愛爾卡酶CLEA(2h，37°C，550rpm)。在檢驗之前未進行脫鹽。將被檢驗的蛋白質在水中再生，使得最後濃度為lmg/ml。將相同體積的蛋白質懸浮液和明膠-PBS溶液相結合以開始檢驗。類似地檢驗未處理過的CLEA。零蛋白質的對照品由水(實施例3)或適當製備的碘化鉀溶液(其餘實施例)組成。隨後將檢驗介質在 Eppendorf微型離心機中進行離心(12000rpm)，以移除所有不溶性材料，然後通過輸送異丙醇茚三酮溶液(lwt% )到上清液上以得到2 1的水/有機體積比(45min，7(TC )來分析上層清液。在顯色之後，將反應冷卻並在570nm下用分光光度法定量。在超出比耳定律的情況(即A > 1. 5)中，在測量之前用異丙醇準備稀溶液。所有的對照都是相對的，並且是針對未處理過的CLEA原料。基於底物N-乙醯甘氨酸乙酯的其他生物檢驗可在pH7. 5和 40°C下進行，正如用於檢驗枯草桿菌蛋白酶的任何一種已建立的方法。交聯血紅蛋白聚集體牛物檢驗。以鄰苯二胺為顯餼劑來實施基於K Zhang 等人(「Stopped-flow spectrophotometric determination of H2O2 with Hb as catalyst" Talanta 51，179-186，2000)的改進的檢驗方法。使用磷酸鈉(10mM,pH8)代替規定的緩衝系統。在培養(lh，450rpm，RT)之後，通過離心作用將任何顆粒材料從反應溶液中分離。顏色的分光光度法檢測完全按照該文獻所規定的進行。使用動傑光散射(DLS)的尺寸縮減的前體材料(即從實施例1-5獲得的)的顆粒尺寸分析。將納米顆粒樣品(在實施例2-3的情況中為儲存而預先被瞬間凍結和凍幹) 在蒸餾水中再生。得到的懸浮液可根據需要通過加入更多的鹽而被穩定。在優化樣品製備後，分析物之後被轉移到300μ 1的試管中，並置於馬爾文儀器公司的納米系列粒度儀(即配置有633nm雷射的Nano-ZS品牌)內。每一個樣品在製備後立即讀數，因為過多的延遲通常導致聚集(一般產生1-3微米的顆粒)並甚至沉積(如在延長的時間段之後的信號損失所證明的那樣_顆粒溶解，信號損失的另一原因對CLEA來說並不是一種選擇)。對從產生通常不大於500nm(具有合理的尺寸分布)的顆粒尺寸的實施例1_5中獲得的樣品進行三次分析。圖8和圖9分別明確顯示了兩種分析的平均數尺寸分布譜圖，即與碘化鉀一起在Gelimat G-I儀中研磨的愛爾卡酶CLEA(即實施例1)和與碘化鉀一起在研缽中手動研磨的賽威蛋白酶CLEA(即實施例4)。出於分析的目的，將分別為0.3A(lmg CLEA/ml)和 0. 024A(0. 25mg CLEA/ml)的顆粒吸光度讀數輸入到分析程序中。在實施例1_4中，在多個 SEM圖像中的局部區域似乎描繪的是微米尺寸的顆粒；但是，這些較大的顆粒事實上是如 DLS結果所證明的交聯納米顆粒的再聚集簇。DLS結果因此對本發明相當重要，因為其指向一種能基本上定量的、產生具有生物活性的納米尺寸材料的納米碎裂過程。實施例1-3的 DLS分布圖是單峰的，而實施例4是雙峰的。實施例5的DLS分布圖也是雙峰的；但是在此實施例中，納米顆粒、以及微米尺寸的或再聚集的納米顆粒這二者均被觀察到。總的來說， 每一張SEM顯微圖的納米顆粒的尺寸分布與相應的DLS讀數相一致(光散射分布圖通常指示大約40-50%更大直徑的顆粒)。在整個文件中給出了示例性的實施方案。本領域的技術人員可以理解，本發明能以其他特定形式來實施。本領域的技術人員不需要過度的實驗即可以實施類似的其他實施方案。出於本專利文件的目的，本發明的範圍不僅僅限制於特定的實施例或上述描述的備選方案。
權利要求
1.一種共價交聯蛋白納米顆粒，大小為10-999nm並優選為50-200nm，適用於生物技術、化妝品、製藥和生物醫學的應用，其特徵在於，所述納米顆粒包含一種或多種蛋白質、一種或多種吸附物和至少一種零或更大長度的蛋白間交聯，並且是在每個維度中最小長度為 1微米的、成分相同或近似相同的前體材料的納米碎裂產品。
2.根據權利要求1所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，蛋白質組分包含酶、激素、 受體、結構類蛋白質、運輸類蛋白質或抗體類蛋白質中的一種或多種。
3.根據權利要求1或2所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，蛋白質組分包括下述中的一種或多種水解酶、水解酶原、異構酶、轉移酶、氧化還原酶、裂解酶、連接酶、胰島素、胰增血糖素、胰高血糖素樣肽、促胰島素分泌素、促胰島素分泌素衍生物、普蘭林肽、胰島素樣生長因子、胰島素抗體、胰島素原抗體、幹擾素、抗癌單克隆抗體、抗癌疫苗、奈西立肽、抗血小板劑、細胞因子、腫瘤壞死因子α、白介素1受體拮抗劑、HIV-I抑制肽Τ20、人造蛋白質 5H-ex、促生長素抑制素、HIV融合抑制劑T-1249、抗菌蛋白質、溶菌酶、乳鐵傳遞蛋白、細菌素、白介素-2、血管緊縮素原、血管緊縮素、血管緊縮素轉化酶抑制劑、明膠、膠原質、原骨膠原、殼聚糖、絲蛋白、角蛋白、肌漿球蛋白、肌動蛋白、生長激素、清蛋白、球蛋白、血紅蛋白、 肌球素和/或細胞色素。
4.根據權利要求1到3中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，所述納米顆粒反映了所述前體材料的化學成分、交聯歷程和加工歷程。
5.根據權利要求1到4中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，所述前體是交聯蛋白聚集體(沉澱物或凍乾物)或晶體。
6.根據權利要求1到5中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，共價交聯通過以化學方式、酶方式或去水熱方式處理所述前體材料來實現。
7.根據權利要求1到6中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，零或更大長度的蛋白質間交聯通過以化學方式、酶方式或去水熱方式處理所述前體材料來實現。
8.根據權利要求1到7中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，在所述前體材料中形成交聯的化學試劑能溶於或分散於水或有機溶劑材料中，並且包含碳化二醯亞胺； 右旋糖酐醛；二烴基二醯亞胺鹽和擁有多達20個橋碳原子的其他雙功能或三功能的交聯齊U;和/或戊二醛聚合體、澱粉醛、聚胺、有機矽化合物以及有至少5個功能基團的其他聚合連接物。
9.根據權利要求1到8中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，在所述前體材料中形成交聯的酶是水解酶、轉移酶和/或氧化還原酶。
10.根據權利要求1到9中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，在所述前體材料中形成交聯的酶是轉氨酶。
11.根據權利要求1到10中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，所述前體材料通過在真空條件下在70-120°C下加熱蛋白質粉末6-4 來去水熱式地交聯。
12.根據權利要求1到11中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒，其特徵在於，前體材料中的所述吸附物包含水、有機溶劑、鹽、凍幹保護劑、冷凍保護劑和/或表面活性劑。
13.一種製備根據權利要求1所述的交聯蛋白納米顆粒的方法，包括製備微米或更大級的蛋白質聚集體或晶體的步驟，以及交聯該聚集體或晶體以提供所述前體材料的步驟， 其特徵在於，對所述前體進行會引起納米化的尺寸縮減過程，產生最終產品。
14.根據權利要求13所述的納米化方法，其特徵在於，對所述前體材料施加機械剪切力。
15.根據權利要求13或14所述的納米化方法，其特徵在於，使用在100-15000rpm且優選在1000-6000rpm下運行的常規高剪切攪拌器/混合裝置來對所述前體材料施加機械剪切力。
16.根據權利要求13到15中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，機械剪切力在低於120°C的溫度下施加到所述前體材料上30s-10min。
17.根據權利要求13到16中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，對所述前體材料施加水力剪切應力。
18.根據權利要求13到17中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，使用在 100-5000rpm且優選在1000-2000rpm下運行的均質器作為分散/混合儀器來將水力剪切應力施加到水或有機介質中的所述前體材料上。
19.根據權利要求13到18中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，水力剪切應力在低於100°C的溫度下施加到所述前體材料上5min到汕，優選為30min到1.釙。
20.根據權利要求13到19中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，將粉碎機械力施加到所述前體材料上。
21.根據權利要求13到20中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，通過使用研缽和研杵的手動研磨來施加粉碎機械力以便粉碎所述前體材料，以按重量計的從2 1到 1 1000的各自比例來供給前體和作為助磨劑固體粉末。
22.根據權利要求13到21中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，在低於80°C的溫度下通過音波或水力空化將壓力梯度應力施加到所述前體材料上。
23.根據權利要求13到22中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，對所述前體材料施加冷卻，以使其變脆並減少分解。
24.根據權利要求13到23中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，尺寸縮減之前和期間的冷卻用液氮來完成。
25.根據權利要求13到M中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，加入清除劑分子以減少蛋白質分解，加入量為相對於前體材料的0. 01-2%重量。
26.根據權利要求13到25中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，清除劑分子為 α -生育酚、柚皮素、視黃醇、碘化物、輔酶Q10、褪黑激素、類胡蘿蔔素萜類化合物、黃酮類多酚、酚酸和酯、穀胱甘肽、N-乙醯基半胱氨酸、植酸、草酸、檸檬酸、丁子香酚、氧雜蒽酮、薑黃色素、黃酮並木脂素、右旋硫辛酸、尿酸、胡蘿蔔素、對苯二酚、抗壞血酸、丁基羥基甲苯、 重亞硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽。
27.根據權利要求13到沈中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，加入固體粉末以促進物理尺寸縮減的過程，以按重量計的從2 1到1 1000的各自比例來供給前體和所述固體粉末。
28.根據權利要求13到27中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，所述固體粉末為碘化鉀、碘化鈉、氯化鈉或其他鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽、活性炭、二氧化矽、氧化鋁、二氧化鈦、甲殼質、角蛋白和/或聚醯亞胺。
29.根據權利要求13到觀中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，加入以重量計2-100倍過量的穩定劑分子以防止/限制再凝聚。
30.根據權利要求13到四中任一項所述的納米化方法，其特徵在於，穩定劑分子為碘化鉀、碘化鈉、氯化鈉，或任何鹼金屬或鹼土金屬鹽，銨鹽、糖類、多羥基化合物、聚乙烯基吡唆、聚乙烯吡啶烷酮、聚醯胺、檸檬酸、抗壞血酸、清蛋白、羥丙甲纖維素和/或明膠。
31.通過如權利要求13到四中任一項所述方法製備的如權利要求1到12中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒在提高經由任何給藥途徑的治療性能中的應用，所述給藥途徑包括口服的、口腔的、舌下的、GALT的、腹膜內的、肌肉的、皮膚的、皮下的、鞘內的、薄壁組織內的和靜脈內的。
32.通過如權利要求13到四中任一項所述方法製備的如權利要求1到12中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒在修復由溶酶體儲存紊亂引起的新陳代謝失衡中的應用。
33.通過如權利要求13到四中任一項所述方法製備的如權利要求1到12中任一項所述的交聯蛋白納米顆粒在罕見病、囊胞性纖維症、消化失調、酶響應癌症、糖尿病和缺氧症狀、與再灌注相關的損傷、慢性創傷和大腦病狀的治療中的應用。
全文摘要
本發明涉及交聯蛋白納米顆粒及其生產方法。所述方法包括通過機械的或去水熱的剪切、機械粉碎、音波空化和/或水力空化來製備和納米化(即尺寸縮減至納米級)蛋白質納米顆粒前體材料，即微米或更大尺寸的交聯蛋白。
文檔編號A61K9/51GK102481263SQ201080038893
公開日2012年5月30日 申請日期2010年7月7日 優先權日2009年7月7日
發明者阿爾佩·塔拉爾普 申請人:薩班哲大學