耐脅迫轉基因小麥植物的製作方法

2023-12-10 04:18:26

專利名稱：耐脅迫轉基因小麥植物的製作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因小麥植物(wheat plants)。具體地，本發明涉及對環境脅迫，例如鹽脅迫的耐性增加的轉基因小麥植物。
背景技術：
在全世界範圍內，鹽度升高對農業造成的威脅正以令人警覺的速度增長。隨著世界人口的增加和耕地的減少，充分利用植物生物技術提高作物產量具有了關鍵性的意義。為了減少鹽脅迫對作物產量的影響，人們需要植物例如穀類(cereal)植物的耐鹽性品種。
人們已經多次嘗試培育對鹽脅迫耐性提高的植物。例如，通過常規的野生種雜交育種(crossbreeding)，已經產生了對鹽脅迫有一些抗性的小麥新品種。但是，常規的雜交育種對產生新作物品種而言是一個緩慢的過程，而且有限的脅迫抗性的種質來源，以及親緣關係較遠的植物種類之間雜交的不相容性，都給常規的育種技術造成了其它的問題。而且，常規雜交育種成功產生的植物的耐鹽性仍然相對較低，商品化品種的耐性不過100mM的鹽。
鹽脅迫是受影響的植物的細胞中水勢的下降，以及影響植物細胞的關鍵生化途徑的過量的鈉離子造成的。近來，研究已經轉向分子手段，以發展對鹽脅迫的抗性增加的作物。積累的實驗觀察結果和理論思考都提示，植物對鹽脅迫的耐性背後可能存在的機制，是相容性低分子量滲透質，例如多元醇/糖類(sugars)，特定的胺基酸，以及鎓類(onium)化合物的積累。
許多研究已經把植物中脯氨酸的積累與耐鹽性的提高，以及對脫水(water deprivation)、高溫和低溫、重金屬毒性、病原體感染、厭氧生活、營養物不足、大氣汙染以及紫外照射的耐性增加聯繫起來(見例如Stewart和Lee；1974；Planta；120279-289；Briens和Larher；1982；Plant；Cell Environ.；5287-292；Barnett和Naylor；1966；Plant Physiol.；411222-1230；Boggess等；1976；Aust.J.Plant Physiol.；3513-525；Jones等；1980；Aust.J.Plant Physiol.；7193-205；Katz和Tal；1980；Z.Pflanzenphysiol.Bd.；98283-288；Treichel；1986；Plant Physiol.；67173-181；Thomas等；1992；PlantPhysiol.98626-631)。Hare和Cress(1997)所綜述的研究指出，對植物施加脅迫的過程中，植物中脯氨酸水平的增加與負面生理效應的減輕相聯繫。例如，對多次研究中收集的實驗證據的分析提示，脯氨酸的積累可能起到保護植物細胞膜和多肽不受無機離子和極端溫度的不良影響的作用。
植物細胞中的脯氨酸濃度可以通過增加脯氨酸生產和/或減少脯氨酸降解來提高。在植物細胞中生產脯氨酸的途徑有兩條。它們是穀氨酸途徑(glutamate pathway)和鳥氨酸途徑(orthinine pathway)。有人提出，在年幼的擬南芥(Arabidopsis thaliana)植株中脯氨酸是通過穀氨酸或鳥氨酸途徑生產的，而在成熟的植株中，或當遭受脅迫時，通常是穀氨酸途徑佔主導地位(參見例如Roosens等；1998；Plant Physiol；117263-271)。
編碼參與特定的滲透質例如脯氨酸的生物合成的酶的數種基因已經被導入了雙子葉植物菸草中。然而，雖然再生的菸草植株對鹽脅迫顯示了部分的耐性(參見例如Tarczynski等；1993；Science；259508-510；Kishor等；1995；Plant Physiol.；1081387-1394；Lilius等；1966；Biotech.；14177-180)這些研究卻似乎沒有繼續下去。
更重要的是，雖然目前已經用雙子葉植物菸草作了一些研究，但還沒有參與滲透質例如脯氨酸的生物合成的基因被導入到小麥植物中。因此，對能夠耐受的脅迫的商品化小麥植物仍然存在需求。
發明概述發明人驚奇地發現，通過將編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子導入小麥植物中，提供了對脅迫的抗性誘導的或增加的轉基因小麥植物。由此，本文所公開的發明的最一般的形式提供耐脅迫小麥植物及保護所述植物的方法。該方法使用編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子。
本發明的第一個方面中提供一種耐脅迫小麥植物，其已被編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子轉化。
本發明的第二個方面中提供保護小麥植物免受脅迫的方法，包括將編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子導入小麥植物的步驟。
在一個實施方案中，所述脅迫選自乾旱(drought)、鹽、脫水(dehydration)、熱(heat)、寒冷(cold)、凍結(freezing)、水浸(water logging)、傷害(wounding)、機械脅迫(mechanical stress)、氧化脅迫(oxidative stress)、臭氧、高光(high light)、重金屬、營養物剝奪(nutrient deprivation)和有毒化學品。更優選地，所述脅迫是鹽、霜凍(frost)或乾旱。最優選地，所述脅迫是多於100mM的鹽或低於0℃的溫度的存在。
所述核酸分子可以是cDNA、RNA或其雜交分子。優選地，所述核酸分子是編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的cDNA分子。最優選地，所述cDNA分子具有核苷酸序列，其基本上如圖2(SEQ ID NO1)所示或為其生物學活性片段。
所述核酸分子可以整合(integrate)到宿主細胞的基因組中，或可以作為染色體外元件(extrachromosomal element)存在。
鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)核酸分子可以分離自任何植物物種。優選地，所述植物是擬南芥。
被所述鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)核酸分子轉化的小麥植物可以是任何品種的小麥植物。優選地，所述小麥植物選自普通小麥(Triticum aestivum)和Triticum durum。
在第三個方面中，本發明提供包含編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子的轉基因小麥植物，植物材料，種子或其後代，其中所述核酸分子的表達導致產生能在高於(more than)100mM的鹽存在下生長的轉基因植物、植物材料、種子或其後代。
在第四個方面中，本發明提供一種核酸構建體，其包含從植物分離的啟動子和如本文所定義的鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)基因。
所述啟動子可以是組成性(constitutive)，遍在性(ubiquitous)、脅迫誘導性(stress-inducible)、組織特異性(tissue specific)或發育控制性(developmentally controlled)的。優選地，所述啟動子是泛素啟動子。
在一個實施方案中，所述構建體基本上如圖1所示。然而應當理解，可以通過化學或酶促處理在體外、或利用重組DNA技術在體內生成這些構建體的修飾和改變的形式。這樣的構建體與公開的那些可以有例如一個或多個核苷酸替換、缺失或插入的不同，但基本上保持本發明的構建體或核酸分子的生物活性。
在另一個實施方案中，所述轉基因小麥植物還包含已被下調的內源性脯氨酸降解系統。
所述轉基因小麥植物還可包含編碼選擇標記的多核苷酸，該多核苷酸與編碼OAT的多核苷酸可操作地連接，從而便於所述轉基因小麥植物的選擇。
在另一個實施方案中，本發明提供由本發明的轉基因小麥植物生產的食物。
在第五個方面中，本發明提供生產具有被誘導的或提高的耐鹽性的轉基因小麥植物的方法，該方法包括下列步驟a)用編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子轉化小麥植物的植物組織或細胞；b)將該組織或細胞再生為完整植株；c)以足夠誘導或增加植物對高於(greater than)100mM的鹽的耐性的條件和時間在再生的植物中表達OAT。
在另一個實施方案中，所述方法還包括用多核苷酸轉化所述小麥植物的步驟，從而便於選擇所述轉基因小麥植物，其中所述多核苷酸編碼選擇標記並與編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子可操作地連接。
在另一個實施方案中，所述方法還包括下調所述轉基因小麥植物中的內源性小麥脯氨酸降解系統的步驟。


圖1顯示包含與OAT可操作地連接的泛素啟動子的核酸構建體。
圖2顯示OAT的核酸序列。
圖3顯示OAT的胺基酸序列。
圖4顯示品系2490.1的高、中和低度耐性水平。該轉基因品系分成3個不同的組。
圖5顯示單次霜凍事件13天後轉基因植物(2490.1和2721.1)及其各自的對照品種(Westonia和Carnamah)的種子發育所受的影響。
定義下面的敘述用到重組DNA技術中使用的多種術語。除非另有定義，本文中使用的所有的技術和科學術語都具有本發明所屬領域的技術人員通常理解的含義。下面這些參考文獻為本領域技術人員提供了本發明中使用的多個術語的一般性定義Singleton；等；《Dictionary of Microbiology andMolecular Biology》(第二版.1994)；《The Cambridge Dictionary of Science andTechnology》(Walker編；1988)；《The Glossary of Genetics》；第五版；Rieger；R等人編；Springer Verlag(1991)；及Hale和Marham；The Harper CollinsDictionary of Biology(1991)。但是，為了便於清楚、一致地理解對本說明書和權利要求書，包括給予這些術語的範圍，提供了下面的定義。
術語「細胞」可以指來自植物的任何細胞，包括但不限於體細胞(somaticcells)、配子(gemetes)或胚(embryos)。
「胚」是指萌發(germination)開始前的孢子體(sporophytic)植物。胚可以通過有性雜交(sexual crossing)或自交的配子受精作用而形成。「有性雜交」是指一植株被另一植株傳粉。「自交」(selfing)是通過自體受粉，即花粉和胚珠來自同一植株，而產生種子。術語「回交」(backcrossing)是指將F1雜種植株與其兩親之一雜交。典型地，回交被用來將賦予簡單遺傳的、高度可遺傳的性狀的基因轉移到近交系(inbred line)中。該近交系稱為輪迴親本(recurrent parent)。所希望的性狀的來源稱為供體親本(donorparent)。供體親本和輪迴親本有性雜交後，選擇具有供體親本的所希望的性狀的F1雜種植株，並重複地與輪迴親本或自交系雜交(即回交)。
胚還可以由「胚體質發生」(embryo somatogenesis)和「克隆」(cloning)形成。體細胞胚胎(somatic embryogenesis)是指由植物的細胞、組織或器官直接或間接地形成胚。
間接體細胞胚胎的特徵在於愈傷組織的生長和愈傷組織表面上胚的形成。
直接體細胞胚胎是指從外植體組織上的單個細胞或細胞群形成無性胚(asexual embryo)，中間未插入愈傷組織階段(intervening callus phase)。由於愈傷組織傾向於衍生物異常的植株，直接體細胞胚胎是優選的。
通用的術語「顆粒」(grain)是指植株的胚珠中存在的胚乳。
短語「導入核酸序列」指通過重組手段，包括但不限於農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化，生物射彈(biolistic)方法，電穿孔，in planta技術，等等導入核酸序列。術語「核酸」與DNA、RNA和多核苷酸同義。含有導入的核酸序列的植物在這裡稱為R，代植物。R1植物也可以由導入了所述核酸的植物的克隆、有性雜交或自交而產生。
「核酸分子」或「多聚(polynucleic acid)核酸分子」在這裡指所有形式的脫氧核糖核酸和核糖核酸，即，單鏈和雙鏈的DNA、cDNA、mRNA等。
「雙鏈DNA分子」指形成正常的雙鏈螺旋的多聚體形式的脫氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)。該術語僅僅指所述分子的一級和二級結構，而不將其局限於任何具體的三級結構形式。因此該術語包括出現在線性DNA分子(例如限制片段)、病毒、質粒和染色體中以及其它地方的雙鏈DNA。在討論具體的雙鏈DNA分子結構時，本文可能依照只給出沿DNA非轉錄鏈(即具有與mRNA同源的序列的鏈)上5』到3』方向的序列的常規來描述序列。
如果按照遺傳密碼翻譯某DNA序列產生某胺基酸序列(即該DNA序列「編碼」該胺基酸序列)，則稱該DNA序列「對應於」(corresponds)該胺基酸序列。
如果一個DNA序列和另一DNA序列編碼相同的胺基酸序列，則稱該DNA序列「對應於」另一DNA序列。
如果兩個DNA序列在規定的長度上有至少約85％，優選至少約90％，最優選至少約95％的核苷酸匹配，則稱這兩個DNA序列「基本上相似」。
DNA構建體的「異源」區或域，是指較大的DNA分子中可辨別的DNA片段，在自然界中該片段不與所述較大的DNA分子相伴隨地出現。因此，當所述異源區編碼植物基因時，通常位於該基因側翼的DNA在來源生物的基因組中並不位於該植物基因組DNA的側翼。異源區的另一例子是編碼序列本身不出現在自然界中(例如，基因組編碼序列含有內含子的cDNA，或具有與天然基因不同的密碼子的合成序列)的構建體。等位變異或天然發生的突變事件不產生本文所定義的DNA異源區。
「編碼序列」是對應於或編碼蛋白質或肽序列的密碼子的符合閱讀框的(in-frame)序列。如果兩個編碼序列或它們的互補序列編碼相同的胺基酸序列，則稱它們彼此對應。伴隨有合適的調控序列的編碼序列可以在體內被轉錄並翻譯為多肽。在編碼序列的3』一側通常會有聚腺苷酸化信號和轉錄終止序列。
多核苷酸「同源物」(homologs)是指單鏈或雙鏈形式的、含有天然核苷酸的已知類似物的DNA或RNA和其聚合物，它們與參比的核酸具有相似的結合性質，並且其代謝的方式與天然存在的核苷酸相似。
「轉基因植物」是指已經通過重組技術，例如含核酸的載體，導入了核酸的植物。「載體」是指這樣的核酸組合物，其能夠轉導、轉化或感染細胞，從而導致該細胞表達載體編碼的核酸，並且可選地，表達不同於細胞的天然蛋白質的蛋白質，或以非細胞天然的方式表達蛋白質。載體包括要被所述細胞表達的核酸(通常是RNA或DNA)。載體可選地包括幫助核酸實現進入細胞的物質，例如反轉錄病毒粒子(retroviral particle)，脂質體，蛋白質外殼(protein coating)等等。載體包含允許它們在細菌或其它非植物生物中擴增和被選擇的核酸序列。對載體和分子生物學技術的描述可見Current Protocols in Molecular Biology；Ausubel等人編；CurrentProtocols；Greene Publishing Associates；Inc.和John Wiley Sons；Inc.聯合出版；(through and including the 1998 supplement)(Ausubel)。
「質粒」是載體的一類，其包含能夠在植物細胞中在染色體外或作為植物細胞染色體的一部分複製的DNA；並且表示為在大寫字母和/或數字前/後的小寫的「p」。本文所用的起始質粒是可商購的、並且公眾可以在不受限制的基礎上得到的質粒，或者可以從這些可得到的質粒出發通過本文公開的方法和/或依照已公開的方法構建。在某些情形下，本領域一般技術人員顯然可知，本領域已知的其它質粒可以與本文描述的質粒互換地使用。
短語「表達盒」指載體中要被轉錄的核酸序列，以及指導表達的控制序列。術語「控制序列」指在特定的宿主細胞中表達可操作地連接的核苷酸編碼序列所需的DNA序列。適於原核生物中表達的控制序列包括例如複製起點、啟動子、核糖體結合位點和轉錄終止位點。適於真核生物中表達的控制序列包括例如複製起點、啟動子、核糖體結合位點，聚腺苷酸化信號和增強子。最重要的控制序列之一是啟動子。
「啟動子」是指導核酸轉錄的核酸控制序列的排列(array)。如本文中使用的，啟動子包含轉錄起始位點附近的必要的核酸序列，例如，對聚合酶II型啟動子而言，TATA元件。
啟動子還可選地包含遠端的(distal)增強子或阻抑蛋白(repressor)元件，它們可以位於距離轉錄起始位點達數千個鹼基對的地方。啟動子可以是同源的，即，天然存在時指導所需核酸的表達，或者是異源的，即在天然存在時指導源自不同於所需核酸的基因的核酸的表達。具有異源啟動子的融合基因對於例如調控被編碼的蛋白的表達是理想的。「組成性」啟動子是指在大多數環境和發育條件下，在所選生物體中有活性的啟動子。「誘導型」(inducible)啟動子是指在所選的生物體中受環境或發育性調控的啟動子。
例子包括來自植物病毒的啟動子，例如來自花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子，如Odell等；(1985)；Nature；313810-812，以及來自例如稻肌動蛋白(McElroy等；(1990)；Plant Cell；163-171)；泛素(Christensen等；(1992)；Plant Mol.Biol.12619-632；和Christensen；et al.；(1992)；Plant Mol.Biol.18675-689)；pEMU(Last等；(1991)；Theor.Appl.Genet.81581-588)；MAS(Velten等；(1984)；EMBO J.32723-2730)；和玉米H3組蛋白(Lepetit等；(1992)；Mol.Gen.Genet.231276-285；and Atanassvoa等；(1992)；PlantJournal 2(3)291-300)的基因的啟動子。
其它可以與OAT多核苷酸連接以供在植物細胞中表達的調控元件包括終止子、聚腺苷酸化序列、以及編碼允許蛋白質在植物細胞中定位或從細胞分泌的信號肽的核酸序列。已知這樣的調控元件，以及添加這些元件或將這些元件與複製酶基因的調控元件交換的方法，包括但不限於，3』終止區和/或聚腺苷酸化區，例如根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂氨酸合酶(nos)基因(Bevan等；(1983)；Nucl.Acids Res.12369-385)；馬鈴薯蛋白酶抑制物II(PINII)基因(Keil等；(1986)；Nucl.Acids Res.145641-5650；和An等；(1989)；Plant Cell；1115-122)；以及CaMV 19S基因(Mogen等；(1990)；Plant Cell；21261-1272)的3』終止區和/或聚腺苷酸化區。
植物信號序列，包括但不限於，使蛋白質靶向植物細胞的細胞外基質的信號肽編碼DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等，(1989)，J.Biol.Chem.2644896-4900)，Nicotiana plumbaginifolia延伸基因(extension gene)(DeLoose等，(1991)，Gene，9995-100)，將蛋白質靶向液泡的信號肽，如甘薯(sweet potato)sporamin基因(Matsuka等，(1991)，PNAS，88834)，以及大麥凝集素基因(Wilkins等，(1990)，Plant Cell，2301-313)，導致蛋白質被分泌的信號肽，例如PRIb的信號肽(Lind等，(1992)，Plant Mol.Biol.1847-53)，或大麥α澱粉酶(BAA)的信號肽(Rahmatullah等(1989)，Plant Mol.Biol.12119，在此併入作為參考)。
對本發明而言，啟動子序列的3』末端與編碼序列的翻譯起始密碼子相鄰，並且向上遊延伸，包括引發高於背景可檢測的水平的轉錄所需的最少數目的鹼基或元件。在啟動子序列中可存在轉錄引發位點(transcriptioninitiation site)(可用S1核酸酶作圖來方便地確定)，以及負責結合RNA聚合酶的蛋白質結合域(共有序列)(consensus sequence)。
「外源」元件是指這樣的元件，其對宿主細胞而言是外來的，或者對宿主細胞而言是同源的，但處在該宿主細胞中其通常不出現的位置。
DNA的「消化」，是指用僅作用於該DNA中特定位置的酶來催化切割該DNA。這樣的酶稱為限制酶或限制性內切核酸酶，而DNA中被這些酶切割的位點稱為限制位點。如果DNA中有多個限制位點，則消化會產生兩個或更多的線性化DNA片段(限制片段)。本文中使用的多種限制酶是可商購的，而且它們的反應條件，輔因子，及其它要求均按照酶製造商所確定的使用。限制酶通常用縮寫來指代，該縮寫包括大寫字母及後隨的其它字母，表示各限制酶所最初來源的微生物；以及數字，指明具體的酶。一般而言，在約20μl的緩衝溶液中用1-2個單位的酶消化1μg的DNA。對於具體的限制酶，合適的緩衝液和底物量由製造商所規定，和/或者是本領域公知的。
從限制消化物「回收」或「分離」特定的DNA片段，典型地是通過下述實現的在聚丙烯醯胺或瓊脂糖凝膠上電泳分離消化產物(其稱為「限制片段」)，根據相對於已知分子量的標記DNA片段的遷移率鑑定目標片段，切下含有所需片段的部分凝膠，然後從該凝膠分離DNA，例如通過電洗脫(electroelution)。
「連接」(ligation)指在兩條雙鏈DNA片段間形成磷酸二酯鍵的過程。除非另有說明，連接使用已知的緩衝液和條件，且對於每0.5μg的大約等摩爾量的待連接DNA片段使用10個單位的T4 DNA連接酶。
「寡核苷酸」是指長度較短的單鏈或雙鏈多聚脫氧核苷酸，其用已知方法化學合成(涉及例如，三酯，亞磷醯胺，或膦酸化學)的、例如Engels等，(1989)，Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.28716-734所描述的。它們然後用例如聚丙烯醯胺凝膠電泳純化。
如本文所使用的，「聚合酶鏈式反應」或「PCR」是指一種在體外擴增所需的核苷酸序列的方法，如美國專利4,683,195所述。一般而言，PCR方法涉及重複的引物延伸合成循環，使用兩條能夠優先與模板核酸雜交的寡核苷酸引物。典型地，PCR方法中使用的引物與模板中位於要擴增的核苷酸序列的兩端或兩側的核苷酸序列互補，雖然也可以使用與要擴增的核苷酸序列互補的引物。Wang等人，《PCR Protocols》，pp.70-75(Academic Press，1990)；Ochman等人，《PCR Protocols》，pp.219-227；Triglia等人，(1988)，Nucl.Acids Res.168186。
「PCR克隆」是指用PCR方法擴增特定的所需核苷酸序列，所述核苷酸序列存在於來自合適的細胞或組織來源的核酸，包括全基因組DNA和從全細胞RNA轉錄的cDNA之中。Frohman等，(1988)，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，858998-9002；Saiki等，(1988)，Science，239487-492；Mullis等，(1987)，Meth.Enzymol.155335-350.
短語「可操作地編碼」(operably encodes)指啟動子和第二核酸序列之間的功能性聯接(functional linkage)，其中所述啟動子序列引發對應於所述第二序列的RNA的轉錄。
術語「後代」(progeny)指某一特定植株(自交)或植株對(雜交或回交)的後裔(descendants)。這些後裔可以是F1，Fez或任何後續的代。
典型地，親本(parents)是花粉供體和胚珠供體，將它們雜交以產生本發明的後代植物。
親本還指本發明的雜種植物(F2植物)的F1親本。最後，親本指輪迴親本，其與本發明的雜種植物回交而產生本發明的另一種雜種植物。
術語「產生轉基因植物」是指產生本發明的植物。所述植物是通過重組技術，例如克隆、體細胞胚胎發生(somatic embryogenesis)或本領域技術人員用於產生植株的任何其它技術而產生的。
DNA的「整合」可以通過使用微注射、生物射彈、電穿孔或脂質體轉染(lipofection)將DNA大量導入細胞後進行非同源重組來實現。其它方法，例如同源重組，和/或限制酶介導的整合(restriction enzyme mediatedintegration，REMI)或轉座子也被涵蓋在內，並被認為是改進的整合方法。
「克隆」是從單個細胞或共同的祖先通過有絲分裂而來的細胞群體。
「核酸序列同源物」指含有天然核苷酸的已知類似物的單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，它們與參比核酸具有類似的結合性質，並且以與天然出現的核苷酸類似的方式被代謝。
除非另有說明，特定的核酸序列還默認涵蓋其被保守修飾的變體(例如，簡併密碼子取代)和互補序列，以及明確指明的序列。具體地，簡併密碼子取代(degenerate codon substitution)可以通過產生這樣的序列來實現該序列中，一個或多個被選擇的(或所有的)密碼子的第三位被取代為混合的鹼基(mixed-base)和/或脫氧肌苷殘基(Batzer等，(1991)，Nucleic AcidRes.195081；Ohtsuka等，(1985)，J.Biol.Chem.2602605-2608；和Rossolini等，(1994)，Mol.Cell.Probes 891-98)。術語「核酸」與基因、cDNA和基因編碼的mRNA可以互換使用。
術語「胺基酸序列同源物」是指具有相似的胺基酸序列的蛋白質。本領域的技術人員將認識到，關鍵的胺基酸序列位於蛋白質的功能域之中。因此，對於同源蛋白質而言，可能在胺基酸序列的全長上的同源性少於40％，但在一個功能域中同源性大於90％。除了天然出現的胺基酸外，同源物還涵蓋這樣的蛋白質，其中一個或多個胺基酸殘基是相應的天然出現的胺基酸的人造化學類似物，以及天然出現的蛋白質。
在本文中可以用通用的三字母符號或IUPAC-IUB生物化學命名委員會(Biochemical Nomenclature Commission)推薦的單字母符號來指稱胺基酸。
類似地，核苷酸可以用它們普遍接受的單字母編碼來指稱。
「保守修飾的變體」適用於胺基酸和核酸序列。對於特定的核酸序列，保守修飾的變體指編碼一致的或基本上一致的(identical)胺基酸序列的核酸，或者，核酸不編碼胺基酸序列時，指基本上一致的序列。
由於遺傳密碼的簡併性，任何特定的蛋白都被大量功能上一致的核酸序列所編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU都編碼胺基酸丙氨酸。因此，任何用密碼子確定丙氨酸之處，該密碼子都可以被變換為任何所述的相應密碼子而不改變被編碼的多肽。這樣的核酸變化是「沉默變化」(silent variations)，是保守修飾變化的一種。本文中每個編碼多肽的核酸序列，也都描述了該核酸的每種可能的沉默變化形式。本領域技術人員將認識到，密碼子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密碼子)中的特定核酸可以被修飾而產生功能上相同的分子。因此，編碼多肽的核酸的每種沉默變化形式，都默示地包含在被描述的序列之中。
對於胺基酸序列，本領域技術人員將認識到，在核酸、肽、多肽或蛋白質序列中發生個別的取代、缺失或添加，使得在被編碼的序列中改變、添加或缺失單個胺基酸或小部分胺基酸時，如果這樣的改變導致胺基酸被替換為化學上相似的胺基酸，則這樣的單個取代、缺失或添加是「保守修飾的變體」。提供功能上相似的胺基酸的保守性取代表是本領域公知的。
下面的六個組分別包含相互為保守性取代的胺基酸1)丙氨酸(A)，絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，穀氨酸(E)；3)天冬醯胺(N)，谷胺醯胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W).
(見，例如，Creighton，PROTEINS(1984))。
如本文中所用的，術語「轉化」和「轉染」指使用分子生物學家所用的多種手段，在培養物中或在植物的器官中，將所需的核酸例如質粒或表達載體導入植物的細胞的過程。因此，當外源DNA被導入細胞的細胞壁之內時，稱該細胞已經被該外源DNA「轉化」。外源DNA可以整合於(共價地連接)也可以不整合於構成該細胞基因組的染色體DNA。例如在原核生物和酵母中，外源DNA可能被保持在附加型元件(episomal element)例如質粒上。對於真核細胞而言，穩定轉染的細胞是指這樣的細胞，其中外源DNA通過染色體複製而被遺傳給子細胞。這種穩定性表現在真核細胞能夠建立由含有外源DNA的子細胞群體構成的細胞系或克隆。
有多種已知的將外來基因導入植物的方法，可以用來將修飾的核酸插入植物宿主，這些方法包括生物的和物理的植物轉化規程。可參考例如Miki等，(1993)，「Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants」，於《Methodsin Plant Molecular Biology and Biotechnology》，Glick及Thompson編，CRCPress，Inc.，Boca Raton，67-88頁。所選的方法隨宿主植物而不同，包括化學轉染方法例如磷酸鈣，微生物介導的基因轉移例如土壤桿菌(Agrobacterium)(Horsch等，(1985)，Science，2271229-31)，電穿孔，顯微注射和生物射彈轟擊。
用於植物細胞或組織轉化和再生的表達盒、載體以及體外培養方法是已知並可以獲得的。參考例如Gruber等，(1993)，「Vectors for PlantTransformation」於《Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology》中，Glick和Thompson編，CRC Press，Inc.，Boca Raton，89-119頁。
使用最廣的導入表達載體到植物中的方法是基於天然的土壤桿菌轉化系統。根癌土壤桿菌和髮根土壤桿菌(A.rhizogenes)是植物致病性的土壤細菌，其遺傳轉化植物細胞。根癌土壤桿菌的Ti質粒和髮根土壤桿菌的Ri質粒分別攜帶負責遺傳轉化植物的基因。參見，例如，Kado(1991)，Crit.Rev.Plant Sci.101。對土壤桿菌載體系統和土壤桿菌介導的基因轉移方法的描述在Gruber等，同上；Miki等，同上；及Moloney等，(1989)，Plant CellReports，8238中有提供。
類似地，可以將基因插入源自根癌土壤桿菌的或源自髮根土壤桿菌的Ti質粒或Ri質粒。這樣，使用這些質粒可以象上述那樣構建表達盒。已知有很多控制序列，當它們與異源編碼序列偶聯並轉化宿主生物體時，其基因表達對於原編碼序列的組織/器官特異性而言具有保真性。參見，例如，Benfey和Chua(1989)，Science，244174-181。特別適用於這些質粒中的控制序列是供所述基因在多種目標植物中組成性葉特異性表達的啟動子。其它有用的控制序列包括來自胭脂氨酸合成酶基因(NOS)的啟動子和終止子。NOS啟動子和終止子在質粒pARC2中存在，該質粒可獲自美國典型培養物保藏中心，指定名稱為ATCC 67238。如果使用這樣的系統，還必須有來自Ti和Ri質粒的毒力(vir)基因，該vir基因或者與T-DNA部分一起，或者藉助雙元系統(binary system)，其中vir存在於另一載體上。這樣的系統、用於該系統的載體以及轉化植物細胞的方法在下列文獻中有描述被美國專利4,658,082；1993年11月16日授權給Robeson等的美國專利5,262,306引用的、於1986年10月1日提交的美國申請序列號913,914；以及Simpson等(1986)，Plant Mol.Biol.6403-415(也被上述』306專利引用)；這些文獻都以及全部內容併入本文作為參考。
一旦構建了這些質粒，就可將它們置入髮根土壤桿菌或根瘤土壤桿菌中，並用這些載體轉染一般對鹽度敏感的植物種類的細胞。其它數種轉基因植物也在本發明的考慮之內，包括但不限於大豆(soybean)、玉米(corn)、高粱(sorghum)、苜蓿(alfalfa)、稻(rice)、三葉草(clover)、甘藍(cabbage)、香蕉(banana)、咖啡(coffee)、芹菜(celery)、菸草(tobacco)、豇豆(cowpea)、棉(cotton)、甜瓜(melon)和胡椒(pepper)。選擇根瘤土壤桿菌或是髮根土壤桿菌將取決於用其來轉化的植物。一般而言根瘤土壤桿菌是優選用於轉化的生物。大多數雙子葉植物(dicotyledons)，某些裸子植物(gymnosperms)，以及少數單子葉植物(monocotyledons)(例如Liliales和Arales的某些成員對根瘤土壤桿菌感染敏感。髮根土壤桿菌的宿主範圍也很寬，包括大多數雙子葉植物(dicots)和某些裸子植物，包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成員。其它已證明對遺傳轉化植物有效的技術包括粒子轟擊(particlebombardment)和電穿孔。參見，例如，Rhodes等，(1988)，Science，240204-207；Shigekawa和Dower，(1988)，Bio/Techniques，6742-751；Sanford等，(1987)，Particulate Science Technoligy，527-37；和McCabe，(1988)，Bio/Technology，6923-926。
這些細胞一旦被轉化，則可以用來再生出能夠耐受環境脅迫的轉基因植物。例如，可以通過對植物致傷，然後將載體導入創傷部位，來用這些載體感染整株植物。植物的任何部位都可以被致傷，包括葉、莖和根。或者，可以用這些載體接種外植體形式的植物組織，例如子葉組織(cotyledonary tissue)或葉盤(leaf disk)，並在促進植株再生的條件下培養。用髮根土壤桿菌或根瘤土壤桿菌接種植物組織而轉化的、含有編碼目的基因的基因的根(roots)或者枝(shoots)，可以用作植物組織的來源，通過體細胞胚胎發生(somatic embryogenesis)或器官發生(organogenesis)再生出轉基因植物。這樣的再生植物組織的方法的例子在下列文獻中有記載Shahin，(1985)，Theor.Appl.Genet.69235-240；美國專利4,658,082；Simpson等，(1986)，Plant Mol.Biol.，6403-415；及1993年11月16日授權給Robeson等的5,262,306中所引用的、同於1986年10月1日提交的美國專利申請序列號913,913和913,914，在此將它們的全部公開併入作為參考。
雖然土壤桿菌介導的轉化的宿主範圍寬，但這種基因轉移模式對一些重要的作物物種和裸子植物難以奏效(recalcitrant)，儘管近來在稻中獲得了某些成功(Hiei等，(1994)，The Plant Journal，6271-282)。作為土壤桿菌介導的轉化的替代方式，已經發展了數種植物轉化方法，它們被統稱為直接基因轉移技術(direct gene transfer techniques)。
一種普遍適用的植物轉化方法是微粒(microprojectile)介導的轉化，其中DNA被攜帶在尺寸為約1到4μm的微粒表面上。通過生物射彈(biolistic)裝置將表達載體導入植物組織，該裝置將微粒加速到300到600m/s的速度，該速度足以穿透植物細胞壁和膜。(Sanford等，(1987)，Part.Sci.Technol.527；Sanford，1988，Trends Biotech，6299；Sanford，(1990)，Physiol.Plant 79206；Klein等，(1992)，Biotechnology 10268)。
另一種將DNA物理地送入植物的方法是超聲處理(sonification)目標細胞，如Zang等，(1991)，Bio/Technology，9996所述。作為選擇，脂質體(liposome)或原生質球(spheroplast)融合已被用來將表達載體導入植物。參見例如，Deshayes等，(1985)，EMBO J.42731；及Christou等，(1987)，PNAS USA，843962。還有使用CaCl2沉澱、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)或聚-L-鳥氨酸(poly-L-ornithine)將DNA直接攝入原生質體(protoplasts)的報導。參見，例如，Hain等，(1985)，Mol.Gen.Genet.199161；和Draper等，(1982)，Plant Cell Physiol.23451。
還描述了原生質體和完整細胞及組織的電穿孔。參見，例如，Donn等，(1990)，於《Abstracts of the VIIthInt′l.Congress on Plant Cell and TissueCulture IAPTC》中，A2-38，第53頁；D′Halluin等，(1992)，Plant Cell41495-1505；及Spencer等，(1994)，Plant Mol.Biol.2451-61。
或者，將DNA構建體與合適的T-DNA側翼區(fianking regions)組合併導入常規的根瘤土壤桿菌宿主載體。當根瘤土壤桿菌宿主感染植物細胞時，該細菌的毒力功能引導構建體和鄰接的標記(marker)插入該細胞。
顯微注射技術是本領域已知的，並且在科研和專利文獻中有充分的描述。使用聚乙二醇沉澱的DNA構建體導入在Paszkowski等，1984，EMBOJ.32717中有描述。電穿孔技術在Fromm等，1985，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，825824中有描述。射彈轉化則在Klein等，1987，Nature 32770-73中有描述。
根瘤土壤桿菌介導的轉化技術，包括卸甲(disarming)和雙元載體(binary vectors)的應用，也在科研文獻中有充分描述。參見，例如，Horsch等，1984，Science，233496-498，及Fraley等，1983，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA，804803。
轉化本發明的植物的一種優選的方法是微粒轟擊(microprojectilebombardment)。在這種方法中，用滲壓劑(osmoticum)處理目標組織。然後將修飾的OAT基因DNA沉澱，並包被到鎢或金微顆粒(microparticles)上。然後將這些微顆粒裝載到微粒或生物射彈裝置中，並轟擊被處理過的細胞(Bower等，1996)。
發明詳述對本文提及的所有出版物而言，本文引用它們是為了描述並公開這些出版物中報導的、可能用於本發明的規程和試劑。不應將本文的任何內容解釋為承認本發明無權以發明在先為依據使這些公開成為相對本發明的在後公開。
除非另有說明，本發明的實踐中用到現有技術之內的常規分子生物學、植物生物學和重組DNA技術。這些技術對本領域技術人員而言是熟知的，並得到了文獻的充分描述。參見，例如，Maniatis，Fritsch及Sambrook，《Molecular CloningA Laboratory Manual》(1982)；《DNA CloningAPractical Approach》，卷I和II(D.N.Glover編，1985)；《OligonucleotideSynthesis》(M.J.Gait編，1984)；《Nucleic Acid Hybridization》(B.D.Hames和S.J.Higgins編，1985)；《Transcription and Translation》(B.D.Hames和S.J.Higgins編，1984)；B.Perbal，《A Practical Guide to Molecular Cloning》(1984)，和Sambrook，等，《Molecular Cloninga Laboratory Manual》第12版(1989)。
應當理解本發明不限於被描述的具體材料和方法，因為它們是可變化的。還應當理解，本文所用的術語只是為了描述具體的實施方案，而並不意在限制本發明的範圍，本發明的範圍僅被所附的權利要求所限制。必須注意，本文中和所附權利要求中使用的單數形式「a」「an」和「the」包括複數的含義，除非上下文另有明確的指示。因此，例如，提到「a polynucleotide(多核苷酸)」時，包括了多個這樣的多核苷酸，提到「an enhancer element(增強子元件)」時，包括了一個或更多的增強子元件。雖然與本文所述的那些相似或等同的任何材料或方法都可用來實踐或測試本發明，優選的材料和方法是下面所描述的。
本發明的一個最廣泛的方面考慮使用轉基因(transgene)，其被工程操作(engineered)以產生表達鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)基因的轉基因小麥植物。鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)是鳥氨酸途徑(ornithine pathway)的一種酶，其在植物細胞中產生脯氨酸。OAT催化氨基從鳥氨酸轉移到α-酮戊二酸(alpha-ketoglutarate)，產生穀氨酸-5-半醛(glutamic-5-semi-aldehyde)和穀氨酸。因此，本文所用的術語「轉基因植物」意指這樣的植物，其中已納入(incorporate)了OAT多核苷酸序列，包括但不限於可能不是通常地存在的多核苷酸，不是通常地轉錄為RNA或翻譯為蛋白質(表達)的DNA序列。
本文所用的術語「小麥植物」包括，例如，選自普通小麥、Triticum durum，Triticum aestivum var.westonia，一粒小麥(Triticum monococcum)，Triticumaegilopoides，圓錐小麥(Triticum turgidum)，Triticum polonicum，Triticumcarthlicum，Triticum dicoccum，Triticum paleocolchicum，Triticum aestivum var.carnamah和Triticum turanicum的小麥家族的任何植物。
本文所用的術語「轉基因」指編碼OAT多肽，且通過實驗操作被導入到小麥植物的基因組中的任何多核苷酸序列。轉基因可以是「內源DNA序列」或「異源DNA序列」(即「外來的」(foreign)DNA)。術語「內源DNA序列」指天然地出現在其被導入的細胞中的核苷酸序列，只要其相對於天然存在的序列而言不含有某些修飾(例如點突變、選擇標記基因的存在，等等)。術語「異源DNA序列」指這樣的核苷酸序列，其連接於，或通過操作而被連接到，在自然狀態下不與其連接或者在自然狀態下與其在別處連接的核苷酸序列。異源DNA對於其被導入的細胞而言不是內源的，而是從另一細胞獲得的。異源DNA還包括含有某些修飾的內源DNA序列。一般說來，雖然不是一定如此，異源DNA編碼這樣的RNA和蛋白質，它們通常不被表達該DNA的細胞所產生。異源DNA的例子包括突變的野生型基因(即，受到修飾從而不再是野生型基因的野生型基因)，報導基因，轉錄和翻譯調控基因，選擇標記蛋白(例如賦予藥物抗性的蛋白質)，等等。
因此，一旦如上面討論地確定了合適的小麥宿主植物，則構建包含一種或多種OAT多核苷酸或其功能活性的片段的轉基因。術語「功能活性的」(functionally active)，當用來指本發明的OAT多肽時，是指這樣的模式，其中核苷酸序列的改變並不一定影響該序列編碼能夠執行與未改變的「親本」多肽基本上相同的功能的多肽的能力。例如，核苷酸序列可以被截短、伸長或突變使得該核苷酸序列編碼的多肽與「親本」序列不同，但仍然編碼能夠與「親本」分子基本上類似地執行功能的多肽。因此，本發明的OAT多核苷酸的功能活性的衍生物(derivatives)、類似物(analogs)或變體(variants)將具有與圖2(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列不同的核苷酸序列，但該功能活性的衍生物、類似物或變體所編碼的多肽能夠表現出與所述OAT多肽相關的一種或多種已知的功能活性。這樣的修飾可以是任意的，如通過定點誘變，或者可以是自發的。
OAT(EC號2.6.1.13)的同義詞包括L-鳥氨酸2-氧-酸氨基轉移酶(L-ornithine2-oxo-acid aminotransferase)，鳥氨酸氨基轉移酶(ornithineaminotransferase)，鳥氨酸-氧-酸轉氨酶(ornithine-oxo-acid transaminase)，氨基轉移酶鳥氨酸-酮酸(aminotransferase ornithine-keto acid)，L-鳥氨酸-5-氨基轉移酶(L-ornithine 5-aminotransferase)，L-鳥氨酸氨基轉移酶(L-ornithine aminotransferase)，L-鳥氨酸α-酮戊二酸δ氨基轉移酶(L-ornithinealpha-ketoglutarate delta aminotransfer)，鳥氨酸5-氨基轉移酶(ornithine 5-amino transferase)，鳥氨酸δ-轉氨酶(ornithinedelta-transaminase)，鳥氨酸轉氨酶(ornithine transaminase)，鳥氨酸-2-氧酸氨基轉移酶(ornithine-2-oxoacid aminotransferase)，鳥氨酸-α-酮戊二酸氨基轉移酶(ornithine-alpha-ketoglutarate aminotransferase)，鳥氨酸-酮酸氨基轉移酶(ornithine-keto acid aminotransferase)，鳥氨酸-酮酸轉氨酶(ornithine-keto acid transaminase)，鳥氨酸酮戊二酸氨基轉移酶(ornithineketoglutarate aminotransferase)，鳥氨酸-氧酸-氨基轉移酶(ornithine-oxo acidaminotransferase)和鳥氨酸α-氧戊二酸轉氨酶(ornithinealpha-oxoglutaratetransaminase)。
本領域的技術人員將會理解，本發明的OAT多核苷酸的功能活性的衍生物、類似物、同源物或變體，可以在重要區域例如受體結合位點之外發生顯著的變化，但是，從不同種病毒分離的OAT多核苷酸之間的高序列保守性區域可能編碼重要的區域，例如受體結合位點等。因此，在這些高度保守區域中發生的突變可能不會產生功能活性的衍生物、類似物、同源物或變體。例如，表1所示的保守的核苷酸序列可能保持不被改變，除非該改變是極度保守的。
基本上相似的序列可以在Southem雜交實驗中得以鑑定，例如在具體的系統所定義的高度、中度或低度嚴緊條件下。確定合適的雜交條件是現有技術之內的。參見例如Sambrook等，《DNA Cloning》，卷I，II和III.NucleicAcid Hybridization。但通常地，核酸分子雜交或退火的「嚴緊條件」是如下所述的(1)洗滌使用低離子強度和高溫，例如0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，50℃，或(2)在雜交過程中使用變性劑(denaturing agent)如甲醯胺，例如，50％(v/v)甲醯胺及0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩衝液，pH 6.5及750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42℃。
雜交的中度嚴緊條件的一個例子是使用50％甲醯胺，5XSSC(0.75MNaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH 6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5XDenhardt′s溶液，超聲處理的鮭精DNA(50μg/mL)，0.1％SDS，及10％硫酸葡聚糖，42℃，在42℃，0.2XSSC和0.1％SDS中洗滌。
進一步舉例說明，且並非意在限制，低嚴緊度條件包括Shilo和Weinberg在1981年描述的那些(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，786789-6792)。當使用這樣的條件處理含有DNA的濾膜(filter)時，它們通常在40℃，在含有35％甲醯胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，和500μg/ml變性鮭精DNA的溶液中被預處理6小時。雜交在做了如下改變的相同溶液中進行0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鮭精DNA，10％(w/v)硫酸葡聚糖，並使用5-20X106cpm的32P標記的探針。濾膜在雜交混合物中40℃溫育18-20h，然後在含2XSSC，25mM Tris-HCl(pH 7.4)，5mM EDTA，和0.1％SDS的溶液中55℃洗滌1.5h。用新鮮溶液更換洗滌溶液並在60℃再溫育1.5h。吸乾濾膜並曝光以進行放射自顯影。需要的話，將濾膜在65-68℃洗滌第三次並對膠片再次曝光。可能使用的其它低嚴緊度條件是本領域熟知的(例如跨種雜交(cross-species hybridization)所用的那些)。
本發明的OAT多核苷酸，其功能性活性衍生物、類似物或變體可用本領域的多種方法生產。例如，可以使用本領域已知的多種方法中的任何方法(參見例如Maniatis，T.，1990，《Molecular Cloning，A Laboratory Manual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)修飾克隆的OAT多核苷酸。可以用限制性內切核酸酶在合適的位點切割該序列，然後如果需要，進行進一步酶修飾、分離和體外連接。
另外，可以在體外或體內突變編碼OAT的多核苷酸序列，從而生成或破壞功能性區域，或在功能性區域中生成變異，和/或形成新的限制性內切核酸酶位點或破壞先前存在的位點，以便於進一步的體外修飾。可以使用本領域已知的任何誘變技術，包括但不限於化學誘變(chemicalmutagenesis)，體外定點誘變(in vitro site-directed mutagenesis)(Hutchinson等，1978，J.Biol.Chem 2536551)。
或者，所述OAT多核苷酸的多核苷酸變體可能來自簡併密碼子取代或互補序列。具體地，簡併密碼子取代可以通過產生這樣的序列而實現該序列中，一個或多個所選的(或全部的)密碼子的第三位被混合鹼基(mixed-base)和/或脫氧肌苷殘基所取代(Batzer等，1991，Nucleic Acid Res.195081；Ohtsuka等，1985，J.Biol.Chem.2602605-2608；和Rossolini等，1994，Mol.Cell.Probes，891-98)。或者，變體可以是這樣的多核苷酸其與SEQ ID NO1(圖2)基本上相似，或者在該多核苷酸的3』和/或5』端，或在該多核苷酸內添加、缺失或取代了一個或多個核苷酸。
在一個實施方案中，所述OAT多核苷酸是與SEQ ID NO1具有至少85％的核苷酸序列同一性的雙鏈DNA分子。一旦合適的轉基因被確定，並被分離或者構建，則通過標準技術將其整合到表達載體中。因此，本發明還考慮包含本發明的轉基因的表達載體。因此，在一個實施方案中構建這樣的表達載體，其包含分離並純化的DNA分子，該DNA分子包含啟動子，該啟動子與OAT編碼區域可操作地連接，該編碼區域可操作地連接於轉錄終止區域，由此該終止子驅動該編碼區域的轉錄。該編碼區域可包含編碼OAT基因的片段或序列。包含表達載體的DNA分子還可含有植物內含子，還可含有其它植物元件例如編碼非翻譯序列(untranslated sequences)(UTL’s)的序列和充當轉錄或翻譯增強子的序列。
優選的植物轉化載體包括但不限於源自根癌土壤桿菌Ti質粒，和公開在例如Herrera-Estrella(1983)，Bevan(1983)，Klee(1985)和歐洲專利申請號EP 0120516(特此分別併入作為參考)中的那些載體。
由於本發明的表達載體優選用於轉化小麥植物，因此選擇能夠在所述的植物種中驅動表達的啟動子。在不同種植物中起作用的啟動子也是本領域熟知的。可用於在植物中表達所述多肽的啟動子有誘導性的、病毒的(viral)、合成的(synthetic)或組成性的啟動子，如上所述(Odell等，1985同上)，和/或受時序調控的(temporally regulated)、受空間調控的(spatiallyregulated)，和受時空調控的(spatio-temporally regulated)啟動子。優選的啟動子包括增強的CaMV35S啟動子，以及FMV35S啟動子。
以雙鏈DNA形式定位於植物核基因組的基因的表達涉及由RNA聚合酶(RNA polymerase enzyme)從DNA的編碼鏈轉錄出信使RNA(mRNA)，和隨後在核中mRNA初級轉錄物的加工。被稱為「啟動子」的DNA區域調控DNA轉錄為mRNA。包含啟動子的DNA表現為這樣的鹼基序列，它向RNA聚合酶發出信號(signal)，讓其與該DNA結合(associate)，並引發(initiate)mRNA的轉錄，用DNA的一條鏈作為模板生成相應的RNA鏈。所選擇的具體啟動子應當能夠導致OAT編碼序列的充分轉錄，以在所得的植物中產生針對環境脅迫的實質的(substantial)保護。
本發明的OAT多核苷酸在植物組織中可以由多種啟動子驅動。啟動子可以是近於(near)組成性的(即它們在所有組織中驅動轉基因的轉錄)，例如CaMV35啟動子，源自根癌土壤桿菌T-DNA的1』-或2』-啟動子，或組織特異性的或發育特異性的。在本發明的實踐中，CaMV35S和FMV35S啟動子的增強的或重複的(duplicate)形式是特別有用的(Kay等，1987；Rogers，美國5,378,619)。
或者，植物啟動子可能受環境控制。這樣的啟動子被稱為「誘導性」啟動子。可能導致誘導性啟動子的轉錄的環境條件的例子包括病原體攻擊，無氧環境或光的存在。
優選地，使用能夠指導強表達的啟動子。這樣的啟動子包括但不限於Christensen和Quail(1996)所描述的玉米泛素啟動子(maize ubiquitinpromoter)，McElroy D，Blowers AD Jenes B和Wu R(1990)描述的稻肌動蛋白啟動子(rice actin promoter)，Medberry SL，Lockhart BEL和Olszewskine(1992)所描述的鴨蹠草花葉病毒(commelina mosaic virus)啟動子。
本領域技術人員將會認識到，有多種啟動子在植物細胞中有活性且已被文獻描述。這樣的啟動子可以從植物或植物病毒中獲得，包括胭脂氨酸合酶(nopaline synthase)(NOS)和章魚氨酸合酶(octopine synthase)(OCS)啟動子(它們由根癌土壤桿菌的根瘤誘導性(tumor inducing)質粒所攜帶)，花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)(CaMV)19S和35S啟動子，來自核酮糖1，5-二磷酸羧化酶(ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase)(ssRUBISCO，一種非常豐富的植物多肽)小亞基的光誘導性啟動子，稻Actl啟動子和玄參花葉病毒(Figwort Mosaic Virus)(FMV)35S啟動子。所有這些啟動子都已經被用來產生多種DNA構建體，並在植物中表達(參見例如McElroy等，1990，美國專利5,463,175)。
另外，可能優選使用含有組織特異性啟動子的植物整合載體(plant-integrating vectors)來產生OAT多核苷酸的表達。具體的目標組織可包括葉(leaf)、莖(stem)、根(root)、塊莖(tuber)、種子(seed)、果實(fruit)等等。所選的啟動子應該具有所希望的組織和發育特異性。因此，應當通過選擇具有所希望的組織表達能力和大致啟動子強度，及選擇在目標組織中產生所希望的脅迫抗性水平的轉化體(transformant)，來優化啟動子功能。在植物中表達異源結構基因時通常要利用這種從轉化體池選擇的手段，因為含有相同基因的轉化體之間存在由於基因插入植物基因組的位置所導致的差異(一般稱為「位置效應」(position effect))。除了已知導致DNA在植物細胞中表達(組成性或組織特異性的)的啟動子之外，可以通過對在目標組織中選擇性地或優選地表達的基因的植物cDNA文庫進行篩選，然後確定啟動子區域，來鑑定其它的啟動子用於本發明。
其它示例性的組織特異性啟動子有玉米蔗糖合成酶1(sucrosesynthetase 1)(Yang等，1990)，玉米醇脫氫酶1(alcohol dehydrogenase 1)(Vogel等，1989)，玉米捕光複合物(light harvesting complex)(Simpson，1986)，玉米熱休克蛋白(heat shock protein)(Odell等，1985同上)，豌豆(pea)小亞基RuBP羧化酶(small subunit RuBP carboxylase)(Poulsen等，1986；Cushmore等，1983)，Ti質粒甘露氨酸合酶(mannopine synthase)(McBride和Summerfelt，1989)，Ti質粒胭脂氨酸合酶(Langridge等，1989)，矮牽牛(petunia)查耳酮異構酶(chalcone isomerase)(Van Tunen等，1988)，菜豆(bean)富甘氨酸蛋白1(glycine rich protein 1)(Keller等，1989)，CaMV35s轉錄物(Odell等，1985同上)及馬鈴薯patatin(Wenzler等，1989)的啟動子。優選的啟動子是花椰菜花葉病毒(CaMV 35S)啟動子和S-E9小亞基RuBP羧化酶啟動子。
如果需要，本發明的DNA構建體中使用的啟動子可以被修飾，以影響它們的控制特性。例如，可以將CaMV35S啟動子與ssRUBISCO基因中抑制ssRUBISCO在無光條件下表達的部分連接，以產生在葉中有活性但在根中沒有活性的啟動子。因而，對於本說明書而言，短語「CaMV35S」啟動子包括CaMV35S啟動子的變化形式，例如通過與操縱子區域連接、隨機或受控的誘變等等而得到的啟動子。另外，可改變啟動子以使其包含多個「增強子序列」，來幫助提高基因表達。Kay等(1987)已經報導了這樣的增強子的例子。
對於由被組織特異性啟動子轉化的植物細胞產生的本發明的轉基因植物，可以將其與被另一組織特異性啟動子轉化的植物細胞所產生的第二轉基因植物雜交，以產生在多於一種的特定組織中顯示轉化效果的雜種轉基因植物。
本發明的DNA構建體所產生的RNA也可以含有5』非翻譯前導序列(5′non-translated leader sequence)(5』UTL)。該序列可以來自表達該基因所選用的啟動子，可以被特別地修飾以增加mRNA的翻譯。5』非翻譯區也可以從病毒RNA、合適的真核基因、或合成的基因序列獲得。本發明不限於這樣的構建體，其中非翻譯區來自伴隨啟動子序列的5』非翻譯序列。用於本發明的一種植物基因前導序列是矮牽牛(penuia)熱休克蛋白70(hsp70)前導序列(Winter等，1988)。
5』UTL當定位於DNA序列的轉錄起始位點和編碼序列的開頭之間時能夠調控基因表達。有人已經對前導序列進行編輯(compilation)，以預測最優和次優序列和產生「共有」(consensus)及優選的前導序列(Joshi，1987)。本文考慮優選的前導序列包括這樣的序列，它們包含預計將指導其所連接的結構基因最優地表達的序列，也就是說，包括優選的共有前導序列，該共有前導序列可增加或維持mRNA的穩定性，並防止不合適的翻譯起始。本領域技術人員結合本文的公開可以知道如何選擇這樣的序列。最優選的序列將是來自在植物中特別是玉米中高表達的基因的序列。矮牽牛HSP70前導序列可以是一種特別有用的前導序列。
為了優化表達，DNA表達構建體中還可以包含內含子。這樣的內含子典型地位於非翻譯序列中靠近mRNA 5』端處。該內含子可以來自，但不限於來自，由下列組成的內含子組玉米熱休克蛋白(HSP)70內含子(美國專利5,424,412；1995)，稻Act1內含子(McElroy等，1990)，Adh內含子1(Callis等，1987)，或蔗糖合酶內含子(Vasil等，1989)。
定位於植物核基因組的本發明的基因的3』非翻譯區還含有聚腺苷酸化信號，其在植物中起作用導致腺苷酸核苷酸添加到mRNA的3』端。RNA聚合酶轉錄核基因組編碼DNA序列通過發生聚腺苷酸化的位點。典型地，聚腺苷酸化位點下遊幾百個鹼基對處的DNA序列起終止轉錄的作用。本文將這樣的DNA序列稱為轉錄終止區域。這些區域對被轉錄的信使RNA(mRNA)的高效聚腺苷酸化是必需的。優選的3』區域的例子有(1)3』轉錄而非翻譯的區域，其含有例如胭脂氨酸合酶(NOS)基因等土壤桿菌根瘤誘導性(Ti)質粒的基因的聚腺苷酸化信號；(2)例如豌豆核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亞基基因等植物基因的3』末端，稱為本文中E9(Fischhoff等，1987)。構建體典型地包括OAT多核苷酸以及3』末端DNA序列，其中3』末端DNA序列充當終止轉錄的信號，並且，在用於核基因表達的構建體中，為所得的mRNA聚腺苷酸化作準備。最優選的3』元件考慮是來自下述的那些根瘤土壤桿菌胭脂氨酸合酶基因(nos 3』端)(Bevan等，1983)，根瘤土壤桿菌章魚氨酸合酶基因的T7轉錄物的終止子，和馬鈴薯或西紅柿(tomato)蛋白酶抑制物I或II基因的3』末端。如果需要，還可以包括例如TMV OMEGA元件(Gallie等，1989)等調控元件。
轉錄增強子或重複的增強子可以用於增加表達。這些增強子通常出現在真核細胞中執行功能的啟動子中轉錄開始處的5』側，但是經常可被正向或反向地插入編碼序列的5』或3』側。增強子的例子包括來自CaMV 35S啟動子、章魚氨酸合酶基因(Ellis等，1987)、稻肌動蛋白基因和來自非植物真核生物(例如酵母；Ma等，1988)的啟動子的元件。
在本發明的特定實施方案中，使用內部核糖體結合位點(IRES)元件來產生多基因(multigene)或多順反子(polycistronic)的信息(messages)。IRES元件能夠繞開(bypass)5』甲基化Cap依賴的翻譯的核糖體掃描模型而在內部位點開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1985)。已經描述了來自小RNA病毒(picornavirus)家族的兩個成員(脊髓灰質炎(polio)和腦心肌炎(encephalomyocarditis))的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，以及來自哺乳動物信息的IRES(Macejak和Sarnow，1991)。IRES元件可以與異源開放閱讀框連接。各自被IRES隔開的多個開放閱讀框可以一起被轉錄，產生多順反子信息。通過IRES元件，每個開放閱讀框都可為核糖體所及，以實現高效的翻譯。使用單個啟動子/增強子來轉錄單條信息，可以高效地表達多個基因。
IRES元件可以與任何異源的開放閱讀框連接。這包括分泌蛋白質、由獨立的基因編碼的多亞基蛋白質、胞內或膜結合蛋白質和選擇標記的基因。通過這種方式，可以用單個構建體和單個選擇標記，通過工程加工手段在細胞中同時導入數種蛋白的表達。
選擇什麼表達載體，以及最終OAT多核苷酸與什麼啟動子可操作連接，直接依賴於要轉化的宿主細胞。已知在構建重組DNA分子的技術中存在固有的限制。但是，可用於實踐本發明的載體能夠指導與其可操作連接的OAT編碼區的表達。
包含OAT序列的載體還通常包含標記(marker)基因，其賦予植物細胞可選擇的表型。例如，所述標記可編碼殺生物劑(biocide)抗性，特別是抗生素抗性，例如對卡那黴素(kanamycin)、G418、博來黴素(bleomycin)、潮黴素(hygromycin)的抗性，或除草劑(herbicine)抗性，例如對chlorosluforon，或phosphinothricin(雙丙氨磷(bialaphos)和草氨膦(Basta)中的有效成分)的抗性。
可用於在高等植物中表達基因的典型的載體是本領域熟知的，包括已有記載的源自根瘤土壤桿菌根瘤誘導性(Ti)質粒(Rogers等，1987)。但是，已知有數種其它的植物整合性(plant integrating)載體系統在植物中起作用，包括已有記載的pCaMVCN轉移控制(transfer control)載體(Fromm等，1985)。pCaMVCN(可從Pharmacia，Piscataway，N.J.獲得)包括所述CaMV35S啟動子。
在一個實施方案中，用於表達OAT多核苷酸的載體包含在植物細胞中有效的選擇標記。在另一個實施方案中，編碼OAT多核苷酸和/或選擇標記的基因處在兩個或更多不同的載體上。選擇標記可以是藥物抗性選擇標記或代謝選擇標記。一種優選的藥物抗性選擇標記是這樣的基因，其表達導致卡那黴素抗性；即，含有胭脂氨酸合酶啟動子、Tn5新黴素磷酸轉移酶II(neomycin phosphotransferase II)(nptII)和胭脂氨酸合酶3』非翻譯區域的嵌合(chimeric)基因，如Rogers等，1988所述。
製備表達載體的手段是本領域熟知的。用於轉化植物的表達(轉化)載體和製造這些載體的方法記載於美國專利4,971,908，4,940,835，4,769,061和4,757,011中(特此將其分別併入本文作為參考)。可以修飾這些載體使其包含本發明的編碼序列。
已經發展了多種方法將DNA通過互補粘性末端或平末端可操作地連接到載體。例如，可以將互補的均聚物段(homopolymer tract)添加到要插入的DNA片段和載體DNA。然後通過互補的均聚物尾巴之間的氫鍵連接(join)載體和DNA片段而形成重組DNA分子。
在一個實施方案中，將圖2(SEQ ID NO1)所示的編碼OAT的雙鏈DNA與泛素啟動子和玉米醇溶蛋白(zein)終止子連接(ligate)以形成名為「pGBA2」的表達載體，如圖1所示。
用本發明的表達載體轉化的小麥植物也在本文的考慮之內。源自這樣的轉化或轉基因細胞的轉基因植物也在本文的考慮之內。本領域技術人員將認識到，可以通過本領域熟知的方法將含有本發明的結構編碼序列的嵌合植物基因插入植物的基因組。這樣的DNA轉化植物細胞的方法包括土壤桿菌介導的植物轉化，使用脂質體，使用病毒或花粉(pollen)的轉化，電穿孔，原生質體轉化，基因轉入花粉，注射到生殖器官(reproductive organs)中，注射到未成熟的胚(embryos)中，以及粒子轟擊。這些方法各自有優缺點。因此，向特定的植物株(strain)導入基因的一種特定的方法，對於其它的植物株可能不一定是最有效的，但對於特定的植物株而言哪些方法有用則是公知的。
將轉化DNA片段導入細胞的方法有多種，但不全都適於將DNA送入植物細胞。合適的方法認為包括幾乎任何可以將DNA導入細胞的方法，例如根瘤土壤桿菌和相關的土壤桿菌菌株感染，直接送遞DNA，例如通過PEG介導的原生質體轉化(Omirulleh等，1993)，通過乾燥/抑制介導的DNA攝取(desiccation/inhibition-mediated DNA uptake)，通過電穿孔，通過碳化矽纖維攪拌，通過加速DNA包被的顆粒，等等。在某些實施方案中，優選加速方法，這些方法包括例如微粒轟擊等等。
導入DNA到細胞的技術對本領域技術人員而言是公知的。已經有四種送遞基因進入細胞的通用方法被描述(1)化學方法(Graham和van der Eb，1973)；(2)物理方法例如顯微注射(Capecchi，1980)，電穿孔(Wong和Neumann，1982；Fromm等，1985)和基因槍(gene gun)(Johnston和Tang，1994；Fynan等，1993)；(3)病毒載體(Clapp，1993；Lu等，1993；Eglitis和Anderson，1988a；1988b)；和(4)受體介導的機制(receptor-mediatedmechanisms)(Curiel等，1991；1992；Wagner等，1992)。
對多種動物和植物細胞施加短暫的高壓電脈衝，將在質膜中產生納米尺寸的孔(pores)。DNA或者通過這些孔，或者作為這些孔被封閉的同時膜組分發生重分配(redistribution)的結果而被直接攝入細胞質。電穿孔可具有極高的效率，而且可以用於瞬時表達克隆的基因和建立攜帶目標基因的整合拷貝的細胞系。與磷酸鈣介導的轉染或原生質體融合形成對照的是，電穿孔經常產生攜帶外來基因的一個，或最多少數個整合拷貝的細胞系。
通過電穿孔導入DNA對於本領域技術人員而言是公知的。為了實現電穿孔轉化，可以使用脆性的(friable)組織例如細胞懸浮培養物(suspensionculture)或胚性愈傷組織(embryogenic callus)，或者作為選擇，可以直接轉化未成熟胚或其它有組織結構的(organized)組織。可使所選細胞暴露於果膠降解酶(pectin-degrading enzymes)(pectolyases(溶果膠酶))或有控制地對其機械致傷，以部分降解其細胞壁，使這些細胞更易於被轉化。這樣的細胞將作為此階段可能實行的電穿孔DNA轉移的受體，然後根據新併入的DNA的性質，採用合適的選擇或篩選程序來鑑定被轉化的細胞。
將轉化DNA片段送遞到植物細胞中的另一種較好的方法是微粒射彈。在這種方法中，可以用核酸包被顆粒，並通過推進力(propelling force)送遞到細胞中。示例性的顆粒包括由鎢、金、鉑等構成的那些。使用這些顆粒，位於小金屬顆粒表面上的DNA被通過細胞壁運載到胞質中，如Klein等，1987；Klein等，1988；Kawata等，1988所描述的。這些金屬顆粒穿過數層細胞，因而使得轉化組織外植體(tissue explants)中的細胞成為可能。
微粒射彈除了是一種可重複地穩定轉化植物的有效手段外，還有一大優點是其既不需要原生質體的分離(Cristou等，1988)，也不要求對土壤桿菌感染的敏感性。通過加速將DNA送遞入植物細胞的方法的一個說明性的實施方案是生物射彈顆粒送遞系統(Biolistics Particle Delivery System)，該系統可用來推動包被有DNA的顆粒或細胞通過屏(screen)，例如不鏽鋼或Nytex屏，到達被懸浮的植物培養細胞覆蓋的濾器表面上。所述屏分散該顆粒，使得它們不以大的聚團(aggregates)形式被送遞給受體細胞。人們相信，在射彈設備和要被轟擊的細胞之間置入屏，可減少射彈聚團的大小，還可減少過大的射彈對受體細胞造成的傷害，從而促進轉化頻率的提高。
為了轟擊，優選將懸浮細胞在濾器或固體培養基上集中(concentrate)。或者，可以將未成熟胚或其它目標細胞布置(arrange)在固體培養基上。將要被轟擊的細胞定位於微粒截止板(microprojectile stopping plate)下方合適距離處。如果需要，還在加速裝置和要被轟擊的細胞之間放置一個或多個屏。通過使用本文提出的技術，可獲得多達1000或更多個瞬時表達標記基因的細胞的焦點(focus)。轟擊後48小時焦點中表達外源基因產物的細胞數通常在1到10個之間，平均為1到3個。
在轟擊轉化中，可以對轟擊前的(pre-bombardment)培養條件和轟擊參數進行優化以產生最大數目的穩定轉化體。在這種技術中，物理參數和生物參數都是重要的。物理因素是指那些涉及操作DNA/微粒沉澱(precipitate)的因素，或那些影響大射粒(macroprojectiles)或微粒的飛行距離(flight)和速度(velocity)的因素。生物因素包括在轟擊之前和轟擊後立即對細胞進行的操作、以及為了幫助減輕轟擊相關的創傷(trauma)而對目標細胞施行的滲透壓調整中涉及的所有步驟，還包括轉化DNA的性質，例如線性化(linearized)的DNA或完整的超螺旋質粒。轟擊前的操作被認為對於未成熟植物胚的成功轉化特別重要。
因此，本文考慮到，可能希望在小規模的研究中調整一些轟擊參數，以全面地優化條件。可能特別希望調整例如間距(gap distance)、飛行距離(flight distance)，組織距離(tissue distance)和氦氣壓力等物理參數。還可以使創傷減少因子(trauma reduction factors)通過改變那些影響受體細胞的生理狀態，並因此可能影響轉化和整合效率的條件。例如，可以調節受體細胞的滲透壓狀態、組織水化(tissue hydration)、及傳代培養階段或細胞周期以獲得最優的轉化。本領域技術人員結合本公開將了解其它的常規調節方式。
顆粒介導的轉化方法對本領域技術人員而言是公知的。美國專利5,015,580(特此將其併入作為參考)記載了使用該技術對大豆的轉化。
土壤桿菌介導的轉移是一種廣泛適用的導入基因到植物細胞的方法，因為DNA可以被導入整個植物組織，從而無需從原生質體再生完整植株。使用土壤桿菌介導的植物整合載體來導入DNA到植物細胞是本領域熟知的。參見例如已有記載的方法(Fraley等，1985；Rogers等，1987)。用土壤桿菌介導的轉移對棉類植物(cotton plants)進行的基因工程改造在美國專利5,004,863中有記載(特此併入作為參考)；在美國專利5,349,124中描述了類似的萵苣類植物的轉化(特此併入作為參考)；在美國專利5,416,011中描述了土壤桿菌介導的大豆轉化(特此併入作為參考)。另外，Ti-DNA整合是相對比較精確的過程，幾乎不產生重排(rearrangements)。要轉移DNA的區域由邊界序列(border sequences)確定，而且通常在植物基因組中插入間插DNA(intervening DNA)，如Spielmann等，1988；Jorgensen等，1987所述。
新型的土壤桿菌轉化載體能夠在大腸桿菌(E.coli)和土壤桿菌中複製，從而可以進行方便的操作，如Klee等，1985所述。另外，近來隨著用於土壤桿菌介導的基因轉移的載體的技術進步，載體中基因和限制位點的排列已經得到改良，以便於構建能夠表達多種多肽編碼基因的載體。Rogers等，1987所述的載體具有方便的多接頭區域(multi-linker regions)，其側翼為啟動子和聚腺苷酸化位點，用於直接表達插入的多肽編碼基因，該載體適用於本發明的目的。另外，轉化還可以使用同時含帶甲(armed)和卸甲Ti基因的土壤桿菌。對於土壤桿菌介導的轉化效率較高的植物品種，土壤桿菌介導的轉化是優選的方法，因為其基因轉移具有簡便性和確定性。
葉盤和其它組織例如子葉和下胚軸(hypocotyl)的土壤桿菌介導的轉化，似乎僅限於土壤桿菌天然感染的植物。土壤桿菌介導的轉化在雙子葉植物中效率最高。幾乎沒有單子葉植物表現為土壤桿菌的天然宿主，雖然使用土壤桿菌載體在天冬(asparagus)中產生了轉基因植物，如Bytebier等，1987描述的。近來也已用土壤桿菌轉化了其它單子葉植物。這些中包括玉米(corn)(Ishida等1996)和稻(Cheng等1998)。
使用土壤桿菌轉化方法形成的轉基因植物通常在一個染色體上含有單個基因。這樣的轉基因植物對所加入的基因而言可以稱為雜合的(heterozygous)。但是，由於「雜合」一詞通常暗示一對染色體中的另一染色體中的相同座位上存在互補的基因，而這裡含有一個加入的基因的植物中並不存在這樣的基因，故認為對於這樣的植物更確切的名稱是獨立分離子(independent segregant)，因為所加入的外源基因在有絲分裂和減數分裂中獨立地分離。
當該植物作為雜種商品化時，例如玉米，獨立分離子可能是優選的。此時，將含有所述基因的獨立分離子與另一植物雜交，以形成對目標基因而言雜合的雜交植物。
另一優先的選擇是對加入OAT多核苷酸而言純合(homozygous)的轉基因植物，即轉基因植物含有兩個加入的基因，在成對染色體的每條染色體的相同座位上各有一個。純合的轉基因植物可以通過使含有使單個加入的基因的獨立分離子轉基因植物有性交配(自交)，使所產生的種子發芽，並且相對於對照(天然非轉基因的)或獨立分離子轉基因植物，分析所產生的植株的指徵純合性孟德爾遺傳及目標基因活性。
可以使兩個不同的轉基因植物交配，產生含有兩個獨立分離的加入的外源基因的後代。通過使合適的後代自交，可以產生對於所加入的編碼目標多肽的外源基因二者而言均為純合的植物。本文還考慮(contemplate)與親本植物的回交和與非轉基因植物的異型雜交(out-crossing)。
植物原生質體的轉化可以使用基於磷酸鈣沉澱、聚乙二醇處理、電穿孔和這些處理的組合的方法來實現(參見例如Potrykus等，1985；Lorz等，1985；Fromm等，1985；Uchimiya等，1986；Callis等，1987；Marcotte等，1988)。
這些系統在不同植物種質(germplasm)中的應用取決於從原生質體再生那種植物品種的能力。從原生質體再生穀類的示例性方法已有描述(參見例如Fujimura等，1985；Toriyama等，1987；Yamada等，1986；Abdullah等，1986)。
為了轉化從原生質體再生不能成功的植物種質，可以利用其它導入DNA到完整細胞或組織的途徑。例如，可以從未成熟胚或外植體再生穀類，如Vasil，1988所述。
還可以通過直接轉移DNA到花粉中來將DNA導入植物，如Zhou等，1983；Hess，1987所述。可以通過注射DNA到植物的生殖器官中而獲得多肽編碼基因的表達，如De La Pena等，1987所述。DNA還可以直接注射到未成熟胚的細胞中，和通過乾燥胚的復水(rehydration)導入細胞中，如Neuhaus等，1987；Benbrook等，1986所述。
在實現送遞外源OAT多核苷酸到受體小麥細胞之後，為了獲得本發明的轉基因小麥植物，下一步驟通常涉及鑑定被轉化的細胞用於進一步培養和植株再生。如本文提到的，為了改善鑑定轉化體的能力，最好使用可選擇或篩選的標記基因作為所述OAT多核苷酸，或者除了所述OAT多核苷酸之外還使用可選擇或篩選的標記基因。在這種情況下，一般可以通過將細胞暴露於一種或多種選擇劑來分析可能被轉化的細胞群體，或篩選細胞中所需的標記基因性狀。
一種鑑定轉化細胞的方法的示例性實施方案涉及使轉化的培養物暴露於選擇劑，例如代謝抑制劑(metabolic inhibitor)，抗生素，除草劑等。已被轉化且已穩定整合了賦予對所用選擇劑的抗性的標記基因的細胞將在培養中生長和分裂。敏感的細胞將難以進一步培養。一個優選的標記基因的例子賦予對草甘膦(glyphosate)的抗性。當用該基因作為選擇標記時，使用草甘膦來處理認為被轉化的細胞的培養物。處理後，轉基因細胞可供進一步培養，而敏感的，或者說非轉化的細胞則不可。該方法在美國專利5,569,834中有詳細的描述，特此併入作為參考。另一個優選的選擇標記系統的例子是新黴素磷酸轉移酶(nptII)抗性系統，其賦予對抗生素卡那黴素的抗性，如美國專利5,569,834(特此併入作為參考)。同樣，用該系統轉化後，經過卡那黴素處理，被轉化的細胞將可供進一步培養，而沒有被轉化的細胞則不能。另一種優選的選擇標記系統涉及使用賦予對巴龍黴素(paramomycin)的抗性的基因構建體。這類選擇標記系統的使用在美國專利5,424,412中有描述(特此併入作為參考)。
另一種優選的選擇標記系統涉及使用本發明考慮到的基因。具體地，用OAT多核苷酸和功能性等價物轉化的細胞將產生鹽抗性(salt resistance)。因此，通過培養細胞並分離對高鹽水平有抗性的細胞，基因組中導入了重組DNA分子的植物細胞可以從沒有納入該重組分子的細胞群體中被選擇出來。
本發明還考慮到，篩選和選擇標記的組合可用於鑑定被轉化的細胞。在某些類型的細胞和組織中，選擇劑，例如草甘膦和卡那黴素，或者不能提供足夠的殺滅活性以清楚地識別被轉化的細胞，或者可能對轉化體以及非轉化體同樣地導致顯著的非選擇性抑制，從而使得該選擇技術無效。本文認為，通過使用生長抑制性化合物例如草甘膦，在低於導致100％抑制的濃度條件下進行選擇，然後對生長的組織中可篩選標記基因例如編碼卡那黴素抗性的基因的表達進行篩選，可以從不適於單獨選擇細胞和組織類型中回收轉化體。本文還認為，通過選擇和篩選的結合，可以從更多的細胞和組織類型中鑑定轉化體。
從單個植物原生質體和多種外植體生發(development)和再生植物是本領域熟知的(Weissbach and Weissbach，1988)。該再生和生長過程通常包括這樣的步驟選擇被轉化的細胞，並培養個體化(individualized)細胞，通過通常的胚胎發育階段，直到(並包括)生根小植物(root plantlet)階段為止。轉基因胚和種子的再生是類似的。然後將所得的轉基因生根苗(rootedshoots)種植在合適的植物生長培養基，例如土壤中。
含有通過土壤桿菌導入並編碼目標多肽的外來外源性基因的植物，可以通過本領域熟知的方法例如Horsch等，1985所描述的方法，從葉外植體發育或再生而得到。該過程中，在選擇劑的存在下，用誘導被轉化的植株產生再生苗的培養基培養轉化體，如Fraley等，1983所述。具體地，美國專利5,349,124(特此併入作為參考)詳細描述了遺傳轉化的萵苣細胞的產生及由此獲得的植物，該植物表達雜合的晶體蛋白，該蛋白賦予該植物針對鱗翅目(Lepidopteran)幼蟲的殺蟲(insecticidal)活性。
該過程通常在2到4個月之內產生苗，然後將這些苗轉移到合適的含有選擇劑和防止細菌生長的抗生素的生根誘導培養基中。生根的苗在選擇劑存在下形成小植物，然後將其移植到土壤或其它培養基中以供根的產生。這些過程依賴於所採用的特定植物株而變化，這些變化形式是本領域熟知的。
優選地，使再生的植物自體受粉(self-pollinated)以產生純合的轉基因植物，或者，將從再生植物獲得的花粉與農業上重要的品系(line)的由種子生長的(seed-grown)植物雜交。這些品系可以是近交系(inbred lines)或遠交系(out bred lines)。反過來，使用那些重要品系對再生植物授粉。含有所需多肽的本發明的轉基因植物用本領域技術人員熟知的技術來培育。
因此，在一個實施方案中，本發明的轉基因植物對於OAT mRNA具有增加的基因量。優選的轉基因植物是獨立分離子，並能夠將這些基因和它們的活性傳給其後代。更優選的轉基因植物對於所述OAT多核苷酸是純合的，並在有性交配時將它們傳給其所有後代。來自轉基因植物的種子可以在田間或溫室種植，並使所得的性成熟轉基因植物自體受粉以產生純種的(true-breeding)植物。這些植物的後代形成純種品系(true breeding lines)，評估該品系OAT轉基因的表達。
本文認為，在某些情況下，通過穩定導入一種或多種天然的、合成修飾的或突變的OAT轉基因，轉基因植物的基因組已被擴大。在某些情況下，將有多於一個轉基因被納入轉化的宿主植物細胞的基因組。當多於一個OAT編碼DNA片段被納入這樣的植物的基因組時即是如此。在特定情況下，最好有一個，兩個，三個，四個，或更多的OAT基因(天然的或重組改造的)被納入轉化的轉基因植物並在其中表達。
在本發明的一個實施方案中，所述具有增加的OAT多肽的轉基因小麥植物具有對脅迫的誘導的或增加的耐性。術語「耐性」(tolerance)覆蓋下列範圍的保護作用，即從延遲乃至完全抑制脅迫條件所導致的細胞代謝改變、細胞生長降低和/或細胞死亡。優選地，本發明的轉基因小麥植物對脅迫條件具有耐性表現為下面的意義，即在同樣的條件下，小麥植物可以基本上正常地生長，而相應的野生型小麥植物顯示出生長、代謝、生存力(viability)和生產力(productivity)的降低，和/或雄性或雌性不育。
本文所用的「脅迫耐性」指在脅迫中生長和生產生物質(biomass)的能力，在脅迫後重新開始(reinitiate)生長和生物質生產的能力，和歷經脅迫而存活(survive)的能力。術語「脅迫耐性」還覆蓋植物在脅迫中能以類似於未受脅迫的條件下的方式經歷其發育程序(developmental program)的能力，例如，在脅迫條件下，以類似於未受脅迫的條件下的方式從休眠(dormacy)轉換到萌發(germination)，從營養(vegetative)階段轉換到生殖(reproductive)階段。確定植物的生長或對脅迫的響應(response)的方法包括，但不限於高度測量(height measurements)，葉面積(leaf area)、植物水關係(plant water relations)、開花能力(ablity to flower)，以及產生後代能力和生產能力，或本領域技術人員已知的任何其它方法。
術語「脅迫」包括生物性脅迫(biotic stress)，例如病原體(包括病毒、細菌、真菌、昆蟲和線蟲)造成的脅迫及這些的組合，和環境脅迫，特別是因為不利的環境條件可能使病原體克服植物對脅迫的天然耐性。
術語「病原體」(pathogens)指對植物的生理狀態具有負面影響的生物。病原體的例子包括能夠對植物的生理狀態造成負面影響的病毒、細菌、真菌、及寄生蟲(parasties)和害蟲(pests)例如線蟲和昆蟲。
術語「環境脅迫」在現有技術中已被以幾種不同的方式定義，其大體上和術語「滲透脅迫」(osmotic stress)一致。例如Holmberg和Bulow，1998，(Trends Plant Sci.3，61-66)定義了造成非生物脅迫(abiotic stress)的不同環境脅迫因素。鹽、乾旱、熱、寒冷(chilling)和凍結都已作為誘導滲透脅迫的條件的例子被描述。本說明書所用的術語「環境脅迫」指無生命的(non-living)或非生物的(non-biological)環境脅迫對代謝、生長或生存力細胞、組織、種子、器官或整株植物所產生的任何不利影響。更具體地，其還涵蓋環境因素例如鹽脅迫(salt stress)、水脅迫(water stress)(淹水(flooding)、水浸(water logging)、乾旱、脫水)、無氧(低水平的氧、CO2等)、氧脅迫(aerobic stress)、滲透脅迫、溫度脅迫(temperature stress)(熱(hot/heat)、寒冷、凍結、霜)或營養物剝奪，汙染物脅迫(pullutantstress)(重金屬，有毒化學品)、臭氧、高光和上述的組合。
在一個優選的實施方案中，本發明的轉基因小麥植物具有增加的耐受鹽脅迫能力。術語「鹽脅迫」、「鹽度誘導的脅迫」(salinity-induced stress)或類似的術語，是指與提高的鹽濃度相關或被提高的鹽濃度誘導，並對細胞的胞內和胞外環境的滲透勢(osmotic potential)造成擾動(perturbation)的任何脅迫。具體地，本發明的耐鹽性小麥植物在至少150mM NaCl的存在下相對於未轉化的「野生型」小麥植物能夠顯示至少350％的種子產量增加。
可以使用例如後述實施例6列出的程序，在水培系統(hydroponicssystem)中150mM鹽條件下，對照商業小麥栽培種例如Westonia測試轉基因植物。例如，耐鹽品系2490.1的10株轉基因植物分離為3個水平的耐鹽性(見圖4)。2490.1的最高組的每株種子數(seed number)、種子重量(seedweight)、分櫱數(tiller number)和穗數(head number)高於Westonia和低耐鹽性轉基因組3.5倍以上。
在一個實施方案中，本發明提供由本發明的植物生產的食物(food)。本文所用的「食物」是指可被生物代謝以產生能量和構建組織的任何物質，包括液體和固體食物。
在整個本說明書中，「包含」(comprise)一詞，以及其變化形式，如「comprising」和「comprises」，意思是「包括但不限於」，而不意在排除其它的添加成分(additives)、組分(components)、完整實體(integers)或步驟。
下面將參考如下的非限制性實施例對本發明作進一步的描述，這些實施例僅作為參考。但應當理解，下面的實施例僅僅是說明性的，不應看作是對上述發明的一般性的任何限制。特別地，當就本發明在兩種小麥品種中使用某一OAT基因作詳細描述時，顯然能夠理解，本文的研究結果並不限於所述的這些OAT基因來源或小麥品種。
實施例1鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)基因將OAT基因從擬南芥分離到雙元載體中。為了轉化該基因到小麥中，通過PCR擴增過程擴增該基因，並使用BamH1和Kpn1限制位點將其轉入載體pGBA2。
用於擴增帶有限制位點BamH1(5』端)和Kpn1(3』端)OAT基因的引物如下正向引物5』GCATGGATCCGCTTCACAATGGCAGCAGCCACCACG下劃線部分是BamH1位點，粗體部分是起始密碼子。
反向引物5』GCATGGTACCGAAAGCTGGGTTCAAGCATAGAGG下劃線部分是Kpn1位點，粗體部分是起始密碼子。
用於鑑定轉基因小麥中的擬南芥(Arabidopsis)OAT基因的引物如下。
正向引物5』GAGTTGTGACAATGATGCTACTCGTGG反向引物5』CGAGTACATCGTGAAGAGCCTCAGATCC預測的PCR產物的長度是770bp的片段。
用Pfu DNA聚合酶(Promega)擴增帶有BamH1和Kpn1限制位點的OAT基因。所用的試劑和程序如Pfu所附說明書所列出的。在1％瓊脂糖凝膠上運行PCR產物，與1kb+DNA分子量標記(molecularladder)比較。使用UltracleanTMDNA純化試劑盒(Geneworks)根據製造商的指示從瓊脂糖凝膠純化擴增產物。簡單的說，從凝膠切出目標條帶，加入3倍凝膠體積的Ultra-salt，並在65℃溫育混合物5min以溶解瓊脂糖。加入5-7μL的Ultra-Bind二氧化矽基質，充分混合溶液並在室溫溫育該管5min以結合DNA。20,800g離心5秒以沉降Bresa-Bind/DNA基質，棄去上清液，渦旋混合10秒將沉澱重懸於1ml的Ultra-Wash溶液中。將管離心5秒並吸去所有上清液。通過將重懸沉澱在2倍體積的蒸餾水中從Ultra-Bind上洗脫DNA，室溫溫育5min，20,800g離心1min，將含有DNA的上清液移出到新管中。
如下所述擴增片段OAT基因，以篩選含有該基因的小麥植物PCR成分為4mM MgCl2，10mM Tris-HCl，50mM KCl，0.75mM dNTP和每種引物0.2pmol。反應條件為94℃，3min，然後35個94℃，30秒、60℃，30秒和72℃，2分鐘的循環。將反應在72℃保持7分鐘，然後在保持在15℃的溫度。然後在1％的瓊脂糖凝膠上運行PCR反應物並與1kb+DNA分子量標記比較。
實施例2克隆OAT基因到pGBA2載體中來自實施例1的帶有BamH1和Kpn1限制位點的OAT基因產物用BamH1和Kpn1限制酶切割後，連接到同樣被BamH1和Kpn1切割的pGBA2載體中的泛素啟動子和玉米醇溶蛋白終止子之間。泛素啟動子、OAT基因和玉米醇溶蛋白終止子構成了OAT構建體(圖1)。用連接混合物轉化大腸桿菌DH10b菌株感受態細胞後，鋪在含有氨苄青黴素的LB瓊脂上，以選擇被pGBA2轉化的大腸桿菌細胞。然後通過PCR擴增OAT基因的770bp片段，來檢驗被轉化的大腸桿菌菌落中pGBA2質粒內OAT基因的存在。進行限制性消化，然後將所得圖式與預測的片段大小的圖式相匹配，來確認OAT基因的存在。
實施例3OAT基因的測序使用ABI377自動測序儀(Applied Biosystems Industries)按照製造商的指示對實施例2鑑定的一個克隆進行測序。測序是進行使用實施例1的產生770bp片段的正向和反向引物，加上另一內部引物(internal primer)(5』ACAATTGCTAATGTACGTCC)。使用SeqEdTM1.0.3版軟體(AppliedBiosystems Industries)分析原始序列數據，並使用基於全球資訊網的(web based)程序MultAlin(Corpet，1988)與來自Genbank的推定的擬南芥OAT基因序列(NM 123987)進行序列比對。圖2顯示所得的OAT核苷酸序列，而圖3顯示OAT的胺基酸序列。
實施例4用OAT構建體產生轉基因小麥植物使用下列程序產生含有實施例2所述的OAT構建體的轉基因小麥植物群體。
OAT構建體的製備用HaeII消化含有OAT構建體的pGBA2，產生這樣的片段，其含有OAT構建體，位於該構建體5』端的pGBA2的177bp，和位於該構建體的3』端的pGBA2的283bp(圖1)。在1％瓊脂糖凝膠上運行OAT構建體，並如實施例1所述從凝膠抽提出DNA。將DNA以500ng/μL的濃度重懸在水中。
目標組織在玻璃溫室中22-24℃種植小麥植物(栽培品種Westonia和Carnamah)。開花後11-15天收集含有未成熟胚的種子並將其表面消毒。切下未成熟胚，並且在轟擊之前放在含有2.5mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)MS(Murashige和Skoog，1962)培養基上。
微粒轟擊目標組織的滲透劑處理、DNA沉澱以及微粒轟擊均按照已描述的對甘蔗的方法進行(Bower等，1996)，不同的是使用鎢顆粒。每次轟擊用50μg金顆粒轟擊小麥組織。用於轟擊的線性片段是CAH線性構建體(Weeks等，2000)，其編碼氨腈水合酶以降解氨腈，以及等摩爾濃度的OAT構建體。
選擇轟擊之後，在24℃、黑暗中將胚置於含有2.5mg/l的2，4-D的MS培養基上2周，然後轉移到加了40mg/l的氨腈(Sigma)的相同的培養基中，在相同的培養條件下經過6周，每兩周更換新鮮培養基。將組織轉移到含有0.1mg/L 2，4-D和40mg/l氨腈的MS培養基上，並轉移到光照下以供再生。2周後，將組織轉移到不合天冬醯胺和谷胺醯胺，並含有0.1mg/L的2，4-D和55mg/l氨腈的MS培養基(C2培養基)上。2周後將組織轉移到不含2，4-D、含65mg/l氨腈的C2培養基(C3培養基)上。然後將從這些組織生發出的健康小植物轉移到加有65mg/l氨腈的1/2MS培養基上。一旦它們生發出根，即將它們轉移到溫室中的盆栽混合土(potting mix)中。
實施例5基於PCR的轉基因分析為了證明實施例4中產生的植物是否的確含有擬南芥OAT基因的轉基因，用PCR擴增該基因的片段。
從小麥葉提取DNA的方法，如提取植物DNA用的Nucleon PhytoPureTM(Amersham Biosciences)的說明中所詳述的。
用於擴增770 bp片段的PCR引物和條件如實施例1和2所述。
本選擇系統產生的的轉基因產物(transgenics)中有大約50％含有OAT基因。
實施例6使用鹽水水培系統(saline hydroponics system)篩選耐鹽性鑑定了帶有OAT基因的小麥植物後，讓轉基因T0植物產種，並收集種子用於鹽水栽培篩選。
根據先前的實驗，發現150mM的鹽可顯著地導致植物生長中斷，並造成早期產種。
種子種植到石棉小室(rockwool cubes)中(每室一個種子)，讓其在水中萌發並生長到大約10cm高。然後將植物轉移到裝有玄武巖(basaltrock)(2cm blue metal)的開孔的4L盆中。將盆置於水培連續流系統中，使1/2霍格蘭溶液(Hoaglands solution)充入到低於玄武巖頂部2cm的高度。每盆5株植物，每個轉基因品系2盆。讓植物適應水培系統3天時間後，用9∶1比例的NaCl∶CaCl2將溶液分別調節為50mM鹽。每3天將溶液調高50mM，直至達到150mM。然後將溶液保持在150mM鹽。考慮到蒸發和植物的營養物攝取，用1/2霍格蘭溶液有規律地對儲液罐加以調整。
一旦植物完成其生命周期，則將其收集用於表型測定。測定包括每株植物的分櫱數、每株植物的穗數(head number)、每株植物的種子重量和每株植物的種子數。
轉基因品系2490.1在所述水培系統中顯示150mM鹽的耐鹽性。測試的10株2490.1植物顯示，耐鹽性分離為三個顯著不同的組(圖4)。高耐鹽性組、中度耐鹽性組和無耐鹽性組，比例分別為1∶2.5∶1.5。表1中「轉基因2490.1植物」代表高耐鹽性組，而「無效分離體」(null segregates)表示無耐性組中的植物。
表1顯示，2490.1高鹽分離體相對於Westonia和2490.1低鹽(無耐性)分離體，分櫱數、穗數和種子重量增加了2.5倍(3.5fold)以上。高鹽分離體的種子數高於所述兩種對照3倍(4-fold)以上。
表1耐鹽性陽性轉基因植物、商業品種(Westonia)和無效分離體的分櫱數、穗數、種子數和種子重量。S.D.為相對平均值的標準偏差。轉基因2490.1有Westonia背景。

實施例7耐霜凍性評分將來自含有OAT轉基因(品系2490.1和2721.1)的植物T2代的種子種植在4L盆(含有無菌的盆栽混合土和肥料)中，每盆4個種子，在環境受控的房間裡生長。房間中的條件為晝間(12h，3:00pm開始)20℃，夜間(12h)14℃。開花大約20天之前，每2天將晝間的溫度線性遞減(rampdown)2℃，每3天將夜間的溫度線性遞減2℃，直到最終晝間的溫度為8℃，夜間的溫度為4℃。
一旦開始開花，即將植物轉移到霜凍室(frosting chamber)中(輻射線性遞減降溫(radative chilling ramp)且地面/根部溫度(floor/root temperature)受控)，其中溫度從4℃降低到-4℃，保持3小時後，再線性遞增回4℃。該過程經過12小時，一旦完成，即將植物轉迴環境受控的房間。從霜凍後7天起，以晝間溫度每2天升高2℃、夜間溫度每3天升高4℃的速率升高環境受控的房間中的溫度，直到最終的溫度為晝間24℃，夜間18℃。
將轉基因植物和各個對照霜凍後13天，對與麥穗發育階段相應的種子發育水平進行評分。評分方法用未受霜凍的Westonia非轉基因植物作為受過霜凍的Westonia植物和轉基因品系2490.1的基線(0值)；用未受霜凍的Carnamah作為受過霜凍的Carnamah及2721.1的基線。評分的標度為0到5，其中5表示與對照相比沒有或幾乎沒有種子發育(基線)。
兩種受過霜凍的轉基因品系都顯示，相對於受過霜凍的對照(Westonia和Carnamah小麥品種)，種子發育受影響的水平顯著地降低(圖5)。所受影響平均減少到三分之一以下(three fold less)。由此，這些初步結果顯示這些轉基因植物也具有霜凍抗性。
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Ala Thr Arg Gly Phe Gly Pro Leu Leu Pro Gly Asn Leu Lys Val Asp195 200 205Phe Gly Asp Ala Asp Ser Leu Glu Lys Ile Phe Lys Glu Lys Gly Asp210 215 220Arg Ile Ala Gly Phe Leu Phe Glu Pro Ile Gln Gly Glu Ala Gly Val225 230 235 240Ile Ile Pro Pro Asp Gly Tyr Leu Lys Ala Val Arg Glu Leu Cys Thr245 250 255Lys Tyr Asn Val Leu Met Ile Ala Asp Glu Val Gln Ser Gly Leu Ala260 265 270Arg Ser Gly Lys Met Leu Ala Cys Asp Trp Glu Glu Ile Arg Pro Asp275 280 285Met Val Ile Leu Gly Lys Ala Leu Gly Gly Gly Val Ile Pro Val Ser290 295 300Ala Val Leu Ala Asp Lys Asp Val Met Leu His Ile Lys Pro Gly Gln305 310 315 320His Gly Ser Thr Phe Gly Gly Asn Pro Leu Ala Ser Ala Val Ala Met325 330 335Ala Ser Leu Asp Val Ile Val Glu Glu Lys Leu Val Glu Arg Ser Ala340 345 350Ser Leu Gly Glu Glu Leu Arg Ile Gln Leu Asn Glu Ile Lys Lys Gln355 360 365Phe Pro Lys Tyr Ile Lys Glu Val Arg Gly Arg Gly Leu Phe Asn Ala370 375 380Ile Glu Phe Asn Ser Glu Ser Leu Ser Pro Val Ser Ala Tyr Asp Ile385 390 395 400Cys Leu Ser Leu Lys Glu Arg Gly Val Leu Ala Lys Pro Thr His Asn405 410 415Thr Ile Val Arg Leu Thr Pro Pro Leu Ser Ile Ser Ser Asp Glu Leu420 425 430Arg Asp Gly Ser Glu Ala Leu His Asp Val Leu Glu Leu Asp Leu Pro435 440 445Asn Leu Leu Lys Ile Asn Ser Gly Lys Thr Pro Val Ser His Ile Thr450 455 460Glu Cys Asp Arg Cys Gly Arg Asn Leu Tyr Ala465 470 47權利要求
1.耐脅迫小麥植物，其中所述小麥植物已經被編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子轉化。
2.權利要求1的耐脅迫小麥植物，其中所述核酸分子是具有基本上如圖2(SEQ ID NO1)所示核苷酸序列的cDNA分子或者是其生物活性片段。
3.權利要求1的耐脅迫小麥植物，其中所述植物與未被轉化的小麥植物相比，具有增加的耐受選自下列脅迫的能力乾旱脅迫、鹽脅迫、脫水脅迫、熱脅迫、寒冷脅迫、凍結脅迫、水浸脅迫、傷害脅迫、機械脅迫、氧化脅迫，臭氧脅迫、高光脅迫、重金屬脅迫、營養物剝奪脅迫和毒性化學品脅迫。
4.保護小麥植物免受脅迫的方法，包括將編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子導入小麥植物的步驟。
5.權利要求4的方法，其中所述脅迫選自乾旱、鹽、脫水、熱、寒冷、凍結、水浸、傷害、機械脅迫、氧化脅迫，臭氧、高光、重金屬、營養物剝奪和毒性化學品。
6.權利要求4的方法，其中所述脅迫是鹽或乾旱。
7.權利要求4的方法，其中所述脅迫是存在高於100mM的鹽。
8.權利要求4-7任一項的方法，其中所述鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)核酸分子是從擬南芥分離的。
9.權利要求4-8任一項的方法，其中所述小麥植物選自普通小麥和Triticum durum。
10.轉基因小麥植物、植物材料、種子或其後代，其包含編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子，其中所述核酸分子的表達導致產生能在高於100mM的鹽存在下生長的轉基因植物、植物材料、種子或其後代。
11.核酸構建體，其包含鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)基因和分離自植物的啟動子，其中所述核酸構建體能夠轉化小麥植物，致使該小麥植物具有耐脅迫性。
12.權利要求11的核酸構建體，其中所述啟動子是組成性啟動子、遍在性啟動子、脅迫誘導性啟動子、組織特異性啟動子或發育控制型啟動子。
13.權利要求11的核酸構建體，其中所述啟動子是泛素啟動子。
14.權利要求11的核酸構建體，其中所述核酸分子是具有基本上如圖2(SEQ ID NO1)所示的核苷酸序列的cDNA分子或其生物活性片段。
15.產生具有增加的或被誘導的耐鹽性的轉基因小麥植物的方法，該方法包含下列步驟a)用編碼鳥氨酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子轉化小麥植物的植物組織或細胞；b)使所述組織或細胞再生為完整植物；及c)以足夠誘導或增加植物對高於100mM鹽的耐性的條件和時間在再生的植物中表達OAT。
全文摘要
本發明涉及轉基因小麥植物。具體地，本發明涉及耐脅迫的小麥植物，其中該植物已被編碼鳥苷酸氨基轉移酶(OAT)的核酸分子轉化。
文檔編號C12N15/82GK101048060SQ200580033672
公開日2007年10月3日 申請日期2005年7月29日 優先權日2004年8月3日
發明者斯科特·D·麥克尼爾, 道格拉斯·A·張伯倫, 羅伯特·S·鮑爾 申請人:穀物生物技術澳大利亞有限公司