黃麴黴菌lamp檢測引物及其可視化檢測方法

2023-12-10 04:14:01 1

黃麴黴菌lamp檢測引物及其可視化檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種黃麴黴菌LAMP檢測引物及其可視化檢測方法，專用於黃麴黴菌特異檢測。主要設計了一種黃麴黴菌的LAMP檢測引物（包括1對外側引物和1對內側引物），並經過恆溫擴增和加入50μMCalcein-500μMMnCl2顯色劑顯色或瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到綠色螢光或出現LAMP特徵性的梯形帶。本發明可被用於生產實踐中黃麴黴菌感染的花生和玉米等作物中黃麴黴菌的可視化檢測，同時可用於自然發病的花生或玉米組織中早期診斷和病菌的監測和鑑定。
【專利說明】黃麴黴菌LAMP檢測引物及其可視化檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種黃麴黴菌LAMP檢測引物及其可視化檢測方法，專用於黃麴黴菌快速可視化檢測，同時可用於自然發病的花生或玉米組織中早期診斷和病菌的監測和鑑定，屬於有害生物檢測、鑑定領域。
【背景技術】
[0002]黃麴黴毒素(Aflatoxin)是黃麴黴和寄生麴黴生長繁殖過程中產生的真菌次生代謝產物，它是所有真菌毒素中對環境汙染最嚴重，對人畜危害最大的一種毒素，具有致癌、致畸、致突變作用，主要以侵染花生、玉米、大豆、小麥、堅果等農作物及其製品為主，被其侵染的食品及飼料大部分都失去營養價值和經濟價值，因此，各國為了保護國民的身體健康及農牧業的經濟利益都制定了毒素的限量標準，黃麴黴毒素限量已成為農產品出口的技術壁壘。黃麴黴及其毒素汙染不僅直接危害人們的健康，而且影響農作物的品質和外貿出口，所以人們一直設法採取 各種措施防止其汙染，可迄今為止還沒有一種理想的方法。國內外研究的焦點主要集中在黃麴黴毒素的檢測方法，而對產黃麴黴毒素菌的分子檢測技術鮮有報導。傳統麴黴菌的分類鑑定主要是基於形態學特徵、致病性測定、生理生化特性和血清學反應鑑定等，目前對黃麴黴菌的檢測大多仍沿用傳統的培養及鑑定方法，傳統的病原菌檢測技術是在分離得到病原物的基礎上，通過形態學觀察和柯赫氏法則來判斷病原物的種類。整個過程常常需要耗費大量的勞動力和時間，一般需要幾天才能完成。而且要求操作者具備專業的病原菌分離、形態學鑑定知識和豐富的經驗。因此，以形態特徵為基礎的常規病害診斷技術，由於其耗時長，效率低，而且容易出現假陽性或假陰性結果，難以滿足對黃麴黴病快速敏感診斷的實際需要，很容易錯過病害防治的最佳時期。因此，建立一種快速、靈敏、準確的黃麴黴檢測診斷技術不僅非常必要，而且十分迫切。
[0003]PCR技術為植物病原診斷提供了快速、靈敏、準確的優勢，然而目前PCR特異性檢測技術仍然需要PCR儀、電泳和凝膠成像系統等昂貴的專業儀器和分子生物學試劑，且需要分子生物學專業實驗人員操作，限制了 PCR檢測方法的推廣應用。循環恆溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification,簡稱 LAMP)是 2000 年由日本榮研株式會社Notomi等人開發的一種新型循環恆溫核酸擴增技術。LAMP反應針對靶基因的6個位點設計出4條引物,利用一種鏈式置換活性的DNA聚合酶(fci DNA polymerase),在恆溫條件下(60 - 65°C )保溫30 - 90分鐘，即可完成擴增反應。由於LAMP反應的高效性和等溫快速擴增的特點，在90分鐘內可將擴增IO9 - 101°倍。LAMP擴增產物的檢測一般採用螢光染料目測觀察、瓊脂糖凝膠電泳和濁度觀察等方法。由於LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等特徵，因而具有極為廣泛的應用前景。目前LAMP檢測主要應用於人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測，在植物病原菌檢測中報導極少，黃麴黴菌的LAMP可視化檢測國內外均未見報導。

【發明內容】
[0004]本發明的目的是針對現有技術中黃麴黴菌的生物學檢測方法所需周期長、檢測方法特異性差，靈敏度低的問題，提供一種黃麴黴菌的LAMP檢測引物以及結果可靠、易於操作、特異性強、靈敏度高的黃麴黴菌的可視化檢測方法。
[0005]本發明的技術方案如下:
一種黃麴黴菌LAMP檢測引物，其特徵在於引物序列如下:
外側引物 F3: GTGAATTGCAGAATTCCGTGAA
B3: CCTACAGAGCGGGTGACAA
內側引物 FIP:ATGACGCTCGGACAGGCATG-ATCGAGTCTTTGAACGCACA
BIP:TTGGGTCGTCGTCCCCTCTC-CCCCATACGCTCGAGGAT?
[0006]一種利用權利要求1的引物的黃麴黴菌LAMP可視化檢測方法，其特徵在於:LAMP反應體系為:外側引物F3 5uM和B3 5uM各0.25uL，內側引物FIP 40uM和BIP 40uM各
0.25uL，12.5uL反應混合液，IuL顯色劑，IuL 8U BstYm聚合酶，25ng DNA模板，用滅菌雙蒸水補足到25 UL0
[0007]其中，所述的反應混合液為40mM Tris-HCl, 20mM (NH4)2S04, 20mM KCl，16 mMMgSO4,0.2% Triton X-100,1.6M Betaine,2.8 mM dNTPs。
[0008]所述的LAMP反應條件為在65°C溫育60 min, 82°C保溫lOmin。
[0009]其中，所述的顯色劑為50 μ M Calcein-500uM MnCl2，顯色結果觀察到綠色螢光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；或取2uL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現梯形條帶判斷為陽性，沒有出現則判斷為陰性。
[0010]本發明方法適用於黃麴黴菌的快速可靠的檢測和鑑定，對於農業生產中黃麴黴菌引起的病害中病菌的檢測具有重要的實用價值。本發明與現有技術相比，具有以下的技術優勢和積極效果:
1、結果可靠:本發明所設計出的LAMP檢測引物，已經對來源不同的黃麴黴菌和帶黃麴黴菌的花生、玉米組織進行了測試驗證，因此結果可靠性具有充分的保證；
2、特異性強:本發明所採用的LAMP引物是針對黃麴黴菌ITS基因序列中6個不同區域設計出4條特異性引物，6個區域中任何區域與引物不匹配均不能進行核酸擴增，故特異性
聞。
[0011]3、靈敏度高:LAMP對黃麴黴菌的檢測靈敏度在DNA水平上可達到10fg。
[0012]4、實用性好:本發明所設計出的LAMP引物，可用於帶黃麴黴菌高靈敏度快速檢測，因此本方法的實用性強，可滿足對黃麴黴菌進行快速可靠的檢測和鑑定的需要；
5、操作簡便快速:應用本發明方法，對帶黃麴黴菌的組織和土壤進行檢測可在數小時內完成，且LAMP核酸擴增是在等溫條件下進行，只需一個水浴鍋即可，不需要複雜的儀器設備和昂貴的分子試劑，結果肉眼直接可見。
[0013]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發明黃麴黴菌的特異LAMP檢測結果圖。其中:上圖為瓊脂糖凝膠電泳結果，圖中泳道I為黃麴黴菌，泳道2-9為其他麴黴菌、真菌和細菌菌株，泳道M為DL 2000DNA marker ;下圖為螢光顯色結果，離心管號與泳道號相對應。[0015]圖2為本發明黃麴黴菌的LAMP靈敏性檢測結果圖。其中:上圖為瓊脂糖凝膠電泳結果，圖中泳道 1- 7 分別為 Ing, 100 pg, 10 pg, I pg, 100 fg, 10 fg, and I fg,泳道M為DL 2000 DNA marker ;下圖為螢光顯色結果，離心管號與泳道號相對應。
【具體實施方式】
[0016]以下為本發明的具體實施例，進一步說明本發明，但本發明不僅限於此。
[0017]實施例1:LAMP引物對黃麴黴菌的特異性擴增
1.LAMP引物的設計
根據黃麴黴核糖體轉錄間隔區(ITS)序列，採用PrimerExplorer V4軟體設計一種LAMP檢測引物，包括I對外引物(F3和B3)和I對內引物(FIP和BIP)，引物序列分別為:
F3:5』 -GTGAATTGCAGAATTCCGTGAA-3』
B3:5』 -CCTACAGAGCGGGTGACAA-3』
FIP:5』 -ATGACGCTCGGACAGGCATG-ATCGAGTCTTTGAACGCACA-3』
BIP:5』 -TTGGGTCGTCGTCCCCTCTC-CCCCATACGCTCGAGGAT-3』
2.基因組DNA的提取
採用CTAB法提取包括黃麴黴在內的5種麴黴菌和17種不同真菌、細菌基因組DNA。
[0018]具體方法如下:取50mg冷凍乾燥後的菌絲粉於1.5ml離心管中，加入900ul 2%CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)提取液(提取液的配方為:2% CTAB ；100 m mo I/L Tris-HCl(三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽)，pH 8.0 ；20mmol/L EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，pH8.0 ；1.4mol/L NaCl)和90 μ I 10% SDS (十二烷基苯磺酸鈉)後混勻，於55-60°C水浴1.5 h,每10 min振蕩混勻一次，水浴1.5h後離心(12，OOOrpm) 15min,取上清液加入與上清液等體積的酚/氯仿/異戊醇(酚、氯仿和異戊醇的體積比為25:24:1)，離心(12, OOOrpm) 5min,取上清液(水相),加入與上清液等體積的氯仿抽提一次(12，OOOrpm)離心5min,吸上清(350ul)，加0.1體積(35ul)的3mol/L NaAc溶液和2體積(700ul)的冰無水乙醇，-20°C下沉澱30min後12，OOOrpm離心5 min,輕輕地倒去上清液，加入700ul冰70%乙醇進行洗滌(稍離心，傾掉上清)，在超淨工作檯上自然晾乾無酒精味後用IXTE (10mmol/LTris-HCL, 0.lmmol/L EDTA, pH8.0)溶液進行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光度計檢測DNA濃度並稀釋至50ng/ μ I待用。
[0019]3.黃麴黴菌的LAMP特異檢測 對供試菌株進行LAMP擴增驗證。
[0020]①LAMP反應體系25 uL:包括外側引物F3 (5uM)和B3 (5uM)各0.25uL，內側引物FIP (40uM)和 BIP (40uM)各 0.25uL，12.5uL 反應混合液[40mM Tris-HCL, 20mM (NH4)2SO4,20mM KCL,16 mM MgSO4,0.2% Triton X-100,1.6M Betaine,2.8 mM dNTPs]，luL50μ MCalcein-500yM MnCl2, IuL (8U)feiDNA聚合酶，25ng DNA模板，用滅菌雙蒸水補足到25uL。LAMP反應條件為在65°C溫育60 min，82°C保溫lOmin。
[0021]②在LAMP反應液中加入IuL顯色劑，所述顯色劑為50 μ M Calcein-500 μ M MnCl2,顯色結果觀察到綠色螢光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2uL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特徵性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。[0022]4.檢測結果
檢測的特異性結果見圖1，只有第I個樣品即黃麴黴菌樣品出現了綠色螢光和特徵性梯形帶。除了不同來源的黃麴黴菌顯色結果可觀察到綠色螢光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特徵性的梯形帶外，檢測了另外4種麴黴菌和17種真菌、細菌菌株顯色結果為橙色或瓊脂糖凝膠電泳沒有出現擴增條帶，說明此引物具有很強的特異性，可被用於生產實踐中黃麴黴菌快速可靠的檢測和鑑定。
[0023]實施例2 =LAMP弓丨物對黃麴黴菌的靈敏性檢測
1.黃麴黴菌的LAMP靈敏性檢測
採用10倍濃度系列稀釋法將提取的黃麴黴菌DNA稀釋成lng，100 pg, 10 pg, I pg,100 fg, 10 fg, and I fg共7個不同濃度梯度。
[0024]①LAMP反應體系25 uL:包括外側引物F3 (5uM)和B3 (5uM)各0.25uL，內側引物FIP (40uM)和 BIP (40uM)各 0.25uL，12.5uL 反應混合液[40mM Tris-HCL, 20mM (NH4)2SO4,20mM KCL,16 mM MgSO4,0.2% Triton X-100,1.6M Betaine,2.8 mM dNTPs]，luL50μ MCalcein-500 μ M MnCl2, IuL (8U)feiDNA聚合酶，25ng DNA模板，用滅菌雙蒸水補足到25uL。LAMP反應條件為在65°C溫育60 min，82°C保溫lOmin。
[0025]②在LAMP反應液中加入IuL顯色劑，所述顯色劑為50 μ M Calcein-500 μ MMnC12，顯色結果觀察到綠色螢光判斷為陽性，橙色判斷為陰性。或取2uL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特徵性的梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0026]2.檢測結果
黃麴黴菌LAMP靈敏性檢測結果見圖2，第f 6個樣品的顯色結果可觀察到綠色螢光或瓊脂糖凝膠電泳出現LAMP特徵性的梯形帶，說明檢測靈敏度可達10fg。
【權利要求】
1.一種黃麴黴菌LAMP檢測引物，其特徵在於引物序列如下:
外側引物 F3: GTGAATTGCAGAATTCCGTGAA
B3: CCTACAGAGCGGGTGACAA
內側引物 FIP:ATGACGCTCGGACAGGCATG-ATCGAGTCTTTGAACGCACA
BIP:TTGGGTCGTCGTCCCCTCTC-CCCCATACGCTCGAGGAT?
2.一種利用權利要求1的引物的黃麴黴菌LAMP可視化檢測方法，其特徵在於:LAMP反應體系為:外側引物F3 5uM和B3 5uM各0.25uL，內側引物FIP 40uM和BIP 40uM各0.25uL，12.5uL反應混合液，IuL顯色劑，IuL 8U BstYm聚合酶，25ng DNA模板，用滅菌雙蒸水補足到25 UL0
3.根據權利要求2所述的黃麴黴菌LAMP可視化檢測方法，其特徵在於:所述的反應混合液配方為 40mM Tris-HCl, 20mM (NH4)2S04, 20mM KCl, 16 mM MgSO4,0.2% Triton X-100，1.6M Betaine,2.8 mM dNTPs。
4.根據權利要求2所述的黃麴黴菌LAMP可視化檢測方法，其特徵在於:所述的顯色劑為50μΜ Calcein-500yM MnCl2，顯色結果觀察到綠色螢光判斷為陽性，橙色判斷為陰性；或取2uL擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如出現梯形條帶判斷為陽性，沒有出現則判斷為陰性。
【文檔編號】C12R1/67GK103451294SQ201310396394
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月4日 優先權日:2013年9月4日
【發明者】陳慶河, 李本金, 尹容美, 劉裴清, 翁啟勇 申請人:福建省農業科學院植物保護研究所