一種抗d-二聚體單克隆抗體及其用途的製作方法

2023-12-09 19:06:01 2

專利名稱：一種抗d-二聚體單克隆抗體及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗D-二聚體單克隆抗體及其用途，屬於生物技術領域。
背景技術：
D-二聚體是交聯纖維蛋白經纖溶酶作用後的終末產物。在凝血過程中，凝血酶 在水解纖維蛋白原後，即相繼釋放出纖維蛋白肽A(FPA)和肽B(FPB)，剩餘部分為可溶 性纖維蛋白單體(SFM)，在轉行醯胺酶作用下，SFM轉變為纖維蛋白，繼而血液凝固， 其過程是經過一系列交聯後完成，此後形成的纖維蛋白性質穩定，一般不溶解，但可被 纖溶酶所降解，交聯纖維蛋白在纖溶酶降解過程中逐漸生成若干種多聚體，D-二聚體即 是其特異的產物之一，其分子量為184000 202000。在病理狀態下，凝血與纖溶的動態 平衡遭到破壞，凝血傾向增強，從而纖維蛋白降解產物增加，導致D-二聚體含量增加。 D-二聚體水平的增高，表明體內有纖維蛋白血栓形成和纖溶發生，所以臨床上可作為體 內高凝狀態和纖溶亢進的分子標誌物。D-二聚體的檢測對多種疾病的診斷及治療有重要的價值。尤其可在無症狀的高 危患者中對深靜脈血栓(DVT)進行早期篩選；與肺泡_動脈氧分壓差(A_aD02)聯合檢 測可作為排除診斷肺栓塞的首選篩選試驗。此外還可輔助診斷肝臟疾病；對腦梗死進行 診斷及預後判斷；鑑別惡性腫瘤，其他能夠引起D-二聚體升高的因素還有創傷性的骨 折、嚴重感染、穩定性冠心病、重症感染、兒童過敏性紫癜(HSP)急性期、膿毒血症、 結節病等。目前，對D-二聚體的檢測方法主要有DELISA法Rylatt首先以提純的D-二 聚體作為抗原，免疫小鼠後獲得多株抗D-二聚體的單克隆抗體，然後應用ELISA試驗測 定其中D-二聚體含量，其靈敏度達到lOng/ml，稱為ELISA檢測法。其敏感性高，能 定量，但操作繁瑣。2)膠乳凝集法是目前應用最廣泛的D-二聚體檢測法。將獲得 的單抗包被於乳膠顆粒(Latex)上，當血中D-二聚體與Latex發生抗原抗體反應時，致 敏的Latex發生凝集，測得其含量，為Latex檢測法。本法精確度低，只能定性，適應於 急診。3)發色底物法該方法敏感性好、準確性高，可單人份標本迅速檢測，但成本過 尚O採用膠體金標記技術的免疫層析法具有方便、快捷、試劑易於保存等優點，已 被廣泛應用於免疫的各個領域，但膠體金免疫層析法的使用關鍵要解決其特異性、靈敏 度及準確性的問題，這都需要選用具有高度特異性和高親和力的單克隆抗體。

發明內容
本發明的目的是提供一種高度特異性的抗D- 二聚體單克隆抗體及其在膠體金免 疫層析法製備的D- 二聚體檢測試劑盒中的應用，以實現利用膠體金免疫層析法能快速、 準確、高靈敏度檢測D-二聚體的目的。本發明所提供的抗D-二聚體單克隆抗體，其特徵在於其輕鏈的胺基酸殘基序列如SEQ ID No.l所示，其重鏈的胺基酸殘基序列如SEQ ID No.2所示。所述的抗D-二聚體單克隆抗體，是由保藏號為CCTCCNO.C201060的雜交瘤 細胞株6B8D11H12分泌產生。所述的雜交瘤細胞株是以D-二聚體為免疫源，小鼠為免疫對象，通過免疫注射 小鼠，取免疫小鼠脾臟製備懸液，並使之與骨髓瘤細胞進行細胞融合獲得。所述的抗D- 二聚體單克隆抗體，屬於IgG亞型。所述的抗D-二聚體單克隆抗體的腹水效價為1 106。本發明的抗D-二聚體單克隆抗體不僅可以與D-二聚體高度特異性結合，而 且靈敏度高、穩定性好，可通過本領域技術人員所公知的的方法，製備成D-二聚體的 各種檢測試劑盒。尤其是，應用本發明的抗D-二聚體單克隆抗體和膠體金免疫層析法 製備的D-二聚體檢測試劑盒，不僅可以快速、簡捷檢測人血清、血漿或全血標本中的 D-二聚體，不僅使檢測靈敏度達到96.08%，檢測特異度達到94.79%，檢測準確度達到 95.67%,而且能使Kappa檢驗值達到0.901，遠大於0.75，與臨床診斷具有較高的診斷一 致性，可用於臨床上對血栓性疾病的輔助診斷。


圖1為5』 RACE產物電泳圖，其中1號為輕鏈結果，2號為重鏈結果，M為 DNA Marker。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本 發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領 域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要 求書所限定的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件、實驗室手冊中 所述的條件或按照製造廠商所建議的條件。實施例1 抗D- 二聚體單克隆抗體的製備一、動物免疫取雌性6 8周齡的BALB/c小鼠，首次免疫用濃度為5mg/ml的D- 二聚體純 品，經腹腔和四肢腋下注射，總量Iml;每隔2周以同樣的方法加強免疫1次，共免疫3 次，末次免疫後的第4天，從經三次免疫後小鼠眼球採血，離心分離血清，用ELISA法 選出效價高的小鼠準備融合。二、雜交瘤細胞系的製備將完成免疫過程的小鼠準備取脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0融合，在融合前 一天製備飼養細胞；融合時無菌下取小鼠脾細胞，與SP2/0細胞以10 1混合，以50% PEG介導融合，離心後重懸於HAT選擇性培養基中，接種於含有飼養細胞的96孔微孔板 中，置37°C、5%C02培養箱培養，融合後第3d、第5d、第7d用HAT培養液半量換液， 兩周後換用HT培養液。觀察雜交瘤細胞的生長情況，等克隆長至孔底面積的1/3 1/2，取培養上清液，用ELISA法進行抗體檢測，篩選陽性克隆。以有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞 進行克隆化培養，直到克隆化細胞抗體陽性率為100%，選出高分泌特異性細胞株(即 ELISA效價在1 IO6以上的陽性克隆)，此時可將陽性克隆細胞進一步擴大培養。將雜 交瘤細胞經體外連續傳代3個月以上和反覆凍存、復甦，定期收集上清，用篩選抗體的 方法測定上清中的抗體，直至細胞系能穩定分泌單克隆抗體。三、單克隆抗體的製備和純化選用成年BALB/c小鼠，腹腔注射0.5ml液體石蠟，1 2周後收集生長狀態良 好的單克隆雜交瘤細胞株6B8D11H1該細胞株已在設置於中國武漢大學內的中國典 型培養物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期為2010年7月1日，保藏號為CCTCC NO.C201060，每隻腹腔注射lml。接種2周左右的小鼠腹部可見明顯膨大，以頸椎脫 臼法處死後打開腹腔，取出腹水。離心後吸取上清，用硫酸銨沉澱後，再用DEAE離子 交換柱純化，用PH5.6、20mM的醋酸鹽緩衝液洗脫，收集洗脫液。再用親和層析純化法 (蛋白A-Sepharose4B柱)繼續純化，上樣條件樣品和蛋白A_Sepharose4B柱用PH8.2、 1.0M的Tris緩衝液平衡後再上樣。洗脫條件用PH3.0、50mM的甘氨酸緩衝液洗脫， 收集洗脫液，製得特異的單克隆抗體。四、單克隆抗體的腹水效價及鑑定取小鼠腹水抗體，用篩選抗體的方法測定效價為1 106，亞型鑑定為IgG型。實施例2 單克隆抗體的特異性鑑定材料纖維蛋白原及其碎片X、Y、D、E和血漿。方法採用ELISA法檢測，以D- 二聚體為陽性對照。結果顯示纖維蛋白原及其碎片X、Y、D、E和血漿均為陰性。說明本發明的抗D- 二聚體單克隆抗體對D- 二聚體有高度特異性。實施例3 單克隆抗體的可變區序列的克隆與測序採用5，RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends，快速擴增 cDNA 末端)技術，
從分泌抗D- 二聚體單克隆抗體的雜交瘤細胞株6B8D11H12中克隆功能性抗體的可變區 序列。其步驟可簡述為由一個反義的基因特異性引物(GSPl)來合成cDNA第一鏈， cDNA第一鏈純化後，利用末端脫氧核苷酸轉移酶(Terminal deoxynucleotidy transferase, TdT)在cDNA的3』末端加上一個合成的同聚核苷酸錨定序列。利用第二個巢式基因特 異性引物(GSP2)和一個與同聚核苷酸尾巴可以退火的錨定引物來擴增cDNA。具體實驗 過程如下材料-由雜交瘤細胞株6B8D11H12分泌產生的抗D-二聚體單克隆抗體-大腸桿菌ToplO菌株-pGEM-T Easy 克隆載體引物設計根據免疫球蛋白基因的特點，設計兩套分別對應Ig和Kappa恆定區的基因特異 性引物GSP1、GSP2,引物序列如下pRace-H-GSPl GTCCACCKYGGTSYTGCTGGCYGGGTGpRace-H-GSP2 GCACACYRCTGGACAGGGATCCAGAGTTCC
pRace-K-GSPl ACTTGACATTGATGTCTTTGpRace-K-GSP2 CACGACTGAGGCACCTCCAGATG克隆過程A、第一鏈合成以總RNA為模板，以GSPl為引物，在反轉錄酶的作用下合成cDNA第一鏈。 具體步驟如下1)在一個0.5ml的微量離心管中加入以下組分GSPl 2.5ml總 RNA 1 5 μ g補充經DEPC處理的水至總體積為15.5 μ 1，混勻。2)70°C變性lOmin，冰浴Imin，短暫離心後依次加入以下組分IO^PCRbuffer 2.5 μ 125mM MgCl2 2.5 μ 1IOmM dNTP mix 1.0 μ 10.IM DTT 2.5 μ 1。3)混勻，短暫離心後置42°C lmin。4)在反應體系中加入1 μ 1 SuperScriptTMII RT (Invitrogen公司)，輕輕混勻後置 42°C 反應 50min。5)反轉錄結束後置70°C、15min以終止反應。6)離心10 20秒後置於37°C。7)加入1 μ 1 RNase mix,輕輕混勻後置於37°C反應30min。8)將反應管取出置冰上備用。B、DNA 純化使用QIAGEN公司QIAquick PCR純化試劑盒。1)加5倍體積於反轉錄體系的PB緩衝液於反轉錄反應管中，混勻。2)將QIAquick離心柱置於2ml收集管中，把樣品加入離心柱，13000rpm離心60秒。3)棄去液體，將離心柱放回原來的收集管中，加入0.75ml PE緩衝液於QIAquick 離心柱，13000rpm離心60秒。4)棄去液體，將QIAquick離心柱放回原來的收集管，13000rpm離心60秒。5)將QIAquick離心柱置於一乾淨的1.5ml離心管，在QIAquick膜中央加入30 μ 1 EB緩衝液，靜置Imin後，13000rpm離心60秒。C、cDNA 加尾1)在一個0.5ml的微量離心管中一次加入以下組分DEPC 處理的水 6.5 μ 1
5*tailing buffer 5.0 μ 12mM dCTP2.5 μ 1純化的cDNA 10.0 μ 1，混勻。2)將反應管置94°C維持3min後，冰浴lmin，短暫離心後置冰上。
3)加入 1 μ 1 TdT,混勻後置 37°C反應 lOmin。4)將反應管置於65°C中作用30min終止反應，離心後置於冰上備用。D、PCR在一個0.2ml的PCR薄壁管中加入以下組分滅菌水31.5 μ 110*PCR Buffer 5.0 μ 125mM MgCl2 3.0 μ 1IOmM dNTP mix 1.0 μ 1GSP2 (lOpmol/ μ 1) 2.0 μ 1ΑΑΡ (IOpmol/ μ 1) 2.0 μ 1dC-tailed cDNA 5.0 μ 1Tag 酶0.5 μ 1合計50.0 μ 1混勻後置PCR儀中進行反應。E、PCR產物電泳純化PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑑定，結果如圖1所示其中1號為輕鏈結 果，在約450bp處有一特異性條帶；2號為重鏈結果，在約500bp處有一特異性條帶。F、使用Promega公司的pGEM-T Easy試劑盒，將PCR產物克隆到pGEM-TEasy 載體，轉化大腸桿菌ToplO (Invitrogen公司)具體過程為1)輕鏈和重鏈PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，分別回收450bp和500bp的條 帶，最終定容於20 μ 1體積的滅菌水中；2)在一個0.5ml的微量離心管中，加入以下組分2*連接緩衝液5 μ 1pGEM-T Easy 50ng (1 μ 1)PCR 產物 25ng (3 μ 1)Τ4 連接酶 1 μ 1混勻後室溫連接2小時或者4°C連接16小時以上。3)轉化大腸桿菌感受態細胞，塗布於含有氨苄青黴素和IPTG、X-GAL的LB平 板上，37 °C培養12小時左右。G、測定所克隆的PCR產物的鹼基序列各選取至少5個質粒測定其所含的PCR產物的鹼基序列。H、根據鹼基序列與胺基酸編碼序列的相應關係，分析PCR產物的閱讀框架， 確定相應可變區的胺基酸序列，其輕鏈和重鏈的序列分別如SEQ ID No.l和SEQ ID No.2 所示。根據免疫球蛋白基因的特點驗證其為抗體序列。實施例4 本發明的抗D- 二聚體單克隆抗體的應用採用本領域技術人員所公知的膠體金免疫層析法，製作D- 二聚體快速檢測試劑 盒，在體外定性檢測人血清、血漿或全血標本中的D-二聚體，用於臨床上輔助診斷血栓 性疾病。一、檢測原理
採用膠體金標記的免疫層析技術，標本中的D- 二聚體與檢測區包被的抗D- 二 聚體單克隆抗體結合，當D-二聚體濃度超過檢測限時，在檢測區會形成一條色帶，無 D-二聚體的標本在檢測區不會形成色帶；而質控區則始終會出現紅色色帶，以提示檢測 結果正確有效。二、檢測方法A、標本收集及準備1)採用標準實驗室程序收集血清、血漿或全血標本。2)避免熱滅活標本，以防止出現溶血或蛋白變性。3)全血標本採集使用肝素或EDTA為抗凝劑，收集血液標本，由於D-二聚體 在全血或血清標本中很不穩定，全血或血清標本應在採集後4小時內用於檢測。4)血漿/血清標本採集將全血標本離心以獲得血清或血漿標本，如果標本不 能馬上用於檢測，置2 8°C保存24小時，如果不能在24小時內進行檢測，需置-20°C 或更低溫度下保存。注意標本在檢測前需平衡至室溫。B、操作步驟1)實驗前將所需物質及標本平衡至室溫。然後撕開鋁箔袋，從中取出檢測板， 放在水平的表面上。2)用移液器加80μ1標本(或用吸管滴加2滴標本)於樣品孔中。3) 15分鐘內觀察結果。注意若為D-二聚體含量低的標本，顯色時間可能 會超過15分鐘。三、結果判定1)陽性15分鐘內出現兩條色帶時，結果判為陽性。2)陰性如果檢測區不出現色帶，而在質控區出現一條色帶，結果判為陰性。3)無效如果質控區不出現色帶，結果判為無效，必須使用新檢測板重新檢測 標本。四、臨床應用結果為評價本發明的D- 二聚體快速檢測試劑盒在臨床上應用於對血栓性疾病進行輔 助診斷的適用性與準確性，在上海市中西醫結合醫院進行了臨床研究，從臨床中選出300 例樣本作為研究對象。入選對象以血栓性疾病的患者為主，也包括少部分非血栓性疾病 的就診患者。採用美國Inverness公司的D- 二聚體檢測試劑盒(免疫螢光法)進行對比 研究，依據檢測結果將樣本分為病例組和對照組。同時用本發明的試劑盒對這些樣本進 行檢測，比較檢測結果，並進行統計分析，實驗結果見表1所示。表1應用本發明的檢測試劑盒的臨床對比研究結果
權利要求
1.一種抗D-二聚體單克隆抗體，其特徵在於其輕鏈的胺基酸殘基序列如SEQ ID Nal所示，其重鏈的胺基酸殘基序列如SEQ ID No.2所示。
2.根據權利要求1所述的抗D-二聚體單克隆抗體，其特徵在於所述的抗D-二聚體 單克隆抗體是由保藏號為CCTCC NO.C201060的雜交瘤細胞株6B8D11H12分泌產生。
3.根據權利要求2所述的抗D-二聚體單克隆抗體，其特徵在於所述的雜交瘤細胞 株是以D-二聚體為免疫源，小鼠為免疫對象，通過免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾臟製備 懸液，並使之與骨髓瘤細胞進行細胞融合獲得。
4.根據權利要求1所述的抗D-二聚體單克隆抗體，其特徵在於所述的抗D-二聚 體單克隆抗體屬於IgG亞型。
5.根據權利要求1所述的抗D-二聚體單克隆抗體，其特徵在於所述的抗D-二聚 體單克隆抗體的腹水效價為1 106。
6.—種權利要求1所述的抗D-二聚體單克隆抗體的應用，其特徵在於用於D-二 聚體檢測試劑盒的製備。
7.根據權利要求6所述的抗D-二聚體單克隆抗體的應用，其特徵在於用於膠體金 免疫層析法製備的D- 二聚體檢測試劑盒。
8.根據權利要求7所述的抗D-二聚體單克隆抗體的應用，其特徵在於用於臨床上 對血栓性疾病的輔助診斷。
全文摘要
本發明公開了一種抗D-二聚體單克隆抗體，所述抗體的輕鏈的胺基酸殘基序列如SEQ ID No.1所示，其重鏈的胺基酸殘基序列如SEQ ID No.2所示。所述的抗體是由保藏號為CCTCC NO.C201060的雜交瘤細胞株6B8D11H12分泌產生。本發明的抗D-二聚體單克隆抗體可應用於D-二聚體的各種檢測試劑盒的製備中。使用本發明的單克隆抗體和膠體金免疫層析法製備的D-二聚體檢測試劑盒，不僅使檢測靈敏度達到96.08％，檢測特異度達到94.79％，檢測準確度達到95.67％，而且能使Kappa檢驗值達到0.901，遠大於0.75，與臨床診斷具有較高的診斷一致性，可用於臨床上對血栓性疾病的輔助診斷。
文檔編號G01N33/577GK102010472SQ201010516779
公開日2011年4月13日 申請日期2010年10月22日 優先權日2010年10月22日
發明者周季餘, 黃桂民, 黃波 申請人:上海貝西生物科技有限公司