人退變椎間盤軟骨終板幹細胞、製備方法及其應用的製作方法

2023-12-07 05:18:16

專利名稱：人退變椎間盤軟骨終板幹細胞、製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及人退變椎間盤軟骨終板幹細胞在臨床治療椎間盤退變性疾病及其它生物治療中的應用。
背景技術：
下腰痛是臨床常見病和多發病，是引起勞動力喪失和殘疾的最常見病因之一。一般認為椎間盤退行性改變是引起下腰痛最常見的原因，因此對椎間盤退行性疾病的預防和治療具有重要的意義。目前椎間盤退變相關疾病的治療手段主要包括保守治療、手術治療和生物治療。保守治療為對症治療，以緩解症狀為目的，屬於階梯治療的第一步。椎間盤髓核摘除術或脊柱節段融合內固定等手術治療方式只是解決了椎間盤突出所致的神經受壓及脊柱節段不穩的問題，不能從根本上解決椎間盤退行性改變。此外，單純椎間盤髓核摘除會引起椎間隙塌陷，脊柱節段不穩從而產生腰痛等症狀，且有一定的復發率；內固定的使用會加速鄰近椎體節段的退變，從而產生新的臨床症狀。因此，手術治療的長期效果仍然不是十分理想，而且治療費用高，手術所帶來的相關併發症較多。目前，生物治療方式包括基因治療、生長因子治療、細胞治療和組織工程等。椎間盤退行性疾病的生物治療作為一種新興的治療手段，還沒有普遍應用於臨床，但是生物治療的應用前景廣泛，有望成為手術治療和保守治療的有效補充，延緩甚至逆轉椎間盤退變的生物學過程，以改善患者的臨床症狀。

發明內容
本發明的目的是提供一種從人退變椎間盤軟骨終板中分離、純化出具有多向分化潛能的幹細胞，該幹細胞與骨髓間充質幹細胞生物學特性相似，能向骨、軟骨及脂肪等方向誘導分化，而且較骨髓間充質幹細胞表現出更強的成骨和成軟骨分化能力。其具體特徵為①在標準的培養條件下能貼塑料瓶壁生長；②細胞表面標誌物能表達CD105、CD73、⑶90，不表達⑶45、⑶34、⑶14或⑶lib、⑶79alpha或⑶19及HLA-DR表面分子；③在體外培養能向骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞方向分化。本發明還提供一套較為完整的人軟骨終板幹細胞獲取、篩選、純化和擴增方法，包括以下步驟步驟1:制定標本來源的病例納入標準經患者知情並同意，年齡小於70歲，大於40歲；無結核、肝炎、腫瘤、糖尿病等傳染性疾病及自身免疫性疾病；行頸椎、胸椎和腰椎融合手術。步驟2 :將手術中遺棄的軟骨終板標本，在無菌條件下用解剖顯微鏡對軟骨終板標本進行分離，去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環組織，用尖刀仔細刮除粘附於軟骨終板上的髓核，剩下透明狀的軟骨終板。機械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細胞，並以臺盼藍測定細胞活力。將獲取到的原代細胞置37°C、5%C02、95%溼度條件下孵箱培養，倒置相差顯微鏡每天觀察細胞生長情況，每3天換液1次。
步驟3 :將長滿近90%培養瓶的軟骨終板幹細胞用胰蛋白酶消化傳代時，以瓊脂糖篩選系統篩選幹細胞，挑選細胞克隆，置培養於培養瓶置37°C、5%C02孵箱培養擴增、傳代。步驟4 :將傳至第3代的幹細胞進行凍存備用，需要應用時將該細胞復甦。步驟5 :復甦後，將該細胞體外培養擴增，將生物學性能穩定的細胞複合海藻酸鈉，術中X線引導下向目標椎間盤穿刺注射。本發明提供了人軟骨終板幹細胞在防止椎間盤退變性疾病的應用，主要可應用治療的疾病範圍包括1.椎間盤源性腰痛或椎間盤源性頸肩痛病例，經磁共振及椎間盤封閉等手段可明確責任椎間盤。2.腰椎間盤或頸椎間盤髓核摘除術後病例，術後殘留腰痛及頸肩痛且可以明確手術椎間盤為責任椎間盤。3.其它可以採用人軟骨終板幹細胞治療的椎間盤退變性疾病。將上述幹細胞複合海藻酸鈉凝膠植入紐西蘭大白兔退變椎間盤模型中，六個月後觀察檢測結果，發現該細胞支架複合物能夠顯著阻止椎間盤的退變，且髓核再生能力明顯 強於骨髓間充質幹細胞組。此外，該動物實驗屬於異種移植，組織學檢測未見明顯免疫排斥反應。綜上所述，椎間盤軟骨終板幹細胞經動物體內試驗證實其顯著的髓核再生能力，且不存在明顯免疫排斥反應。因此，軟骨終板幹細胞在椎間盤退變性疾病的生物治療中具有良好的應用價值。


圖1所示為人軟骨終板大體標本。圖2所示為人軟骨終板幹細胞相差顯微鏡下形態。圖3所示為瓊脂糖篩選系統中軟骨終板幹細胞集落。圖4所示為流式細胞術檢測軟骨終板幹細胞免疫標誌物結果。符合國際細胞治療學會(the International Society for Cellular Therapy, ISCT)所定義的間充質幹細胞(MSCs)標準。圖5所示為人軟骨終板幹細胞在相應的誘導液誘導下,能向骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞分化。圖5A為非誘導對照組，茜素紅染色不著色，而誘導組經茜紅素染色著色，證實有骨礦化結節生成。圖5B為非誘導對照組經油紅O染色不著色，圖5E為誘導組油紅O染色著色，證實有脂滴形成。圖5C為非誘導細胞團，阿利新藍染色不著色，圖5F為誘導後細胞團，阿利新藍染色呈藍染，證實有細胞團內有大量蛋白聚糖產生，經誘導後的細胞具有軟骨細胞的生物學性能。圖6所示為軟骨終板幹細胞與骨髓間充質幹細胞體外進行細胞聚集成團試驗，等量細胞經誘導向軟骨細胞分化，分別在第1，2，3周時，都顯示軟骨終板幹細胞比骨髓間充質幹細胞所成細胞團更大，顯示的分泌的蛋白聚糖更多，成軟骨的能力更強。圖7所示為分別植入人骨髓間充質幹細胞-海藻酸鈉複合物組、人軟骨終板幹細胞-海藻酸鈉複合物組和海藻酸鈉植入組術後第6月磁共振檢查結果圖(箭頭所指為手術椎間盤，箭頭以上為正常對照椎間盤)。可見人軟骨終板幹細胞組手術椎間盤信號強度(亮度)及髓核再生能力明顯強於骨髓間充質幹細胞組，而單純海藻酸鈉植入組中實驗椎間盤顯著退變，磁供振T2信號顯著降低，且鄰近的下位椎間盤也信號強度降低，發生退變。
圖8所示為人骨髓間充質幹細胞-海藻酸鈉複合物組、人軟骨終板幹細胞-海藻酸鈉複合物組和單純海藻酸鈉植入組在植入手術後第6月X線檢查結果圖(箭頭所指為手術椎間盤，箭頭以上為正常對照椎間盤)。可見人軟骨終板幹細胞組維持椎間隙高度的能力強於骨髓間充質幹細胞組，而單純海藻酸鈉植入組中實驗椎間盤顯著退變，椎間隙變窄，且臨近椎間盤也發生高度丟失。圖9示X線引導下行椎間盤穿刺注入人軟骨終板幹細胞-海藻酸鈉複合物模式圖，此圖為椎間盤造影病例。
具體實施例方式本發明公開了人軟骨終板幹細胞的製備及其臨床治療的應用。本發明的方法及應用已經通過較佳實施進行了描述，來實現和應用本發明技術。下面結合實施例，進一步闡述本發明
實施例1人退變軟骨終板幹細胞的獲取及篩選純化將手術中遺棄的椎間盤標本，無菌狀態下在無菌操作臺紫外燈照射30分鐘殺菌，以含1%慶大黴素的磷酸鹽緩衝液漂洗標本組織直到無血跡，在解剖顯微鏡下對椎間盤標本組織進行分離，去除棉絮狀的髓核組織和白色的纖維狀纖維環組織，用尖刀仔細刮除粘附於軟骨終板上的髓核組織，剩下透明狀的軟骨終板。眼科剪將剩下的軟骨終板剪至ImmX ImmX Imm大小，將剪醉的組織用O. 25%11型膠原酶於37°C消化6小時或先於搖床I小時，再於37°C消化4小時。將軟骨終板組織消化液經孔徑為IOOum或200目的濾網過濾，濾液在1000轉/分鐘條件下離心5分鐘，所得沉澱用含10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養基洗滌3遍，再以該培養基懸浮細胞，吹打使其成單細胞懸液，取IOul細胞懸液以怠盼藍測定細胞活力。剩下的細胞懸液接種於培養瓶，在37°C、5%C02、95%溼度條件下孵箱培養，倒置相差顯微鏡每天觀察細胞生長情況，每3天換液I次。將長滿近90%培養瓶的軟骨終板幹細胞吸棄培養基，加入磷酸緩衝液漂洗2遍，加入胰蛋白酶消化細胞約3-5分鐘，顯微鏡下觀察見少量細胞脫落時加入Iml含10%胎牛血清的培養基終止消化，輕輕吹打細胞，使細胞脫離瓶底，將細胞吸取移入離心管以1000轉/分鐘，離心5分鐘，棄上清，磷酸鹽緩衝液漂洗2遍，用含10%胎牛血清培養基輕輕吹打使細胞變成單細胞懸液，取IOul懸液進行細胞計數，用培養基調整為3 X 104/ml。將1%瓊脂加熱融化，於45°C水浴中溫育，同時將培養基也置於45°C水浴中預溫。將細胞瓊脂培養基(含血清)(1:1:1)混勻後立即倒入24孔板或35_平皿中，10-14天後肉眼可以觀察到白色細胞團。待觀察到大量細胞克隆形成後，解剖鏡下挑取單個細胞集落吹散，將細胞接種至96孔板或24孔板進行於37°C、5%C02孵箱條件下擴大培養。實施例2凍存人軟骨終板幹細胞將增殖狀態良好的細胞，吸棄培養液，加入適量經37°C預溫的O. 25%胰蛋白酶溶液，消化3-5分鐘分散細胞。加入2-4ml含血清的培養液終止胰蛋白酶的消化作用。吹打分散細胞，移入離心管中，平衡後以(800-1000)r/min離心5-10分鐘，棄上清液。加l_2ml培養液重新懸浮細胞，用細胞計數板計算細胞密度，用培養液將細胞濃度調整到(2-5) X IO6/ml,放置冰浴中。將同樣含10%胎牛血清的培養基製成含20% 二甲基亞碸(DMSO)或製成含20%甘油的冷凍保護液，將等量的冷凍保護液滴加於等量的細胞懸液中，輕輕吹打均勻，製成含10%DMS0或甘油的冷細胞懸液，細胞濃度為(1_2)X 10%1。將細胞懸液分別移到冷凍管中，每管1-1. 5ml (事先在管上標明細胞名稱、日期、密度),旋緊管蓋。將冷凍管先置於4°C冰箱O. 5-1小時，再移至-20°C低溫冰箱1-2小時，然而置於_70°C低溫冰箱中過夜，再投入液氣中。實施例3復甦人軟骨終板幹細胞迅速將冷凍管取出，立即投入38_40°C溫水中，並充分搖動，使其迅速融化，一般I分鐘左右完成。在超淨工作檯內，將細胞懸液移至含5ml培養液的離心管內，1000r/min離心5分鐘，棄上清液，加入5ml培養液，吸管輕輕吹打懸浮細胞。將細胞懸液移入培養瓶內，置37 °C培養箱，次日更換一次培養液後 ，待用。實施例4製備人軟骨終板幹細胞藻酸鹽複合物海藻酸鈉，一種天然多糖，是從褐藻類海洋生物中提取的一種線型陰離子天然多糖，是由甘露糖醛酸殘基和古洛糖醛酸殘基以均聚物和雜聚物排列的共聚物，其均聚物部分可在遇到二階陽離子(如Ca2+)時，通過離子交聯發生凝膠化，形成網狀藻酸鈣離子水凝膠。具有一般藥物製劑輔料所需要的穩定性、溶解性、粘性和安全性。將長滿近90%培養瓶的軟骨終板幹/祖細胞吸棄培養基，加入磷酸緩衝液衝洗2遍，加入胰蛋白酶消化細胞約3-5分鐘，顯微鏡下觀察見少量細胞脫落時加入含10%胎牛血清的培養基終止胰蛋白酶的消化，輕輕吹打細胞，將細胞吸取移入離心管離心5分鐘，棄上清，磷酸鹽緩衝液漂洗2遍，含10%胎牛血清培養基輕輕吹打使細胞變成單細胞懸液，再次離心將上清液吸棄，剩下細胞團。以質量濃度1. 2%的海藻酸鈉加入細胞團塊，輕輕軟打混勻，製成3X 107ml密度的藻酸鹽細胞複合物。實施例5選取符合適合治療的病例可應用治療的疾病範圍包括1.椎間盤源性腰痛或椎間盤源性頸肩痛病例，經磁共振及椎間盤封閉等手段可明確責任椎間盤。2.腰椎間盤或頸椎間盤髓核摘除術後病例，術後殘留腰痛及頸肩痛且可以明確手術椎間盤為責任椎間盤。3.其它可以採用人軟骨終板幹細胞治療的椎間盤退變性疾病。實施例6人軟骨終板幹細胞-海藻酸鈉複合物的植入治療在適合治療的病例中，術中在X線引導下行目標椎間盤穿刺，向椎間盤注入適量體積的人軟骨終板幹細胞-海藻酸鈉複合物，再從原通道注入上述凝膠複合物1/3體積的35g/L氯化鈣溶液完成體內的交聯過程，置入穿刺針芯封住注入通道30秒，拔出穿刺針完成操作。實施例7椎間盤退變的治療效果驗證術後定期進行腰椎正側位、動力位X線片，腰骶椎椎間盤MRI掃描觀察；術前及術後各時間點進行VAS，JOA, ODI評分對比，判斷治療效果。以上所述僅是本發明的基本內容，應當指出，在不脫離本發明的前提下，其它科技人員可以對軟骨終板幹細胞做出基因轉染和修飾等改進，但只要涉及運用人軟骨終板幹細胞用於治療等商業目的，這些改進和修飾及其治療等行為都應視為本發明的保護範圍。
權利要求
1.一種人軟骨終板幹細胞，其是從人退變椎間盤軟骨終板中分離出的具有多向分化潛能的幹細胞，其特徵在於①在標準的培養條件下能貼塑料瓶壁生長；②細胞表面標誌物能表達 CD105、CD73、CD90，不表達 CD45、CD34、CD14 或 CDllb、CD79alpha 或 CD19 及 HLA-DR 表面分子；③在體外培養能向骨細胞、軟骨細胞及脂肪細胞方向分化，且較骨髓間充質幹細胞表現出更強的成骨和成軟骨分化能力。
2.權利要求1所述幹細胞的製備方法，其包括以下步驟步驟1:對軟骨終板標本組織進行分離獲得軟骨終板，用機械-膠原酶法獲取軟骨終板原代細胞，體外擴增時並篩選、純化，將獲取到的細胞置孵箱培養，每3天換液I次；步驟2 :待細胞融合達90%時，對軟骨終板細胞消化傳代，運用瓊脂糖篩選系統篩選細胞，得到較高純度的軟骨終板幹細胞，再置於孵箱培養，進行擴增；步驟3 :將傳至第3代的細胞進行凍存備用，需要應用時將該細胞復甦即可。
3.權利要求1所述人軟骨終板幹細胞在製備治療椎間盤退變性疾病的組織工程髓核中的應用。
4.權利要求1所述人軟骨終板幹細胞在製備治療椎間盤退變性疾病的組織工程髓核中的應用，所述組織工程髓核是將人軟骨終板幹細胞與支架材料複合而獲得，人軟骨終板幹細胞的用量為>lX105/ml。
5.根據權利要求3或4所述人軟骨終板幹細胞的應用，其特徵在於所述椎間盤退變性疾病包括椎間盤源性腰痛、椎間盤源性頸肩痛，還可用於經磁共振及椎間盤封閉等手段可明確責任椎間盤病例、腰椎間盤或頸椎間盤髓核摘除術後病例、術後殘留腰痛及頸肩痛且可以明確手術椎間盤為責任椎間盤病例。
6.根據權利要求4所述人軟骨終板幹細胞的應用，其特徵在於所述組織工程髓核是將人軟骨終板幹細胞體外培養擴增並經篩選後，複合海藻酸鈉而形成，在X線引導下行目標椎間盤穿刺注射。
全文摘要
本發明提供一種從人退變椎間盤軟骨終板中分離、純化出具有多向分化潛能的幹細胞，該幹細胞與骨髓間充質幹細胞生物學特性相似，經誘導能向骨、軟骨及脂肪等方向分化，而且較骨髓間充質幹細胞表現出更強的成骨和成軟骨分化能力。軟骨終板幹細胞經動物體內試驗證實其具有顯著的髓核再生能力和阻止椎間盤退變的作用，且不存在明顯免疫排斥反應，在椎間盤退變性疾病的生物治療中具有良好的應用前景和價值。
文檔編號A61P19/08GK103013910SQ201210418889
公開日2013年4月3日 申請日期2012年10月26日 優先權日2012年10月26日
發明者黃博, 王海, 周躍 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學第二附屬醫院