一種檢測豬輸血傳播病毒2型抗體的間接elisa試劑盒的製作方法

2023-12-04 19:28:06 3

專利名稱：一種檢測豬輸血傳播病毒2型抗體的間接elisa試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於檢測豬輸血傳播病毒2型(即豬TTV2)抗體的間接ELISA試劑盒，屬於獸醫生物技術領域。
背景技術：
TTV (Torque Teno virus)又名輸血傳播病毒，屬指環病毒科(Anelloviridae),壬型細環病毒屬(1tatorquevirus),是一種無囊膜的單股環狀負鏈DNA病毒。最早是由日本學者Nishizawa等於1997年發現的，由於該病毒是從肝炎患者體內分離獲得的，因此懷疑其與肝炎有關，從而引起了高度關注。隨後各國對本國不同人群中TTV感染情況進行了流行病學調查，結果發現人群中TTV DNA陽性率一般在10%以上。目前已經證實，除了人類可以感染TTV以外，在靈長類動物(黑猩猩、類人猿和猴)、家畜(豬、牛、羊、犬、貓、雞)和其它動物(老鼠、樹駒和駱駝)體內均相繼檢測到了 TTV的存在。研究表明TTV已經在世界豬群中廣泛存在，並且可能與某些疾病的引起有關，因此已在全球引起重視。Segales J等對1985年-2005年間，採自西班牙99個豬場的162份血清樣品進行TTV檢測，結果在 所有年份中均檢測出豬TTV，在母豬和肉豬中，TTVl的陽性率分別為34.2%和30.9%, TTV2的陽性率分別為46.6%和62.8%, TTVl和TTV2共感染率分別為19.8%和24.5%,該結果表明至少在1985年豬TTV就已經存在於西班牙豬場中。Martinez等對西班牙178頭野豬中TTV的感染情況進行了調查，結果總陽性率為84%，TTVl和TTV2的陽性率分別為58%和66%，TTVl和TTV2共同感染的陽性率為18%，但該結果被認為與地理位置有關。王礞礞等首次對國內來自廣東、福建和江西等7個省份的258份豬血液樣品和組織樣品進行了檢測，結果表明豬群中TTVl和TTV2感染陽性率分別為37.6%和82.6%，TTV2陽性率明顯高於TTVl，二者的混合感染率為34.5%，證實我國豬群中存在TTV感染，並且以TTV2較為流行。該病毒經常與其他病毒發生共同感染。McKeown N E等研究表明，該病毒與已知病原的混合感染能夠增加疾病的嚴重性，而且該病毒具有潛在的跨種傳播給人的危害，這也提示我們不能忽視對該病毒的研究。對於新發疫病的診斷和防制工作是科研工作者首要解決的關鍵，目前只有通過PCR技術擴增TTV的核酸來診斷，建立該病毒的抗體檢測方法，對該病的流行病學調查、免疫效果的評價等極有意義，而ELISA因具有檢測通量大、結果確切、靈敏度高、易於基層推廣等特點而倍受歡迎，成為目前應用最廣泛的一種血清學檢測方法。由於目前豬TTV尚不能在體外培養中得到很好的增殖，所以通過分子生物學方法大量表達TTV的抗原蛋白並以此作為包被抗原建立檢測豬血清中抗TTV抗體的ELISA成為最佳選擇。豬TTV分為兩個亞型，即TTVl和TTV2，基因組之間變異的一個突出特點是，與TTV2相比，TTVl有大量的變異位點，即TTVl的變異性比TTV2的大。在TTVl中，總共有1349個變異位點，平均每個變異位點有1.27個替代物，在TTV2中變異位點比較少，共有670個。此外，ORFs之間的突變模式也是不同的:0RF1可能編碼病毒衣殼蛋白(Cap)和複製相關蛋白(Rep)，比較保守，在密碼子的第三個位置的變化率比較高，儘管已經報導了 0RF2和0RF3的一些保守區域，但相對來說，二者的保守性比較低。且我國TTV的流行情況表明，TTV2感染率明顯高於TTVl，我國TTV2較為流行。因此，本發明以豬TTV流行亞型TTV2的相對保守基因ORFl基因為模板，進行原核表達、純化，利用純化的重組蛋白作為抗原建立間接ELISA檢測方法，為該病毒的早期診斷以及大規模的檢測提供了技術手段。

發明內容
技術問題
本發明的目的是提供一種能快速、簡便地檢測豬TTV2血清抗體的間接ELISA試劑盒，即利用pcoldl原核表達載體，構建了能表達豬TTV2 ORFl部分基因的載體，並將表達的重組蛋白純化後包被ELISA板，以檢測豬血清中TTV2的抗體水平。技術方案
本發明通過以下步驟實現:
一種能快速、簡便地檢測 豬TTV2血清抗體的間接ELISA試劑盒，試劑盒內設有抗體檢測板，封閉液，樣品稀釋液，洗滌液，酶結合物工作液，酶底物溶液，終止液，陽性對照和陰性對照；其中抗體檢測板為包被豬TTV2重組ORFl蛋白的可拆96孔酶標板，酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記山羊抗豬IgG多克隆抗體，陽性對照為豬TTV2標準陽性血清，陰性對照為豬標準陰性血清，包被豬TTV2重組ORFl蛋白序列如下:
IDLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKDQGHWSNWAQIKYYWIYDTGVGNAVY 5I VVMLKKDIDDNPGRMATEFKTTPGQHPNAIDHIELINEGWPYWLYFFGKS 101 EQDIKKEAHSEEIAREYATNPKSKKLKIGIVGWASSNFTTPGSSQNVGGN 151 TAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSIGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFD 20I WGLRSLCMLRDNMQLGSQELDDECTMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFK 251 PELKDYNUMKYAFKFQWGGHGTERFKTTI ⑶ PSTIPCPFEP ⑶ RFHSGI 30I QDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKDTLKRLLELPTETEEEKAYPLLGQKT 351 EKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQEEETQRRKHHKPSKRRLLKHLQRVVKR 401 MKT。所述的豬TTV2重組ORFl蛋白是由原核表達質粒pcoldl-ORFl表達的，原核表達質粒pcoldl-ORFl是由以下方法構建而成的:
O利用基因工程重組技術構建豬TTV2 ORFl部分基因的原核表達質粒，命名為pcoldl-ORFl ;是由以下方法構建而成的，設計了一對含有酶切位點的引物:
SFORF1: CCGCTTG^GACTTAACGGAACCGTGGCTAGAAG {Xho I)
SR0RF1: CCCA4 化T7TGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA {Hindi II)
利用上述特異性引物，從TTV2陽性病料中擴增基因片段，得到1227bp的擴增片段，再利用各自引物上的限制性內切酶，分別對PCR擴增產物和pcoldl載體進行酶切，用T4 DNA連接酶順次將酶切的PCR擴增片段連接到pcoldl上。具體來說，首先將pcoldl載體和SF0RF1與SR0RF1引物擴增的片段分別經通ol和歷/^III酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA連接酶連接，構建pcoldl-ORFl載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態中，提取質粒，挑選酶切鑑定正確的克隆進行測序鑑定。
挑取經通ol和歷/^III雙酶切出1215bp條帶的質粒進行測序，測序結果表明目的片段與pcoldl載體正確相連，表達蛋白的閱讀框正確，結果表明重組原核表達載體質粒pcoldl-ORFl構建成功。2)將質粒pcoldl-ORFl轉化宿主菌大腸桿菌BL21中成為基因工程菌(命名為BLpcold1-ORFUdf BLpcold1-ORFl 在 LB 培養基中於 15°C培養，經 0.2mmol/L 誘導表達並經SDS-PAGE電泳分析顯示重組蛋白以不溶性包涵體形式存在於菌體中；從而獲得豬TTV2重組蛋白的原核表達質粒pcoldl-ORFl。3)以重組蛋白為包被抗原製備ELISA檢測板，檢測豬血清中豬TTV2的抗體水平；
(O包被:將權利要求1或2所述的一種豬TTV2 ORFl截短蛋白的原核表達質粒pcoldl-ORFl表達的重組蛋白純化後用抗原包被液稀釋為1.65 μ g/mL的終濃度，每個ELISA孔加入100 μ I，4°C條件下包被過夜。棄去板中的包被液體，PBST緩衝液洗滌5minX 3次。抗原包被液為0.05M，pH9.6的碳酸鹽緩衝液；PBST緩衝液為含質量比0.01%Tween-20的PBS緩衝液；
(2)封閉:每孔加封閉液200μ 1，37°C條件下作用lh，PBST緩衝液洗滌5minX3次；封閉液為含質量比2%脫脂奶粉的PBS緩衝液；
(3)加待檢血清:每孔加入100μ I用含有質量比0.5%BSA的PBS稀釋後的血清，37°C條件下作用1.0h, PBST緩衝液洗滌5minX3次；
(4)加二抗:每孔加入100μ I稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG, 37°C條件下作用30 min,PBST緩衝液洗滌5minX 3次；稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG為用pH7.0的PBS按1:5000比例稀釋；
(5)加顯色液:每孔加含lm·g/mlTMB四甲基聯苯二胺的顯色液100 μ 1，37°C避光作用5 min ；
(6)加終止液:每孔加入100μ I終止液，酶標儀測定450 nm吸光值0D450 ;終止液為2M H2SO4 ；
(7)結果判定:待檢血清0D450值>0.248時判定為豬TTV2抗體陽性，0D450值Z 0.248判定為陰性。有益效果
本發明方法首次利用分子生物學基因克隆表達技術，獲得豬TTV2 ORFl重組蛋白，以重組蛋白為抗原建立間接ELISA，可對目前我國流行的豬TTV2進行有效的診斷，判斷豬群中TTV2抗體水平和自然感染的狀況，為豬TTV2病毒的防制提供了一種快速、簡便的檢測方法。試驗證明，本發明首次利用表達和純化後的重組蛋白(TTV2 0RF1)作為抗原包被ELISA板建立的間接ELISA方法，確實可以檢測到豬體內抗豬TTV2抗體，且具有良好的特異性和重複性。對臨床樣品進行檢測，結果表明本方法可以作為豬TTV2血清學檢測的一種方法而運用到生產實際中。


圖1重組蛋白表達和純化後的SDS-PAGE分析1:超聲波裂解沉澱；2:超聲波裂解上清；3:誘導後產物；4:未誘導產物；5:蛋白Marker
圖2免疫印跡試驗顯示豬TTV2 ORFl重組表達蛋白 1:蛋白Marker ； 2:pcold1-0RFl表達蛋白的純化產物 圖3純化蛋白的Western blotting檢測 1:空載體誘導蛋白；2:pcold1-0RFl純化蛋白；3:蛋白Marker
具體實施例方式本發明的要點是:利用pcoldl構建部分豬TTV2 ORFl基因的原核表達載體，並將表達後的重組蛋白進行純化，建立間接ELISA檢測試劑盒和檢測方法，並運用於臨床檢測。包被抗原的製備:
1.1特異性引物設計與合成:根據GenBank收錄的豬TTV2基因序列(GenBank登錄號為:EF514716)，選取編碼豬TTV2開放閱讀框ORFl基因，利用Primer Premier 5.0軟體設計了含有酶切位點的弓I物並提交上海英駿公司進行合成。SFORFl-:CCGC7TG^GACTTAACGGAACCGTGGCTAGAAG {Xhol)
SRORFl: CCCA4化T7TGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA {HindiII)
1.2原核表達載體的構建:利用上述特異性引物，從TTV2陽性病料中擴增基因片段，得到1227bp的擴增片段，再利用各自引物上的限制性內切酶，分別對PCR擴增產物和pcoldl原核表達載體(購自Takara)進行酶切,用T4 DNA連接酶(購自Takara)順次將酶切的PCR擴增片段連接到pcoldl上。具體來說，首先將pcoldl載體和SF0RF1與SR0RF1引物擴增的片段分別經通ol和歷/^III酶切，回收各自的酶切片段，用T4 DNA連接酶連接，構建pcoldl-ORFl載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5a (北京全式金生物技術有限公司)感受態中，提取質粒，酶切鑑定陽`性克隆，鑑定為陽性克隆的送南京金思瑞公司進行序列測定。挑取經通ol和歷/^III雙酶切出1215bp條帶的質粒進行測序，測序結果表明目的片段與pcoldl載體正確相連，表達蛋白的閱讀框正確，結果表明重組原核表達載體質粒pcoldl-ORFl構建成功。將質粒pcoldl-ORFl轉化宿主菌大腸桿菌BL21中成為基因工程菌，命名為基因工程菌BLpcold1-ORFl。所述重組原核表達載體質粒pcoldl-ORFl表達的重組蛋白序列如下:
I DLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKDQGHWSNWAQIKYYWIYDTGVGNAVY
5I VVMLKKDIDDNPGRMATEFKTTPGQHPNAIDHIELINEGWPYWLYFFGKS101 EQDIKKEAHSEEIAREYATNPKSKKLKIGIVGWASSNFTTPGSSQNVGGN151 TAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSIGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFD20I WGLRSLCMLRDNMQLGSQELDDECTMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFK251 PELKDYNUMKYAFKFQWGGHGTERFKTTI ⑶ PSTIPCPFEP ⑶ RFHSGI30I QDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKDTLKRLLELPTETEEEKAYPLLGQKT351 EKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQEEETQRRKHHKPSKRRLLKHLQRVVKR401 MKT
1.3重組蛋白的誘導表達和分析將基因工程菌BLpcold1-ORFl按2%比例接種於含Amp的LB液體培養基(在950mL去離子水中加入胰化蛋白腖10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，用NaOH調pH至7.0，用去離子水定容至1L)中，15°C振蕩培養至0D600 ^ 0.4 0.6，加入IPTG至終濃度為0.2mmol/L，進行誘導表達，收集誘導後不同時間表達的菌體，於冰浴上進行超聲破碎，裂解後的菌液經IOOOOrpm離心30min，分離上清和沉澱同時進行SDS-PAGE電泳(採用LaemimLi不連續SDS-PAGE系統，分離膠12%、濃縮膠4%)，鑑定目的蛋白的表達及表達形式。1.4重組蛋白純化:
取100ml LB液體培養基，按照1.3中蛋白誘導表達條件進行大量誘導培養，取包涵體按照Macherey-Nagel公司Protino N1-TED Resin試劑盒說明書進行蛋白純化,取回收蛋白樣品加2xSDS凝膠加樣緩衝液煮沸5 min後，進行SDS-PAGE鑑定蛋白純度。回收蛋白樣品採用分光光度計測定蛋白質濃度。SDS-PAGE分析顯示，重組蛋白在大腸桿菌BL21 (北京全式金生物技術有限公司)細胞中成功表達，以 不溶性包涵體形式存在於菌體中，蛋白分子量大小為52kDa (圖1)，與預測的重組蛋白大小基本一致，鎳柱回收後蛋白質樣品進行SDS-PAGE，可見單一的目的條帶(圖2)，表明用鎳柱純化該表達蛋白效果較好。Western Blotting分析:按照1.4中方法純化的蛋白進行SDS-PAGE,參照常規Western Blotting方法進行操作,最後採用DAB底物顯示試劑(武漢博士德公司)進行顯色。結果在52KDa處出現特異條帶，表明表達純化的蛋白與豬TTV2陽性血清具有很好的反應原性(圖3)。2.以重組蛋白建立間接ELISA:
取純化後的TTV2 ORFl重組蛋白做包被抗原建立間接ELISA方法，採用方陣法探索ELISA最佳蛋白包被濃度和血清稀釋度，以及ELISA最佳反應條件。2.1抗原包被液的確定
分別以磷酸鹽緩衝液(0.01M, ρΗ7.4，PBS)、Tris-HCl緩衝液(0.05 Μ，ρΗ8.5)、碳酸鹽緩衝液(0.05 Μ，ρΗ9.6)、蒸餾水作為包被液，以最佳稀釋度稀釋抗原，4°C包被過夜，洗滌後以1%BSA進行封閉2h，洗滌後加入以最佳稀釋度稀釋的血清，作用lh，洗滌後加入1:5000稀釋的酶標二抗作用lh，洗滌後加入TMB室溫避光顯色lOmin，通過0D450值和P/N值來確定最合適的包被液。結果顯示，碳酸鹽緩衝液的包被效果最好，因此用碳酸鹽緩衝液作為抗原稀釋液包被酶標板。2.2抗原抗體的最佳工作濃度
將純化的pcold-ORFl重組蛋白用0.05mMpH9.6的碳酸鹽緩衝液自上而下依次做1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640、1:1280 梯度稀釋，100 μ I/ 孔，4 °C 過夜。次日取出用PBST洗滌3次，每次5min。用1%的牛血清白蛋白(BSA)進行封閉，200μ1 /孔，37°C作用2h。將標準陰陽性血清作1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320梯度稀釋，從左至右依次加入各孔，100μ1/孔，37°C作用lh，洗滌(同上)；隨後每孔加入100 μ I稀釋至工作濃度(1:5000)的羊抗豬IgG-HRP (武漢博士德公司)；37°C作用Ih，洗滌(同上)；每孔加入100 μ I TMB顯色液,避光室溫顯色10 min,最後加入100 μ I終止液終止反應,立即使用酶標儀測定其0D450值。根據0D450值和Ρ/Ν值確定抗原和抗體的最佳工作濃度。結果顯示，當抗原的稀釋度為1: 160，抗體的稀釋度為1: 160時，陽性血清的0D450值接近於1.0，並且P/N值最大。因此，確定重組蛋白最佳包被濃度為1.65 μ g/mL,血清最佳稀釋度為1:160。2.2最佳包被時間的選擇
以最佳抗原濃度包被ELISA板，分成三組。第一組:37°C包被2h ;第二組:37°C孵育Ih後4°C過夜；第三組:4°C包被過夜。陰、陽性血清各做4個重複。三種不同包被條件下包被後，洗滌，以1%BSA進行封閉2h，洗滌後加入以最佳稀釋度稀釋的血清，作用lh，洗滌後加入
I: 5000稀釋的酶標二抗作用lh，洗滌後加入TMB室溫避光顯色lOmin，通過0D450值和P/N值來確定最佳包被條件。結果確定最佳包被時間為4°C過夜。2.3 最佳封閉液的選擇用碳酸鹽緩衝液將抗原稀釋至最佳濃度包被ELISA板，4°C包被過夜。次日取出洗滌後，分別以1%BSA、2%BSA、2%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉、1%明膠、2%明膠、5%犢牛血清、10%犢牛血清作為封閉液，陰陽性血清各做2個重複。進行封閉2h，洗滌後加入以最佳稀釋度稀釋的血清，作用lh，洗滌後加入1:5000稀釋的酶標二抗作用lh，洗滌後加入TMB室溫避光顯色lOmin，通過0D450值和P/N值來確定最佳封閉液。結果顯示，當用2%脫脂奶粉進行封閉時，P/N值最大，封閉效果最好，因此選用2%脫脂奶粉作為最佳封閉液。 2.4封閉時間的選擇用碳酸鹽緩衝液將抗原稀釋至最佳濃度包被ELISA板，4°C包被過夜。次日取出洗滌後，以2%脫脂奶粉分別封閉30min、60min、90min、120min，陰陽性血清各做4個重複。洗滌後加入以最佳稀釋度稀釋的血清，作用lh，洗滌後加入1:5000稀釋的酶標二抗作用lh，洗滌後加入TMB室溫避光顯色lOmin，通過0D450值和P/N值來確定最佳封閉時間。當封閉時間為60min和90min時，P/N值較大並且相差不大，因此為了節省時間，本實驗選用封閉時間60min做為最佳封閉時間。2.5最佳血清稀釋液的選擇
在血清稀釋液中加入封閉成分，能達到減少非特異性吸附作用，為此在PBS中加入
0.5%BSA、2%脫脂奶粉、5%脫脂奶粉和1%明膠，用己知的陰、陽性血清進行ELISA檢測，觀察OD值變化及P/N變化，並以PBS稀釋血清作為對照篩選最佳一抗稀釋液。結果選擇含有
0.5%BSA的PBS作為最佳一抗稀釋液。2.6血清最佳反應時間的確定
用碳酸鹽緩衝液將抗原稀釋至最佳濃度包被ELISA板，4°C包被過夜。次日取出洗滌後，以2%脫脂奶粉封閉60min，洗滌後，加入用1.5%BSA樣品稀釋液稀釋至最佳濃度的血清，分別作用30min、60min、90min、120min,陰陽性血清各做4個重複。洗漆後加入1:5000稀釋的酶標二抗作用lh，洗滌後加入TMB室溫避光顯色lOmin，通過0D450值和P/N值來確定血清最佳反應時間。當血清作用時間為60min時，P/N的值明顯比較大，因此選擇血清最佳作用時間為60min。2.7最適酶標二抗使用濃度的確定
用碳酸鹽緩衝液將抗原稀釋至最佳濃度包被ELISA板，4°C包被過夜。次日取出洗滌後，以2%脫脂奶粉封閉60min，洗滌後，加入用1.5%BSA樣品稀釋液稀釋至最佳濃度的血清作用60min,洗滌後，分別加入濃度為1:2000、1:3000、1:4000、1:5000的酶標二抗，作用Ih,陰陽性血清各做2個重複。洗滌後加入TMB室溫避光顯色lOmin，通過0D450值和P/N值來確定酶標二抗的最佳濃度。當酶標二抗濃度為1:5000時，P/N值最大，因此本實驗選用1:5000作為酶標二抗的最佳工作濃度。

2.8最適酶標二抗反應時間的確定用碳酸鹽緩衝液將抗原稀釋至最佳濃度包被ELISA板，4°C包被過夜。次日取出洗滌後，以2%脫脂奶粉封閉60min，洗滌後，加入用1.5%BSA樣品稀釋液稀釋至最佳濃度的血清作用60min,洗漆後加入濃度為1:4000的酶標二抗,分別作用30min、60min、90min、120min,陰陽性血清各做4個重複。洗滌後加入TMB室溫避光顯色lOmin，通過0D450值和P/N值來確定酶標二抗最佳反應時間。當二抗作用時間為30min時，P/N值最大，因此選擇30min作為酶標二抗最佳反應時間。 2.9最適底物反應時間的確定
用碳酸鹽緩衝液將抗原稀釋至最佳濃度包被ELISA板，4°C包被過夜。次日取出洗滌後，以2%脫脂奶粉封閉60min，洗滌後，加入用1.5%BSA樣品稀釋液稀釋至最佳濃度的血清作用60min，洗滌後加入濃度為1:4000的酶標二抗，作用30min，洗滌後加入TMB室溫避光分別顯色3min、5min、8min，陰陽性血清各做4個重複。通過0D450值和P/N值來確定底物最佳反應時間。當反應時間為5min時，P/N值最大，因此選擇底物反應時間為5min。2.10間接ELISA方法陰陽性臨界值的確定
用已建立的間接ELISA方法檢測陰性的豬血清，計算40份TTV陰性血清0D450的平均值(X)為0.191，標準差(SD)為0.019，按照公式:X+3SD確定間接ELISA檢測方法的陰陽性臨界值為0.248，即當樣品的0D450值彡0.248時即為陽性，0D450值< 0.248時則為陰性。2.11間接ELISA的特異性和重複性試驗
用建立的豬TTV2間接ELISA檢測方法檢測已知的SS2 (豬鏈球菌2型)(參見張雪寒、何孔旺、周俊明等.豬鏈球菌2型次黃嘌呤核苷酸脫氫酶缺失株的構建[J].中國農業科學.2009.5(42): 1789-1796.)、HPS (副豬嗜血桿菌)(參見王海燕，劉茂軍，馮志新等.副豬嗜血桿菌培養特性及致病性研究[J].金陵科技學院學報. 2009.4(25):80-83)、Mhp(豬肺炎支原體)(參見王佔偉，劉茂軍，馮志新等.滲透壓對豬肺炎支原體168株的影響[J].Agricultural Science & Technology.2012.13 (10):2051-2054)、PCV2 (豬圓環病毒2型)(參見郭容利，何孔旺，鍾書霖等.兩株豬圓環病毒2型病毒的分離鑑定及其序列分析[J].江蘇農業學報.2009.25(5): 1063-1067.)、PPV (豬細小病毒)(參見潘群興，王永山，何孔旺等.重組表達口蹄疫病毒T細胞表位豬細小病毒病毒樣顆粒的製備[J].中國預防獸醫學報.2010.11(32):844-848)、PRV (豬偽狂犬病毒)(參見張雪寒，何孔旺，繆文凱等.Taqman探針實時定量PCR檢測豬偽狂犬病毒[J].江蘇農業學報.2008.24(4):440-443.)、TGEV (傳染性胃腸炎病毒)(參見何孔旺，林繼煌，還紅華等.豬傳染性胃腸炎病毒致弱株STC3細胞培養特性及致病性研究[J].Chinese Journalof Veterinary Science and Technology.2001.31 (8): 8-9.)、CSFV (豬痕病毒)(參見張雪寒，何孔旺，郭容利等.檢測CSFV、JEV、PRRSV三種RNA病毒多重RT-PCR方法的建立[J].中國預防獸醫學報.2007.29(5):385-388.)、PRRSV (豬繁殖與呼吸症候群病毒)(參見李彬，毛力，何孔旺等.豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)江蘇分離株NJGC 0RF5基因的克隆及遺傳變異分析[J].江蘇農業學報.2011.27(4):775-781.)、FMDV (口蹄疫病毒)(參見劉耀方，何孔旺，張德坤等.利用多重RT-PCR對口蹄疫病毒分型[J].江蘇農業科學.2007.5:136-139.)陽性血清，同時設立TTV2陽性、陰性對照，測定其0D450，確定是否有交叉反應。結果OD值均小於0.248，為陰性，表明該重組蛋白與上述病毒的陽性血清無交叉反應，說明該間接ELISA方法特異性強。批內重複:用同一批次製備的純化重組抗原包被同一塊ELISA板，對2份陽性血清和2份陰性血清樣本進行檢測，每份血清樣本重複4個孔，測定0D450值，計算變異係數(CV=SD/X)，評價批內重複試驗效果。結果表明，4份血清的0D450值變異係數均小於10%，表明同一樣品在同一批次試驗中變異程度較小，具有良好的重複性。批間重複:在不同批次製備的串聯蛋白包被的酶標板中，每批隨機抽取I個，檢測6份TTV2抗體水平不同的血清，每份血清平行做4孔，計算檢測結果的變異係數(CV=SD/X)。6份血清的0D450值變異係數均小於5%，表明同一樣品在不同批次試驗中變異程度較小，具有較好的重複性。結果表明批內和批間的變異係數均小於5%，表明該方法具有較好的重複性。3.間接ELISA方法的初步應用
通過建立的間接ELISA方法對2010年 2011年之間江蘇和安徽兩省送檢的352份豬血清進行檢測。江蘇送檢的血清共192份，其中82份檢測結果為陽性，陽性率為42.7%，安徽送檢的血清共160份，其中12份檢測結果為陽性，陽性率為7.5%，兩省送檢血清的TTV2總陽 性率為26.7%。
權利要求
1.一種豬輸血傳播病毒2型(TTV2)抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特徵在於:試劑盒內設有抗體檢測板，封閉液，樣品稀釋液，洗滌液，酶結合物工作液，酶底物溶液，終止液，陽性對照和陰性對照；其中抗體檢測板為包被豬TTV2重組ORFl蛋白的可拆96孔酶標板，酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記山羊抗豬IgG多克隆抗體，陽性對照為豬TTV2標準陽性血清，陰性對照為豬標準陰性血清，包被豬TTV2重組ORFl蛋白序列如下: I DLTEPWLEGWGNAFYSVLGYEAIKDQGHWSNWAQIKYYWIYDTGVGNAVY 5I VVMLKKDIDDNPGRMATEFKTTPGQHPNAIDHIELINEGWPYWLYFFGKS 101 EQDIKKEAHSEEIAREYATNPKSKKLKIGIVGWASSNFTTPGSSQNVGGN 151 TAAIQGGYVAWAGGQGKLNLGAGSIGNLYQQGWPSNQNWPNTNRDETNFD 20I WGLRSLCMLRDNMQLGSQELDDECTMLSLFGPFVEKANPIFATTDPKYFK 251 PELKDYNUMKYAFKFQWGGHGTERFKTTI ⑶ PSTIPCPFEP ⑶ RFHSGI 30I QDPSKVQNTVLNPWDYDCDGIVRKDTLKRLLELPTETEEEKAYPLLGQKT 351 EKEPLSDSDEESVISSTSSGSSQEEETQRRKHHKPSKRRLLKHLQRVVKR 401 MKT。
2.根據權利要求1所述的一種豬TTV2抗體間接ELISA診斷試劑盒，其特徵在於:所述的豬TTV2重組ORFl蛋白是由原核表達質粒pcoldl-ORFl表達的，原核表達質粒pcoldl-ORFl是由以下方法構建而成的: 設計一對含有酶切位點的引物:SFORF1: CCGCTTG^GACTTAACGGAACCGTGGCTAGAAG Xho ISRORFl: CCCA4化T7TGTTTTCATCCTCTTTACCACCCGCTGGA Hindi 11利用上述特異性引物，從TTV2陽性病料中擴增ORFl基因片段，得到1227bp的擴增片段，再利用各自引物上的限制性內切酶，分別對PCR擴增產物和pcoldl原核表達載體進行酶切，用T4 DNA連接酶將擴增片段的酶切產物連接到pcoldl酶切產物上，構建pcoldl-ORFl載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態中，經酶切鑑定和測序鑑定，表明重組原核表達載體質粒pcoldl-ORFl構建成功。
3.根據權利要求1或2所述的ELISA試劑盒，其用於檢測豬血清中豬TTV2的抗體水平的方法為: (1)包被:將權利要求1或2所述的一種豬TTV2重組ORFl蛋白純化後用抗原包被液稀釋為1.65 μ g/mL的終濃度，每個ELISA孔加入100 μ 1，4°C條件下包被過夜；棄去板中的包被液體，PBST緩衝液洗滌5minX3次，抗原包被液為0.05M，pH9.6的碳酸鹽緩衝液；PBST緩衝液為含質量比0.01%Tween-20的PBS緩衝液； (2)封閉:每孔加封閉液200μ 1，37°C條件下作用lh，PBST緩衝液洗滌5minX3次；封閉液為含質量比2%脫脂奶粉的PBS緩衝液； (3)加待檢血清:每孔加入100μ I用含有質量比0.5%BSA的PBS稀釋後的血清，37°C條件下作用1.0h, PBST緩衝液洗滌5minX3次； (4)加二抗:每孔加入100μ I稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG, 37°C條件下作用30 min,PBST緩衝液洗滌5minX 3次；稀釋的HRP標 記的羊抗豬IgG為用pH7.0的PBS按1:5000比例稀釋；(5)加顯色液:每孔加含lmg/mlTMB四甲基聯苯二胺的顯色液100 μ 1，37°C避光作用.5 min ； (6)加終止液:每孔加入100μ I終止液，酶標儀測定450 nm吸光值0D450 ;終止液為.2M H2SO4 ； (7)結果判定:待檢血清0D450值>0.248時判定為豬TTV2抗體陽性，0D450值Z 0.248判定 為陰性 。
全文摘要
本發明涉及一種用於檢測豬輸血傳播病毒2型(TTV2)抗體的間接ELISA試劑盒，屬於生物技術領域。包括抗原重組蛋白的製備、間接ELISA的建立、判定標準及臨床血清學檢測的應用。所述的抗原重組蛋白是利用pcoldI原核表達載體，構建表達豬TTV2ORF1截短蛋白的基因工程菌pcoldI-ORF1，並將表達的重組蛋白純化作為抗原建立了間接ELISA檢測方法。該方法用於檢測豬血清中TTV2的抗體水平具有重複性好、特異性高的特點，可用於豬TTV2的血清學調查，為該病的防治和流行情況的掌握提供一種快速、簡便的血清學檢測方法。目前該方法是國內首次利用豬TTV2ORF1重組蛋白建立檢測豬群中TTV2抗體的ELISA檢測方法。
文檔編號G01N33/569GK103235121SQ20131008750
公開日2013年8月7日 申請日期2013年3月18日 優先權日2013年3月18日
發明者何孔旺, 王小敏, 張文文, 倪豔秀, 溫立斌, 俞正玉, 張雪寒, 郭容利, 呂立新, 李彬, 周俊明, 茅愛華, 葉青, 汪偉, 周萍, 沈江萍 申請人:江蘇省農業科學院