一株耐冷凍麵包酵母菌株及其基因無痕敲除方法

2023-11-06 19:32:47

專利名稱：一株耐冷凍麵包酵母菌株及其基因無痕敲除方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體是涉及一株耐冷凍麵包酵母菌株及其基因無痕敲除方法。
背景技術：
麵包酵母(Baker’sYeast,學名 Saccharomyces cerevisiae)是一種重要的工業微生物，含有豐富的營養成分，是饅頭、麵包、餅乾等麵食生產過程中最重要的微生物發酵齊U、生物疏鬆劑和生物營養劑。隨著冷凍麵團生產技術的迅速發展，耐冷凍麵包酵母及其耐冷凍機製得到了廣泛研究，在歐美、日本等發達國家，冷凍麵團技術也已廣泛應用於焙烤工業。普通麵包酵母的耐冷凍性差是限制冷凍麵團技術發展的主要因素。海藻糖是酵母細胞內一種自身保護劑，可以保護細胞在冷凍過程免受凍傷。增加酵母胞內海藻糖含量可以提高麵包酵母的耐冷凍性能。但是隨著公眾對食品安全的關注，通過傳統遺傳學方法構建的菌株，由於殘留非自身的外源基因，其生產應用受到限制。因此有必要對酵母進行無痕基因敲除，以保證不會留下任何外源DNA。酵母菌的無痕修飾起初是為了除去篩選標記，以便在單個菌株中進行多基因操作。去除篩選標記主要有兩種方法，一種是在靶基因敲除後，利用敲除元件中正向重複序列(hisG)之間的同源重組。另一種則是利用重組酶介導的敲除系統,例如Cre/Loxp系統等。利用第一種方法，首先需要構建帶有「hisG-URA3-hisG」的質粒，然後使用長引物直接PCR得到敲除元件，通過轉化敲除目的基因後，再反向篩選，利用正向重複序列(hisG)之間的同源重組去除篩選標記。此法中長引物包含兩部分序列，一部分是與質粒退火的序列，另一部分是與靶基因兩側的側翼序列相同的基因序列。通過這種方法得到的轉化子，其基因組的靶位置上，會殘留一個重複序列。利用第二種方法，通過轉化篩選標記兩側帶有重組酶位點的敲除元件到酵母中，一步整合實現目的基因的敲除，然後轉化另一個編碼重組酶的質粒，以實現抗性標記的去除。在工業酵母的改造中，這個系統具有很高的效率，但是其仍會留下外源序列(單一 1xp位點)，並且在進行多基因敲除時，留下的這些位點增大了發生染色體重排的可能性。2006年，日本學者使用帶有靶基因一側40bp重複序列的長引物，通過融合PCR構建的無痕敲除元件，可以方便的實現重組，並且不會留下外源基因。但是這種方法中，40bp的重複序列重組效率較低。總之，本領域仍需要一種高效的無痕基因敲除方法。

發明內容
本發明解決的技術問題是提供了一株耐冷凍麵包酵母菌株及其基因無痕敲除方法。為解決上述技術問題，本發明採用如下技 術方案:本發明提供的麵包酵母菌株是具有快速發酵性能的耐冷凍麵包酵母菌株，具體為麵包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY_14aΔU。該菌已於2013年3月28保藏於中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06110:，地址為:中國北京市朝陽區大屯路甲3號)，保藏編號為CGMCC N0.7379。所述麵包酵母菌株在其他發酵性能不受影響的情況下，發酵後胞內海藻糖含量佔細胞乾重11.7%，較親本菌株提高了 134%，細胞在液體麵團中冷凍21天後，存活率達到78%，是親本菌株的2.6倍。所述麵包酵母菌株具體可以通過對出發菌株麵包酵母(Saccharomycescerevisiae) CICC31616 (中國工業微生物菌種保藏管理中心,公眾可以通過該保藏管理中心獲得出發菌株CICC31616)的中性海藻糖酶編碼基因NTHl的全部序列進行無痕敲除來實現。上述基因無痕敲除可以用以下方法實現。各步驟所涉及具體操作方法參考現有文獻報導，如Joseph Sambrook等，《分子克隆實驗指南》第二版,科學出版社，1995。用PCR方法獲得突變ura3片段，將其通過醋酸鋰化學轉化法導入到麵包酵母出發菌株，通過同源重組以實現出發菌株的URA3基因突變。用PCR方法分別擴增敲除靶基因NTHl的上遊和下遊、長度為0.5 2.0kb的同源序列片段，然後通過融合PCR，將上、下遊序列融合成無縫片段。將該片段克隆至酵母整合質粒YIplac211上，獲得能夠進行整合敲除的質粒。在整合敲除質粒的上遊同源臂或者下遊同源臂中，選擇合適的單一酶切位點，將質粒酶切線性化。通過醋酸鋰化學轉化法，將線性化的整合敲除質粒導入麵包酵母中，用不含尿嘧啶(uracil)的酵母合成培養基篩選發生第一步整合重組的酵母突變株。將經過鑑定的發生第一步整合重組的酵母突變株，經含有5-氟乳清酸(5-F0A)合成培養基平板反向篩選獲得發生第二步整合重組的酵母突變株。用PCR方法獲得出發菌株正常的URA3基因片段，將其導入到發生了第二步整合重組的酵母突變株中，以回復突變的ura3標記基因。本發明所述麵包酵母菌株可應用於麵包生產中。本發明同時提供了一種專門用於鑑定所述耐冷凍麵包酵母菌株的基因序列，該基因序列是用NTHl-D-F和NTHl-U-R引物對以所述耐冷凍麵包酵母菌株基因組為模板擴增的片段，其序列如表I所示。有益效果:本發明針對麵包酵母傳統基因敲除中篩選標記殘留，不便進行多基因敲除研究，以及殘留外源基因的問題，提供了一株麵包酵母菌株及一種高效的無痕基因敲除方法。本發明不僅可用於研究酵母基因的功能和代謝機制，而且由於所獲得的突變株不殘留任何外源基因，可以安全的用於工業生產。


圖1為帶有突變ura3基因麵包酵母菌株BY-HaA U的表型驗證圖。圖2為整合敲除質粒YIplac211_UD的構建流程示意圖。圖3為整合敲除質粒YIplac211_UD的電泳驗證圖。圖4為整合敲除質粒YIplac211_UD與酵母基因組的兩步整合重組流程示意圖。圖5為發生第一步整合重組的菌株BY-14aA U-U的電泳驗證圖。圖6為發生第二步整合重組的菌株BY-HaAU-Λ N的電泳驗證圖。

圖7為回復ura3突變的整合重組菌株BY_14a Λ N靶基因位置的部分測序圖。
具體實施例方式下面通過具體的實施方案敘述本發明。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的範圍，本發明的實質和範圍僅由權利要求書所限定。對於本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和範圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬於本發明的保護範圍。實施例1:無痕敲除中性海藻糖酶基因NTHl麵包酵母的構建本實例所用的出發菌株CICC31616，本實例中改造後的麵包酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)於2013年3月28日保藏於中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.7379。所述質粒Hplac211的來源見R.D.Gietz,and A.Sugino，New yeast-Escherichia coli shuttle vectors constructed with invitro mutagenized yeast genes lacking six-base pair restriction sites.Gene74(1988)527-34。所述大腸桿菌DH5a購自Takara公司。所述YI3D培養基為通用的完全培養基，所述酵母合成培養基(SD)成分為2%葡萄糖、0.67% ΥΝΒ、不含尿嘧啶的胺基酸混合物溶液，固體培養基含2%進口瓊脂粉。根據Genebank中的酵母基因組數據和整合質粒序列，設計了下述實施例中各引物。表1.本實施例中所用到的引物
權利要求
1.一株耐冷凍麵包酵母菌株，具體為麵包酵母(Saccharomyces cerevisiae)BY-14AAU，保藏編號為 CGMCC N0.7379。
2.如權利要求1所述的一株耐冷凍麵包酵母菌株，其特徵在於，所述麵包酵母菌株發酵後胞內海藻糖含量佔細胞乾重11.7% ;細胞在液體麵團中冷凍21天後，存活率達到78%，是親本菌株的2.6倍。
3.如權利要求1所述的一株耐冷凍麵包酵母菌株的構建方法，其特徵在於，所述構建方法是通過融合PCR技術和整合型載體質粒YIplac211介導的兩步基因整合法，將編碼中性海藻糖酶的基因NTHl無痕敲除來實現的。
4.如權利要求3所述的一株耐冷凍麵包酵母菌株的構建方法，其特徵在於，具體步驟包括:用PCR方法獲得突變ura3片段，將其通過醋酸鋰化學轉化法導入到麵包酵母出發菌株，通過同源重組實現出發菌株的URA3基因突變；用PCR方法分別擴增敲除靶基因NTHl上遊和下遊、長度為0.5 2.0kb的同源序列片段，然後通過融合PCR，將上、下遊序列融合成無縫片段；將該片段克隆至酵母整合質粒YIplac211上，獲得能夠進行整合敲除的質粒；在整合敲除質粒的上遊同源臂或者下遊同源臂中，選擇合適的單一酶切位點，將質粒酶切線性化；通過醋酸鋰化學轉化法，將線性化的整合敲除質粒導入麵包酵母中，用不含尿嘧啶的酵母合成培養基篩選發生第一步整合重組的酵母突變株；將經過鑑定的發生第一步整合重組的酵母突變株，經含有5-氟乳清酸合成培養基平板反向篩選獲得發生第二步整合重組的酵母突變株；用PCR方法獲得出發菌株正常的URA3基因片段，將其導入到發生了二步整合重組的酵母突變株中，以回復突變的ura3標記基因。
5.如權利要求1或2所述的一株耐冷凍麵包酵母菌株在麵包生產中的應用。
全文摘要
本發明公布了一株耐冷凍麵包酵母菌株及其構建方法，具體是通過無痕敲除基因NTH1構建的耐冷凍麵包酵母BY-14AΔU，保藏編號CGMCC No.7379。無痕基因敲除方法構建耐冷凍麵包酵母，是通過融合PCR和酵母整合質粒YIplac211，敲除編碼中性海藻糖酶基因NTH1來實現的。本發明實現了將麵包酵母NTH1基因快速、高效地無痕敲除，菌株BY-14AΔU在其他發酵性能不受影響的情況下，胞內海藻糖含量較親本菌株提高了134％；細胞在液體麵團中冷凍21天後，存活率達到78％，是親本菌株的2.6倍。本發明構建的酵母菌中基因組上不殘留任何外源基因，因此可以安全的用於工業生產。
文檔編號C12N1/18GK103232947SQ201310127538
公開日2013年8月7日 申請日期2013年4月12日 優先權日2013年4月12日
發明者肖冬光, 王光路, 董建, 張翠英 申請人:天津科技大學