一種剛果紅法測定穀物β-葡聚糖含量的方法

2023-11-06 06:53:17

一種剛果紅法測定穀物β-葡聚糖含量的方法
【專利摘要】本發明涉及一種剛果紅比色法測定穀物β-葡聚糖含量的方法。包括以下步驟：提取穀物中的β-葡聚糖、配製標準β-葡聚糖溶液、配製待測β-葡聚糖提取物溶液、配製剛果紅溶液、製作標準曲線、測定待測液吸光度、根據標準曲線，計算提取物中β-葡聚糖含量。本發明簡單有效，所需儀器十分普遍，只需要普通可見分光光度計即可，剛果紅試劑便宜易得，適用範圍廣。
【專利說明】一種剛果紅法測定穀物β-葡聚糖含量的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種剛果紅比色法測定穀物β -葡聚糖含量的方法。

【背景技術】
[0002] 燕麥、大麥等穀物中含有豐富的葡聚糖。葡聚糖是由吡喃型葡萄糖單元通 過β-(1-3)和β-(1-4)糖苷鍵連接而成的線型多糖，是穀物中主要的水溶性膳食纖維，具 有重要的生理功能。β-葡聚糖可促進脂肪代謝，降低血清中膽固醇水平，調節葡萄糖代 謝，對糖尿病有明顯的抑制和預防作用。另外，β_葡聚糖在結腸發酵可以產生較高比例 的短鏈脂肪酸，能促進結腸黏膜上皮細胞的增殖，促進益生菌增殖，預防結腸癌。
[0003] 目前，穀物中β-葡聚糖含量的測定方法包括酶法和calcofluor-流動注射法。使 用酶法進行測定時，如果酶的純度不高往往會導致測定結果產生較大誤差，而高純度的專 一性β-葡聚糖水解酶價格極其昂貴，在很大程度上限制了該方法的使用。calcofluor-流 動注射法具有高效、準確等優點，但需要專用的流動注射儀和螢光檢測器，購置儀器成本較 高。本文提出的剛果紅比色法，使用常規的分光光度計就可以簡單有效、快速準確的測定溶 液中的穀物β-葡聚糖含量。
[0004] 剛果紅是一種雙偶氮染料，分子式為C32H22N 6O5S2Na3，在水溶液中的最大吸收波長 在497 nm附近。水溶液中的剛果紅可與穀物β-葡聚糖形成複合物，複合物的最大吸收波 長與剛果紅相比發生紅移。複合物與剛果紅的吸收光譜在550 nm處有最大的吸光度差值， 且吸光度差值與β_葡聚糖濃度在一定範圍內呈線性關係，基於這一原理可建立剛果紅比 色法定量測定穀物中β_葡聚糖的含量。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種簡單有效的利用剛果紅比色法測定穀物β -葡聚糖含 量的方法。
[0006] 為實現上述目的，本發明採取以下技術方案： 一種剛果紅法測定穀物β_葡聚糖含量的方法，主要包括以下步驟： (1) 提取穀物中的葡聚糖，獲得葡聚糖提取物； (2) 配製標準β-葡聚糖溶液； (3) 配製待測β -葡聚糖提取物溶液； (4) 配製剛果紅溶液； (5) 製作標準曲線； (6) 測定待測液吸光度； (7) 根據標準曲線，計算提取物中β_葡聚糖含量。
[0007] 更具體地，所述方法的具體步驟如下： (1) 提取穀物中β-葡聚糖，獲得待測β-葡聚糖提取物； (2) 取標準β-葡聚糖，加去離子水於60-100 ° C水浴溶解1-3 h，然後定容，使之濃 度為0. I mg/mL，得標準β -葡聚糖溶液； (3) 待測β -葡聚糖提取物溶液的配製方法同標準β -葡聚糖溶液的配製； (4) 取剛果紅，用0.05-0. 2 mol/L、pH 6-8的磷酸鹽或碳酸鹽緩衝液溶解並定容，得 15-120 Pg/mL的剛果紅溶液； (5) 準確移取標準β-葡聚糖溶液0-1.2 mL置於不同的試管中，分別向每支試管中加 入剛果紅溶液，使β-葡聚糖最終濃度範圍為0-20 Pg/mL，剛果紅最終濃度為10-80 Pg/ mL，立即振蕩10-60 s，靜置20-60 min後於550 nm處測定吸光度，測定時以相同濃度的剛 果紅溶液為空白，每次測試至少做3次平行實驗，然後以標準β -葡聚糖濃度為橫坐標，吸 光度為縱坐標，繪製β_葡聚糖標準曲線，得到回歸方程； (6) 移取待測β-葡聚糖提取物溶液，加入剛果紅溶液立即振蕩10-60 s，靜置20-60 min後於550 nm處測定吸光度，測定時以相同濃度的剛果紅溶液為空白； (7) 通過標準曲線及回歸方程，計算得到待測β-葡聚糖提取物中β-葡聚糖含量。
[0008] 更優選地，步驟（6)中靜置20-30分鐘後於550 nm處測定吸光度。
[0009] 本發明具有以下優點： 1. 剛果紅試劑便宜易得； 2. 所需儀器十分普遍，只需要普通可見分光光度計即可； 3. 比色法操作簡單快速； 4. 適用範圍廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1是剛果紅法測定β -葡聚糖含量的標準曲線圖。

【具體實施方式】
[0011] 本發明的具體實施步驟如下： 步驟1 :可採用酶法、鹼法、酸法提取穀物β -葡聚糖，得β -葡聚糖提取物； 步驟2:準確稱取適量標準β-葡聚糖，加少量去離子水，60-100 ° C水浴攪拌溶解， 冷卻後定容，即得一定濃度的β -葡聚糖標準溶液，建議濃度為〇. I mg/mL ; 步驟3 :待測β-葡聚糖提取物溶液的配製方法同步驟2 ; 步驟4 :準確稱取適量剛果紅試劑，溶解於pH 6-8的磷酸鹽或碳酸鹽緩衝液中，緩衝液 離子強度為〇. 05-0. 2 mol/L，製得15-120 Pg/mL的剛果紅溶液； 步驟5:準確移取標準β-葡聚糖溶液0-1.2 mL置於不同的試管中，分別向每隻試管 中加入相同濃度的剛果紅溶液，使β -葡聚糖最終濃度範圍為0-20 Pg/mL，剛果紅最終濃 度為10-80 Pg/mL，立即振蕩10-60 s，靜置20-60 min後，以相同濃度的剛果紅溶液為空 白於550 nm處測定吸光度。每個測試至少做3次平行實驗； 步驟6 :準確移取適量待測穀物β-葡聚糖溶液，加入與步驟5中相同濃度的剛果紅溶 液，立即振蕩10-60 s，靜置20-60 min後，以相同濃度的剛果紅溶液為空白於550 nm處測 定吸光度，至少進行3次平行測試； 步驟7 :以標準β -葡聚糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪製β -葡聚糖標準曲線， 得到回歸方程。從而可根據待測液吸光度計算得到待測液中β-葡聚糖含量。並可進一步 計算出提取物中β-葡聚糖的含量。
[0012] 為了充分公開本發明的剛果紅測定穀物β -葡聚糖含量的方法，以下結合實施例 加以說明。
[0013] 實例1 :測定燕麥提取物中β -葡聚糖的含量。
[0014] (1)酶法提取燕麥β-葡聚糖：研磨燕麥粒，過50目篩得燕麥麩皮。稱取50 g燕 麥麩皮，以固液比1:5加入82%乙醇，85 ° C回流2 h，離心保留沉澱，以適量無水乙醇洗滌 後離心，置於40 ° C烘箱中脫溶劑12 h。殘渣以固液比1:10加蒸餾水，52 ° C水浴提取 兩次，所得提取液真空濃縮後加入無水氯化鈣和耐高溫α-澱粉酶85 ° C反應30 min。冷 卻後調pH至8.0,加入胰蛋白酶38 ° C反應4 h。離心後調pH至7.0,加無水乙醇後離心 取沉澱，於80 ° C溶解。冷卻後置於-18 ° C預凍，然後冷凍乾燥得燕麥β-葡聚糖提取 物； (2) 配製標準β -葡聚糖溶液：準確稱取0. 0100 g標準β -葡聚糖，加少量去離子水， 80 ° C水浴溶解，冷卻後定容至100 mL，搖勻，即得0. I mg/mL的β -葡聚糖標準溶液； (3) 配製待測提取物：準確稱取0.0100 g待測燕麥β-葡聚糖提取物，加少量去離子 水，80 ° C溶解，冷卻後定容至100 mL，搖勻，得待測β-葡聚糖溶液； (4) 配製剛果紅溶液：準確稱取0. 0375 g剛果紅試劑，溶解於0. I mol/L、pH 7. 5的磷 酸鹽緩衝液中並定容至500 mL，搖勻，即得75 Pg/mL的剛果紅溶液； (5) 製作標準曲線：準確移取0. I mg/mL的β -葡聚糖溶液0、0. 12、0. 24、0. 36、0. 48、 0. 6、0. 72 mL，用去離子水補足至2 mL，加入75 Pg/mL的剛果紅溶液4 mL，立即振蕩10 s， 靜置30 min後於550 nm處測定吸光度，測定時以2 mL去離子水加入4 mL相同濃度的剛 果紅溶液為空白。每次測試均做3次平行實驗。然後以標準β-葡聚糖濃度為橫坐標，吸 光度為縱坐標，繪製β_葡聚糖標準曲線，得到回歸方程，如圖1所示； (6) 測定待測燕麥提取物中β-葡聚糖的含量：準確移取適量待測β-葡聚糖溶液，用 去離子水補足至2 mL，加入75 Pg/mL的剛果紅溶液4 mL，立即振蕩10 s，靜置30 min後 於550 nm處測定吸光度，測定時以2 mL去離子水加4 mL相同濃度剛果紅為空白。經計算 得到燕麥提取物中β -葡聚糖的含量為92. 39%。
[0015] 實例2 :測定大麥提取物中β -葡聚糖的含量。
[0016] (1)酶法提取大麥β-葡聚糖：研磨大麥粒成合適粒度的大麥粉,稱取50 g大麥 粉，其餘操作同實例1中燕麥的提取流程，冷凍乾燥後得大麥葡聚糖提取物。
[0017] (2)餘下測定步驟同實例1，測定大麥β-葡聚糖提取物與剛果紅混合液在550 nm 處的吸光度，注意扣除空白剛果紅溶液的吸光度，計算得大麥提取物中β_葡聚糖的含量 為 83. 09%。
[0018] 實例3 :緩衝液對吸光度的影響。
[0019] 本發明所用的緩衝液對吸光度影響比較大，吸光度太小所得實驗結果不夠準確， 吸光度在〇. 2-0. 8之間是比較理想的狀態。當緩衝液pH小於6. 0時，剛果紅溶液易形成聚 集體並生成肉眼可見的小顆粒，從而影響測定結果。因此需要控制緩衝液的離子強度和PH 值在合適的範圍內。下表列出了不同pH和離子強度的磷酸鹽緩衝液對吸光度的影響。剛 果紅最終濃度為50 Pg/mL，標準β-葡聚糖的最終濃度為8 Pg/mL。所得吸光度均是剛果 紅-葡聚糖複合物與純剛果紅之間的吸光度之差。
[0020] 由表1可知，在緩衝液pH6-8範圍內，吸光度有一定的變化，且以pH7. 5的緩衝液 中吸光度最大。在實際的測定中建議選擇稍微偏鹼性的緩衝液，這對於溶解β-葡聚糖和 剛果紅都較為有利。
[0021] 表1緩衝液對吸光度的影響

【權利要求】
1. 一種剛果紅法測定穀物葡聚糖含量的方法，其特徵在於：所述方法的步驟如 下： (1) 提取穀物中葡聚糖，獲得待測葡聚糖提取物； (2) 取標準葡聚糖，加去離子水於60-100 ° C水浴溶解1-3 h，然後定容，使之濃 度為0. I mg/mL，得標準P -葡聚糖溶液； (3) 待測3 -葡聚糖提取物溶液的配製方法同標準3 -葡聚糖溶液的配製； (4) 取剛果紅，用0. 05-0. 2 mol/L、pH 6-8的磷酸鹽或碳酸鹽緩衝液溶解並定容，得 15-120 吒/mL的剛果紅溶液； (5) 準確移取標準葡聚糖溶液0-1.2 mL置於不同的試管中，分別向每支試管中加 入剛果紅溶液，使葡聚糖最終濃度範圍為0-20 呢/mL，剛果紅最終濃度為10-80呢/ mL，立即振蕩10-60 s，靜置20-60 min後於550 nm處測定吸光度，測定時以相同濃度的剛 果紅溶液為空白，每次測試至少做3次平行實驗，然後以標準P -葡聚糖濃度為橫坐標，吸 光度為縱坐標，繪製葡聚糖標準曲線，得到回歸方程； (6) 移取待測葡聚糖提取物溶液，加入剛果紅溶液立即振蕩10-60 s，靜置20-60 min後於550 nm處測定吸光度，測定時以相同濃度的剛果紅溶液為空白； (7) 通過標準曲線及回歸方程，計算得到待測葡聚糖提取物中葡聚糖含量。
2. 根據權利要求1所述的剛果紅法測定穀物3 _葡聚糖含量的方法，其特徵在於：步 驟（6)中靜置20-30分鐘後於550 nm處測定吸光度。
【文檔編號】G01N1/28GK104316481SQ201410647032
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年11月12日 優先權日:2014年11月12日
【發明者】吳佳, 吳小燕, 李琳琳, 張如, 戴巧玲, 趙蘭, 李健 申請人:福州大學