根癌農桿菌介導的黑孢塊菌遺傳轉化方法

2023-11-06 06:24:12

根癌農桿菌介導的黑孢塊菌遺傳轉化方法
【專利摘要】本發明公開了一種根癌農桿菌介導的黑孢塊菌遺傳轉化方法，屬於黑孢塊菌的遺傳轉化領域。本發明根癌農桿菌介導的黑孢塊菌遺傳轉化方法，包括以下步驟：(1)製備黑孢塊菌孢子懸浮液；(2)將攜帶有目的基因的雙元載體質粒轉化根癌農桿菌，獲得根癌農桿菌陽性轉化子，製備菌液；(3)將步驟(2)製備的菌液與步驟(1)製備的黑孢塊菌孢子懸浮液混合，共培養；(4)選擇性培養，篩選黑孢塊菌轉化子，鑑定，即得。本發明方法以黑孢塊菌的孢子為受體，以根癌農桿菌為介體，具有簡單方便，轉化效率高且穩定，轉化子為單拷貝的頻率高等優點，適用於黑孢塊菌功能基因組學及生物學研究等。
【專利說明】根癌農桿菌介導的黑孢塊菌遺傳轉化方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及黑孢塊菌的轉化方法，尤其涉及根癌農桿菌介導的黑孢塊菌遺傳轉化 方法，屬於黑孢塊菌的遺傳轉化領域。

【背景技術】
[0002] 黑孢塊菌（Tuber melanosporum)是一種原產自法國，與橡樹、櫟樹等樹種根系共 生的外生菌根型食用真菌，以其與生俱來的獨特香味和"鑽石"身價而備受關注。黑孢塊菌 基因組測序的完成推動了研宄人員從分子水平對黑孢塊菌生物學的認識，但是由於黑孢塊 菌尚未建立成熟的遺傳作業系統，極大限制了黑孢塊菌功能基因組學研宄。
[0003] 近年來發展起來的根癌農桿菌介導的絲狀真菌轉化方法具有以下三個優點： 第一，農桿菌可以轉化完整的細胞如孢子、菌絲體，甚至是大型真菌的子實體，這就免 去了製備原生質體的麻煩，從而不需要考慮影響原生質體轉化率的諸多因素（Vianey Olmedo-Monfil，Carlos Cortes-Penagos，Alfredo Herrera-Estrella. Three decades of fungal transformation:key concepts and applications. Methods in Molecular Bi〇 1 ogy，2004, 267:297-313.);第二，農桿菌轉化的轉化效率很高；研宄表明，農桿菌介 導絲狀真菌的轉化效率一般在300-720個轉化子每10 7個細胞，比其他真菌轉化方法 高 100-1000 倍（Marcel-J.A.de Groot，Paul Bundock，Paul_J.J Hooykaas，Alice_G. M. Beijersbergen. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of filamentous fungi. Nature Biotechnology, 1998, 16:839-842.);第三，T-DNA 插入產 生的突變體大部分為單拷貝插入，當採用具有單核的分生孢子為轉化受體時可以得到後 代不分離的轉化子，避免了真菌菌絲多核所造成的轉化子不穩定的難題（ED Mullins，X Chen, P Romaine, R Raina, DM Geiser, S Kang. Agrobacterium-Mediated Transformation of Fusarium oxysporum:An Efficient Tool for Insertional Mutagenesis and Gene Transfer. Phytopathology, 2001，91:173-180.)。根癌農桿菌介導的絲狀真菌遺傳轉化系 統存在的缺點是轉化需要大量的孢子或者子實體作為轉化受體，並不適用於人工培養條件 下產抱少或者不產抱真菌（Olmedo-Monfil et al, 2004)。
[0004] 黑孢塊菌在發酵條件和真菌常規培養基PDA培養基上產孢很少或者不產孢，同時 黑孢塊菌目前尚未有成功製備原生質體的報導，缺少一套適合黑孢塊菌的遺傳轉化系統是 限制黑孢塊菌分子生物學研宄的瓶頸。
[0005] 因此，亟待構建一種簡單、高效的黑孢塊菌遺傳轉化系統，對於推動黑孢塊菌功能 基因組學研宄，促進黑孢塊菌資源的開發和利用具有重要意義。


【發明內容】

[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一種根癌農桿菌介導的黑孢塊菌（Tuber melanosporum)遺傳轉化方法，該方法簡單方便、轉化效率高且穩定。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明所採取的技術方案是：
[0008] 本發明公開了一種根癌農桿菌介導的黑孢塊菌（Tuber melanosporum)遺傳轉化 方法，包括以下步驟：
[0009] (1)製備黑孢塊菌孢子懸浮液；（2)將攜帶有目的基因的雙元載體質粒轉化根癌 農桿菌，獲得根癌農桿菌陽性轉化子，製備菌液；（3)將步驟（2)製備的菌液與步驟（1)制 備的黑孢塊菌孢子懸浮液混合，共培養；(4)選擇性培養，篩選黑孢塊菌轉化子，鑑定，即 得。
[0010] 其中，步驟（1)所述黑孢塊菌孢子懸浮液中孢子濃度為104-108個/mL，優選為10 6 個/mL ;所述製備黑孢塊菌孢子懸浮液，包括：(a)將黑孢塊菌菌絲體接種於PDA培養基，於 28°C培養活化；優選的，活化3d ; (b)將活化後的黑孢塊菌菌絲體接種於VBC培養基，28°C 培養4-9d，優選為7d ;用無菌水洗滌菌絲體，收集黑孢塊菌的孢子，稀釋，即得。
[0011] 步驟（2)將攜帶有目的基因的雙元載體質粒轉化根癌農桿菌的方法為本領域技 術人員所熟知，例如化學轉化法。
[0012] 步驟（2)所述製備菌液包括：(a)挑取根癌農桿菌陽性轉化子，接種到含抗生素的 LB培養基中，28°C 200rpm震蕩培養12-20h，優選為18h，離心，收集菌體；(b)用頂培養基 重懸菌體，離心，收集菌體；（c)用頂培養基重懸菌體，將菌體濃度0D_調至0. 1?0. 6,優 選為0. 15?0. 3,28°C 200rpm振蕩培養3-8h，優選為6h，即得。
[0013] 其中，所述IM培養基中含有乙醯丁香酮，優選的，所述乙醯丁香酮的濃度為 200mmol/L〇
[0014] 本發明根癌農桿菌介導的黑孢塊菌遺傳轉化方法中，步驟（3)將步驟（2)製備的 菌液與步驟（1)製備的黑孢塊菌孢子懸浮液等體積混合；所述共培養的培養基為鋪有硝酸 纖維素薄膜的CM培養基；共培養條件為28°C避光培養24-60h，優選為48h。
[0015] 其中，所述CM培養基為添加2 % (w/v)瓊脂糖的頂培養基，含有終濃度為 200mmol/L的乙醯丁香酮。
[0016] 步驟（4)所述選擇性培養是將步驟（3)共培養後的硝酸纖維素薄膜揭下，正向鋪 到含抗生素的PDA培養基，28°C培養至出現可見的單菌落。進一步將單菌落挑取至新的選 擇性培養基上，分離有抗生素抗性的黑孢塊菌菌株。
[0017] 本發明所述抗生素選自頭孢黴素、潮黴素或卡那黴素。
[0018] 本發明根癌農桿菌介導的黑孢塊菌遺傳轉化方法，利用VBC培養基促進黑孢塊菌 大量產孢，隨後將含有雙元載體的根癌農桿菌與黑孢塊菌孢子混合後共培養，通過抗性篩 選，獲得轉化子。該方法的轉化效率可達1-6X10 5個孢子，轉化效率高且穩定，克服了黑孢 塊菌多細胞菌絲體難以快速製備大量單細胞原生質體等原因導致的黑孢塊菌遺傳轉化困 難的問題。
[0019] 本發明成功的將PCAMBIA1302-1質粒轉化了黑孢塊菌，篩選到一系列整合潮黴素 抗性基因的突變體。PCR鑑定結果表明，所有供試轉化子均能擴增出預期大小的片段，說明 黑孢塊菌轉化子含有插入的T-DNA片段。進一步將PCR擴增產物進行序列測定，Blast分 析表明，擴增片段與潮黴素磷酸轉移酶基因的一致性達到100%，進一步說明T-DNA已經成 功的轉入黑孢塊菌基因組，且可以穩定的遺傳。本發明以1〇 6孢子為出發材料，通過根癌農 桿菌介導分別篩選到28、45和62個陽性轉化子，陽性轉化效率達到4. 53± 1. 75個/105個 孢子。
[0020] 本發明還成功的將外源綠色螢光蛋白編碼基因引入黑孢塊菌，經表達以後，受體 細胞在激發光下表現出特異的綠色，可以用於發酵過程中細胞活性檢測、形態分析，同時也 是研宄黑孢塊菌與寄主植物相互作用關係的重要工具。該實驗結果從細胞水平進一步證實 本發明構建的黑孢塊菌遺傳轉化系統的有效性，同時也為黑孢塊菌生物學研宄提供了一種 重要工具。
[0021] 本發明技術方案與現有技術相比，具有以下有益效果：
[0022] (1)本發明方法與基於原生質體轉化方法相比更為簡單，同時該方法適用於其它 產孢較少的絲狀真菌。
[0023] (2)本發明方法利用VBC培養基一次可以大量製備黑孢塊菌的孢子，滿足構建突 變體文庫等遺傳操作的需要。
[0024] (3)本發明以黑孢塊菌的孢子為受體，以根癌農桿菌為介體，具有轉化效率高、轉 化子為單拷貝的頻率高等優點，適用於黑孢塊菌T-DNA隨機插入突變體文庫的構建、功能 基因的沉默或敲除等。這是國內外首次報導黑孢塊菌的遺傳轉化系統。
[0025] 本發明所涉及到的術語宙義
[0026] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術及科學術語都具有與本發明所屬領域的 普通技術人員通常所了解相同的含義。
[0027] 術語"遺傳轉化"意指通過某種途徑或技術將外源基因導入受體細胞的基因組中， 並使之在受體細胞中得以表達。
[0028] 術語"轉化子"意指導入外源DNA從而獲得新的遺傳性狀的受體菌單菌落。
[0029] 術語"抗生素"意指由微生物（包括細菌、真菌、放線菌屬）或高等動植物在生活 過程中所產生的具有抗病原體或其它活性的一類次級代謝產物，能干擾其他生活細胞發育 功能的化學物質；包括0 _內醯胺類（如頭孢菌素類）、氨基糖苷類（如卡那黴素）、醯胺醇 類（如氯黴素）等幾千種。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1為黑孢塊菌在產孢培養基VBC的生長情況及孢子形態觀察；其中，A :黑孢塊 菌在產孢培養基VBC的生長情況；B :孢子形態觀察；
[0031] 圖2為質粒pCAMBIA1302-l的圖譜；
[0032] 圖3為部分黑孢塊菌轉化子菌落形態；其中，A :未轉化的黑孢塊菌菌株；B :部分 黑孢塊菌轉化子菌落；
[0033] 圖4為隨機挑選的黑孢塊菌轉化子潮黴素磷酸轉移酶基因（hph)的PCR擴增的電 泳圖譜；其中，1-10 :黑孢塊菌轉化子；positive control :以PCAMBIA1302質粒作為模板的 PCR擴增結果；Negative control (wild type):以野生型黑孢塊菌基因組作為模板擴增結 果；Negative control (without template) :PCR 反應體系中不添加模板；
[0034] 圖5為質粒pCAMBIA1302的圖譜；
[0035] 圖6為黑孢塊菌野生菌株及轉化子螢光檢測結果；其中，A :黑孢塊菌野生菌株；B : 黑孢塊菌轉化子。

【具體實施方式】
[0036] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但是應理解所述實施例僅是範例性的，不對本發明的範圍構成任何限制。本領 域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節 和形式進行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發明的保護範圍。
[0037] 1、實驗材料
[0038] 黑孢塊菌（四川省綿陽市食用菌研宄所）；
[0039] 根癌農桿菌EHA105 (硫酸卡那黴素敏感型）（由南京農業大學武俊副教授惠贈）；
[0040] PCAMBIA1302-1質粒（本發明人實驗室構建，利用Spel與Xbal雙酶切 PCAMBIA1302後，通過粘性末端自連構建pCAMBIA1302-l質粒，lacZa和啟動子區被刪 除）；
[0041] pCAMBIA1302 質粒(The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vector for plant transformation.Plant Molecular Biology. 25(6)，989-994(1994))。
[0042] 實施例1黑孢塊菌突變體文庫的構建
[0043] 1、實驗方法
[0044] 1. 1黑孢塊菌孢子的製備
[0045] (1)將黑孢塊菌菌絲體接種於PDA培養基上，於28°C培養活化3d。PDA培養基： 200g去皮馬鈴薯，加適量蒸餾水煮製30min後加葡萄糖20g，MgS0 4 *7H20 1. 5g，KH2P043. 0g， VB150mg，瓊脂18g，補充蒸餾水定容至1000mL，pH自然，115°C，30min高溫滅菌。
[0046] (2)將活化後的黑孢塊菌菌落邊緣的菌絲體接種於VBC培養基上，28°C培養7d後， 用5mL無菌水洗滌菌絲體，收集黑孢塊菌的孢子。
[0047] VBC 培養基：磷酸二氫鉀 1. 0g，硝酸鉀 1. 0g，蔗糖 0? 5g，VB1100mg，VC 100mg，瓊脂 20g，蒸餾水定容至1000mL，pH自然，115°C，30min高溫滅菌。
[0048] (3)將一滴孢子懸浮液置於血球計數板上，利用顯微鏡對孢子進行計數，將孢子懸 浮液稀釋至1〇 6個/mL。
[0049] 1. 2根癌農桿菌的轉化及培養
[0050] 採用化學轉化法將PCAMBIA1302-1質粒（圖1)轉化根癌農桿菌。
[0051] 1. 2. 1根癌農桿菌感受態製備
[0052] 將保存的根癌農桿菌EHA105 (硫酸卡那黴素敏感型）在LB固體培養基上活化，轉 接三次後，接種到LB液體培養基中，28°C，200rpm，搖床振蕩培養至0D_= 0. 5,收集細胞， 利用預冷的〇. 1M CaCl2溶液製備根癌農桿菌感受態細胞。
[0053] LB培養基成份：蛋白腖10g，酵母粉5g，NaCl 10g，定容至1L。
[0054] 1. 2. 2pCAMBIA1302-l質粒轉化根癌農桿菌
[0055] 將10yL pCAMBIA1302-l質粒加入50yL根癌農桿菌感受態細胞中，冰浴靜置 30min，然後置於液氮中速凍3min，立即37°C水浴熱擊5min ;再置於冰上2min，加入650 y L 28°C預熱的LB液體培養基，28°C，200rpm，搖床振蕩培養5h，4000r/min離心菌液5min，重懸 於100 y L液體LB培養基中，塗布在含有50 y g/mL卡那黴素的LB固體培養基上，篩選根癌 農桿菌陽性轉化子。
[0056] 利用菌落PCR鑑定陽性轉化子，鑑定引物為：HPT-5 :GACGACACCGTCAGCGCGTC， HPT-3 :CITTGCCCTCGGACGAGTGCTGG。PCR 反應體系為 50yL，包括 lOXBuffer 5yL， dNTP (20mmol .LiMuL，引物（25pmol ? y L 〇 各 2 y L，Mg2+ (25mmol *L 菌體 DNA (約 50ng ? y I71) 1 y L，Taq DNA 聚合酶（5U ? y I71) 0? 5 y L，加 H20 至 50 y L。反應條件：94°C變 性 5min ;94°C 30sec，5(TC 30sec，72°C lmin，30 個循環；72°C延伸 10min〇
[0057] 1. 2. 3根癌農桿菌陽性轉化子的培養
[0058] 挑取活化的根癌農桿菌EHA105 (攜帶pCAMBIA1302-l質粒）單菌落接種到LB培 養基（含50yg/mL硫酸卡那黴素）中，28°C、200rpm震蕩培養18h後，5000rpm離心5min， 棄去上清，收集菌體。用IM培養基重懸菌體，5000rpm離心5min，棄去上清，收集菌體，再次 用IM培養基重懸菌體，通過頂培養基將菌體濃度0D 6(i(i調至0. 15?0. 3,28°C 200rpm搖床 振蕩培養6h。
[0059] 頂培養基成份：KH2P041. 45g，K2HP042. 05g，（NH4) 2S040. 5g，MgS04 ? 7H20 0? 5g，NaCl 0? 15g，CaCl20. 067g，FeS04 ? 7H20 0? 0025g，1M MES(pH 5. 5)40mL，20%葡萄糖（W/V) 10mL， 50%甘油（￥/￥)51^，微量元素51^，200111111〇1乙醯丁香酮仏5)11^，定容至11，1151：高壓滅菌 30min〇
[0060] 微量元素配製：稱取 ZnS04 ? 7H20、CuS04 ? 5H20、MnS04 ? 7H20、Na2Mo04 ? 7H20、H3B03 各0. Olg溶於lOOmL水中。
[0061] 200mmol乙醯丁香酮配製：稱取0. 039g溶於lmL無水乙醇中。
[0062] 20 %葡萄糖：稱取20g葡萄糖，無菌水定容至100mL。
[0063] 50%甘油：50mL甘油溶於50mL的無菌水中。
[0064] 1. 3根癌農桿菌與黑孢塊菌孢子共培養及選擇性培養
[0065] 將上述製備好的EHA105 (攜帶pCAMBIA1302-l質粒）菌液和黑孢塊菌孢子懸浮液 等體積渦旋混勻，吸取200 y r混合液均勻塗布在鋪有硝酸纖維素薄膜的CM培養基上，CM培 養基在使用前加入AS至終濃度為200mM/L。將培養皿在超淨工作檯中吹至半乾，28 °C避光 培養48h。將硝酸纖維素薄膜從共培養基上揭下，正向鋪到PDA培養基（含200 y g/mL頭孢 黴素、250 y g/mL潮黴素B)上，28 °C培養，直至在PDA培養基上出現可見的單菌落。
[0066] CM培養基為添加2 % (w/v)瓊脂糖的頂培養基。
[0067] 1. 4黑孢塊菌轉化子的篩選及鑑定
[0068] 1. 4. 1黑孢塊菌轉化子的篩選
[0069] 將PDA培養基上生長的單菌落挑取至新的選擇性培養基上，分離有潮黴素抗性的 黑孢塊菌菌株，將抗性菌株繼續在含50 y g/mL潮黴素B培養基上培養三代至生長穩定。
[0070] 1. 4. 2黑孢塊菌轉化子的鑑定
[0071] 將潮黴素抗性菌株接種到含有50 y g/mL潮黴素B、200 y g/mL頭孢黴素的PDA液 體培養基中，28°C，200rpm培養72h，13000rpm離心5min，棄上清，收集菌體，提取轉化子基 因組。基因組提取採用真菌基因組提取試劑盒（商品編號D3390-01，0MEGA生物技術公司）。
[0072] PCR鑑定採用靶向潮黴素抗性基因的特異引物（HPT-F2 :GACGACACCGTCAGTGCGTC， HPT-3 :CITTGCCCTCGGACGAGTGCTGG)。PCR 反應體系為 50 y L，包括 lOXBuffer 5 y L， dNTP (20mmol .LiMuL，引物（25pmol ? y L 丨）各 2 y L，Mg2+ (25mmol *L 菌體 DNA (約 50ng ? y I71) 1 y L，Taq DNA 聚合酶（5U ? y I71) 0? 5 y L，加 H20 至 50 y L。反應條件：94°C變 性 5min ;94°C 30sec，50°C 30sec，72°C lmin，30 個循環；72°C延伸 10min。PCR 產物按照常 規方法用1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，經凝膠成像系統成像觀察並記錄電泳結果。
[0073] 將PCR擴增產物進行序列測定，Blast分析擴增片段與潮黴素磷酸轉移酶基因的 一致性。
[0074] 2、實驗結果
[0075] 2. 1黑孢塊菌在產孢培養基VBC的生長情況及孢子形態觀察
[0076] 黑孢塊菌在產孢培養基VBC的生長情況及孢子形態觀察見圖2。
[0077] 2. 2黑孢塊菌轉化子的篩選
[0078] 部分黑孢塊菌轉化子菌落形態見圖3。
[0079] 2. 3黑孢塊菌轉化子的鑑定
[0080] PCR鑑定結果（圖4)表明，供試轉化子及質粒pCAMBIA1302-l均能擴增出預期大 小的片段，而未經轉化的野生型菌株及無菌水對照則擴增不到相應大小的片段，說明黑孢 塊菌轉化子含有插入的T-DNA片段。
[0081] 為了進一步證實PCR擴增結果的可靠性，將PCR擴增產物進行序列測定，其核苷酸 序列為SEQ ID NO. 1所示。Blast分析表明，該片段與潮黴素磷酸轉移酶基因的一致性達到 100%，進一步說明T-DNA已經成功的轉入黑孢塊菌基因組，且可以穩定的遺傳。
[0082] 本發明以106孢子為出發材料，通過根癌農桿菌介導分別篩選到28、45和62個陽 性轉化子，陽性轉化效率達到4. 53 ± 1. 75個/105個孢子。
[0083] 實施例2黑孢塊菌的基因標記
[0084] 1、實驗方法
[0085] 1. 1黑孢塊菌孢子的製備
[0086] 具體方法同實施例1。
[0087] 1. 2根癌農桿菌的轉化及培養
[0088] 具體方法同實施例1，所用質粒為pCAMBIA1302(圖5)。
[0089] 1. 3根癌農桿菌與黑孢塊菌孢子共培養及選擇性培養
[0090] 具體方法同實施例1。
[0091] 1. 4黑孢塊菌轉化子的篩選及鑑定
[0092] 1. 4. 1黑孢塊菌轉化子的篩選
[0093] 將PDA培養基上生長的單菌落挑取至新的選擇性培養基上，分離有潮黴素抗性的 黑孢塊菌菌株，將抗性菌株繼續在含50 y g/mL潮黴素B培養基上培養三代至生長穩定。
[0094] 1. 4. 2黑孢塊菌轉化子螢光強度檢測
[0095] 挑取陽性轉化子的菌絲體置於載玻片上，置於倒置螢光顯微鏡（IX-51，日本奧林 巴斯公司生產）下進行螢光檢測。
[0096] 2、實驗結果
[0097] 挑取陽性轉化子的菌絲體置於載玻片上，置於倒置螢光顯微鏡下進行螢光檢測， 採用藍光激發光，能夠觀察到陽性轉化子產生明顯螢光，而野生菌株不產生螢光（圖6)。
[0098] 本實驗主要將外源綠色螢光蛋白編碼基因引入黑孢塊菌，經表達以後，受體細胞 在激發光下表現出特異的綠色，可以用於發酵過程中細胞活性檢測、形態分析，同時也是研 宄黑孢塊菌與寄主植物相互作用關係的重要工具。
[0099] 該實驗結果從細胞水平進一步證實本發明構建的黑孢塊菌遺傳轉化系統的有效 性，同時也為黑孢塊菌生物學研宄提供了一種重要工具。
【權利要求】
1. 一種根癌農桿菌介導的黑孢塊菌（Tuber melanosporum)遺傳轉化方法，其特徵在 於，包括以下步驟： (1)製備黑孢塊菌孢子懸浮液；(2)將攜帶有目的基因的雙元載體質粒轉化根癌農杆 菌，獲得根癌農桿菌陽性轉化子，製備菌液；（3)將步驟（2)製備的菌液與步驟（1)製備的 黑孢塊菌孢子懸浮液混合，共培養；(4)選擇性培養，篩選黑孢塊菌轉化子，鑑定，即得。
2. 按照權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特徵在於：步驟（1)所述黑孢塊菌孢子懸 浮液中孢子濃度為104-108個/mL，優選為10 6個/mL。
3. 按照權利要求1或2所述的遺傳轉化方法，其特徵在於，步驟（1)所述製備黑孢塊菌 孢子懸浮液，包括：（a)將黑孢塊菌菌絲體接種於PDA培養基，於28°C培養活化；優選的，活 化3d ; (b)將活化後的黑孢塊菌菌絲體接種於VBC培養基，28°C培養4-9d，優選為7d ;用無 菌水洗滌菌絲體，收集黑孢塊菌的孢子，稀釋，即得。
4. 按照權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特徵在於，步驟（2)所述製備菌液包括： (a)挑取根癌農桿菌陽性轉化子，接種到含抗生素的LB培養基中，28°C 200rpm震蕩培養 12-20h，離心，收集菌體；(b)用頂培養基重懸菌體，離心，收集菌體；（c)用頂培養基重懸 菌體，將菌體濃度〇D6(i(i調至0. 1?0. 6,28°C 200rpm振蕩培養3-8h，即得。
5. 按照權利要求4所述的遺傳轉化方法，其特徵在於，步驟（2)所述製備菌液包括： (a)挑取根癌農桿菌陽性轉化子，接種到含抗生素的LB培養基中，28°C 200rpm震蕩培養 18h，離心，收集菌體；(b)用頂培養基重懸菌體，離心，收集菌體；（c)用頂培養基重懸菌 體，將菌體濃度〇D6(l(l調至0. 15?0. 3,28°C 200rpm振蕩培養6h，即得。
6. 按照權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特徵在於：步驟（3)將步驟（2)製備的菌 液與步驟（1)製備的黑孢塊菌孢子懸浮液等體積混合；所述共培養的培養基為鋪有硝酸纖 維素薄膜的CM培養基；共培養條件為28°C避光培養24-60h，優選為48h。
7. 按照權利要求4、5或6所述的遺傳轉化方法，其特徵在於：所述IM培養基或共培養 的培養基中含有乙醯丁香酮；優選的，所述乙醯丁香酮的濃度為200mmol/L。
8. 按照權利要求1所述的遺傳轉化方法，其特徵在於：步驟（4)所述選擇性培養是將 步驟（3)共培養後的硝酸纖維素薄膜揭下，正向鋪到含抗生素的PDA培養基，28°C培養至出 現可見的單菌落。
9. 按照權利要求4、5或8所述的遺傳轉化方法，其特徵在於：所述抗生素選自頭孢黴 素、潮黴素或卡那黴素。
【文檔編號】C12N15/80GK104450767SQ201410788066
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月17日 優先權日:2014年12月17日
【發明者】湯亞傑, 賈開志, 徐陽華, 張權 申請人:湖北工業大學