糞腸球菌cms－h001及其應用的製作方法

2023-11-05 13:10:42 1

專利名稱：糞腸球菌cms－h001及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及糞腸球菌的新的菌株以及該菌株的應用。
背景技術：
幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染是人類最常見的感染之一，感染率在全球人口中達50％以上。1982年Warren和Marshall從人胃黏膜標本中成功培養出幽門螺桿菌，並確定HP為胃炎和消化性潰瘍的致病菌以來，改變了慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關性淋巴瘤(MALT)的治療和胃癌的預防格局，已將上述四種疾病定為HP相關性疾病。大量研究表明，HP感染是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與胃癌及胃黏膜相關性淋巴瘤(MALT)的關係非常密切，並於1996年被世界衛生組織確認為一級致癌原。根除HP治療可以降低胃疾病的發生率。目前國內外治療Hp感染的標準方案根除HP感染是以質子泵抑制劑(PPI)和(或)鉍劑加上兩種抗生素的「三聯」或「四聯」療法(MalfertHeiner P，MegraudF，O』Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacterpylori infection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.AlimentaryPharmacology and Therapeutics 2002；16167-180)。用抗生素抑殺HP取得了滿意的療效並縮短了治療時間。
儘管目前用抗生素抑殺HP非常有效，但費用較昂貴，且人們必須承受抗生素帶來的危害也相當大。隨著抗生素的聯合廣泛使用，HP耐藥菌株增多，抗生素使用的種類、時間和量將隨之增加，這將引起如下危害1、大量長時間和聯合多種抗生素，對人體的毒副作用將增大；2、菌株變異和耐藥菌株增多，變異的菌株將不僅只限於HP；3、其他腔部和皮膚的微生態破壞，導致各腔道自淨功能降低，使其他黏膜萎縮相關性疾病甚至腫瘤的發生率增加。抗生素聯合大量應用，會產生抗生素相關性腹瀉、腸道菌群失調、甚至產生偽膜性腸炎等一系列問題，使療效下降，患者依從性降低，停藥後易復發和再感染等缺陷，及耐藥菌株的迅速增加更使根除率下降。因此尋找非抗生素治療HP勢在必行。
Adamasson等(Nomura A，Stemmermann GN，Chyou PH，Kato I，Perez-Perez GI.Blaser MJ.Helicobacter pylori infection and gastric carcinomaamong Japanese Americans in Hawaii.N Engl J Med 1991；3251132-1136.)報導了幾例使用抗生素治療Hp導致的菌群失調口腔內出現抗藥性鏈球菌和葡萄球菌；胃黏膜中細菌數增加，且出現抗藥性共生菌；腸道內微生態環境的改變最明顯，抗藥性腸道球菌、腸桿菌、類桿菌在治療後都有所增加。故尋求一種毒副作用少，病人容易接受的治療方法成為目前醫學研究中的熱點。

發明內容
本發明的目的就是為了解決以上問題，提供一種能有效治療幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染的新的糞腸球菌菌株及其在製備藥物等方面的應用。
本發明的再一目的是提供含有上述菌株的幽門螺桿菌抑制劑、藥物組合物、食品、保健品及食品添加劑。
為實現上述目的，本發明採用了以下技術方案本發明公開了一種糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，其保藏號為CCTCC No.M 206108。
本發明還公開了幽門螺桿菌抑制劑，所述抑制劑含有保藏號為CCTCCNo.M 206108的糞腸球菌CMS-H001。
本發明還公開了所述的糞腸球菌CMS-H001在製備用於治療幽門螺桿菌感染導致的疾病的藥物中的應用。
具體的，所述疾病為胃病。
或者具體的，所述疾病為慢性胃炎。
或者具體的，所述疾病為消化性潰瘍。
或者具體的，所述疾病為胃黏膜相關性淋巴瘤。
或者具體的，所述疾病為胃癌。
本發明進一步公開了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有藥學有效劑量的上述的糞腸球菌CMS-H001。
本發明還公開了一種食品，所述食品含有上述的糞腸球菌CMS-H001。
優選的，所述食品為飲料。
本發明進一步公開了一種保健品，所述保健品包含上述的糞腸球菌CMS-H001。
本發明進一步公開了一種食品添加劑，所述食品添加劑包含上述的糞腸球菌CMS-H001。
本發明的糞腸球菌CMS-H001，是一種分離的全新的菌株，該菌株在體內、體外均能夠有效拮抗幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)；且對酸和膽汁都有良好的耐受性；能減輕HP感染引起的黏膜慢性炎症損傷，減少淋巴細胞、漿細胞的浸染，對HP的根除率達到75％-87.5％，與現階段常規的PPI三聯療法比較差異無顯著性。本發明的新的菌株可用於治療HP感染與HP相關性疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關性淋巴瘤和胃癌。
保藏信息菌株名稱糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001保藏日期2006年10年23日保藏單位中國典型培養物保藏中心(CCTCC)保藏編號CCTCC No.M 206108


圖1為本發明糞腸球菌CMS-H001在光鏡下的形態圖。
圖2為本發明糞腸球菌CMS-H001的5000×倍掃描電鏡圖像。
圖3為本發明糞腸球菌CMS-H001的20000×倍掃描電鏡圖像圖4為本發明糞腸球菌CMS-H001的6000×倍透射電鏡圖。
圖5為本發明糞腸球菌CMS-H001的12000×倍透射電鏡圖。
圖6為實施例2中的胃體、胃竇損傷積分直方圖，A代表胃體損傷積分直方圖，B代表胃竇損傷積分直方圖。
圖7為實施例2中Giemsa染色細菌記數積分的直方圖，A代表胃體Hp積分直方圖，B代表胃竇Hp積分直方圖。
圖8為實施例2中各治療組胃黏膜改良Giemsa染色圖，空白對照組(A)胃小凹內未見明顯桿菌，模型組(B)可見大量桿菌黏附；而糞腸球菌CMS-H001治療組(C)和PPI治療組(D)則僅可見少量桿菌黏附(Giemsa染色，×1000)。
圖9為實施例2中模型組胃組織勻漿染色結果圖，A、B分別為模型組胃組織勻漿塗片和勻漿組織細菌培養的HE染色光鏡下形態，均可見Gram’s染色陰性細菌，呈彎曲桿菌或弧形(Gram’s染色，油鏡)。
具體實施例方式
微生態學研究正常微生物群與其宿主的相互關係，微生態療法應用可拮抗病原菌活性的活菌製劑來治療細菌感染，作用特異、直接、長久，無明顯毒副作用。微生態調節劑——益生菌通過提高某些有利於健康的細菌的數量和活性，重建菌群平衡而對宿主起有益作用。常見的益生菌主要包括乳桿菌、乳酸鏈球菌、雙歧桿菌等，這些細菌是健康人胃腸道的正常菌群，其代謝產物中含有乙酸、乳酸、過氧化氫等，對病原菌有一定的拮抗作用。另外，這些細菌能夠產生多種細菌素，有高度特異的抑菌或殺菌作用。因此益生菌通過多種途徑拮抗病原菌，減少了耐藥性的發生，為治療細菌感染性疾病提供了新的途徑。
本發明的新的菌株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，是一種益生菌，能夠有效拮抗幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)，可用於治療HP感染與HP相關性疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關性淋巴瘤和胃癌。
本發明的新的菌株糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，已經於2006年10年23日在位於中國武漢市的中國典型培養物保藏中心(CCTCC)進行了保藏，保藏號為CCTCC No.M 206108。
本發明的糞腸球菌CMS-H001菌株在EC培養基上為醬紫色扁平菌落，直徑1～2毫米，邊緣齊，表面光滑，光鏡下表現為革蘭氏染色陽性球菌；掃描電鏡和透射電鏡下呈球狀或串珠狀，無芽孢球菌，胞壁結構完整，無芽生現象，胞質均勻。菌株代謝終產物中，VFA主要為乙酸，NVFA主要為乳酸，以及少量琥鉑酸。
在糞腸球菌CMS-H001菌株的體外拮抗Hp試驗中發現，高壓滅菌的和過濾除菌的糞腸球菌CMS-H001上清液無抑制Hp作用，而糞腸球菌CMS-H001培養上清液則有明顯的拮抗Hp作用，說明糞腸球菌CMS-H001抗Hp作用效力的發揮依賴於活菌狀態或代謝終產物的有效成分。
進一步的體外模擬胃十二指腸環境抗性研究發現，糞腸球菌CMS-H001接種到pH為2.0的酸性環境中活菌計數與接種到pH6.8的近中性環境中的無顯著差異，表明糞腸球菌CMS-H001菌株對pH2.0的MRS液體培養基耐受良好；同時，糞腸球菌CMS-H001菌株在含0.3％膽汁鹽的MRS液體培養基活菌計數較接種於不含膽鹽的MRS無顯著性差異。表明本發明的糞腸球菌CMS-H001菌株對酸和膽汁都有良好的耐受性。
以上研究表明，從人胃竇和十二指腸分離的厭養菌株中篩選出的糞腸球菌CMS-H001菌株，對模擬胃酸和十二指腸膽汁環境抗性良好，體外可明顯抑制Hp臨床株，而且這種作用依賴活菌的直接參與。這些研究表明本發明的糞腸球菌CMS-H001菌株已經具備成為藥用菌的必備條件，可用於開發成應用微生態療法防治Hp感染的新藥、保健品以及食品添加劑等。
本發明進一步用糞腸球菌CMS-H001菌株對HP誘導的胃炎模型鼠進行體內治療研究，並與現階段常規的治療方法「PPI三聯療法」進行比較。研究發現本發明的益生菌糞腸球菌CMS-H001能減輕HP感染引起的黏膜慢性炎症損傷，減少淋巴細胞、漿細胞的浸染，與模型組比較有顯著性差異，與PPI治療組比較無明顯差異，並有抑制HP的作用，治療後HP細菌檢測明顯減少，對HP的根除率達到75％-87.5％，與PPI三聯療法比較差異無顯著性。
本發明的研究結果說明正常人胃內存在對Hp有拮抗作用的共生菌，並且存在菌株特異性。本發明從健康人胃竇分離的厭養菌株中篩選出的糞腸球菌CMS-H001，在體內有明顯抑制Hp臨床株的作用，其對HP的根除率與PPI加抗菌素的三聯療法比較無顯著性差異。此結果對Hp感染的治療提供了新的方法，為微生態在治療HP相關性疾病方面提供了理論基礎。
利用本發明的糞腸球菌CMS-H001可以製備成藥物組合物。該藥物組合物含有藥學有效劑量的糞腸球菌CMS-H001的活菌形式。此外，所述藥物組合物還可以含有合適的藥物載體。本發明的藥物組合物可以為膠囊、溶液或可飲用懸浮液、袋裝粉劑等形式，每一單一劑量一般含有糞腸球菌CMS-H001菌株約為106～1010細胞。本發明的藥物組合物可用於防治HP相關性疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關性淋巴瘤和胃癌等。
利用本發明的糞腸球菌CMS-H001還可以製備成食品、保健品或食品添加劑的形式，這些食品、保健品或食品添加劑可用於防治HP相關性疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關性淋巴瘤和胃癌等，提高使用者的健康水平。本發明的食品可以是含有本發明糞腸球菌CMS-H001活菌的飲料的形式，也可以是含有該活菌的乳製品、發酵乳、酸豆奶等形式。
下面通過具體的實施例對本發明作進一步詳細的描述。
實施例1糞腸球菌CMS-H001的分離鑑定及其生物學特性1、培養基處方及配置MRS液體培養基取蛋白腖5g，牛肉粉5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，K2HPO42.5g，檸檬酸銨1g，NaCl 2.5g，MgSO40.25g，MnSO40.1g，Tween-80 0.5g加蒸餾水500ml溶解後121℃高壓蒸氣滅菌，置4℃冰箱備用。
MRS固體培養基蛋白腖5g，牛肉粉5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖10g，K2HPO42.5g，檸檬酸銨1g，NaCl 2.5g，MgSO40.25g，MnSO40.1g，Tween-800.5g加蒸餾水500ml溶解，加入瓊脂粉10g，121℃高壓蒸氣滅菌，澆注無菌培養皿，置4℃冰箱備用。
2、胃鏡取材和標本轉送胃鏡下抽吸健康成人十二指腸降段液體0.5ml入2mlMRS液體培養基，按上法共取三個標本，厭氧盒30分鐘內轉送至實驗室。
3、糞腸球菌CMS-H001種子菌的分離培養糞腸球菌CMS-H001種子菌分離自一健康成人十二指腸降段液體，標本在厭氧盒內於37℃恆溫培養4h後取出，按10-1系列稀釋至10-7，原液和各級稀釋液各取100ul滴加到MRS平板，L型玻棒塗布均勻，37℃厭氧培養48h後取出觀察菌落形態，挑單克隆行革蘭氏染色鏡檢，將不同形態和染色性的菌落單克隆挑入MRS液體培養基中，37℃厭氧環境培養24h後取出染色鏡檢，觀察鏡下形態，並劃線接種於MRS固體培養基，再次37℃厭氧培養48h觀察菌落形態，挑單克隆染色鏡檢，反覆四次傳代純化，直至固體平板上所長菌落形態一致，革蘭氏染色鏡檢形態一致確定已分純。分純的各株細菌可添加防凍劑後於-70℃冰箱低溫保存備用。
3、菌落特徵糞腸球菌CMS-H001在EC培養基上為醬紫色扁平菌落，直徑1～2毫米，邊緣齊，表面光滑。光鏡下為革蘭氏染色陽性球菌，球形或串珠狀，無芽孢。見圖1。
4、掃描電鏡觀察取1g菌泥生理鹽水洗3次，取600ul菌懸液2500rpm/min離心5min，加入600ul 2.5％戊二醛，打散沉澱，固定24h；0.1M PBS清洗，3次×5min；1％的OSO4固定1h；50％、70％、90％、100％的丙酮梯度脫水，每級10min×2次；50％、70％、90％、100％醋酸異戊酯，每級置換5min×2次；臨界點乾燥儀乾燥；離子濺射儀，噴鉑金鍍膜；JSM5600-LV型掃描電鏡觀察、照相。結果如圖2、3所示，糞腸球菌CMS-H001株細菌表面光滑、完整，形態均一，呈球狀或串珠狀，無芽孢，圖2、圖3分別代表5000×和20000×倍。
5、透射電鏡觀察取1g菌泥生理鹽水洗3次，取600ul菌懸液2500rpm/min離心5min，沿管壁加入2.5％戊二醛固定24h，2％的鋨酸固定2h，50％、70％、90％、100％的丙酮梯度脫水，環氧樹脂混合液∶純丙酮＝1∶1，37℃，浸泡24h，Epon812(Epoxiaquivalentgewicht145-160)、DDSA(DodecenylsuccinicAnhydride)、MNA(Methyl Nadic Anhydride)、DMP30(Tris-(dimethylaminomethgl)-phenc)，60℃，包埋成塊；修塊、定位；半薄切片；瑞典LKB-III型超薄切片機切片，厚約500A；醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，日立H-600型透射電鏡觀察、照相。結果如4、5所示，圖像顯示在透射電鏡下細菌形態規整，胞壁結構完整，無腫脹及芽生現象，胞質均勻，未發現異常顆粒，所有切片中未見病毒、支原體等外源因子，圖4、圖5分別代表6000×和12000×倍。
6、糞腸球菌CMS-H001代謝終產物測定(1)儀器日本島津GC2010型氣相色譜檢測儀(GC)，氫焰離子檢測器(FID)，DB-5MS色譜柱；日本島津UV-2501PC；(2)標準液的製備醇和揮發性脂肪酸(VFA)標準液的製備將甲酸37μl、乙酸57μl、丙酸74μl、異丁酸93μl、丁酸92μl、異戊酸109μl、戊酸108μl、己酸125μl、乙醇100μl、丙醇5μl、異丁醇5μl、丁醇10μl、異戊醇0.5μl、戊醇0.5μl加蒸餾水定容至100ml，即為10mmol/L的標準液。
非揮發性脂肪酸(NVFA)標準液的配製將乳酸84μl、苯乙酸60mg、琥珀酸60mg加蒸餾水至100ml，即為10mmol/L的標準液。
(3)VFA製備選用偏磷酸法取標準液或培養物1ml加偏磷酸0.5ml，調整pH值在2.0以下，37℃勻化2h，10000轉/分，4℃離心2min，取上清1μl用於進樣分析。
(4)NVFA製備選用甲醇硫酸法取標準液或培養物2ml加50％硫酸0.2ml，調整PH值在2.0以下，取硫酸酸性培養物1ml，加入甲醇溶液1ml和50％硫酸0.1ml，將樣品煮沸5分鐘或室溫下過夜，加入氯仿0.5ml，混勻後靜置片刻，1000轉/分，4℃離心2min，取氯仿層1μl用於進樣分析。
(5)標本及標準品中各物質的分析分別取提取後的樣品和標準品1μl進樣分析，由日本島津GC2010型氣相色譜檢測儀(GC)檢測各物質的保留時間並以標準品作為樣本中該物質的定量標準。
結果顯示糞腸球菌CMS-H001菌株VFA主要為乙酸，乙酸出峰時間為7.970min，NVFA主要為乳酸，並有少量琥鉑酸，乳酸出峰時間為7.300min，琥鉑酸出峰時間為9.775min。
7、糞腸球菌CMS-H001的生化鑑定API-20 STREP(法國酶裡埃)是一個結合各方面的20個生化試驗的標準化方法。該系統能夠堅定醫學細菌中絕大多數鏈球菌的種或群。
API-20 STREP試驗條由含能進行酶測定和糖發酵的乾燥底物的20個小管所組成，可測定酶活或糖發酵。酶活測定是以濃、純菌懸液接種於乾燥的酶底物。在培養期間，所產生的最終代謝產物通過自然變色或加入試劑而變色而顯示。發酵試驗是以接種於由糖底物組成的培養基。發酵的碳水化合物是以PH指示劑來顯示。
取鏡檢Gram′s染色陽性球菌菌株行API-20 STREP生化鑑定，鑑定方法參見API-20 STREP鑑定試劑盒中廠商配備的說明書。結果見表1。
表1 糞腸球菌CMS-H001菌株API-20 STREP生化反應結果


實施例2糞腸球菌CMS-H001對幽門螺桿菌(Hp)的體外抑制試驗(1)糞腸球菌CMS-H001菌株上清液製備菌株按1％體積比接種於MRS液體培養基，37℃厭氧培養24h後取出，4℃5000rpm/min離心10min，留取上清，棄去沉澱。
糞腸球菌CMS-H001菌株滅菌上清液製備按上法得到上清液後121℃高壓蒸氣滅菌20min。
糞腸球菌CMS-H001菌株上清液濾過液製備上清液用0.22微米孔徑的濾器過濾除菌，得到不含細菌的上清液。
(2)Hp菌液製備無菌接種環收集心腦浸液血平板上Hp，接種於0.2ml含50％胎牛血清的心腦浸液，比濁法判斷菌液濃度為1011CFU/ml。
(3)抑菌試驗吸100μl幽門螺桿菌菌懸液滴加到直徑為9cm的心腦浸液血平板，無菌L形玻棒塗布均勻。待菌液完全滲透血平板，用無菌200μlTip頭在平板上打孔，孔徑7mm，孔深5mm，每板4個孔，孔底用0.8％瓊脂液封底後，向孔內分別加入糞腸球菌CMS-H001菌株上清液、滅菌上清液、濾過的上清液，加MRS液體培養基作為對照孔，液面儘量接近血平板表面，不得溢出，每孔加液120μl，一式三份，置於厭養箱中微需氧環境37℃恆溫培養72h。
72h後取出打孔平板測量抑菌圈直徑，高壓滅菌上清液、過濾除菌的上清液以及MRS液體培養基的對應孔內壁和孔周無細菌生長，抑菌圈直徑為0；糞腸球菌CMS-H001菌株培養上清液各孔內壁均有相應細菌生長，三個平板的抑菌圈直徑分別為18mm，18mm，11mm，平均為15.7mm。
實施例3糞腸球菌CMS-H001體外耐酸、耐膽汁試驗(1)耐酸試驗從-70℃冰箱中取出凍存的糞腸球菌CMS-H001菌株，接種於MRS液體培養基中，37℃厭養培養24h後，離心(4300×g，10min，4℃)，棄去上清，收集菌體沉澱，用無菌生理鹽水洗滌3次。然後以1％體積比接種到pH值為2.0(用鹽酸滴定)的MRS液體培養基中。同時接種到pH值為6.8的MRS液體培養基作為對照。
分別在接種後0min和120min取100μl菌液按10-1序列稀釋，各稀釋梯度取100μl接種到pH6.8的MRS平板，厭氧培養48h後行活菌計數。重複三次。
結果如表2所示，糞腸球菌CMS-H001菌株接種到pH為2.0的酸性環境中120min時，活菌計數與接種到pH6.8的近中性環境中的無顯著差異(P＞0.05)，均較接種前的細菌計數稍有增多趨勢，但無顯著性差異(P＞0.05)。表明糞腸球菌CMS-H001菌株對pH2.0的MRS液體培養基耐受良好。
表2.糞腸球菌CMS-H001接種前和接種於pH為6.8和2.0的MRS液體培養基後120min的活菌計數對數值

*P＜0.05 vs.對照組
(2)耐膽汁試驗從-70℃冰箱中取出糞腸球菌CMS-H001菌株接種於MRS液體培養基中，37℃厭養培養24h後，離心(4300×g，10min，4℃)，棄去上清，收集菌體沉澱，用無菌生理鹽水洗滌3次。然後以1％體積比接種到含0.3％膽汁鹽的MRS液體培養基中。同時接種到不含膽汁鹽的MRS液體培養基作為對照。
分別在接種後0min和120min取100μl菌液按10-1序列稀釋，各稀釋梯度取100μl接種到pH6.8不含膽汁鹽的MRS平板，厭養培養48h後行活菌計數。重複三次。
結果如表3所示，糞腸球菌CMS-H001菌株在含0.3％膽汁鹽的MRS液體培養基120min時，活菌計數與接種於不含膽汁鹽的MRS液體培養基相比無顯著性差異(P＞0.05)。
表3.糞腸球菌CMS-H001接種前和接種於含膽汁鹽和不含膽鹽的MRS後120min活菌計數對數值

●P＜0.05 vs.對照組。
實施例4糞腸球菌CMS-H001治療HP感染性胃炎的體內有效性研究用抗生素破壞清潔級BalB/C小鼠胃內微生態環境，使胃內細菌含量明顯減少的情況下，再感染HP成功地形成了HP感染性胃炎模型。經模擬胃內環境的耐酸耐膽汁試驗研究，證明糞腸球菌CMS-H001對酸和膽汁具有一定的抗性。該菌株胃內定植髮現其可在胃內穩定定植。證明糞腸球菌CMS-H001具有體內治療HP的條件。以下對糞腸球菌CMS-H001體內治療HP誘導的胃炎模型鼠進行有效性研究。
一、材料和方法1、HP臨床株分離和純化所需的材料1.1常用試劑和溶液的配製厭氧發生劑成分質量(g)碳酸氫鈉0.8
硼氫化鉀 1.1檸檬酸1.08革蘭氏染液結晶紫染液 結晶紫1g95％乙醇 20ml1％草酸銨水溶液80ml將結晶紫溶解於乙醇中，然後與草酸銨溶液混合。
盧戈氏碘染液 碘1g碘化鉀2g蒸餾水300ml95％酒精95ml乙醇，加5ml蒸餾水稀石炭酸復紅染液稱取鹼性復紅10g，研細，加95％乙醇100ml，放置過夜，濾紙過濾。取該液10ml，加5％石炭酸水溶液90ml混合，即為石炭酸復紅液。再取此液10ml，加水90ml，即為稀石炭酸復紅液。
防凍液DMSO與甘油按1∶2的體積比混合。
2、HP鑑定材料2.1、快速尿素酶試劑盒(福建三強生物化工有限公司)；2.2、胃黏膜的病理組織學檢查由有經驗的醫師進行石蠟切片、HE染色、雙盲閱片。
2.3、Giemsa染色和雙盲閱片評分。
2.4、HP細菌培養由本實驗室用心腦浸液製備培養基備用。
3、碾磨的組織液行Gram’s染色塗片4、動物實驗材料建立清潔級動物飼養房，實驗動物和籠具、飼料購自湖南農業大學動物實驗中心由專人負責動物的飼養和管理；實驗動物已經造模成功為慢性胃炎的普通級BALB/c小鼠24隻，加上空白對照組8隻，共32隻，雌雄各半，體重±2g。
5、菌懸液、藥液的配製無菌接種環收集MRS培養平板上的糞腸球菌CMS-H001菌株，用無菌生理鹽水配成懸液，比濁法調整菌懸液終濃度為1×109CFU/ml。
藥物質子泵抑制劑泮立蘇針劑(40mg/支)(杭州中美華東製藥有限公司，批號040805)；抗生素克拉黴素片劑(250mg/片)(江西匯仁藥業有限公司，批號0510019)，氨苄青黴素針劑(0.5g/支)(華北製藥股份有限公司，批號0404307)，慶大黴素(天津藥業焦作有限公司，批號05052802)，均購自中南大學湘雅二院藥劑科。
小鼠的藥物的劑量按人與各種動物之間的用藥劑量換算已知A種動物每kg體重用藥量，欲計算B種動物每kg體重用藥劑量時，可查表(參見孫敬方著《動物實驗方法學》，北京，人民衛生出版社2001年，116至125頁)，找出折算係數(W)再按下式計算B種動物的劑量(mg/kg)＝W×A種動物的劑量(mg/kg)。由上述公式計算得出各種藥物的劑量如下泮立蘇針劑(40mg)用100ml無菌生理鹽水稀釋成濃度為0.4mg/ml的溶液，每隻小鼠每天每次給0.25ml灌胃。
氨苄青黴素(0.5g)用25ml無菌生理鹽水稀釋成濃度為20mg/ml的溶液，每隻小鼠每天每次給0.25ml灌胃。
克拉黴素(0.25g)用5ml無菌生理鹽水稀釋成濃度為50mg/ml的溶液，每隻小鼠每天每次給0.1ml灌胃。
6、實驗動物分組及治療方法經抗生素預處理、再給予PPI加HP灌胃，造模成功的24隻Balb/c小鼠隨機分成3組，每組8隻。第1組為PPI加抗生素處理組，第2組為糞腸球菌CMS-H001處理組；第3組為模型對照組；另外增加8隻正常Balb/c小鼠作為空白對照組(第4組)。
第1組(PPI+抗生素三聯療法治療組)自第3-10天，每天先禁食12h，予PPI溶液0.25ml及氨苄青黴素0.25ml加克拉黴素0.1ml灌胃，灌完胃後再禁食3-4個小時，每天一次，連用7天。於最後一次灌胃後第4周全部處死小鼠。
第2組(糞腸球菌CMS-H001治療組)自第1-10天，每日先禁食12h，予CMS-H001新鮮菌懸液0.5ml/只灌胃，細菌數為109CFU，灌完胃後再禁食3-4個小時，每天一次，連用10天。於最後一次灌胃後底4周全部處死小鼠。
第3組(模型對照組)自第1～10天，每天予生理鹽水0.5ml/只灌胃，每天一次。連用10天，於最後一次灌胃後第4周處死全部小鼠。
第4組(空白對照組)自第1～10天，每天予生理鹽水0.5ml/只灌胃，每天一次。連用10天，於最後一次灌胃後第4周處死全部小鼠。
小鼠的處理用斷頸法處死小鼠後立即解剖，取出胃腔，去除前胃，沿大彎側剪開，取完整的胃組織(包括十二指腸、胃竇、胃體等)；一半胃黏膜用10％的福馬林液固定後行HE染色和Giemsa染色，另一半組織行快速尿素酶試驗(觀察時間5min)、塗片及細菌培養。
7.細菌檢測7.1HP檢測1)快速尿素酶試驗造模組小鼠處死後取胃黏膜置於液體尿素酶試劑中，室溫下觀察5min，指示劑變紅為陽性。
2)Hp培養胃及十二指腸組織標本用含10％胎牛血清的心腦浸液500ul研磨成勻漿，用前後差量法算得標本質量，10-1系列適當稀釋，各梯度取100ul塗心腦浸液血平板，37℃微需氧培養3～7天，觀察菌落形態，取可疑菌落行革蘭氏染色鏡檢和快速尿素酶試驗。
3)Giemsa染色步驟如下①石蠟切片按同一方向裝入染色架，60℃烤片10分鐘，以上或用電吹風使切片上的石蠟溶化。
②入二甲苯中脫蠟2～5分鐘，重複1次，夏天脫蠟時間短一些，冬天則相反。
③100％，100％，95％，90％，80％，70％乙醇依次各1分鐘，入自來水，流水放置約3分鐘，至切片清晰。
④直接入2％Giemsa染液中染色30分鐘(染液可重複使用)。
⑤自來水洗去染液⑥直接入100％乙醇中脫水。
⑦常規脫水，透明，封片。
4)Gram’s染色步驟①結晶紫染色1min，流水衝洗；②盧戈氏碘媒染染色1min，流水衝洗；③酒精脫色95％酒精脫色，15～30秒，至無紫色脫下為止，流水衝洗；④稀石炭酸復紅復染，1min，流水衝洗。
集中檢測方法中，細菌培養陽性即診斷為HP陽性，快速尿素酶試驗、改良Giemsa染色及Gram’s染色兩項陽性診斷為Hp陽性。
8.病理學處死小鼠立即解剖後，取一半胃黏膜用10％的福馬林液固定後行HE染色小鼠胃組織用10％福馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色(蘇木素染色7分鐘——自來水衝洗多餘的染液——1％鹽酸酒精分化5秒，使細胞核呈紫藍色——自來水成分洗滌——1％伊紅染色，3分鐘左右)。病理科醫生雙盲閱片。
9.判斷標準9.1Hp定植的判斷標準(International Agency for Research on CancerWorking Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.Schistosomes，Liver Flukes，and Helicobacter pylori.LyonInternationalAgency for Research on Cancer，1994177-240.)(MalfertHeiner P，Megraud F，O』Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacter pyloriinfection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.Alimentary Pharmacologyand Therapeutics 2002；16167-180.)高倍鏡下觀察Giemsa染色切片10個視野，以Hp數量的多少進行計分來判斷其定植情況。標準如表4表4.Hp定植量的評分標準

9.2胃黏膜慢性炎症的評分標準(MalfertHeiner P，Megraud F，O』Morain C et al.Current concepts in the management of Helicobacter pyloriinfection-tHe Maastricht 2-2000 Consensus Report.Alimentary Pharmacologyand Therapeutics 2002；16167-180.)觀察黏膜固有層慢性炎症細胞(淋巴細胞、漿細胞及嗜酸性粒細胞)和中性粒細胞，分別對固有層慢性炎症和活動性炎症程度進行計分，標準如下表5。黏膜下層的炎症評分標準同黏膜固有層。整個黏膜的炎症評分為黏膜固有層和黏膜下層的平均值。
表5 胃黏膜病理組織學損傷評分標準

9.3療效判斷(1)Hp根除標準治療停止後一個月做細菌培養陰性或快速尿素酶試驗和組織學染色檢查2項均陰性為Hp根除。
(2)Hp感染好轉標準單位質量組織Hp計數減少或組織學染色細菌量減少。
(3)病理學治癒標準大體觀轉為正常且病理組織學結果正常。
(4)病理學好轉標準大體觀充血水腫較前減輕，糜爛潰瘍灶較治療前縮小(遊標卡測量病灶直徑)，或病理學未完全正常，但評分較治療前減少。
體內有效性判斷標準治癒標準(1)加(3)，即Hp根除加上病理學結果正常。
好轉標準(1)加(4)，或(2)加(3)，或(2)加(4)。
有效率＝治癒率+好轉率10、統計方法運用SPSS11.0統計軟體進行數據處理，結果以均數±標準差(x±s)表示，兩組間均數比較採用t檢驗和方差分析，P＜0.05視為顯著性差異。
二、結果1、一般情況在實驗過程中，觀察各組小鼠的飲食情況、活動量及毛髮、體重的情況，每周稱體重，發現各組小鼠之間飲食及活動量無明顯變化，體重的變化無顯著性差異(P＜0.05)(見表6)。
表6小鼠體重變化表(x±s，n＝8)

2.大體觀察2.1從沿胃大彎縱行切開的胃黏膜面觀察，可以看到模型組Hp感染引起的充血水腫及部分胃竇黏膜糜爛，治療組大部分胃黏膜無明顯充血水腫，治療結束後大體觀可見胃黏膜炎症與模型組比較明顯好轉。
2.2病理組織學損傷積分各組損傷積分參見表7以及圖6的直方圖，圖6的A和B分別代表胃竇、胃體的損傷積分。
總體上胃竇黏膜炎症損傷積分稍高於胃體黏膜，4組間胃竇黏膜炎症損傷積分比較有統計學差異，其中第1組(PPI+抗生素處理組)、第2組(糞腸球菌CMS-H001治療組)、第4組(空白對照組)的胃竇黏膜炎症損傷的積分均低於第3組(模型對照組)，差異有顯著性(P＜0.05)，第1組、第2組、第4組兩兩比較差異無顯著性(P＞0.05)。
胃體炎症損傷積分4組比較有統計學差異，其中第1組、第2組、第4組的胃體黏膜炎症損傷的積分均低於第3組，差異有顯著性(P＜0.05)，第1組、第2組、第4組兩兩比較差異無顯著性(P＞0.05)。
表7Balb/c鼠處理各處理組胃黏膜慢性炎症損傷積分(x±s，n＝8)

注與第3組比較，*P＜0.053、計算HP的根除率3.1 Hp的定植積分Giemsa染色可清楚地顯示Hp呈S形，多定植於胃小凹上部及胃腺腔內。各組Hp的定植積分參見表8以及圖7的直方圖，圖7的A和B分別代表胃竇、胃體的Hp定植積分。
4組間胃竇黏膜Hp定植積分比較有統計學差異，其中第1組、第2組與第3組比較差異有顯著性(P＜0.05)，第1組、第2組兩兩比較差異無顯著性(P＞0.05)。
4組間胃體黏膜Hp定植積分比較有統計學差異，其中第1組、第2組與第3組比較差異有顯著性(P＜0.05)，第1組、第2組兩兩比較差異無顯著性(P＞0.05)。
表8各組Balb/c鼠Hp定植積分結果(x±s，n＝8)

注各組Hp定植積分與第3組比較，×P＜0.05圖8為各組胃黏膜改良Giemsa染色圖，可見空白對照組胃小凹內未見明顯桿菌，模型組可見大量桿菌黏附，而PPI治療組和糞腸球菌CMS-H001治療組則僅可見少量桿菌黏附。
3.2 HP的快速尿素酶試驗和培養結果結果見表9。第1、2組胃竇和胃體部快速尿素酶試驗和細菌培養與第3組比較均有顯著性差異(P＜0.05)。
表9快速尿素酶試驗和細菌培養結果

3.3各處理組不同部位HP的根除率比較結果見表10。
胃竇部第1組和第2組與第3組、第4組比較差異有顯著性(P＜0.05)，第1、2組之間比較差異無顯著性(P＞0.05)。
胃體部第1組、第2組與第3組、第4組比較差異有顯著性(P＜0.05)。
表10 不同處理組、不同部位HP的根除率比較

3.4培養的HP做Gram’s染色塗片觀察細菌形態模型組胃組織勻漿塗片和勻漿組織細菌培養的HE染色光鏡下形態，均可見Gram’s染色陰性細菌，呈彎曲桿菌或弧形，如圖9A、B所示。
以上結果表明，本發明的糞腸球菌CMS-H001能減輕HP感染引起的黏膜慢性炎症損傷，減少淋巴細胞、漿細胞的浸染，與模型組比較有顯著性差異，與PPI治療組(常規治療方法)比較無明顯差異；並有抑制HP的作用，治療後HP細菌檢測明顯減少，對HP的根除率達到75％-87.5％，與PPI三聯療法比較差異無顯著性。
權利要求
1.一種糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS-H001，其保藏號為CCTCC No.M 206108。
2.幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)抑制劑，其特徵在於所述抑制劑含有保藏號為CCTCC No.M 206108的糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)CMS-H001。
3.權利要求1所述的糞腸球菌CMS-H001在製備用於治療幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染導致的疾病的藥物中的應用。
4.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述疾病為胃病。
5.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述疾病為慢性胃炎。
6.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述疾病為胃癌。
7.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述疾病為胃黏膜相關性淋巴瘤。
8.根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述疾病為消化性潰瘍。
9.一種藥物組合物，其特徵在於所述藥物組合物含有保藏號為CCTCC No.M 206108的藥學有效劑量的糞腸球菌CMS-H001。
10.一種食品，其特徵在於所述食品含有保藏號為CCTCC No.M206108的糞腸球菌CMS-H001。
11.根據權利要求10所述的食品，其特徵在於所述食品為飲料。
12.一種保健品，其特徵在於所述保健品含有保藏號為CCTCC No.M 206108的糞腸球菌CMS-H001。
13.一種食品添加劑，其特徵在於所述食品添加劑含有保藏號為CCTCC No.M 206108的糞腸球菌CMS-H001。
全文摘要
本發明公開了一種糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CMS－H001，其保藏號為CCTCC No.M 206108。本發明的糞腸球菌CMS－H001能有效治療幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，HP)感染。
文檔編號A61P1/04GK101067120SQ200610157188
公開日2007年11月7日 申請日期2006年11月29日 優先權日2006年11月29日
發明者盧放根, 林剛 申請人:康哲醫藥研究(深圳)有限公司