治療和診斷纖維化、腫瘤侵入、血管生成和轉移的方法和組合物的製作方法

2023-11-06 01:58:47 4

專利名稱：治療和診斷纖維化、腫瘤侵入、血管生成和轉移的方法和組合物的製作方法
治療和診斷纖維化、腫瘤侵入、血管生成和轉移的方法和組
合物交叉引用本申請要求以下申請的優先權2007年8月2日提交的美國臨時申請號 60/963,282, 名 為「Methods for Selecting Inhibitors of Tumor Invasion, Angiogenesis, and Metastasis (選擇腫瘤侵入、血管生成和轉移的抑制劑的方法)」(代 理人案件號35120-704 101) ；2007年8月2日提交的美國臨時申請號60/963，249，名為 "Treatment of Diseases With Inhibitors of Active LysylOxidase (用活性賴氨酉先氧化 酶抑制劑治療疾病)，，(代理人案件號35120-706. 101) ；2007年8月2日提交的美國臨時 申請號 60/963，214，名為 「Treatment of Diseases Through Inhibition of Both Lysyl Oxidase and LysylOxidase-Like Proteins (通過同時抑制賴氨醯氧化酶和賴氨醯氧化酶 樣蛋白來治療疾病)，，(代理人案件號35120-706. 102) ；2007年8月2日提交的美國臨時 申請號 60/963，248,名為"Diagnosis or Monitoring of Diseases byAssessing Active Lysyl Oxidase Levels or Activity (通過評估活性賴氨醯氧化酶水平或活性來診斷或 監測疾病)(代理人案件號35120-706. 103)；和2007年8月2日提交的美國臨時申請號 60/963, 246, ^^"Combination TherapyIncluding Lysyl Oxidase Modulators (
氨醯氧化酶調節劑的組合治療)」(代理人案件號35120-707. 101)，本申請還與以下申請有 關2008 年8 月 1 日提交，名為「L0X and L0XL2 Inhibitors and Uses (L0X 和 L0XL2 抑制 劑及其應用)」的共同待批美國專利申請(代理人案件號35120-715. 201)，序列號―，和 2008 年 8 月 1 日提交，名為 「L0X and L0XL2 Inhibitors andUses (L0X 和 L0XL2 抑制劑及 其應用)」的PCT專利申請(代理人案件號35120-715. 601)，序列號―，各份申請通過引用 全文納入本文。背景1.癌症癌症是美國和其它發達國家的嚴重公眾健康問題。目前，在美國每4例死亡中即 有一例死於癌症。癌症治療包括用化療藥物治療患者來殺傷腫瘤細胞。然而，腫瘤細胞的 亞組常對藥物治療耐受並能存活，從而在原部位或遠端轉移部位再次繁衍，進而導致可檢 測的疾病復發和發病。據信，具有侵入性和轉移能力增加以及藥物耐受性改變等特性的許 多癌腫瘤細胞經歷包括或類似於EMT (上皮-間充質過渡)的形態轉化。經歷EMT的細胞 喪失上皮細胞正常的黏著性並經歷各種改變，包括E-鈣粘蛋白表達和間充質標記物表達 喪失，運動性增加、侵入性增加和對細胞死亡的耐受性增加。目前癌症的主導療法是外科手術、放療和化療。化療方法，例如抗-腫瘤抗生素， 烷化劑、亞硝基脲化合物、長春花_生物鹼、類固醇激素和抗_代謝藥物構成了腫瘤學家可 用療劑的主體。雖然在癌症治療領域已取得了進展，但癌症依然是主要的健康問題。2.血管生成血管生成是在已有毛細血管外形成新血管，其是各種生理學和病理學過程中一系 列至關重要的事件。正常的組織生長，例如胚胎發育、傷口癒合和月經周期的特徵在於依賴新血管形成來供應氧和營養物以及除去廢物。大量不同且無關的疾病也與新血管系統有 關。某些病狀中，血管生成較低，應提高以改善疾病情況。然而，更常見的是，血管生成過度 是各種病狀的重要特徵，包括以細胞增殖不正常或不受控為特徵或與之有關的病狀。涉及 過度血管生成的病狀包括，例如癌症(實體瘤和血液學腫瘤)、心血管疾病(例如動脈粥樣 硬化和再狹窄)、慢性炎症(類風溼性關節炎、克羅恩病)、糖尿病(糖尿病性視網膜病)、銀 屑病、子宮內膜異位、新生血管性青光眼和肥胖症。這些病症可從血管生成的化療抑制中獲益。血管生成過程通常使正常情況下休眠的內皮增殖和遷移，細胞外周基質發生受控 蛋白酶解並且通過產生毛細血管而合成新胞外基質組分。新的胞內和胞間接觸的建立，內 皮細胞形態分化成毛細血管樣管狀網絡支持它們隨後的成熟、支化、重塑和選擇性退化，從 而形成高度組織的功能性微血管網絡。在正常情況下，血管內皮與其周圍基質組分以及與 促血管生成和血管抑制細胞因子和協調生理學血管生成的生長因子的自分泌、旁分泌和兩 側分泌(amphicrine)相互作用在空間和時間上受到嚴格調控。血管生成對腫瘤組織生長至關重要。觀察到腫瘤比正常組織具有更多血管已有 100多年。幾項實驗性研究提示原發性腫瘤生長和轉移需要新生血管形成。與上述良好 協調的正常組織生長過程相反，活性腫瘤生長所需的病理性血管生成通常是持續性和持久 的，血管生成表型的初始獲得是各種實體瘤和血液學腫瘤類型產生的共同機制。不能募集 和維持血管網絡的腫瘤通常在原位保持休眠，就像無症狀的病損。轉移也依賴於血管生成 腫瘤細胞要成功轉移，其通常必須能使用原發性腫瘤的血管系統、在循環中活下來、停在靶 器官的微血管系統中、離開該血管系統、在靶器官中生長並在靶部位誘導血管生成。因此， 血管生成看來是轉移級聯反應開始以及完成所必需的。因此，血管生成對於腫瘤生長和轉移的重要性為化療提供了最佳的潛在靶位。合 適的抗-血管生成劑可通過延遲血管生成的開始(即，阻斷「血管生成開關」)或通過阻斷 許多腫瘤類型特徵性的持續和病灶新血管形成而直接或間接影響腫瘤-相關的血管生成。 現正在多個臨床試驗中積極評估針對腫瘤-相關內皮以及涉及持續的病理性血管生成的 多種分子和細胞過程及靶標的抗-血管生成治療的安全性和效率。然而，迄今為止發現和 /或鑑定到的安全和/或有效的抗血管生成劑有限。3.纖維化纖維化是作為傷口癒合過程的一部分會在受傷組織中發生是纖維組織異常累積。 這種組織損傷可以是物理傷害、炎症、感染、接觸毒素和其它原因所致。纖維化的例子包括 皮膚瘢痕形成、瘢痕瘤、肝纖維化、肺纖維化(例如，矽肺、石棉沉著病)、腎纖維化(包括糖 尿病性腎病)、硬皮病和腎小球硬化症。例如，肝臟(肝)纖維化可作為對慢性肝損傷的傷口癒合反應的一部分而發生。纖 維化可作為血色病、威爾遜病、酒精中毒、血吸蟲病、病毒性肝炎、膽管阻塞、接觸毒素和代 謝紊亂的併發症而發生。據信，這種疤痕組織的形成表示身體試圖包裹受傷的組織。肝纖 維化的特徵在於數量上與正常肝臟中不同的胞外基質累積。不作檢查，肝纖維化會發展成 肝硬化(定義為存在包裹的結節)、肝衰竭和死亡。Li 和 Frieman (Gastroenterol. Hepatol. 14 618-633,1999)總結道，肝纖維化的 實際和提出的治療方案包括去除潛在的誘因(例如，毒素或感染因子)；抑制炎症(使用，例如皮質激素、IL-I受體拮抗劑或其它藥劑)；使用，例如Y幹擾素或抗氧化劑下調星形細 胞活化；促進基質降解；或促進星形細胞凋亡。雖然近年來有所進展，但許多這些方案仍處 於實驗階段，現有的治療目的在於抑制炎症而不是致力於潛在的生物化學過程。因此，本領 域仍需要治療纖維化，包括肝臟和肺纖維化的材料和方法。本領域需要治療異常或不良血管生成和纖維化相關的癌症、疾病的改進方法。本 發明解決了這一需要並提供相關優點。概述I.通過抑制加工的LOX或LOXL來治療本發明提供利用賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶_樣蛋白(LOXL)抑制劑來 預防和治療異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關各種疾病的新方法和相關組合物及試劑 盒。LOX或LOXL可以是全長或加工形式。全長LOX或LOXL是原酶或前肽形式(即，沒有信 號序列)，而加工形式或切割形式是成熟的形式。LOX或LOXL的全長和加工形式均可以有 活性。LOX或LOXL可以是分泌的形式，其也可有活性。抑制LOX或LOXL可有效預防和治療 腫瘤侵入和轉移，和治療異常血管生成相關疾病以及纖維化疾病。一個實施方式提供體內治療或預防對象中腫瘤侵入或轉移的方法，所述方法包括 給予該對象有效量的活性LOX或LOXL的抑制劑。另一實施方式提供體內降低對象中腫瘤生長的方法，所述方法包括給予該對象 有效量的加工LOX或LOXL的抑制劑，從而將腫瘤生長降低至少25%、50%、75%、90%或 95%。在一些實施方式中，所述腫瘤是轉移性腫瘤。還有另一實施方式提供增加或提高具有轉移性腫瘤的對象存活機會的方法，所述 方法包括給予有此需要的對象有效量的加工LOX或LOXL蛋白的抑制劑，從而將所治療對 象的存活機會增加或提高一段時期。例如，該對象的存活可以增加至少10天、1個月、3個 月、6個月、1年、1. 5年、2年、3年、4年、5年、8年或者甚至10年。蛋白酶解加工或切割後LOX或LOXL可以是LOX或LOXL的成熟形式。LOXL的例子 包括但不限於L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4。在一些實施方式中，LOX或LOXL的抑制劑可 以是活性L0X、L0XL2或L0XL4的抑制劑。在一些這樣的實施方式中，LOX或LOXL的抑制劑 可以抑制活性LOX和L0XL2。LOX或LOXL抑制劑可以是，例如針對LOX或LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX 或LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。這些抑制劑可以是非競爭性抑制劑。II.通過抑制LOX和LOXL來治療本發明還提供通過抑制賴氨醯氧化酶(LOX)和一種或多種賴氨醯氧化酶_樣蛋白 (LOXL)來預防和治療異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關各種疾病的新方法和相關組合 物及試劑盒。同時抑制LOX和LOXL可有效預防或治療各種腫瘤的侵入和轉移，並治療異常 血管生成相關疾病和纖維化疾病。—個實施方式提供體內治療或預防對象中腫瘤侵入或轉移的方法，所述方法包括給予該對象有效量的LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑。另一實施方式提供體內降低對象中腫瘤生長的方法，所述方法包括給予該對象有 效量的LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑，從而將腫瘤生長降低至少25%、50%、75%、90%或 甚至95%。根據一些實施方式，所述腫瘤是轉移性腫瘤。
還有另一實施方式提供增加或提高具有轉移性腫瘤的對象存活機會的方法，所述方法包括給予有此需要的對象有效量的LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑，從而將所治療對 象的存活機會增加或提高一段時期。例如，該對象的存活可以增加至少10天、1個月、3個 月、6個月、1年、1. 5年、2年、3年、4年、5年、8年或者甚至10年。LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑可以不同，分別特異性抑制LOX和LOXL。或者， LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑可以是同時抑制LOX和LOXL的相同分子。LOXL可以是，例 如L0XL1、2、3或4。在一些實施方式中，LOXL是L0XL2或4。在某些實施方式中，LOXL是 L0XL2。LOX或LOXL可以是全長或加工形式。LOX或LOXL可以是原酶形式或成熟形式，兩 種形式可以均有活性。LOX或LOXL可以是分泌形式，其也可有活性。LOX或LOXL的加工形 式是蛋白酶解加工或切割後的形式。LOXL的例子包括但不限於L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4。在一些實施方式中， LOX或LOXL的抑制劑可以是活性LOX、L0XL2或L0XL4的抑制劑。在一些這樣的實施方式 中，LOX或LOXL的抑制劑抑制活性LOX和L0XL2。LOX或LOXL抑制劑可以是，例如針對LOX或LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX 或LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。這些抑制劑可以是非競爭性抑制劑。III.組合治療本發明還提供利用賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白(LOXL)的調節 劑(例如，活化劑/激動劑或抑制劑/拮抗劑)來預防和治療異常細胞增殖、血管生成和纖 維化相關疾病，例如癌症、腫瘤、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、肝纖維化、腎纖維化、肺纖維 化、硬皮病、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病的組合物、試劑盒和方法。LOX或LOXL的抑制劑可與其它治療劑，例如化療劑、抗腫瘤生物藥劑、抗血管生成 劑和抗纖維化藥劑組合來預防或治療這些疾病或病症。據信抑制LOX或LOXL可使腫瘤細 胞中上皮-間充質過渡(EMT)減緩或停止，或將間充質-上皮過渡(MET)誘導至低致瘤性 狀態，從而使得腫瘤或患病細胞對化療藥物、抗腫瘤生物藥劑、抗血管生成劑和抗纖維化藥 劑更敏感。通過腫瘤細胞對治療劑的細胞毒性作用致敏，LOX或LOXL的抑制劑與另一種治 療劑的協同性組合可用於防止或抑制腫瘤侵入和轉移、抑制原發性腫瘤生長，還可用於有 效地預防或治療癌症。IV.選擇藥劑在另一方面，本發明提供選擇防止或抑制腫瘤侵入、血管生成和轉移的藥劑的新 方法。根據本發明，抑制賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白(LOXL)可使腫瘤細 胞中上皮-間充質過渡(EMT)減緩或停止，或將間充質-上皮過渡(MET)誘導至低致瘤性 狀態，從而防止或抑制腫瘤侵入、血管生成和轉移並使得原發性腫瘤細胞對其它治療幹預， 例如放療、化療藥物、抗腫瘤生物藥劑、抗血管生成劑和抗纖維化藥劑更敏感。一個實施方式提供選擇腫瘤侵入、血管生成或轉移的抑制劑的方法，所述方法包 括將處於EMT狀態的細胞與LOX或LOXL抑制劑接觸；檢測細胞EMT狀態的改變，其中EMT 狀態降低或從EMT向MET狀態改變表明LOX或LOXL抑制劑是腫瘤侵入、血管生成或轉移的 抑制劑。V.診斷
在還有另一方面，本發明提供利用特異性識別活性或成熟形式賴氨醯氧化酶或賴 氨醯氧化酶_樣蛋白的分子或物質來診斷或監測異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關各 種疾病的新方法和相關組合物及試劑盒。發明人相信加工的LOX或LOXL是腫瘤侵入和轉 移，以及異常血管生成相關疾病和纖維化疾病的至關重要生物標記。加工形式的LOX或LOXL可以是有活性的。LOX或LOXL可以是原酶形式或成熟形式。LOX或LOXL還可以是分泌形式，其也可以是有活性的。一個實施方式提供診斷或監測對象中癌症轉移的方法，所述方法包括評估血液 或腫瘤中加工LOX或LOXL的水平或活性，從而與參比樣品相比，血液或腫瘤中加工LOX或 LOXL水平或活性的改變表明有轉移性腫瘤生長存在。所述改變可以是加工LOX或LOXL水 平或活性的增加或降低。與參比樣品相比，血液或腫瘤樣品中加工LOX或LOXL水平或活性 增加表明有轉移性腫瘤生長存在。另一實施方式提供監測對象對治療，包括L0X/L0XL調節劑，例如癌症、腫瘤、血管 生成和纖維化疾病治療的反應的方法。在另一實施方式中，該方法包括將LOX或LOXL的 調節劑給予該對象後檢測該對象中膠原端肽或羥脯氨酸含量的改變，其中所述改變表明該 LOX或LOXL調節劑對該對象有治療作用。所述改變可以是增加或降低。例如，膠原端肽或 羥脯氨酸含量降低可表示有治療作用。該方法包括將LOX或LOXL的調節劑給予對象後檢測該對象中C-反應活性蛋白質 或其它急性期反應物水平的改變，其中所述改變表明該LOX或LOXL調節劑對該對象有治療 作用。所述改變可以是C-反應活性蛋白質水平的增加或降低。C-反應活性蛋白質水平降 低通常表示LOX活性降低。VI.纖維化的治療另一方面提供了體內預防、治療或緩解對象中纖維化的方法，所述方法包括給予 該對象有效量的賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白(LOXL)抑制劑。LOX或LOXL 的抑制劑可以是活性形式LOX或LOXL的抑制劑。纖維化的示範性形式包括但不限於心臟纖維化、肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、 皮膚瘢痕形成和瘢痕瘤及阿爾茨海默病。在還有其它實施方式中，心臟纖維化與高血壓、高 血壓性心臟病(HHD)、心肌梗塞(Ml)、動脈粥樣硬化和再狹窄相關。腎纖維化可包括但不限於糖尿病性腎病、膀胱輸尿管反流、小管間質性腎纖維 化、腎小球腎炎或(GN)、局灶性節段性腎小球硬化、膜性腎小球腎炎或腎小球毛細血管性 GN。肝纖維化可包括但不限於肝硬化和相關病症，例如慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝 疾病(NAFLD)、酒精性脂肪肝(ASH)、非酒精性脂肪肝(NASH)、原發性膽汁性肝硬變(PBC)、 膽汁性肝硬變和自身免疫性肝炎。肺纖維化包括特發性肺纖維化(EPF)或隱原性纖維化肺 泡炎、慢性纖維形成性間質肺炎、間質性肺病(ILD)和彌散性實質性肺病(DPLD)。也可用本 文所述組合物預防、治療或緩解心臟纖維化、充血性心力衰竭、心肌病、心臟功能的心肌梗 塞後缺陷；動脈粥樣硬化；類風溼性關節炎；青光眼；年齡相關的黃斑變性(溼性AMD和幹 性AMD)；肺氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)；多發性硬化症；和久喘。本文還提供將L0X/L0XL抑制劑局部遞送至纖維化部位的組合物、裝置、系統和試 劑盒。可利用醫學裝置，例如導管和支架來局部遞送，因而實質性降低了全身性遞送這種 L0X/L0XL抑制劑的相關毒性或其它副作用的風險。
可在病理性心臟病症或疾病，例如高血壓、高血壓性心臟病(HHD)、心肌梗塞(MI)、動脈粥樣硬化和再狹窄之前、同時或之後遞送L0X/L0XL抑制劑以防止這種病理學心 髒病症或疾病相關的病理性纖維化的發作、降低其風險或對其再次治療。例如，可在這種病 理性心臟病症或疾病發作後至少1小時、2小時、3小時、5小時或10小時，或1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14 或更多天給予 L0X/L0XL 抑制劑。LOX或LOXL可以是全長或加工形式。LOX或LOXL可以是原酶形式或成熟形式，兩 種形式均有活性。LOX或LOXL可以是分泌形式，其也可有活性。LOX或LOXL的加工形式是 蛋白酶解加工或切割後的形式。LOXL的例子包括但不限於L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4。在一些實施方式中， LOX或LOXL的抑制劑可以是活性LOX、L0XL2或L0XL4的抑制劑。在一些這樣的實施方式 中，LOX或LOXL的抑制劑抑制活性LOX和L0XL2。LOX或LOXL抑制劑可以是，例如針對LOX或LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX 或LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。這些抑制劑可以是非競爭性抑制劑。附圖簡述

圖1是L0X/L0XL基因組和蛋白質組成的示意圖。圖2是含有預測的和測定的N-和0-糖基化位點、二聯核定位信號 (bipartitenuclear localization signal)和前膠原 C-蛋白酶位點的 L0X/L0XL 序列比 對。圖3描述了上皮_間充質過渡及其在侵入和轉移中的作用。圖4是EMT和MET及用於評估細胞的EMT或MET表型的標記的示意圖。圖5是L0X/L0XL在EMT-MET提升或降低中的作用以及EMT-MET細胞的藥物耐受 性或敏感性的示意圖。圖6顯示了用L0XL2轉染MCF-7(低L0XL2)細胞誘導EMT。(A)MCF_7野生型(WT)細 胞和(B)MCF-7-Loxl2.克隆1作E-鈣粘蛋白染色。第一抗體抗-E-鈣粘蛋白(10 μ g/ml)； 第二抗體抗_小鼠_cy3 (紅)；DAPI 核(藍)。(C)MCF_7野生型細胞和(D)MCF-7_Loxl2. 克隆1作羅丹明鬼筆毒環肽肌動蛋白細胞骨架(紅)和DAPI 核(藍)染色。野生型MCF7 顯示上皮表型，強烈E-鈣粘蛋白陽性(膜染色)(A)，肌動蛋白細胞骨架的羅丹明鬼筆毒環 肽染色顯示環形模式(C)。用L0XL2轉染的MCF7改變成間充質表型，喪失E-鈣粘蛋白表達 (B)，以及肌動蛋白細胞骨架重塑(延長、紡錘體形狀、長肌動蛋白纖維)(D)。圖7顯示在MDA-MB-231中通過消除L0XL2來誘導MET-樣改變。(A-B) MDA-MB-231WT 細胞禾口 (C-F)MDA-MB-231shLoxl2 (C, D)庫 1 ； (E, F)庫 2)穩定敲減細胞 作羅丹明鬼筆毒環肽染色(肌動蛋白細胞骨架染色)。WT細胞延長且是紡錘形(A-B)，而 MDA-MB-231shLoxl2穩定敲減細胞的形狀圓且小(C-F)。通過shRNA敲減消除L0XL2後， F-肌動蛋白染色(羅丹明鬼筆毒環肽)從纖絲向環形/細胞邊緣移動。圖8顯示源自穩定CH0-Loxl2細胞的條件化培養基(CM)對MCF-7WT細胞的作用。 (A-B) 30 % SFII培養基中培養的MCF-7細胞350μ 1常規MCF-7完全培養基中的150 μ 1 SFII培養基(用於CH0-Loxl2細胞的培養基)。(C-D) 30%條件化培養基(CM)中的MCF-7 細胞350 μ 1常規MCF-7完全培養基中的CH0-Loxl2的150 μ 1 CM(從3天無血清CM濃縮 22倍)。用CH0-Loxl2細胞的濃縮無血清CM處理MCF-7細胞4天。如肌動蛋白細胞骨架的羅丹明-鬼筆毒環肽染色所示，與用對照條件化培養基處理的細胞(不表達L0XL2的CHO 細胞)(A-B)相比，用L0XL2-表達細胞的條件化培養基處理的MCF-7(C-D)經歷表型改變。 細胞延長，具有長的F-肌動蛋白纖維，這類似於經歷EMT的細胞，而不像顯示更為環狀「肌 動蛋白邊緣」染色的對照處理細胞。這些數據支持L0XL2誘導的EMT-樣改變是由分泌的 (胞外)L0XL2誘導。(E)顯示源自穩定CH0-Loxl2細胞的不同濃度CM對MCF-7WT細胞的 作用和它們的形態學變化。用濃度增加的含L0XL2的CM處理細胞導致EMT-樣表型改變一 致增加。圖9顯示抗-Loxl2mAb可阻斷將MBA_MD_MB_231 (表達高水平的L0XL2) CM禾口 MCF-7WT細胞培育中觀察到EMT表型。(A，C，E)用MCF-7細胞的CM(培養)的MCF-7WT細 胞，(B, D，F)用MBA-MD-231細胞的CM(培養)的MCF-7WT細胞，其中(C-F)顯示用CM(培 養)的細胞，所述CM在加入MCF-7細胞之前與抗-LoX12mAb預培育分別是(C，D) :mAb 18 號和(E，F) :mAb 423 號，各種濃度的抗體(C，E) :2yg;(D,F) :4ygo圖10顯示培育MDA-MB-231CM與MCF-7細胞得到的EMT-樣改變的特異性阻斷作 用。(A) 「預-培育」收集並澄清的CM與抗Loxl2 418號或422號mAb預培育(室溫下 (RT) 1. 5小時)，然後施加在MCF-7細胞上4天。(B) 「未預-培育」:CM與MDA-MB-231細胞 在有抗-Loxl2 418號或422號mAb存在下(培育)(3天)，然後在收集和澄清之前，施加於 MCF-7上4天。(A)和(B)中EMT-樣形態均被阻斷。作為非-EMT-樣對照，(C)用MCF-7細 胞的3天條件化培養基(CM)處理MCF-7細胞4天，其具有WT MCF-7細胞典型的圓形和扁 平形態。作為EMT-樣對象，⑶用未與任何LoX12mAb培育(培育4天)的MDA231細胞的 3天CM處理MCF-7細胞和(E)用與抗-肌動蛋白抗體預培育(培育4天)的MDA231細胞 的3天CM處理MCF-7細胞。(D)和(E)中均見到紡錘形細胞的EMT-樣形態。圖11顯示用Hs578t腫瘤細胞(表達高水平L0XL2)和抗_Loxl2mAb的條件化培 養基處理MCF-7 (低L0XL2)誘導出的EMT-樣表型改變可阻斷觀察到的EMT表型。(A)將 MCF-7細胞的3天條件化培養基(CM)的條件化培養基施加於MCF-7細胞4天，其具有WT MCF-7細胞典型的圓形和扁平形態。(B，C，D)將Hs-578t細胞(L0XL2高)的條件化培養基 施加於MCF-7細胞(L0XL2低/陰性)。(A-D)細胞作羅丹明-鬼筆毒環肽(F-肌動蛋白， 紅)和DAPI(核，藍)。確認這些作用是L0XL2，而不是其它蛋白質特異性的，將條件化培養 基與4yg(C)作為負對照的抗β-肌動蛋白抗體或(D)抗L0XL2抗體混合。當Hs578t細 胞的條件化培養基先與抗-L0XL2抗體預培育再加入MCF7細胞時，EMT-樣表型被阻斷(D)。 用抗β-肌動蛋白抗體以相同方式處理CM未能阻斷MCF7細胞中的表型改變(C)，支持了由 於將抗體加入CM，L0XL2的阻斷作用是特異性而不是非特異性作用。圖12顯示用MDA MB 231細胞的條件化培養基(CM)培育的SW620細胞經歷EMT 表型改變。(A-B) SW620細胞與MDA MB 231細胞的條件化培養基(CM)培育，20倍和40倍。 箭頭標出了經歷EMT-樣表型的SW620細胞形態。72小時後，細胞經歷EMT表型(由羅丹明 鬼筆毒環肽染色所示)改變。(C-D) 72小時後，與293野生型細胞的條件化培養基(CM)培 育的SW620細胞維持典型的「正常」圓形，20倍和40倍。MDA MB 231或293細胞的條件化 培養基(CM)是3天CM。圖13顯示與293的CM :Loxl2. MCD 轉染物培育的SW620細胞。(A，C，E)顯示72 小時後經歷EMT表型(由羅丹明鬼筆毒環肽染色所示)改變的細胞(50% CM:50%競爭培養基)。(B, C, Ε)分別是(A，C，E)的放大圖，其中箭頭標出經歷EMT-樣表型的SW620細胞 的形態。293 :Loxl2. MCD是經轉染並表達L0XL2片段(稱為L0XL2-MCD，其包括賴氨心氧 化酶結構域)的293細胞。看來單用L0XL2的該部分足以誘導至少部分EMT-樣表型改變。 不是所有細胞均經歷表型改變，但明顯可區分各組細胞。圖14是一幅示意圖(A)未切割和胞內L0X/L0XL及切割的活性L0X/L0XL，(B)活 性L0X/L0XL的細胞攝取和活性促進了 EMT，而當結合於抑制劑，例如抗體時，L0X/L0XL的攝 取被阻斷，從而降低了 EMT和/或增加MET。圖15顯示3T3細胞中的表面相關LOX活性受到BAPN、L0X mAb和LOX siRNA抑制。 依據Amplex Ultra Red與5- 二氨基戊烷底物的氧化，通過辣根過氧化物酶_偶連的螢光 測定方法定量測定到3T3細胞表面明顯有特異性LOX活性。不可逆小分子抑制劑BAPN、用 LOX肽產生的單克隆抗體和特異性靶向LOX mRNA的siRNA寡核苷酸抑制了 LOX活性。圖16顯示了細胞系中佔優勢的L0XL2的兩種形式。(A)細胞系中L0XL2蛋白表達 和分泌。乳腺腫瘤細胞系Hs578t、MDA-MB-231、MCF7 ；肺腫瘤細胞系A549。(B)通常檢測 到的L0XL2形式的示意圖。圖17顯示從CHO細胞純化的L0XL2蛋白表達。CHO細胞中表達Myc-His標記的 (C-末端)L0XL2。主要有兩種顯示(如圖16所示)前肽L0XL2和在SRCR2和SRCR3之間 切割的L0XL2。CHO細胞中還分泌L0XL2。圖18顯示通過層析分離L0XL2諸種類。(A)分離的L0XL2諸種類的層析。(B)證 實L0XL2諸種類的分離的蛋白質印跡分析。圖19顯示表明L0XL2的兩種形式均有活性的體外酶反應。圖20是L0XL2的IC50圖。利用活性L0XL2和L0XL2抗體，AB0023在體外酶試驗 中進行L0XL2抑制。Ml和M20均是AB0023。Asc =腹水產生的，未標記的=生物反應器產 生的，相同的結果。劑量反應顯示隨著抗體濃度升高活性降低。L0XL2製品包括兩種加工形 式(前肽和成熟的)。圖21顯示了 L0XL2的抑制模式。(A)AB0023是L0XL2的非競爭性抑制劑，而(B) β APN是L0XL2的競爭性抑制劑。E =酶，P =產物，S =底物，Ι/Α =抑制劑/抗體。圖22顯示具有酶活性的L0XL2的最小催化區(MCD)。(A)是L0XL2MCD構建物的 示意圖。(B) L0XL2MCD有效分泌。(C) L0XL2MCD具有酶活性。圖23描述了抗-LOX抗體的內在化和攝取。利用抗體在肝腫瘤細胞中進行LOX的 免疫螢光分析。(A-B)用SiNT轉染Hs578t細胞(非靶向敲減對照)，與mAb培育3小時。 Lox定位於胞質溶膠中。(C-D)用siLOX轉染的Hs578t細胞與mAb培育3小時。LOX蛋白 水平降低，從而支持siLOX的消除作用。LOX蛋白也在細胞的周質中。用M37(A，C)或M64 抗體(B，D)檢測L0X。獲得L0X12mAb的類似內在化和攝取結果。因此，這些結果支持染色 是LOX或L0XL2特異性的這一結論。圖24顯示㈧透化或⑶未透化細胞的匯合Hs578t細胞和抗-LOX抗體內在化和 攝取。細胞是匯合後2天，以50，000個細胞/孔接種在8室載玻片後4天。細胞與抗-Lox M64培育3小時，用Alexa 488-綠檢測。獲得LoX12mAb的類似內在化和攝取結果。圖25顯示用siRNA轉染的Hs5 78t中抗-LOX抗體的內在化和攝取，Hs578t細胞 用(A，B) SiN或(C，D) siLOX轉染並與LOX抗體培育5小時。轉染後7天用抗-Lox M64(A，C)或抗-膠原I(B，D)檢測以取得細胞的圖像。獲得LoX12mAb的類似內在化和攝取結果。圖26顯示LOX P印2M64的特異性。篩選mAb抑制細胞侵入和經(A)膠原I和/ 或(B)膠原IV基質遷移的能力。(C)在小室載玻片上檢測M64Mab對Hs578T細胞的特異性 (匯合後第6天)。(D)與膠原相比，LOX定位於小室載玻片上的Hs578T細胞(匯合後 第6天)。細胞未透化處理，圖像放大63倍。圖27顯示從第0天到匯合後第15天的Hs578T細胞時程研究。圖28描述了利用L0XL2和LOX抗體對轉移性乳腺腫瘤組織(淋巴結)樣品的免 疫組化(IHC)分析。利用乳腺TMA:CC08-21-002(賽伯第公司(Cybrdi))，一種轉移性非特 異性浸潤導管癌樣品進行IHC，其中(A，B)L0XL2 ;(C, D) Ki67，一種細胞增殖標記和(E，F) 及L0X。腫瘤細胞均表達L0XL2和L0X，有證據表明基質細胞均表達L0XL2和L0X，(棕色染 色)。(A，C，E) 20 倍放大；(B, E，F) 40 倍放大。圖29描述了利用L0XL2和LOX抗體對原發性乳腺腫瘤樣品的免疫組化(IHC)分 析。利用乳腺TMA :CC08-21-002 (賽伯第公司)，一種非特異性浸潤導管癌-II級樣品進行 IHC，其中(A，B)L0XL2 ;(C，D)Ki67，一種細胞增殖標記和(E，F)及L0X。原發性乳腺腫瘤中 L0XL2和LOX共表達，在腫瘤細胞中強烈檢測到L0XL2蛋白，LOX蛋白主要在直接圍繞腫瘤 細胞的基質細胞(基質成纖維細胞和/或基質成纖維母細胞)中檢測到。(A，C，E)放大20 倍；(B, E，F)放大40倍。圖30顯示了利用埃飛矩陣公司(Affymetrix，Inc)提供的DNA晶片檢測出與正常 組織相比，腫瘤和纖維化疾病組織過表達LOX和L0XL2的mRNA水平。圖31描述了與同一患者的相鄰正常組織中的表達相比，肺腺癌樣品中L0X/L0XL 的表達。A)L0X、LOXLl、L0XL2、L0XL4, B)的數據與A)相同，其中只有LOX和L0XL2作圖。 T 腫瘤；N:正常。圖32描述了肺腺癌樣品中根據持家基因RPL19標準化的L0X/L0XL表達。腫瘤和 毗鄰的正常組織分別作圖，(A)L0X、L0XL1、L0XL2、L0XL4，(B)依據與(A)相同的數據只對 LOX和L0XL2作圖。T 腫瘤；N:正常。圖33顯示了低氧MCF-7細胞中LOX和L0XL2的共表達。正常情況下表達極低水 平LOX和L0XL2的MCF7細胞中，LOX和L0XL2均由低氧誘導(上調倍數與含氧正常條件下 培養的細胞繪製於左軸)。細胞在調節至2% O2,5% CO2 (與含氧正常約20% O2,5% CO2) 的組織培養箱中培養3天。MCF5 乳腺腫瘤細胞系。圖34顯示人細胞系中賴氨醯氧化酶家族成員的mRNA水平。對100ng/rxn RNA 進行一步qRT-PCR。MCF7、MB231、BT549、Hs578t 乳腺腫瘤細胞系；A549 肺腫瘤細胞系； HT1080 纖維肉瘤細胞系；HFF 成纖維細胞細胞系。圖 35 是圖 36_39 中 L0X/L0XL2 的(A) shRNA 和(B) siRNA 敲減的 RTPCR 驗證。(C) 還利用轉染了 Lox、Loxl2、Lox/Loxl2siRNA的MDA-MB 231細胞進行了遷移試驗。與非-靶 向siRNA對照相比，Lox siRNA敲減抑制了 52%的MDA MB 231細胞侵入特性。(D) (C)中 所示MDA MB 231細胞中siRNA敲減的支持性Taqman數據。圖36顯示shL0XL2細胞的埃洛替尼(erlotinib)敏感性。shL0XL2敲減細胞系 (shL0XL2. 195)顯示細胞活力降低約7倍。將計算的IC50與對照細胞系(sh對照)作比 較。親代細胞系是MDA-MB-231。生長百分比(活力)繪製於左軸。埃洛替尼代表了藥物級EGFR抑制劑，包括吉非替尼(gefitinib)。圖37顯示MDA-MB-23IshLOX細胞系的氨甲蝶呤(MTX)敏感性。生長百分比(活 力)繪製於左軸。與對照細胞系(GFP對照)相比，shLOX敲減細胞系顯示活力降低約2倍。 圖38顯示siL0X/L0XL2或LOX抗體(處理)的順鉬(DDP)敏感性。抗-LOX(處 理)的(A)MDA-MB-231siL0X和siL0XL2細胞系或(B)MiaCaPa 2細胞系以及它們對DDP的 敏感性。活力繪製於左軸。與對照細胞系(非-靶向對照)相比，siLOX和siL0XL2敲減 細胞系的活力降低約25%。(C)DDP對用或不用抗-LOX處理的MiaCaPa 2和其它細胞系的 IC50。(D)與未處理(Unt)相比，單用L0X(M64)或L0XL2 (M20)抗體的生長抑制作用。圖 39 顯示 MDA-MB-231siRNA 或 shRNA 細胞系的阿黴素敏感性。(A) siLOX,siL0XL2 和siL0X/L0XL2細胞系。活力繪製於左軸。siLOX、siL0XL2和siL0X/siL0XL2雙重敲減細 胞系顯示對阿黴素的敏感性增加，其中與親代細胞系(對照)相比，計算的IC50顯示降低 27%-55%。(B)顯示與(C)MD A-MB_231shL0X和shL0XL2細胞系的阿黴素敏感性相比， MDA-MB-231siL0X、siL0XL2和siL0X/L0XL2敲減的阿黴素敏感性。活力繪製於左軸。圖40顯示植入裸鼠腎下被膜的MCF7腫瘤細胞和L0XL2轉染MCF7細胞的移植體 大小平均增益。使移植體形成腫瘤，16天。L0XL2穩定轉染入MCF7 (MCF7-L0XL2)產生比野 生型MCF7細胞觀察到的大得多/更具侵襲性的原發性腫瘤。圖41顯示植入裸鼠腎下被膜的HT1080腫瘤細胞的移植體大小平均增益。使移植 體形成腫瘤，10天。用各種抗體(30mg/kg，腹膜內注射)處理小鼠，每周兩次。用以下物質 處理各組(每組5隻小鼠)=ACl 負對照抗體；M64、M5或Mll 「非-L0XL2，，抗體(抗-LOX 抗體)；或AB23:L0XL2抗體。利用AB23的趨勢在該侵襲性原發性腫瘤模型中平均腫瘤大 小約低25%。圖42描述了賴氨醯氧化酶的酶學特徵。L0X/L0XL酶通過桌球機制起作用，米-門 二氏動力學描述了這種機制。圖43描述了酶促抑制作用的普通模式。圖44描述了酶促抑制作用，例如L0XL2的抑制作用的模式。詳述I.通過抑制LOX或LOXL來治療本發明提供利用賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶_樣蛋白(LOXL)加工形式 的抑制劑來預防和治療異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關各種疾病的新方法和相關組 合物及試劑盒。雖然不想受理論的束縛，但抑制加工形式的LOX或LOXL能有效預防或治療腫瘤侵 入和轉移，並且治療異常血管生成相關疾病和纖維化疾病。一個實施方式提供體內治療或預防對象中腫瘤侵入或轉移的方法，所述方法包括 給予該對象有效量的LOX或LOXL的抑制劑。另一實施方式提供體內降低對象中腫瘤生長的方法，所述方法包括給予該對象 有效量的加工LOX或LOXL的抑制劑，從而將腫瘤生長降低至少25%、50%、75%、90%或 95%。根據一些實施方式，所述腫瘤可以是轉移性腫瘤。還有另一實施方式提供增加或提高具有轉移性腫瘤的對象存活機會的方法，所述 方法包括給予有此需要的對象有效量的加工LOX或LOXL的抑制劑，從而將所治療對象的存活機會增加或提高一段時期。在一些實施方式中，該對象的存活可以增加至少10天、1個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或者甚至10年。LOX或LOXL的加工形式可以是有活性的。LOX或LOXL還可以是分泌形式，其也可 有活性。活性LOX或LOXL可以是蛋白酶解加工或切割後的成熟形式。LOXL的例子包括但 不限於L0XL1、L0XL2、L0XL3和L0XL4。在一些實施方式中，LOX或LOXL的抑制劑是活性 LOX、L0XL2或L0XL4的抑制劑。例如，LOX或LOXL的抑制劑抑制活性LOX和活性L0XL2。LOX或LOXL抑制劑可以是針對LOX或LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX或 LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。在一些實施方式中，LOX或LOXL抑制劑是特異性結合LOX或LOXL中某區域的抗 體，所述區域具有選自下表1和2所示SEQ ID NO :1_18的胺基酸序列。如下文和實施例部分所述，活性LOX或LOXL的抑制劑(例如，小分子或抗體)可 用於抑制腫瘤侵入、血管生成或轉移，還可用於治療癌症、腫瘤和異常血管生成相關疾病以 及纖維化疾病。II.通過抑制LOX和LOXL來治療本發明還提供利用加工形式的賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白 (LOXL)的抑制劑來預防和治療異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關各種疾病的新方法和 相關組合物及試劑盒。同時抑制LOX和LOXL可有效預防或治療各種腫瘤的侵入和轉移，並治療異常血管 生成相關疾病和纖維化疾病。一個實施方式提供體內治療或預防對象中腫瘤侵入或轉移的方法，所述方法包括 給予該對象有效量的LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑。另一實施方式提供體內降低對象中腫瘤生長的方法，所述方法包括給予該對象有 效量的LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑，從而將腫瘤生長降低至少25%、50%、75%、90%或 甚至95%。根據一些實施方式，所述腫瘤可以是轉移性腫瘤。還有另一實施方式提供增加或提高具有轉移性腫瘤的對象存活機會的方法，所述 方法包括給予有此需要的對象有效量的LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑，從而將所治療對象 的存活機會增加或提高一段時期。在一些實施方式中，該對象的存活可以增加至少10天、1 個月、3個月、6個月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或者10年。LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑可以不同，分別特異性抑制LOX和L0XL。或者，LOX 的抑制劑和LOXL的抑制劑可以是同時抑制LOX和LOXL的相同分子。在一些實施方式中， LOXL是LOXLl、2、3或4。在一些這樣的實施方式中，LOXL是L0XL2或4，例如LOXL是L0XL2。LOX或LOXL的抑制劑任選抑制蛋白酶解加工或切割後的LOX或LOXL的形式。LOX 或LOXL可以是原酶形式或成熟形式。LOX或LOXL可以是活性形式。全長或加工形式的LOX 或LOXL可以有活性。LOX或LOXL的抑制劑任選抑制LOX或LOXL的分泌形式。LOX或LOXL抑制劑可以是針對LOX或LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX或 LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。在一些實施方式中，LOX或LOXL抑制劑是特異性結合LOX或LOXL中某區域的抗 體，所述區域具有選自下表1和2所示SEQ ID NO :1_18的胺基酸序列。
如下文和實施例部分所述，LOX或LOXL的各種抑制劑(例如，小分子或抗體)可 用於抑制腫瘤侵入、血管生成或轉移，還可用於治療癌症、腫瘤和異常血管生成相關疾病以 及纖維化疾病。III.組合治療 本發明還提供利用賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白(LOXL)的調節 劑來預防和治療異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關各種疾病的新方法和相關組合物及 試齊U盒。如下文所詳述的，抑制LOX或LOXL可使腫瘤細胞中上皮-間充質過渡(EMT)的進 程減緩或停止，或將間充質-上皮過渡(MET)誘導至低致瘤性狀態，從而使得腫瘤或患病細 胞對放療、化療藥物、抗腫瘤生物藥劑、抗血管生成劑和抗纖維化藥劑更敏感。IV.詵擇藥劑本發明提供選擇防止或抑制腫瘤侵入、血管生成和轉移的藥劑的新方法。這些藥 劑可單用或與其它治療劑聯用以預防或治療異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關疾病， 例如癌症、腫瘤、糖尿病性視網膜病、黃斑變性、硬皮病、肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、硬 皮病、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病本發明提供選擇腫瘤侵入、血管生成或轉移的抑制劑的方法，所述方法包括將處 於間充質-上皮過渡(EMT)狀態的細胞與賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白 (LOXL)的抑制劑接觸；檢測細胞EMT狀態的改變，其中EMT狀態降低或從EMT向MET狀態 改變表明LOX或LOXL抑制劑是纖維化、腫瘤侵入、血管生成或轉移的抑制劑。因此，本文還 提供採用EMT-MET試驗篩選有助於腫瘤細胞中EMT向MET過渡的L0X/L0XL抑制劑的方法。不想受理論的束縛，但LOX和LOXL在EMT中的作用與腫瘤細胞攝取活性LOX或 L0XL，從而LOX或LOXL能與相關胞內輔因子相互作用有關；抑制LOX或LOXL能使腫瘤細胞 中EMT的進程減緩或停止，或將MET誘導至低致瘤性狀態，從而防止或抑制腫瘤的侵入、血 管生成和轉移，並使得原發性腫瘤細胞對其它治療幹預，例如放療、化療藥物、抗腫瘤生物 藥劑、抗血管生成劑和抗纖維化藥劑更敏感。細胞的EMT狀態的特徵在于波形蛋白或纖連蛋白的陽性染色，E-鈣粘蛋白染色水 平低和F-肌動蛋白的鬼筆毒環肽染色顯示的肌動蛋白細胞骨架延長及重塑。因此，可通過 測量或檢測波形蛋白或纖連蛋白染色降低、E-鈣粘蛋白染色增加和/或F-肌動蛋白的鬼筆 毒環肽染色顯示的肌動蛋白細胞骨架重塑來監測EMT狀態的降低或從EMT向MET的過渡。任選可採用體外或體內腫瘤侵入或遷移來評估細胞的EMT或MET表型，因為侵襲 性和遷移能力增加與EMT相關。例如，可採用體外傷口癒合或刮擦試驗來監測從EMT向MET 狀態的過渡，因為處於EMT狀態的細胞更具侵襲性和遷移性，從而比侵襲性或遷移較弱的 細胞更快地填充擦痕。 如下文和實施例部分所述，可採用EMT-MET過渡試驗檢驗各種LOX或LOXL抑制劑 (例如，小分子或抗體)抑制腫瘤侵入、血管生成或轉移的能力。抑制全長或加工形式的LOX 或LOXL可有效預防或治療治療侵入和轉移。因此，本文還提供篩選、選擇和設計用於抑制 活性形式LOX或LOXL的候選化合物的方法，和產生抵禦活性形式LOX或LOXL的抗體的方法。 V.診斷
本發明提供利用特異性識別加工形式賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋 白(LOXL)的分子或藥劑來診斷或監測各種異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關疾病的 新方法和相關組合物及試劑盒。不想受理論的束縛，加工形式的LOX或LOXL是腫瘤侵入和 轉移以及異常血管生成相關疾病和纖維化疾病的重要生物標記。一個實施方式提供診斷或監測對象中癌症轉移的方法，所述方法包括評估血液或 腫瘤中加工LOX或LOXL的水平或活性，從而與參比樣品相比，血液或腫瘤中加工LOX或 LOXL的水平或活性改變表明存在轉移性腫瘤生長。所述改變可以是加工LOX或LOXL水平 或活性的增加或降低。與參比樣品相比，加工LOX或LOXL水平或活性增加表明存在轉移性 腫瘤生長。如下文詳述的，可通過各種方法評估加工LOX或LOXL的水平，所述方法包括但不 限於利用特異性結合加工形式LOX或LOXL的抗體的免疫組化方法。可採用各種方法，包 括但不限於產色和螢光計試驗來檢測活性LOX或LOXL的酶活性。VI.治療纖維化本文還提供利用活性形式賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白(LOXL) 的抑制劑來預防和治療各種纖維化相關疾病的組合物、方法和試劑盒。一方面提供治療對象中病理性心臟病症或疾病的方法，所述方法包括給予該對 象有效量的LOX或LOXL抑制劑。例如，病理性心臟病症或疾病可以是高血壓、高血壓性心 髒病(HHD)、心肌梗塞(Ml)、動脈粥樣硬化或再狹窄相關。另一方面提供治療對象中病理性心臟病症或疾病的方法，所述方法包括在不良 心臟事件之前、同時或之後給予該對象有效量的LOX或LOXL的抑制劑。所述不良心臟事件 可以是心肌梗塞，例如急性心肌梗塞。可在不良心臟事件之前、同時或之後給予LOX或LOXL的抑制劑。例如，可在心肌 梗塞後至少1小時、2小時、3小時、5小時或10小時，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14或更多天給予所述抑制劑。可將LOX或LOXL的抑制劑局部遞送至不良心臟事件所致的纖維化部位。還有另一方面提供預防或治療對象中病理性心臟病症或疾病的方法，包括包含 LOX或LOXL抑制劑的組件。該組件可以是摻入LOX或LOXL抑制劑的支架，可以是分子量低 於500道爾頓的小分子，例如β-氨基丙腈(BAPN)。可將抑制劑包被在支架上。或者，該裝置可包含將LOX或LOXL抑制劑局部遞送至不良心臟事件所致心臟纖維 化部位的導管。還有另一方面提供試劑盒，其裝有包含藥學上可接受的賦形劑配製的LOX或 LOXL抑制劑的藥物組合物；和如何利用該藥物組合物治療或預防病理性心臟病症或疾病 的使用說明書。還提供了用於治療或預防對象中纖維化相關疾病的方法、組合物和試劑盒，包括 給予該對象有效量的LOX或LOXL抑制劑。纖維化相關疾病可選自肝纖維化、腎纖維化、肺 纖維化、皮膚瘢痕和瘢痕瘤形成以及阿爾茨海默病。LOX或LOXL的抑制劑可以是活性LOX或LOXL的抑制劑。活性LOX或LOXL可以是 蛋白酶解加工或切割後的成熟形式LOX或LOXL。LOXL的例子包括但不限於L0XL1、L0XL2、 L0XL3和L0XL4。LOX 或LOXL的抑制劑可以是活性L0X、L0XL2或L0XL4的抑制劑。在一些實施方式中，LOX或LOXL的抑制劑同時抑制活性LOX和活性L0XL2。LOX或LOXL抑制劑可以是針對LOX或LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX或 LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。在某些實施方式中，LOX或LOXL抑制劑是特異性結合LOX或LOXL中某區域的抗 體，所述區域具有選自下表1和2所示SEQ ID NO :1_18的胺基酸序列。 如下文和實施例所詳述的，可利用LOX或LOXL的各種抑制劑(例如，小分子或抗 體)。1.腕酉細捕禾_糧氧垂舶本文所用的術語「賴氨醯氧化酶」指催化以下反應的酶肽基-L-賴氨醯_肽 +02+H20 —肽基-醛基賴氨醯(allysyl)-肽+ΝΗ3+Η202。賴氨醯氧化酶(EC 1. 4. 3. 13)的 其它同義詞包括蛋白質_賴氨酸6-氧化酶和蛋白質-L-賴氨酸氧6-氧化還原酶(脫氨 基作用)。參見，例如 Harris 等，Biochim. Biophys. Acta 341:332-44(1974) ；Rayton 等， J. Biol. Chem. 254 :621_26 (1979) ；Stassen, Biophys. Acta 438 :49_60 (1976)。LOX 是在其 活性中心具有酪氨醯醌的賴氨醯加成物的含銅醌蛋白，其催化肽基賴氨酸氧化以形成肽基 α _氨基己二 _ S -半醛。一旦形成，該半醛可與鄰近的醛或其它賴氨醯基團自發縮合以形 成鏈內和鏈間交聯。參見，例如Rucker等，Am. J. Clin. Nutr. 67 :996S_1002S(1998)。賴氨 醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白的例子包括具有與以下序列之一表達或翻譯的多肽基 本上相同的胺基酸序列的酶EMBL/GenBank登錄號M94054 ；AAA59525. Ι-mRNA ；S45875 ； AAB23549. Ι—mRNA ；S78694 ；AAB21243. Ι—mRNA ；AF039291 ；AAD02130. Ι—mRNA；BC074820 ； AAH74820. Ι-mRNA ；BC074872 ；AAH74872. Ι-mRNA ；M84150 ；AAA59541. 1-基因組 DNA。LOX 的 一種實施方式是人賴氨醯氧化酶(hLOX)前蛋白原。LOXL 酶樣酶或蛋白的例子見 Molnar 等，Biochim Biophys Acta. 1647 220-24(2003) ；Csiszar, Prog. Nucl. Acid Res. 70 1-32 (2001)；和 2001 年 11 月 8 日公布 的TO 01/83702，所有這些文獻通過引用納入本文。(在這三份出版物中應注意「L0XL1」稱 為「L0XL」，而在本發明中，利用「L0XL」總體上指代賴氨醯氧化酶-樣蛋白，不只是L0XL1)。 這些酶包括 L0XL1，由 GenBank/EMBL BC015090 保藏的 mRNA 編碼；AAH15090. 1 ；L0XL2,由 GenBank/EMBL U89942 保藏的 mRNA 編碼；L0XL3，由 GenBank/EMBLAF282619 保藏的 mRNA 編 碼；AAK51671. 1 ；和 L0XL4，由 GenBank/EMBLAF338441 保藏的 mRNA 編碼；AAK71934. 1。「賴氨醯氧化酶」或LOX還包括基本上保留了其催化賴氨醯殘基脫氨基作用的酶活 性的功能片段或衍生物。功能片段或衍生物通常保留其賴氨醯基氧化活性的至少50%。在 一些實施方式中，功能片段或衍生物通常保留其賴氨醯基氧化活性的至少、或60%、70%、 80%、90%、95%、99%或100%。賴氨醯氧化酶還可包括不實質性改變其活性的保守性氨 基酸取代。本領域技術人員已知合適的保守性胺基酸取代，通常可作出這種取代而不改變 所得分子的生物學活性。本領域技術人員知道在多肽的非必需區域進行單胺基酸取代通常 不會實質性改變生物學活性。參見，例如Watson等，Molecular Biology of the Gene (基 因的分子生物學)，第 4 版，1987，BC 出版公司(The Benjamin/Cummings Pub. Co.)，第 224 頁。下文提供了一些賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶_樣蛋白例子的細節。賴氨醯氧化酶是含銅的胺氧化酶，其將伯胺底物氧化成反應活性醛。賴氨醯氧化酶催化膠原中肽基賴氨酸和羥基賴氨酸殘基以及彈性蛋白中肽基賴氨酸殘基的氧化脫氨 基作用，其對於胞外基質的形成至關重要。得到的肽基醛自發縮合併經歷氧化反應以形成 胞外基質的正常結構完整性所需的賴氨酸-衍生共價交聯。過氧化氫(H202)和銨的釋放量 與肽基醛產物成化學計量關係。參見，例如Kagan等，J. Cell. Biochem. 88 =660-72(2003)。 LOX的主要活性是在細胞外氧化膠原和彈性蛋白中的特定賴氨酸殘基，但 它還可在胞內起作用，從而可能調節基因表達(Li等，Proc. Natl. Acad. Sc i. USA 94 12817-12822 (1997)，Giampuzzi 等，J. Biol. Chem. 275 :36341_36349 (2000))。 此夕卜， LOX誘導單核細胞、成纖維細胞和平滑肌細胞的趨化性(Lazarus等，Matrix Biol. 14 727-731 (1995) ；Nelson 等，Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 188 :346_352 (1988))。LOX 本身可 由許多生長因子和類固醇，例如TGF-β、TNF-α和幹擾素誘導(Csiszar，Prog. Nucl. Acid Res. 70 :1-32(2001))。最近的研究將不同生物學功能，例如發育調控、腫瘤抑制、細胞運動 性和細胞衰老中的其它作用歸於L0X。LOX及其最近發現的氨基氧化酶家族，LOX-樣(LOXL) 可在它們的胞內和胞外定位中起重要作用。已知人和小鼠中存在5種不同的賴氨醯氧化酶，LOX和四種LOX相關或LOX-樣蛋 白(L0XL、L0XL2、L0XL3、L0XL4)，出於本發明的目的，統稱為「L0X/L0XL」。賴氨醯氧化酶的 5種形式位於5種不同染色體上。這些家族成員顯示在結構和功能上有一定重疊，但顯示的 功能還是不同。例如，誘變所致小鼠中靶向LOX缺失看來在分娩時是致命的(Hornstra等， J. Biol. Chem. 278 14387-14393 (2003))，而 LOXL缺陷不導致嚴重的發育表型(Bronson 等， Neurosci. Lett. 390 :118_122(2005))。LOX具有高度保守的蛋白質結構域，在包括人、小鼠、大鼠、雞、魚和果蠅在內的幾 個物種中是保守性的。人LOX家族具有含205胺基酸LOX催化結構域的高度保守C-末端區 域。保守區域含有銅結合的(Cu)、保守性細胞因子受體樣結構域(CRL)和賴氨醯-酪氨醯 醌輔因子位點(LTQ)。預測的胞外信號序列以陰影框出。類似地，12個半胱氨酸殘基也是 保守性的，其中2個位於前多肽原區域內，而10個在LOX的催化活性加工形式中(Csiszar， Prog. Nucl. Acid Res. 70 1-32 (2001)) 保守區域還包括纖連蛋白結合結構域。LOX的前多肽原區域含有信號肽，經切割(切割位點估計在Cys21-Ala22之間) 產生信號序列肽和48kDa的胺基酸前肽形式L0X，本文也稱為全長形式。該前肽在通過 高爾基體時是N-糖基化的，其分泌入胞外環境，金屬內切蛋白酶(一種前膠原C-蛋白 酶)在Glyl68-Aspl69之間切割該酶原或前肽，該蛋白酶是Bmpl、Till和Tl 12基因的產 物。BMP I (骨形態發生蛋白I)是將該前肽加工成功能性30kDa酶和ISkDa前肽的前膠原 C-蛋白酶。編碼該前肽的序列是中等(60-70%)保守的，而編碼該酶原中包含活性位點 的C-末端30kDa區域的序列是高度(約95% )保守的(Kagan和Li，J. Cell. Biochem. 88 660-672(2003) ；Kagan 等，J. Cell Biochem. 59 :329_38 (1995))。隨後還除去了 N-糖基單 位。相似的潛在信號肽預計在L0XL、L0XL2、L0XL3和L0XL4的氨基末端。對於L0XL， 預計的信號切割位點介於Gly25-Gln26之間；對於L0XL2，介於Ala25-Gln26之間；對 於L0XL3，介於Gly25-Ser26之間。前-膠原和前-LOX中BMP-I切割的共有(位點) 介於Ala/Gly-Asp之間，其後常有酸性或荷電殘基。產生加工LOXL的潛在切割位點是 Gly303-Asp304，然而，其後是非典型的Pro。L0XL3還在Gly447_Asp448具有潛在的切割位點，其後是Asp，在此位點進行加工可產生大小與成熟LOX相似的成熟肽。還在L0XL4內鑑定到BMP-I的潛在切割位點，位於殘基Ala569-Asp570處(Kim等，J. Biol. Chem. 278 52071-52074(2003))。與LOXL家族的其它成員類似，L0XL2也可經蛋白酶解加工並分泌入 培養基(Akiri 等，CancerRes. 63 1657-1666 (2003))。LOX和LOXL中已知不共有的特徵是富含清除受體半胱氨酸(SRCR)結構域。LOX 和LOXL缺乏SRCR結構域，而L0XL2、L0XL3和L0XL4各在N-末端具有4個SRCR結構域。 SRCR結構域在分泌型、跨膜或胞外基質蛋白質中發現。還知道SRCR結構域在許多分泌型 和受體蛋白中介導配體結合(Hoheneste 等，Nat. Struct. Biol. 6 228-232 (1999) ； Sasaki 等，EMB0J. 17 :1606-1613(1998))。LOXL的另一獨特結構域是存在富含脯氨酸的結構域 (Molnar 等，Biochimica Biophsyica Acta 1647:220—224(2003))。LOX和各種LOXL的組織分布也可能不同。LOX在心臟、胎盤、睪丸、肺、腎臟和子 宮中高度表達，但在腦和肝臟中很少表達。LOXLl在胎盤、腎臟、肌肉、心臟、肺和胰腺中表 達，與 LOX—樣在腦和肝臟中很少表達(Kim 等，J. Biol. Chem. 270 :7176_7182 (1995))。 L0XL2在子宮、胎盤和其它器官中高度表達，但與LOX和LOXL類似，在腦和肝臟中表達很少 (Jourdan Le-Saux 等，J. Biol. Chem. 274 12939 12944(1999)) L0XL3 在睪丸、脾臟和前 列腺中高度表達，在胎盤中中等表達，在肝臟中不表達，而L0XL4在肝臟中高度表達(Huang 等，Matrix Biol. 20 153-157 (2001) ；Maki 和Kivirikko，Biochem. J. 355 :381_387(2001)； Jourdan Le-Saux φ, Genomics74 211-218 (2001) ；Asuncion φ, Matrix Biol. 20 487-491(2001))。LOX和不同LOXL蛋白在疾病中的表達或參與也不同。這可能是因為許多原因， 例如組織分布、加工、結構域、活性調節中的差異，以及這些蛋白質之間的其它差異。例如， LOX和LOXL涉及纖維化疾病，因為LOX和LOXL在圍繞纖維化區域的肌型成纖維細胞中 均高度表達(Kagen, Pathol. Res. Pract. 190 :910_919 (1994) ；Murawaki 等，Hepatology 14:1167-1173(1991) ；Siegel Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 2945-2949 (1978)； JourdanLe-Saux 等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 199 :587_592 (1994) ；Kim 等，J. Cell Biochem. 72 181-188 (1999))。LOX和各種LOXL還涉及許多癌症。例如，已有研究顯示在人 膀胱癌中LOXL和L0XL4能後生沉默(印igenetically silenced)並抑制ras/胞外信號-調 節的激酶信號傳導途徑(Wu等，Cancer Res. 67 =4123-4129 (2007)) 0其它研究顯示在頭頸 鱗狀細胞癌中L0XL4基因選擇性上調和擴增(Gorough等，J. Pathol. 212 :74_82 (2007))。 LOX和L0XL2也顯示涉及許多腫瘤，例如結腸和食道癌(Csiszar，Prog. Nucl. Acid Res. 70 1-32(2001))。在乳腺癌中，LOX和LOXL家族成員與癌症有關(Kirschmann等，Cancer Res. 62 448-4483(2002)) ο2.篩選活性L0X/L0XL的調節劑還可採用各種篩選試驗來選擇活性L0X/L0XL的調節劑。前蛋白原分泌和蛋白酶 解加工後，可採用各種篩選試驗選擇活性L0X/L0XL。一個實施方式提供選擇結合活性LOX/ LOXL的化合物的方法，所述方法包括將候選結合化合物與活性LOX或LOXL的多肽培育；和 測定是否發生結合。另一實施方式提供鑑定調節劑，例如活性L0X/L0XL的活化劑/激動劑或抑制劑/ 拮抗劑的方法，所述方法包括將候選化合物與活性L0X/L0XL培育；檢驗活性L0X/L0XL的生物學活性；和測定該活性LOX/LOXL的生物學活性是否改變。另一實施方式提供鑑定活性L0X/L0XL的活化劑或抑制劑的方法，所述方法包括 將候選化合物在含有活性L0X/L0XL的細胞培養液中培育；和檢測該培養液中細胞的生物 學活性改變，其中培養液中細胞的生物學活性改變表明是活性L0X/L0XL的活化劑或抑制 齊IJ。所述生物學活性的改變可以是L0X/L0XL特定功能、L0X/L0XL酶活性或L0X/L0XL的水 平。在一些實施方式中，生物學活性是細胞功能，例如遷移、ΕΜΤ/ΜΕΤ或其它活性，所述改變 是與對照或參比樣品相比較。例如，對照可以是負對照樣品，可包括加入候選化合物後活性 L0X/L0XL水平降低的培養液，或活性L0X/L0XL含量相同但未加入候選化合物的培養液。在 一些實施方式中，將活性L0X/L0XL含量不同的各培養液與候選化合物接觸。例如，如果觀 察到生物學活性有改變，並且如果這種改變在活性L0X/L0XL含量較高的培養液中較大，該 化合物鑑定為活性L0X/L0XL的活化劑。在另一實施方式中，表達的顯著量LOX和/或LOXL可用作本文所述篩選試驗的活 性L0X/L0XL來源，而完整的細胞裂解物可不只含有活性LOX和/或L0XL，還含有無活性LOX 和/或LOXL。所述化合物或多種化合物可以是化學合成的或微生物產生的和/或包含在，例如 樣品，如植物、動物或微生物的細胞提取物中。此外，這些化合物可以是本領域已知，但迄今 為止不知能抑制或活化活性L0X/L0XL。反應混合物可以是無細胞的提取物，或者可包含細 胞或組織培養物。本領域技術人員已知本發明方法的合適裝置，例如通常在Alberts等， Molecular Biology of theCell (細胞的分子生物學)，第三版(1994)和隨附實施例中描 述的。可以將多種化合物，例如加入反應混合物、培養液、注射入細胞或者施加於轉基因動 物。本發明方法中可用的細胞或組織是本發明的宿主細胞、哺乳動物細胞或非人轉基因動 物。如果本發明方法鑑定了含有化合物或多種化合物的樣品，則可能從鑑定為含有能 抑制或活化活性L0X/L0XL的化合物的原始樣品中分離該化合物，或者可進一步細分該原 始樣品(例如，如果其由多種不同化合物構成)，從而減少每份樣品中不同物質的數量並用 原始樣品的小部分重複該方法。根據樣品的複雜程度，上述步驟可進行數次，例如，直至按 照本發明方法鑑定的樣品只含有數量有限的或只有一種物質。在一些實施方式中，樣品包 含化學和/或物理特性類似的物質，在一些實施方式中，所述物質是相同的。本領域技術人員已知產生和篩選大文庫的幾種方法來鑑定對靶標，例如活性LOX/ LOXL具有特異性親和力的化合物。這些方法包括噬菌體展示方法，該方法展示噬菌體的隨 機化肽並通過固定化受體的親和層析作篩選；參見，例如WO 91/17271、WO 92/01047、美國專利號 5，223，409。在另一方法中，採用光刻法合成固定在晶片上的聚合物組合文庫；參見，例如美 國專利號5，143，854、WO 90/15070和WO 92/10092。固定的聚合物與標記的受體接觸，掃 描標記以鑑定結合受體的聚合物。例如Kramer，Methods Mol. Biol. 87 (1998)，25-39中 描述了在連續纖維素膜支持物上合成和篩選肽文庫，從而可用於鑑定本發明多肽的結合配 體，和由此可能的抑制劑和活化劑。該方法還可用於，例如測定活性L0X/L0XL中的結合 位點和識別基序。可以相似方式測定DnaK陪伴分子的底物特異性，接觸位於人白介素_6 及其受體之間；分別參見 Rudiger，EMBO J. 16 (1997)，1501-1507 和 Weiergraber，FEBSLett.379(1996)，122-126。此外，可採用上述方法構建衍生自活性L0X/L0XL的結合表位。成功描述了用於 抗-p24(HIV-l)單克隆抗體的肽表位的類似方法；參見Kramer，Cell 91 (1997)，799-809。 採用群集胺基酸肽文庫對肽_抗體相互作用進行指紋分析的常規途徑描述於KramenMol. Immunol. 32 (1995)，459-465。此外，可按照 Doring, Mol. Immunol. 31 (1994)，1059-1067 所 述的方法獲得活性L0X/L0XL的拮抗劑，並從與本發明多肽特異性結合的單克隆抗體中鑑 定。最近，WO 98Λ5146進一步描述了從複合物文庫中篩選具有所需特性的化合物 的方法，所述特性例如是激動、結合或拮抗多肽或其細胞受體。這種文庫中的複合物包括 所測試的化合物、記錄化合物合成中至少一個步驟的標籤和對報導分子修飾敏感的系鏈 (tether) 0採用修飾系鏈來表示複合物含有具有所需特性的化合物。可解碼所述標籤以顯 示這種化合物合成中的至少一步。鑑定與本發明多肽或編碼這種分子的核酸分子相互作用 的化合物的其它方法是，例如體外篩選噬菌體展示系統以及濾膜結合試驗或利用，例如法 瑪西亞公司(Pharmacia)的BIAcore設備「實時」檢測相互作用。本發明可採用所有這些方法來鑑定活性L0X/L0XL或相關多肽的活化劑/激動劑 和抑制劑/拮抗劑。可利用這種活化劑或抑制劑的基礎結構的各種來源，包括，例如本發明多肽的 模擬類似物。可以通過用立體異構體，即D-胺基酸取代預計生物學活性必需的氨基 酸來產生本發明多肽的模擬類似物或其生物學活性片段；參見，例如Tsukida，J. Med. Chem. 40 (1997), 3534-35410此外，如果利用片段設計生物學活性類似物，可將前模擬 (pro-mimetic)組分摻入肽以重建除去原始多肽部分後喪失的至少一些構象特性；參見， 例如 Nachman, Regul. Pept. 57 (1995)，359-370。此外，活性 L0X/L0XL 可用於鑑定能與天 然多肽一樣有效結合或起到本發明多肽的配體、底物、結合伴侶或受體作用的合成化學肽 模擬物；參見，例如 Engleman，J. Clin. Invest. 99 (1997)，2284-2292。例如，可利用合適 的電腦程式進行活性L0X/L0XL的結構基序的摺疊模擬和計算機再設計(Olszewski， Proteins 25(1996)，286-299 ；Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995)，675-679)。 胃 白質摺疊的計算機重建可用於詳細肽和蛋白質模型的構象和能量分析(Monge，J. Mol. Biol. 247 (1995)，995-1012 ；Renouf，Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995)，37-45)。可通過互 補肽序列的計算機輔助檢索，利用合適程序鑑定賴氨醯氧化酶多肽及其相互作用蛋白質 的相互作用位點(Fassina, Immunomethods 5 (1994)，114-120)。現有技術，例如 Berry， Biochem. Soc. Trans. 22(1994)，1033—1036 ；Wodak, Ann. KY. Acad. Sci. 501 (1987)，1-13 ； Pabo, Biochemistry 25 (1986)，5987-5991中描述了用於設計蛋白質和肽的其它合適的計 算機系統。上述計算機分析獲得的結果可用於，例如製備本發明蛋白質或其片段的肽模擬 物。蛋白質的天然胺基酸序列的這種擬肽(pseudop印tide)類似物可極其有效地模擬親代 蛋白質(Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996)，33218-33224)。例如，將不難獲得的無手性 ο-胺基酸殘基摻入本發明蛋白質或其片段導致醯胺鍵被脂族鏈的聚亞乙基單位取代，從而 提供構建肽模擬物的便利方 案(Banerjee，Biopolymers 39 (1996)，769-777)。現有技術 (Zhang, Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (1996)，327-331)描述了其它系統中的小肽激 素的超反應活性肽模擬類似物。還可通過連續醯胺烷化合成肽模擬物組合文庫並檢驗所得化合物，例如它們的結合和免疫學特性以鑑定活性LOX/LOXL調節劑的合適肽模擬物。現有 技術，例如 Ostresh，Methods in Enzymology 267 (1996)，220—234 禾口 Dorner，Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709-715中描述了肽模擬物組合文庫的產生和使用方法。此外，可利用本發 明多肽的三維和/或晶體學結構設計本發明多肽的生物學活性的肽模擬物抑制劑(Rose， Biochemistry35(1996)，12933—12944 ；Rutenber, Bioorg.Med. Chem. 4(1996)，1545—1558)。 模擬天然生物學多肽的活性的低分子量合成分子的結構設計和分析還描 述於，例如 Dowd，Nature Biotechnol. 16(1998),190-195 ；Kieber-Emmons, Current Opinion Biotechnol. 8(1997),435-441 ；Moore, Proc. West Pharmacol.Soc.40(1997), 115-119 ；Mathews, Proc. West Pharmacol. Soc. 40(1997), 121-125 ；Mukhija, European J. Biochem. 254(1998)，433-438。本領域技術人員還熟知可能設計、合成和評估，例如可用作活性L0X/L0XL或相關 多肽的底物或配體的小有機化合物的模擬物。例如，已有描述說對於拮抗多藥耐藥輔助相 關蛋白的細胞毒性，哈帕羅星(hapalosin)的D-葡萄糖模擬物顯示與哈帕羅星相似的效 率；參見 Dinh, J. Med. Chem. 41 (1998)，981-987。本文所述的抑制劑，例如抗體可結合L0X/L0XL，其可以是競爭性抑制劑、無競爭性 抑制齊U (uncompetitive inhibitor)或非競爭性抑制齊Ll (non-competitive inhibitor)。 對於競爭性抑制，抑制劑通常與底物具有相似的結構。底物濃度低時抑制作用明顯，但可在 底物濃度高時克服。對於無競爭性抑制，抑制劑結合底物在活性位點結合後變得可用的位 點。抑制作用在底物濃度高時最明顯。對於非_競爭性抑制，抑制劑結合遠離底物結合位 點的位點，相對抑制作用在所有底物濃度下通常相同。在一個實施方式中，本文所述抗體或 其抗原結合片段特異性結合全長和加工的LOX或L0XL2。在一方面，全長和加工的LOX或 L0XL2是該酶的活性形式。3.針對 L0X/L0XL 的抗體本文所用的術語「抗體」表示包含特異性結合抗原性表位的必需可變區序列的分 離或重組結合物質。因此，抗體是顯示所需生物學活性，例如結合特異性靶抗原的任何形式 的抗體或其片段。因此，其以最廣泛的含義使用並專門包括單克隆抗體(包括全長單克隆 抗體)、多克隆抗體、人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、納米抗體、雙抗體(diabody)、多特異 性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，包括但不限於scFV、Fab和Fab2,只要它們顯示 所需生物學活性。因此，術語「人抗體」指除可能的非人CDR區域外，含有人來源序列的抗 體，該術語不暗示存在Ig分子的完整結構，只是暗示該抗體在人中的免疫原性作用最低。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，例如，完整抗體的抗原結合或可變區。抗體 片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線形抗體(Zapata等，Protein Eng. 8 (10) 1057-1062 (1995))；單鏈抗體分子；和由抗體片段形成多特異性抗體。木瓜蛋 白酶消化抗體產生各含一個抗原結合位點的兩個相同的抗原結合片段，稱為「Fab」片段，和 殘留的「Fe」片段，該名稱反映出易於結晶的能力。胃蛋白酶處理產生具有兩個抗原結合位 點而仍能交聯抗原的F(ab』)2片段。「Fv」是含有完整的抗原_識別和_結合位點的抗體片段。該區域由一個重鏈可變 域和一個輕鏈可變域的緊密、非共價締合的二聚體構成。就是這種構型使得各可變域的3 個CDR相互作用從而在VH-VL 二聚體表面上限定了抗原結合位點。6個CDR共同賦予抗體的抗原結合特異性。然而，即使是一個可變域(或只含3個抗原特異性CDR的一半Fv)也 具有識別和結合抗原的能力，雖然親和力低於完整的結合位點。「Fab」片段還含有輕鏈恆定區和重鏈的第一恆定區(CH1)。Fab片段與Fab，片段 的區別在於在重鏈CH1區的羧基末端加入少許殘基，包括抗體絞鏈區的一個或多個半胱氨 酸。在本文中，Fab』 -SH指代Fab』，其中恆定區的半胱氨酸殘基具有游離的巰基。最初產 生的F(ab' )2抗體片段是之間具有絞鏈半胱氨酸的一對Fab』片段。其它化學偶連的抗體 片段也是已知的。根據它們恆定區的胺基酸序列，可將任何有脊椎物種的抗體(免疫球蛋白)的「輕 鏈 」分成兩種明顯不同類型中的一種，稱為κ和λ。依據它們重鏈的恆定區的胺基酸序列， 可將免疫球蛋白分成不同種類。免疫球蛋白有5種主要的類別IgA、IgD、IgE、IgG*IgM， 這些類別中的幾種可再分成亞類(同種型)，例如IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。「單鏈Fv」或「sFv」抗體片段包含抗體的Vh和\結構域，其中這些結構域存在於 一根多肽鏈中。在一些實施方式中，Fv多肽還可在Vh和\結構域之間包含多肽接頭，從而 使得sFv形成抗原結合的所需結構。sFv的綜述可參見Pluckthun刊於The Pharmacology of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體的藥理學)，第 113 卷，Rosenburg和 Moore 編，S-V 公司(Springer-Verlag)，紐約，第 269-315 頁(1994)。術語「雙抗體」指含兩個抗原結合位點的小抗體片段，這些片段在同一多肽鏈 (Vh-Vl)中含有與輕鏈可變域相連的重鏈可變域(Vh)。利用很短從而不能在同一鏈 的兩個結構域之間進行配對的接頭，可迫使這些結構域與另一鏈的互補結構域配對，從而 產生兩個抗原結合位點。對雙抗體的更全面描述見，例如EP 404, 097 ；WO 93/11161 ；和 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 :6444_6448 (1993)。「分離的抗體」是從其天然環境的組分中鑑定和分離的和/或回收的抗體。其天 然環境的汙染組分是會干擾該抗體的診斷或治療應用的物質，可包括酶、激素和其它蛋白 性或非蛋白性溶質。在一些實施方式中，抗體可以純化至(1)以抗體的重量計，通過Lowry 方法測定到大於95%，例如大於99重量％，(2)利用旋振杯順序分析儀(spinning cup sequenator)測定到足以獲得至少15個殘基的N-末端或內部胺基酸序列的程度，或(3)利 用考馬斯藍或銀染色劑，通過SDS-PAGE在還原性或非還原性條件下測定到均質。分離的抗 體包括重組細胞內原位的抗體，因為不存在抗體天然環境的至少一種組分。然而，分離的抗 體通常由至少一個純化步驟製得。在一些實施方式中，抗-L0X/L0XL抗體是人源化抗體或人抗體。非人(例如，鼠) 抗體的人源化形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最少序列的嵌合型免疫球蛋白、免疫球 蛋白鏈或其片段(如FV、SCFV、Fab、Fab'、F(ab' )2或抗體的其它抗原結合子序列)。人源 化抗體包括其中受者互補決定區(CDR)的殘基被具有所需特異性、親和力和性能的非-人 物種(供者抗體)，例如小鼠、大鼠或家兔CDR的殘基替代的人免疫球蛋白(受者抗體)。在 一些情況中，人免疫球蛋白的Fv框架殘基被相應的非-人殘基替代。人源化抗體還可包含 既未在受者抗體中也未在輸入的CDR或框架序列中發現的殘基。人源化抗體通常包含基本 上所有或至少一個和通常兩個可變區，其中所有或基本上所有CDR區域對應於非人免疫球 蛋白的那些，所有或基本上所有FR區域是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體還任選含有免疫球蛋白恆定區(Fe)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的(Jones 等，Nature, 321 :522_525 (1986) ；Riechmann等，Nature, 332 323-329 (1988)；和 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992))。本領域熟知人源化非人抗體的方法。人源化抗體通常具有引入其中的一個或多 個非人來源的胺基酸殘基。這些非人胺基酸殘基通常稱為「輸入」或「供者」殘基，一般取 自「輸入」或「供者」可變域。基本上可按照Winter及其同事(Jones等，Nature, 321 522 525(1986) ；Riechmann 等，Nature,332 323327 (1988)) ；Verhoeyen 等·，Science,239 1534 1536(1988))的方法，用嚙齒類CDR或CDR序列取代人抗體的相應序列進行人源化。 因此，這種「人源化」抗體包括嵌合抗體(美國專利號4，816，567)，其中基本上小於完整的 人可變域被非人物種的相應序列取代。實際上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可 能的一些FR殘基被嚙齒類抗體類似位點的殘基取代的人抗體。還可採用本領域已知的各種技術製備人抗體，包括噬菌體展示文庫(Hoogenboom 和 Winter, J. Mol. Biol.，227 381 (1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol.，222 581 (1991))。還可 採用Cole等和Boerner等的技術製備人單克隆抗體(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (單克隆抗體和癌症治療)，Alan R. Liss，第 77 頁(1985)和 Boerner
J- Immunol. ,147(1) :86_95 (1991))。類似地，可通過將人免疫球蛋白基因座引入轉基 因動物，例如內源性免疫球蛋白基因部分或完全滅活的小鼠來製備人抗體。刺激後，觀察到 人抗體產生，這在各方面與人中觀察到的極其相似，包括基因重排、裝配和抗體庫。例如， 美國專利號 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ；5，633，425 ；5，661，016 和以下 科技出版物中描述了該方法Marks 等，Bio/Technology 10,779-783(1992) ；Lonberg 等， Nature 368 856-859(1994) ；Morrison, Nature 368,812 13(1994) ；Fishwald Nature Biotechnology 14,845-51 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14,826(1996)； Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995)。還可如上所述採用已知的選擇和/或誘變方法對抗體進行親和力成熟化。在一些 實施方式中，親和力成熟的抗體的親和力是製備該成熟化抗體的起始抗體(通常是鼠、家 兔、雞、人源化或人抗體)的5倍、超過10倍、超過20倍、或者甚至超過30倍。抗-L0X/L0XL抗體還可以是雙特異性抗體。雙特異性抗體是對至少兩種不同抗原 具有結合特異性的單克隆、還可以是人或人源化抗體。在本例中，一種結合特異性是對LOX 的，而另一種是對任何其它抗原的，例如細胞表面蛋白質或受體或受體亞基。在其它實施方 式中，結合特異性之一是對LOX的，另一種是對LOXL蛋白的，例如L0XL2或L0XL4。抗-L0X/L0XL抗體還可以是免疫偶聯物(immunoconjugate)。這種免疫偶聯物 包含偶連於細胞毒性劑，例如化療劑、毒素(例如，細菌、真菌、植物或底物來源的酶活性毒 素，或它們的片段)或放射性同位素(即，放射性偶聯物)的抗-LOX抗體。「特異性結合」特定多肽或特定多肽上表位或「對其有特異性」的抗體是與該特定 多肽或特定多肽上表位而基本上不結合任何其它多肽或多肽表位的抗體。在一些實施方式 中，本發明抗體(單克隆抗體、scFv, Fab或其它形式的抗體)特異性結合人L0X/L0XL(例 如，hLOX和hLOXL 1 -4)，在約4 °C、25 °C、37 °C或42 °C檢測時，其解離常數Kd等於或小於 ΙΟΟηΜ、小於ΙΟηΜ、任選小於InM、任選小於0. 5nM、任選小於0. InM、任選小於0. OlnM、或任選 小於 0. 005nM。本發明抗體任選結合LOX或LOXL的一個或多個蛋白水解切割位點，例如加工成熟形式的LOX或LOXL的切割位點，藉此有效阻斷LOX或LOXL的加工從而降低活性LOX或 LOXL的水平。本發明抗體任選特異性且選擇性地結合全長形式的L0X，與人LOX的前蛋白原、成 熟或加工的人L0X、或其它賴氨醯氧化酶-樣或賴氨醯氧化酶-相關蛋白(例如，LOXLU L0XL2、L0XL3 和 L0XL4 ；參見 Molnar 等，(2003) Biochim Biophys. Acta. 1647 220~224 ； Csiszar,Prog. Nucl. Acid Res. 70 1-32 (2001)；和 2001 年 11 約 8 日公布的 WO 01/83702) 的結合親和力相比，其結合親和力高，例如至少10倍、至少100倍或者甚至至少1000倍。
本發明抗體任選特異性且選擇性地結合成熟或加工形式的L0X，與人LOX的前 蛋白原、全長形式的人L0X、或其它賴氨醯氧化酶_樣或賴氨醯氧化酶-相關蛋白(例 如，LOXLU L0XL2、L0XL3 和 L0XL4 ；參見 Molnar 等，(2003)Biochim Biophys. Acta. 1647 220-224)的結合親和力相比，其結合親和力高，例如至少10倍、至少100倍或者甚至至少 1000 倍。在一些實施方式中，抗體特異性結合選自SEQ ID NO :1_18的hLOX區域中的表位。
本發明抗體任選同時結合人LOX和人L0XL2，與其它賴氨醯氧化酶_樣或賴氨醯氧 化酶-相關蛋白(例如，L0XL1、L0XL3 和 L0XL4 ；參見 Molnar 等，(2003)Biochim Biophys. Acta. 1647 :220_224)的結合親和力相比，其結合親和力高，例如10倍、至少100倍或者甚 至至少1000倍。本發明抗體任選不僅結合LOX或L0XL，還降低或抑制LOX或LOXL的攝取或內在化 (例如，通過整聯蛋白β 1或其它細胞受體或蛋白質)。據信，這種抗體能減弱ΕΜΤ，因此可 用於本文披露的應用。本發明抗體任選不僅結合LOX或L0XL，還降低或抑制LOX或LOXL的賴氨醯氧化酶 活性。據信，這種抗體能減弱ΕΜΤ，因此可用於本文披露的應用。還採用上述試驗進行L0X/L0XL與其它蛋白質，例如細胞受體(例如，攝取受體整 聯蛋白 β 1)、BTK(burton agammagloublinemia tyrosine kinase,伯頓無丙禾中球蛋白血症 酪氨酸激酶)或其它整聯蛋白的結合，其中使用的是細胞受體(例如，攝取受體整聯蛋白 β 1)、BTK(伯頓無丙種球蛋白血症酪氨酸激酶)或其它整聯蛋白而非ECM蛋白。選擇抑制L0X/L0XL與ECM蛋白、細胞受體和整聯蛋白結合的那些L0X/L0XL抗體 作為進一步開發的候選對象。L0X/L0XL酶通過桌球機制起作用，米-門二氏動力學描述了這種機制(圖41)。 本發明的L0X/L0XL抗體可以是L0X/L0XL的競爭性抑制劑、無競爭性抑制劑或非競爭性抑 製劑。用作競爭性抑制劑、無競爭性抑制劑和非競爭性抑制劑的抗體的作用機制描述於圖 42。對於競爭性抑制，抑制劑通常與底物具有相似的結構。底物濃度低時抑制作用明顯，但 可在底物濃度高時克服。對於無競爭性抑制，抑制劑結合底物在活性位點結合後變得可用 的位點。抑制作用在底物濃度高時最明顯。對於非-競爭性抑制，抑制劑結合遠離底物結合 位點的位點。相對抑制作用在所有底物濃度下通常相同。因此，抑制劑可以是L0X/L0XL抗 體，例如L0XL2 (的抗體)，其可以是競爭性抑制劑、無競爭性抑制劑或非競爭性抑制劑(圖 43)。4.靶向L0X/L0XL的多核苷酸可利用能特異性雜交編碼LOX或LOXL的mRNA轉錄物的反義多核苷酸得到LOX或LOXL水平或活性的抑制劑。本發明的多核苷酸抑制劑任選能降低或抑制LOX或LOXL的攝取或內在化。據信， 這種多核苷酸抑制劑能減弱EMT，因此可用於本文披露的應用。本發明的多核苷酸抑制劑任選降低或抑制LOX或LOXL的賴氨醯氧化酶活性。據 信，這種多核苷酸抑制劑能減弱EMT，因此可用於本文披露的應用。 設計可用於有效下調LOX或L0XL2的反義分子時通常考慮反義方法中採用的兩方 面因素。 第一方面是將寡核苷酸遞送入合適細胞的胞質，而第二方面是設計以抑制其翻譯 的方式特異性結合細胞內所指定mRNA的寡核苷酸。設計反義寡核苷酸時，通常考慮幾方面。為利用反義寡核苷酸或類似物有效體 內抑制基因表達，寡核苷酸或類似物通常要滿足以下要求(i)與靶序列結合的特異性足 夠；(ii)水中的溶解性；(iii)對胞內和胞外核酸酶的穩定性；(iv)穿透細胞膜的能力； 和(ν)用於治療機體時的低毒性。根據解釋靶mRNA和寡核苷酸中結構改變的能量的熱力 學循環，鑑定與其靶mRNA具有最高預計結合親和力的那些序列的算法有，例如Walton等， Biotechnol Bioeng 65 1-9 (1999)所述的。這些算法已成功用於在細胞中實施反義方法。Walton等開發的算法使得科學家 能成功設計家兔β-球蛋白(RBG)和小鼠腫瘤壞死因子-α (TNF-α)轉錄物的反義寡核苷 酸。同一研究組還報導通過動力學PCR技術評估證明理性選擇的寡核苷酸針對細胞培養物 中的3種模型靶mRNA(人乳酸脫氫酶A和B和大鼠gpl30)的反義活性在幾乎所有病例中 有效，包括利用磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸化學方法對兩種細胞類型的三種不同靶標 進行測試。此外，利用體外系統設計和預計特異性寡核苷酸效率的幾種方法也得到公開 (Matveeva 等，Nature Biotechnology 16:1374-1375(1998))。本發明可用的反義分予包括至少10個鹼基，例如10-15個、15-20個鹼基、至少 17、至少18、至少19、至少20、至少22、至少25、至少30、或甚至至少40個鹼基的多核苷酸或 多核苷酸類似物，其在生理條件下可在體內與某多核苷酸鏈的一部分雜交，所述多核苷酸 鏈編碼與SEQ ID NO :1、4、5或7有至少50%同源性，或與其N-末端部分有至少75%同源 性的多肽，而所述同源性採用威斯康星序列分析包的BestFit軟體，利用Smith和Waterman 算法測定，其中空位成熟罰分等於8，空位延伸罰分等於2。可從給予組織的核酸構建物表達本發明可用的反義寡核苷酸，在該情況中，可利 用誘導型啟動子來打開和關閉反義表達，或者可化學合成這種寡核苷酸並作為，例如藥物 組合物的一部分而直接給予組織。化學合成的寡核苷酸及其類似物能具有選擇的預定序列提供了下調基因表達的 手段。可考慮四類基因表達調節方案。在轉錄水平，通過鏈置換或形成三鏈螺旋結合基因組DNA的反義或有義寡核苷酸 或類似物可阻止轉錄。在轉錄物水平，結合靶mRNA分子的反義寡核苷酸或類似物導致胞內 RNA酶H酶促切割雜交體。在該情況中，寡核苷酸或寡核苷酸類似物通過雜交靶向mRNA而 提供由RNA酶H識別和破壞的雙鏈雜交體。或者，這種雜交體形成可幹擾正確的剪接。兩 種情況均造成可翻譯的靶mRNA完整轉錄物的數量降低或消除。在翻譯水平，結合靶mRNA分子的反義寡核苷酸或類似物通過空間位阻阻止必需翻譯因子(核糖體)結合靶mRNA，本領域將該現像稱為雜交扣留，從而使得這些mRNA無法 翻譯。未修飾的寡核苷酸通常不可用作反義序列，因為它們的體內半衰期短，在此期間 核酸酶將其快速降解。此外，它們常難以製備毫克以上的數量。此外，這種寡核苷酸通常是 不佳的細胞膜穿透劑。因此，通常以合適方式設計寡核苷酸類似物。例如，通過精巧的「轉回(switch back)」化學連接減少通過三鏈螺旋形成的雙鏈 DNA(dsDNA)識別的相關產生問題，從而能識別一條鏈上的多嘌呤序列，並且通過「轉回」，可 識別另一鏈上的同型嘌呤序列。就離子強度和PH而言，利用人工鹼基 還能形成良好的雙鏈 體，從而改善結合條件。RNA寡核苷酸還可用於反義抑制，因為它們與靶標形成穩定的RNA-RNA雙鏈體，提 示抑制作用有效。然而，由於它們的溶解性低，通常利用為此目的而設計的RNA寡核苷酸在 細胞內表達。當試圖靶向編碼豐富和長命蛋白的mRNA時，可採用該方法。可採用反義療法來治療許多威脅生命的疾病，許多優點勝過傳統藥物。傳統藥物 通常在致病蛋白質形成後進行幹預。然而，反義療法可阻斷mRNA轉錄/翻譯並在蛋白質形 成前進行幹預，由於反義療法只靶向一種特定的mRNA，與目前的蛋白質抑制治療相比，它們 更有效而副作用較低。幾個臨床試驗證明反義寡核苷酸的安全性、可行性和活性。例如，已成功使用了適 合治療癌症的反義寡核苷酸(Holmund等，Curr. Opin. Mol. Ther. 1 :372_385 (1999))，而通 過靶向c-myb基因、p53和Bcl_2的反義寡核苷酸治療血液惡性腫瘤已進入臨床試驗並顯 示可為患者耐受(Gerwitz, Curr. Opin. Mol. Ther. 1 :297_306 (1999))。最近，已有報導說人類肝素酶基因表達的反義介導抑制能在小鼠模型中抑制人癌 症細胞的胸膜擴散(Uno 等，Cancer Res 61 :7855_60 (2001))。最近，FDA批准了第一種反義藥物。該藥物-福米韋生由埃斯埃斯公司(Isis)開 發，表明能局部治療對CMV視網膜炎的其它治療不耐受或具有禁忌症或對CMV視網膜炎的 以前治療反應不足的AIDS患者的巨細胞病毒(藥物療法新聞網(Pharmacotherapy News Network))。因此，目前一致的意見是上述反義技術領域的最近發展產生了高度精確的反義設 計算法和各種寡核苷酸遞送系統，從而普通技術人員能設計和實施適於下調已知序列表達 而無需訴諸過多試驗和錯誤實驗的反義方法。抑制LOX或LOXL的另一機制是RNA幹擾(RNAi)，該方法利用與靶mRNA同源並導 致其降解的小幹擾 dsRNA(siRNA 或小髮夾 RNA，shRNA)分子(Carthew，Curr. Opin. Cell. Biol. 13 =244-248(2001)) 0例如，L0XL2特異性shRNA的表達感染各種類型的癌細胞能有 效改變它們的形態和侵襲性。RNA幹擾通常是兩步方法。在稱為起始步驟的第一步中，可通過切酶作用將輸入 dsRNA消化成21-23核苷酸(nt)的小幹擾RNA(siRNA)，該酶是dsRNA特異性核糖核酸酶 的RNA酶III家族的一元，其以ATP依賴性方式加工(切割)dsRNA(直接或通過轉基因或 病毒引入)。連續切割事件將RNA降解成19-21bp雙鏈體(siRNA)，各含2-核苷酸3』突出 端(Hutvagner 禾口 Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12 :225_232(2002) ；Bernstein, Nature 409 363-366(2001)) ο
在效應步驟中，SiRNA雙鏈體與核酸酶複合物結合以形成RNA-誘導的沉默複合 物(RISC)。RISC活化需要siRNA雙鏈體的ATP-依賴性解旋。然後，活性RISC通過鹼基 配對相互作用靶向同源轉錄物，通常從siRNA的3』端將mRNA切割成約12個核苷酸片段 (Hutvagner 禾口 Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12 :225_232 (2002) ；Hammond 等，Nat. Rev. Gen. 2 110-119 (2001) ；Sharp, Genes. Dev. 15 :485_490 (2001))。雖然切割機制尚未闡明， 但研究表明各 RISC 含有一個 siRNA 和 RNA 酶(Hutvagner 和 Zamore，Curr. Opin. Genet. Dev. 12 :225-232(2002))。由於RNAi的顯著效力，提示RNAi途徑內有擴增步驟。可通過拷貝輸入dsRNA產生 更多siRNA，或通過複製形成的siRNA進行擴增。或者，通過RISC的多重翻轉事件實現擴增 (Hutvagner 禾口 Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev. 12 :225_232 (2002) ；Hammond 等，Nat. Rev. Gen. 2 110-119 (2001) ；Sharp, Genes. Dev. 15 :485_490 (2001))。RNAi 還描述於 Tuschl， Chem. Biochem. 2 :239_245(2001) ；Cullen, Nat. Immunol. 3 :597_599(2002)；禾口 Brantl， Biochem.Biophys. Act. 1575 15-25(2002)。可如下所述合成適用於本發明的RNAi分子。首先，掃描AA 二核苷酸序列的AUG 密碼子下遊的LOX或LOXL mRNA序列。將各AA和3』毗連19個核苷酸的發生率記錄為潛 在的siRNA靶位點。從開放讀框選擇siRNA靶位點，藥物非翻譯區(UTR)富含調節蛋白質 結合位點。UTR-結合蛋白和/或翻譯起始複合物可幹擾siRNA核酸內切酶複合物的結合 (Tuschl，Chem. Biochem. 2 :239_245 (2001))。然而，應該知道針對非翻譯區的siRNA也可能 是有效的，如GAPDH所示，其中針對5』UTR的siRNA介導細胞GADPH mRNA降低約90%並完 全消除蛋白質水平(www. ambion. com/techlib/tn/91/912. html)。第二，利用任何序列比對 軟體，例如從NCBI伺服器(www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/)獲得的BLAST軟體，將潛在的 靶位點與合適的基因組資料庫(例如，人、小鼠、大鼠等)比較。濾出與其它編碼序列顯示 明顯同源性的推定靶位點。選擇合格靶序列作為siRNA合成的模板。選擇的序列可包括G/C含量低的那些 序列，因為這些序列顯示介導基因沉默比G/C含量高於55%的那些序列更有效。可沿著用 於評估的靶基因的長度選擇幾個靶位點。為更好地評估選擇的siRNA，聯用負對照。負對 照siRNA包括的核苷酸組成可與siRNA相同，但與基因組缺乏明顯的同源性。因此，可利用 siRNA的亂序核苷酸序列，只要其與任何其它基因不顯示任何明顯的同源性。可從有助於SiRNA轉錄物在引入宿主細胞後即可穩定表達的表達載體轉錄本發 明的siRNA分子。工程改造這些載體以表達shRNA，體內加工成能執行基因特異性沉默的 siRNA 分子(Brummelkamp 等，Science 296 :550_553 (2002) ；Paddison 等，Genes Dev. 16 948-958(2002) ；Paul 等，Nature Biotech. 20 505-508 (2002) ；Yu 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 6047-6052(2002))。ShRNA是具有髮夾環結構的單鏈多核苷酸。單鏈多核苷酸具有連接雙鏈區域中一 條鏈的3』端和雙鏈區域中另一鏈的5』端的環區段。由可與靶序列，例如編碼LOX或LOXL 的多核苷酸，或LOX或LOXL mRNA雜交的第一序列和與該第一序列互補的第二序列形成雙 鏈區域，因此該第一和第二序列形成連接序列連接其諸末端從而形成髮夾環結構的雙鏈區 域。第一序列可與編碼L0X/L0XL的多核苷酸的任何部分雜交。shRNA的雙鏈莖結構域包含 限制性內切核酸酶位點。
shRNA的莖環結構可具有任選的核苷酸突出端，例如2_bp突出端，例如3』 UU-突 出端。雖然可能有偏差，莖的範圍通常為約15-49、約15-35、約19-35、約21_31bp、或約 21-29bp，環的範圍是約4-30bp，例如約4_23bp。為在細胞內表達shRNA，可利用含有聚合酶III Hl-RNA或TO啟動子、莖環RNA插 入物的克隆位點和4 5-胸苷轉錄終止信號的質粒載體。聚合酶III啟動子通常具有良好限 定的起始和終止位點，它們的轉錄物缺乏多聚(A)尾。多聚胸苷道(polythymidine tract) 確定這些啟動子的終止信號，轉錄物通常在第二尿苷後切割。在此位置切割表達的shRNA 中產生3』 UU突出端，其類似於合成siRNA的3』突出端。在哺乳動物細胞中表達shRNA的 其它方法描述於以下引用的參考文獻。合適表達載體的例子是pSUPER ，其包含具有良好限定的轉錄起點和由一行5個 胸苷(T5)構成的終止信號的聚合酶-III Hl-RNA基因啟動子(Brummelkamp等，Science 296 =550-553(2002)) 0在終止位點切割轉錄物是在第二尿苷後，因而產生類似於合成 siRNA的末端的轉錄物，其還含有核苷酸突出端。克隆siRNA，從而使其包含感興趣的序列， 艮口，通過短間隔區而與同一序列的逆互補序列隔開的LOX或L0XL。得到的轉錄物本身回折 疊(fold back)，形成介導LOX或LOXL RNAi的莖環結構。另一合適的siRNA表達載體編碼受不同polIII啟動子調控的有義和反義 siRNA (Miyagishi 和 Taira，Nature Biotech. 20 :497_500 (2002))。該載體產生的 siRNA 還 包含5胸苷(T5)終止信號。由於通過脂質轉染將合成siRNA引入細胞的方法可能導致一些細胞類型中的轉 染效率低和/或沉默效應的持續性短，現已開發了載體介導的方法。因此，可利用逆轉錄病毒將本發明所用的siRNA分子遞送入細胞。與諸如脂質 轉染等方法相比，利用逆轉錄病毒遞送siRNA有幾個優點，因為逆轉錄病毒遞送通常更 有效而均勻並能立即選擇穩定的「敲減」細胞(Devroe和Silver, BMC Biotechnol. 2 15(2002))。最近的科技出版物驗證了這種短雙鏈RNA分子在抑制靶mRNA表達中的效力，因此 明確證明了這種分子的治療潛力。例如，現已利用RNAi抑制C型肝炎(病毒)(McCaffrey 等，Nature 418 :38_39 (2002))、HIV-I (Jacque 等，Nature 418 :435_438 (2002))、宮頸癌細 胞(Jiang 和 Milner，0ncogene21 :6041_6048 (2002))和白血病細胞(Wilda 等，Oncogene 21，5716-5724 (2002))表達。5.抗瘤或抗纖維化藥劑按照本發明，LOX或LOXL的抑制劑可以與化療劑聯用以使腫瘤細胞(例如，從EMT 狀態過渡到MET狀態)對化療劑敏感，因此，不僅阻止或抑制腫瘤侵入和轉移，還抑制原發 性腫瘤生長。本文所用的術語「化療劑」或「化療的」(或用化療劑進行治療的情況中的「化 療」)表示包括用於治療癌症的任何非蛋白(即，非肽)化學化合物。化療劑的例子包 括烷化劑，例如塞替派和環磷醯胺(CYTOXAN )；磺酸烷酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊 舒凡；氮丙啶類，例如苄替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)、和烏瑞替派 (uredopa)；乙撐亞胺類和甲基三聚氰胺(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙烯胺 三嗪、三亞乙基磷醯胺、三亞乙基硫化磷醯胺和三羥甲蜜胺(trimethylolomelamine)；己酸配質類(例如，泡番荔枝辛(bullatacin)和泡番荔枝辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼 (包括合成的類似物託泊替康)；苔蘚抑素；卡力他汀(callystatin) ；CC-1065 (包括其阿 多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；縮酚酸肽類抗腫瘤藥(cryptophycin)(特別 是縮酚酸肽類1和縮酚酸肽類8)；多拉司他汀；多卡黴素(duocarmycin)(包括合成類似 物，KW-2189 和 CBI-TMI)；艾槽塞洛素(eleutherobin)；潘克他汀 (pancratistatin)；薩 珂敵汀(sarcodictyin)；海綿他汀(spongistatin)；氮芥，例如瘤可寧、萘氮芥、環磷醯胺 (cholophosphamide)、雌莫司汀、異環磷醯胺、雙氯乙基甲胺、鹽酸氧氮芥、美法侖、新氮芥、 苯芥膽留醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司 汀(foremustine)、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，刺 孢黴素(calicheamicin)，特別是刺孢黴素γ II和刺孢黴素φ II，參見，例如Agnew，Chem. Intl. Ed. Engl.，33 :183_186 (1994)；蒽環類，包括蒽環A ；二膦酸鹽，例如氯膦酸鹽；埃斯 波黴素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色團和相關的色蛋白烯二炔抗生素生色團)、 阿克拉黴素、放線菌素、安麴黴素(authramycin)、偶氮絲氨酸、博萊黴素、放線菌素C、卡拉 比星(carabicin)、洋紅黴素、嗜癌黴素、色黴素、放線菌素D、柔紅黴素、地託比星、6_ 二氮 雜-5-氧代-L-正亮氨酸、阿黴素(doxorubincin)(亞得裡亞黴素 )(包括嗎啉代-阿黴 素、氰基嗎啉代_阿黴素、2-吡咯啉代-阿黴素和脫氧阿黴素)、表柔比星、依索比星、伊達 比星、麻西羅黴素、絲裂黴素，例如絲裂黴素C、黴酚酸、諾拉黴素、橄欖黴素、培洛黴素、泊 非黴素、嘌呤黴素、三鐵阿黴素、羅多比星、鏈黑菌素、鏈佐星、殺結核菌素、烏苯美司、淨司 他丁、佐柔比星；抗-代謝物，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，例如德莫 蝶呤(demopterin)、氨甲蝶呤、蝶羅呤、三甲曲沙；嘌呤類似物，例如氟達拉濱、6-巰基嘌 呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，例如安西他濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞 苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾他濱、氟尿苷；雄激素，例如卡普睪酮、丙酸甲雄烷酮、表 硫雄醇、美雄烷、睪內酯；抗-腎上腺素，例如氨魯米特、米託坦、曲洛司坦；葉酸補充劑，例 如亞葉酸；乙醯葡醛酸內酯；醛磷醯胺糖苷；氨基乙醯丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；貝拉布昔 (bestrabucil)；比生群；依達曲沙；德福法明(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依氟鳥氨 酸；醋酸羥嗶咔唑；大環內酯類抗腫瘤藥(印othilone)；依託格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇 多糖；氯尼達明；美登醇類物質(maytansinoids)，例如美登素和安絲菌素；米託胍腙；米 託蒽醌；莫哌達醇；二胺硝吖啶；噴司他丁 ；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼白酸；2-乙 基醯胼；丙卡巴胼；PSK ；丙亞胺；根黴素；西佐喃；螺旋鍺；細格孢氮雜酸；三亞胺醌；2， 2'，2〃 -三氯三乙胺；單端孢黴烯(特別是T-2毒素、疣孢菌素(verracurirOA、杆孢菌 素A和蛇形菌毒素(anguidine))；尿烷；長春地辛；達卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇； 二溴衛矛醇；哌泊溴烷；加胞苷(gacytosine)；阿糖胞苷(〃 Ara-C")；環磷醯胺；塞替 派；紫杉烷類，例如紫杉醇(新澤西州普林斯頓布裡斯託美時施貴寶腫瘤公司(Bristol MeyersSquibb Oncology, Princeton, N. J.)TAXOL )和多西他賽(法國安東尼 RPR 公司 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France) TAX0TERE )；瘤可寧；吉西他濱(Gemzar ) ；6-硫 鳥嘌呤；巰基嘌呤；氨甲蝶呤；鉬類似物，例如順鉬和卡鉬；長春鹼；鉬；依託泊甙(VP-16)； 異環磷醯胺；米託蒽醌；長春新鹼(vancristine)；長春瑞濱(Navelbine )；諾消靈；替尼 泊苷；依達曲沙；柔紅黴素；氨基蝶呤；昔洛達(xeoloda)；伊班膦酸鹽；CPT-Il ；拓撲異構 酶抑制劑RFS 2000 ；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；維甲酸類，例如維甲酸；卡培他濱；和上述任何物質的藥學上可接受的鹽、酸或衍生物。「化療劑」的定義中還包括用於調節或抑制激 素對腫瘤作用的抗-激素劑，例如抗-雌激素和選擇性雌激素調節劑(SERM)，包括，例如 他莫昔芬(包括Nolvadex )、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4_羥基他莫昔芬、曲沃昔芬、凱奧昔芬 (keoxifene)、LY117018、奧那司酮和託瑞米芬(Fareston )；調節腎上腺中雌激素產生的 芳香酶的抑制劑，例如4(5)-咪唑、氨魯米特、醋酸甲地孕酮(Megace )、依西美坦、福美坦、 法倔唑、伏氯唑(Rivisor )、來曲唑(Femara )和阿那曲唑(Arimidex )；和抗-雄激素， 例如氟他米特、尼魯米特、比卡魯胺、醋酸亮丙瑞林和戈舍瑞林；和上述任何物質的藥學上 可接受的鹽、酸或衍生物。在一個實施方式中，與L0X/L0XL調節劑聯用的抗瘤劑是酪氨酸激酶抑制劑。例 如，ZD1839(AZK K公司(AstraZeneca K. K.)的Iressa )顯示對EGFR (表皮生長因子受體) 酪氨酸激酶的ATP結合位點的ATP有競爭性作用，並通過抑制酪氨酸激酶的自磷酸化而抑 制酪氨酸激酶活性。因此，通過阻斷EGFR-提供的信號轉導(配體，例如表皮生長因子(EGF)結合EGFR 的胞外結構域，然後活化EGFR酪氨酸激酶的胞內結構域，從而不僅導致EGFR的自磷酸化， 還導致各種胞內靶蛋白的自磷酸化，然後將增殖信號從癌細胞表面轉導至核，並導致癌細 胞的增殖、滲透、轉移、血管生成)而表現出抗癌症作用。IMC-C225或西妥昔單抗(Erbitux )是EGFR-靶向單克隆抗體，其識別細胞膜表面 上EGFR的受體部分並抑制EGFR的自磷酸化，從而抑制酪氨酸激酶活性。赫賽汀是針對EGFR 同源的Her2/NeU的單克隆抗體，甲磺酸伊馬替尼(GLEEVEC ，以前稱為STI-571)能抑制 BCR-Abl和c-kit的酪氨酸激酶活性(2號非專利文件)。索拉法尼(Sorafenib) (Nexavar ) 是Raf激酶、PDGF (血小板衍生的生長因子)、VEGF受體2和3激酶和c-Kit的小分子抑制 劑。本文所用針對腫瘤抗原的單克隆抗體是用腫瘤和白血病細胞所表達的抗原，例如 腫瘤特異性抗原引發的抗體。單克隆抗體還包括全人和人源化抗體。癌症治療的治療性抗體的另一例子包括曲妥單抗(HERCEPTIN ；HER2蛋白的過 表達與臨床上更具侵襲性的疾病和不佳的預後有關)；利妥昔單抗(RITUXAN )是用淋 巴瘤細胞上的⑶20產生並選擇性消除正常和惡性的⑶20+前-B和成熟B細胞；阿侖單 抗(CAMPATH )，特異性靶向B和T淋巴細胞上發現的CD52抗原的單克隆抗體，用於治療 慢性淋巴細胞性白血病(CLL)和淋巴瘤；和吉姆單抗佐格米星(Gemtuzumabzogamicin) (MYL0TARG )，包含針對⑶33的特異性抗體和化療劑(佐格米星)的抗體偶聯物，其指示可 以治療復發的成人急性髓細胞性白血病。在另一實施方式中，抗-血管生成劑與L0X/L0XL抑制劑組合來治療癌症和異常 或不良血管生成相關的其它疾病。抗血管生成劑的例子包括但不限於視黃酸及其衍生 物、2-甲氧基雌二醇、ANGIOSTATIN 、END0STATIN 、蘇拉明、角鯊胺、金屬蛋白酶-I的組 織抑制劑、金屬蛋白酶-2的組織抑制劑、纖溶酶原激活物抑制劑-1、纖溶酶原激活物抑制 劑_2、軟骨-衍生的抑制劑、紫杉醇、血小板因子4、硫酸魚精蛋白(鯡精蛋白)、硫酸幾 丁質衍生物(從雪花蟹殼製備)、硫酸化多糖肽聚糖複合物(sp-pg)、星形胞菌素、基質代 謝的調節物，包括，例如脯氨酸類似物((I-氮雜環丁烷-2-羧酸(LACA)、順羥脯氨酸、d， 1-3,4-脫氫脯氨酸、硫代脯氨酸、延胡索酸α - 二吡啶基，β -氨基丙腈、4-丙基-5-(4_吡啶基)-2(3h)_噁唑酮；氨甲蝶呤、米託蒽醌、肝素、幹擾素、2巨球蛋白-血清、黑猩猩(chimp)-3、糜蛋白酶抑制素、β-環糊精十四烷硫酸酯、埃坡恩黴素(印onemycin)；煙麴黴 素、硫代蘋果酸金鈉、d-青黴胺(⑶PT)、β-1-抗膠原酶-血清、α. 2-抗血纖維蛋白酶、比 生群、氯苯扎利二鈉、η-2-羧基苯基-4-氯氨茴酸二鈉或〃 CCA"、沙立度胺；血管抑制性 類固醇、羧基氨基咪唑(cargboxynaminolmidazole)；金屬蛋白酶抑制劑，例如BB94。其它 抗_血管生成劑包括抗體，例如針對這些血管生成性生長因子的單克隆抗體bFGF、aFGF、 FGF-5、VEGF 同種型、VEGF-C、HGF/SF和 Ang-l/Ang-2。Ferrara N.和 Alitalo，K. 「 Clinical application ofangiogenic growth factors and their inhibitors ( il管生成f生生長因 子和它們的抑制劑的臨床應用)〃(1999)Nature Medicine 5:1359-1364。其它抗血管生 成劑可包括VEGF轉錄的抑制劑。示範性的抗-纖維化劑包括但不限於化合物，例如β-氨基丙腈(BAPN)以及以 下文獻公開的化合物1990年10月23日授予Palfreyman等的美國專利號4，965，288， 名禾爾為 『『 Inhibitors of lysyl oxidase, relating to inhibitors oflysyl oxidase and their use in the treatment of diseases and conditionsassociated with the abnormal deposition of collagen (賴氨醯氧化酶抑制劑，涉及賴氨醯氧化酶抑制劑以 及它們在治療膠原異常沉積相關疾病和病症中的應用)」 ；1991年3月5日授予Kagan等的U. S. 4,997,854, 名稱為 "Anti-fibroticagents and methods for inhibiting the activity of lysyl oxidase in situ usingadj acently positioned diamine analogue substrate (抗纖維變性劑和利用毗鄰定位的二胺類似底物原位抑制賴氨醯氧化酶活性 的方法)」，其涉及抑制LOX來治療各種病理性纖維化狀態，這些文獻通過引用納入本文。 其它示範性抑制劑描述於1990年7月24日授予Palfreyman等的U. S. 4，943，593，名 稱為「Inhibitors of lysyl oxidase (賴氨醯氧化酶的抑制劑)」，其涉及諸如2_異丁 基-3-氟_、氯_、或溴-烯丙胺等化合物；以及，例如U. S. 5,021,456 ；U. S. 5，5059,714 ； U. S. 5，120，764 ；U. S. 5，182，297 ；U. S. 5，252，608 (涉及 2_ (1-萘氧基甲基)_3_ 氟烯丙胺)； 和美國專利申請號2004/0248871，這些文獻通過弓|用納入本文。示範性抗-纖維化劑還包 括與賴氨醯氧化酶的活性位點上的羰基反應的伯胺，包括與羰基結合後產生通過共振穩定 的產物的那些，例如以下伯胺乙二胺，胼，苯基胼和它們的衍生物、氨基脲和脲衍生物，氨 基腈，例如β -氨基丙腈(BAPN)，或2-硝基乙胺，不飽和或飽和滷代胺，例如2-溴-乙胺、 2-氯乙胺、2-三氟乙胺、3-溴丙胺、對-滷代苄胺，硒代高半胱氨酸內酯。在另一實施方式 中，抗-纖維化劑是穿透或不穿透細胞的銅螯合劑。其它示範性化合物包括間接抑制劑，這 些化合物阻斷賴氨醯氧化酶對賴氨醯基或羥基賴氨醯基殘基進行氧化脫氨而衍生醛衍生 物，例如硫醇胺(thiolamine)，特別是D-青黴胺或其類似物，例如2-氨基-5-巰基-5-甲 基己酸、D-2-氨基-3-甲基-3- ((2-乙醯胺基乙基)二硫代)丁酸、對-2-氨基-3-甲 基-3-((2-氨基乙基)二硫代)丁酸、4-((對-1-二甲基-2-氨基-2-羧乙基)二硫代) 丁烷亞磺酸鈉、2-乙醯胺基乙基-2-乙醯胺基乙硫醇亞磺酸酯(sulphanate)、4_巰基丁烷 亞磺酸鈉三水合物。6.給藥製劑、試劑盒和途徑還考慮了包含採用所公開方法鑑定為L0X/L0XL調節劑的化合物的治療性組合 物。在一個實施方式中，本文提供預防和治療轉移性腫瘤生長的治療性組合物，該組合物在藥學上可接受的運載體物質中包含治療有效量的LOX/LOXL抑制劑；其中所述抑制劑抑制 賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白，例如L0XL-2，其中所述抑制劑的用量足以預防和 治療轉移性腫瘤生長。在另一實施方式中，本文提供預防和治療轉移性腫瘤生長的治療性 組合物，該組合物在藥學上可接受的運載體物質中組合包含治療有效量的LOX/LOXL抑制 齊IJ，並與放療、外科手術、化療或非LOX/LOXL抑制劑的抗癌症生物物質組合。
本文所用的術語「治療有效量」或「有效量」指單獨給予或與另一治療劑組合給予 細胞、組織或對象時能有效防止或緩解疾病病症或該疾病進展的治療劑用量。治療有效劑 量還指足以緩解症狀，例如治療、治癒、防止或緩解相關醫學病症，或治療、治癒、防止或緩 解這些病症的速度增加的化合物用量。當將各活性成分單獨給予個體時，治療有效劑量單 指該成分。當應用某一組合時，治療有效劑量指產生治療作用的活性成分的組合用量，而無 論是組合、連續或同時給予。例如，當採用體內給予L0X/L0XL抗體時，常規劑量可以是約10 納克到最多100毫克/千克哺乳動物體重/天或更多，例如，約1微克/千克/天到50毫 克/千克/天，任選約100微克/千克/天到20毫克/千克/天、500微克/千克/天到 10毫克/千克/天、或1毫克/千克/天到10毫克/千克/天不等，取決於給藥途徑。本領域技術人員鑑於本文可知道各種藥物組合物及其製備技術和應用。合適 的藥物組合物和相關給藥技術的細節可參見本文的詳細指導，進一步的補充可見，例如 Remington :The Science and Practice of Pharmacy (雷明頓藥學科學和實踐)，第 20 版，(Lippincott, Williams & Wilkins 2003)等教材。所述組合物還包含藥學上可接受的材料、組合物或載體，例如液體或固體填充劑、 稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料，即，運載體。這些運載體參與將所述化合物從一個器官、 或身體部分攜帶或運輸至另一器官或身體部分。就與製劑的其它成分相容和不傷害患者 而言，各運載體應是「可接受的」。可用作藥學上可接受的運載體的材料的一些例子包括 糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；澱粉，例如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素及其衍生物，例如 羧甲基纖維素、乙基纖維素和醋酸纖維素；黃蓍膠粉末；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，例如 可可脂和栓劑蠟；油，例如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；乙二 醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂 酸乙酯；糖；緩衝劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格溶液； 乙醇；磷酸緩衝溶液；和藥物製劑中利用的其它無毒相容物質。組合物中還可以存在潤溼 齊U、乳化劑和潤滑劑，例如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、 調味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑。本發明另一方面涉及執行組合給予L0X/L0XL調節劑與其它治療劑的試劑盒。在 一個實施方式中，所述試劑盒裝有在藥物運載體中配製的L0X/L0XL抑制劑和一種或多種 不同藥物製品中適當配製的至少一種非L0X/L0XL抑制劑的治療劑。製劑和遞送方法通常根據待治療的部位和疾病而改進。示範性製劑包括但不限 於適於胃腸外給藥，例如靜脈內、動脈內、肌肉內或皮下給藥的那些，包括包裹在膠束、月旨 質體或藥物釋放膠囊(摻入為緩釋而設計的生物相容包衣中的活性劑)中的製劑；可攝 取製劑；局部應用的製劑，例如乳膏、軟膏和凝膠；和其它製劑，例如吸入劑、氣溶膠和噴霧 齊U。本發明化合物的劑型根據治療所需的程度和嚴重性、所給予組合物的活性、對象的總體 健康和技術人員熟知的其它考慮而有所不同。
可將本文所述的藥劑摻入適於給藥的藥物組合物。這種組合物通常包含藥劑和藥 學上可接受的運載體。還可將補充性活性化合物摻入組合物中。在還有另一實施方式中，局部遞送本文所述藥劑。與全身性遞送相比，局部遞送能 將藥劑非全身性遞送至，例如纖維化的部位以降低對象的全身(接觸)。可利用各種醫學移 植裝置實現這種局部遞送，所述裝置包括但不限於支架和導管。本領域建立了將所需藥劑 包衣、植入、編碼或者粘附於醫學裝置，例如支架和導管的方法，本文考慮了這些方法。植入支架已用於攜帶醫學藥劑，例如血栓溶解劑。美國專利號5，163,952公開 了熱記憶擴張塑料 支架裝置，其配製成在該支架本身的材料中攜帶醫學藥劑。美國專利 號5，092，877公開了聚合材料支架，其可具有化合物遞送相關的包衣。涉及利用生物可 降解和生物可吸收聚合物的裝置類別的其它專利包括美國專利號4，916，193、美國專利號 4，994，071。例如，美國專利號5，304，121公開了施加於支架的包衣，其由水凝膠聚合物和 預選擇的化合物，例如細胞生長抑制劑或肝素構成。美國專利號5，464，650描述了製備攜 帶治療性物質的包衣血管內支架的方法，其中聚合物包衣材料溶解於溶劑並且治療性物質 分散在溶劑中。然後在塗布後蒸發溶劑。美國專利號6，120，536描述了用於各種假體裝置，包括支架的其它類型包衣。可 利用本文所述藥劑的其它醫學或假體裝置的例子包括但不限於血液交換裝置、血管通路 埠、中心靜脈導管、心血管導管、體外迴路(extracorpeal circuit)、血管移植物、泵、心 瓣膜和心血管縫線。本發明的適用性不應視作局限於植入體設計、植入體位置或構建材料， 而無論本文公開的詳細實施方式。用本文所述藥劑包衣的裝置，包括支架和導管能將藥劑 遞送至特定或局部部位。這種部位特異性遞送可提供手段以便利用由於溶解性、全身性毒 性顧慮或其它問題而不適於全身性遞送的劑量和藥物，例如β-氨基丙腈(BAPN)和相關化 合物或其它胺氧化酶抑制劑(例如，上述L0X/L0XL的小分子抑制劑)。例如，已知可用BAPN 抑制L0X，但該化合物毒性高，從而在全身性給予時其有效應用存在問題。利用支架、導管或 其它醫學裝置遞送活性劑或化合物，例如BAPN能以靶向或局部方式使用有效劑量的化合 物，因而降低了這種化合物和目前給藥途徑相關的全身性毒性作用。7.組合物適應症本發明藥物製劑可用於治療各種疾病。本文所用的「防止」包括預防、防止症狀的發作，防止纖維化相關或L0X/L0XL活性 相關疾病或病症的進展。本文所用的「抑制」、「治療」和「緩解」可互換使用，指，例如症狀 停滯、存活延長、症狀部分或完全緩解、纖維化相關或L0X/L0XL活性相關病狀、疾病或病症 的部分或完全消除。可將治療有效量的組合物給予患者(例如，哺乳動物，如人或非人動物，如靈長 類、嚙齒類、牛、馬、豬、綿羊等)，所述有效量足夠以適用於任何醫學治療的合理效益/風險 比通過抑制疾病或病症，例如纖維化或L0X/L0XL活性相關的本文所述那些而產生所需療 效。對於本發明組合物的人給藥，可採用本領域普通技術人員已知的方法配製組合物。治 療有效量是在器官或組織中至少部分達到所需治療或預防作用的用量。在一個實例中，預 防和/或治療性治療疾病或病症所需的L0X/L0XL抑制劑用量本身不固定。L0X/L0XL抑制 劑的給予量隨疾病或病症的類型、疾病或病症的廣泛性和患有該疾病或病症的哺乳動物的 大小而有所不同。
當患者經歷疾病跡象或症狀的部分或完全緩和或減輕，特別是包括但不限於存活 延長時，視作有反應。根據預後因素，包括復發次數、疾病階段和其它因素檢測的預計無進 展存活時間是數月到數年。延長的存活包括但不限於至少1個月、約至少2個月、約至少3 個月、約至少4個月、約至少6個月、約至少1年、約至少2年、約至少3年、或更長的時間。 檢測的總體存活也是數月到數年。患者的症狀可保持停滯，或可減退。可利用本發明藥物製劑治療的非限制性適應症包括涉及不良或不受控細胞增殖 的那些適應症。這種適應症包括良性腫瘤、各種類型的癌症，例如原發性腫瘤和腫瘤轉移、 再狹窄(例如，冠狀動脈、頸動脈和大腦病損)、血液學疾病、內皮細胞的異常刺激(動脈粥 樣硬化)、外科手術對身體組織的傷害、傷口癒合異常、血管生成異常、產生組織纖維化的疾 病、黃斑變性、肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、硬皮病 、動脈粥樣硬化和阿爾茨海默病、重複 性運動障礙(i^petitive motion disorder)、未高度血管化的組織的疾病和器官移植物相 關的增殖反應。良性腫瘤中的細胞通常保留它們的分化特徵，不以完全不受控的方式分裂。良性 腫瘤通常是固定且非轉移性的。可採用本發明治療的良性腫瘤的具體類型包括但不限於 血管瘤、肝細胞腺瘤、多孔性血管瘤、灶性結節性增生、聽覺神經瘤(acoustic neuromas)、 神經纖維瘤、膽管腺瘤、膽管囊腺瘤(bileduct cystanoma)、纖維瘤、脂肪瘤、平滑肌瘤、間 皮瘤、畸胎瘤、粘液瘤、結節再生性增生、沙眼和化膿性肉芽腫。在惡性腫瘤中，細胞變得不分化、對身體的生長控制信號沒有反應並以不受控方 式擴增。惡性腫瘤是侵襲性的，能傳播到遠端部位(轉移性)。惡性腫瘤通常分成兩類原 發性和繼發性。原發性腫瘤從發現它們的組織中直接產生。繼發性腫瘤或轉移瘤是源自身 體的其它位置但現在傳播到遠端器官的腫瘤。轉移的常見途徑是在毗鄰結構中直接生長， 通過血管或淋巴系統傳播和沿著組織面和身體間隙(腹水、腦脊液等)運動。可通過本文公開的方法治療的原發性和轉移性腫瘤可包括但不限於肺癌(包 括但不限於肺腺癌、鱗狀細胞癌、大細胞癌、細支氣管肺泡癌、非小細胞癌、小細胞癌、間皮 瘤)；乳腺癌(包括但不限於導管癌、小葉癌、炎性乳腺癌、透明細胞癌、粘液癌)；結腸直 腸癌(包括但不限於結腸癌、直腸癌)；肛門癌；胰腺癌(包括但不限於胰腺腺癌、胰島細 胞癌、神經內分泌腫瘤)；前列腺癌；卵巢癌(包括但不限於卵巢上皮癌或表面上皮-間質 腫瘤，包括漿液性腫瘤、內膜樣瘤和粘液性囊腺癌、性索間質細胞瘤)；肝臟和膽管癌(包 括但不限於肝細胞癌、膽管癌、血管瘤)；食道癌(包括但不限於食道腺癌和鱗狀細胞癌)； 非-霍奇金淋巴瘤；膀胱癌；子宮癌(包括但不限於子宮內膜腺癌、子宮乳頭狀漿液性腺 癌、子宮透明細胞癌、子宮肉瘤和平滑肌肉瘤、混合型苗勒腫瘤)；神經膠質瘤、成膠質細胞 瘤、髓質母細胞瘤、和其它腦腫瘤；腎臟癌症(包括但不限於腎細胞癌、透明細胞癌、腎母細 胞瘤)；頭頸癌(包括但不限於鱗狀細胞癌)；胃癌(包括但不限於胃腺癌、胃腸道間質瘤)； 多發性骨髓瘤；睪丸癌；生殖細胞瘤；神經內分泌腫瘤；子宮頸癌；胃腸道、乳腺和其它器官 的類癌；和印戒細胞癌。間充質腫瘤可包括但不限於肉瘤、纖維肉瘤、血管瘤、血管瘤病、血管外皮細胞瘤、 假血管瘤性間質性增生、成肌纖維胞瘤、纖維瘤病、炎性成肌纖維胞瘤、脂肪瘤、血管脂肪 瘤、顆粒細胞瘤、神經纖維瘤、神經鞘瘤、血管肉瘤、脂肉瘤、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤、平滑肌瘤 和平滑肌肉瘤。
可採用本發明治療的癌症或惡性腫瘤(原發性或繼發性)的具體類型還包括但不 限於皮膚癌、骨癌、腦癌、喉、膽囊、胰腺、甲狀旁腺、甲狀腺、腎上腺、神經組織、頭和頸、支 氣管的癌症、基底細胞癌、潰瘍性和乳頭型鱗狀細胞癌、轉移性皮膚癌、骨肉瘤、尤因肉瘤、 網狀細胞肉瘤(veticulum cell sarcoma)、骨髓瘤、巨細胞瘤、小細胞肺腫瘤、膽結石、胰島 細胞腫瘤、原發性腦腫瘤、急性和慢性淋巴細胞和粒細胞腫瘤、毛細胞腫瘤、腺瘤、增生、髓 樣癌、嗜鉻細胞瘤、黏膜神經瘤(mucosal neuronms)、腸神經節瘤、增生性角膜神經腫瘤、馬 方體質腫瘤(marfanoid habitus tumor)、精原細胞瘤、卵巢腫瘤、平滑肌腫瘤、宮頸非典型 增生和原位癌、成神經細胞瘤、視網膜母細胞瘤、軟組織肉瘤、惡性類癌、局部皮膚病損、真 菌病(mycosis fimgoide)、橫紋肌肉瘤、卡波西肉瘤、成骨肉瘤和其它肉瘤、惡性高鈣血症、 腎細胞腫瘤、紅細胞增多症、腺癌、多形性成膠質細胞瘤(glioblastoma multiforma)、白血 病、淋巴瘤、惡性黑色素瘤、表皮狀癌、和其它癌及肉瘤。血液學病症包括可導致血細胞發育異常改變的血細胞異常生長和血液學惡性腫 瘤，例如各種白血病。血液學病症的例子包括但不限於急性髓細胞性白血病、急性前髓細 胞性白血病、急性成淋巴細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、骨髓增生異常症候群和鐮狀 細胞性貧血。急性髓細胞性白血病(AML)是在成年人中最常發生的急性白血病類型。幾種遺傳 病和免疫缺陷狀態與AML風險增加有關。這些病症包括DNA穩定性有缺陷的、導致隨機染 色體斷裂的病症，例如布盧姆症候群、範康尼貧血、L-F宗族(Li-Fraumeni kindreds)、運動 失調性毛細血管擴張症和χ連鎖無丙種球蛋白血症。急性前髓細胞性白血病(APML)代表了 AML的不同亞組。該亞型的特徵在於含有 15 ；17染色體易位的前髓細胞性胚細胞。該易位導致產生由視黃酸受體和序列PML組成的 融合轉錄物。急性成淋巴細胞性白血病(ALL)是由各種亞型體現出不同臨床特徵的異源疾病。 ALL顯示重現性細胞遺傳異常(reoccurring cytogeneticabnormality)。最常見的細胞遺 傳異常是9;22易位。得到的費城染色體(Philadelphia chromosome)表示患者的預後不佳。慢性髓細胞性白血病(CML)是多能幹細胞的無性骨髓增生病。CML的特徵在於特 定染色體異常，其涉及染色體9和22易位，從而產生費城染色體。電離輻射與CML的產生有關。骨髓增生異常症候群(MDS)是因為在包括骨髓、紅細胞和巨核細胞譜系在內的一 個或多個造血譜系中存在發育異常改變而分成一組的異源無性造血幹細胞病。這些改變在 這三種譜系的一種或多種中導致細胞減少。患有MDS的患者通常產生貧血、嗜中性白細胞 減少症(感染)或血小板減少症(出血)相關的併發症。通常約10% -約70%的MDS患 者產生急性白血病。對於各種外科手術過程，包括關節外科手術、腸外科手術和瘢痕瘤瘢痕形成，治療 外科手術期間的身體組織傷害導致異常細胞增殖是可能的。產生纖維化組織的疾病包括肺 氣腫。可採用本發明治療的重複性運動障礙包括腕管症候群。可採用本發明治療的細胞增 殖性病症的例子是骨腫瘤。可採用本發明治療的器官移植相關增殖性反應包括導致潛在的器官排斥或相關併發症的增殖性反應。具體地說，這些增殖性反應可在心臟、肺、肝臟、腎臟和其它身體器官 或器官系統的移植期間發生。本文所述藥物製劑可用於預防或治療將膠原交聯或纖維化增加作為它們病因一 部分的各種疾病。例如，所述組合物的適應症還可包括纖維化。纖維化是可作為受傷組織 中傷口癒合過程一部分而發生的纖維組織異常累積。物理損傷、炎症、感染、接觸毒素和其 它原因可導致這種組織傷害。纖維化的例子包括皮膚瘢痕形成、瘢痕瘤、肝纖維化、肺纖維 化(例如，矽肺、石棉沉著病)、腎纖維化(包括糖尿病性腎病)和腎小球硬化症。其它例子 包括但不限於肺氣腫和慢性阻塞性肺病(COPD)；多發性硬化症；慢性哮喘；動脈粥樣硬化； 類風溼性關節炎；青光眼；和年齡相關的黃斑變性(溼性AMD和乾性AMD)。
心血管纖維化本發明還提供用於治療或預防與心血管疾病，例如充血性心力衰竭、心肌病、心肌 梗塞後心臟功能缺陷、高血壓性心臟病(HHD)、心肌梗塞(Ml)、動脈粥樣硬化、再狹窄(例 如，冠狀動脈、頸動脈和腦損傷)和心臟缺血事件相關心臟病有關的心血管或心臟纖維化 的組合物、方法、系統、醫學裝置和試劑盒。特定賴氨醯氧化酶的表達可與心肌梗塞後的炎性反應和傷口癒合的不同階段有 關。通過特異性抑制下遊纖維化反應相關的特定賴氨醯氧化酶，可避免心臟重塑和傷口愈 合的有害後果，同時發生即時MI後的修復/癒合過程。MI後的治癒反應可誘導L0X/L0XL表達，但如果該過程繼續下去，未經檢查的過度 交聯導致胞外基質重塑或纖維化，從而造成心臟機能失調。破壞基質和交聯的膠原或彈性 蛋白的酶看來起作用較慢或效率不高，因此交聯事件佔上風。除了基質重塑外，由於LOX/ LOXL在上皮-間充質過渡(EMT)中也起作用，其進一步造成心肌細胞重塑和心肌細胞肥大。MI誘導的初始修復性纖維化是有益的(例如，防止動脈瘤和相關的損傷)，可不受 阻礙地進行。然而，雖然不想受特定理論或作用機制的束縛，但本發明人相信在這種修復性 纖維化階段後開始抗-L0X/L0XL治療能減弱導致心臟機能失調的反應性(不當的)纖維 化。例如，可在MI後2、4、6、8、10、12、14、16、16、20、22、24、36、48或更多小時(包括其間的 所有整數)開始抗-L0X/L0XL治療。此外，可在MI後2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或 更多天開始抗-L0X/L0XL治療。類似地，血壓升高(高血壓)導致心臟組織中膠原沉積增 加和蛋白質降解減少(Berk等，J.Clin. Invest.，117 (3) :568_575 (2007))。高血壓性心臟 病或高血壓診斷和/或確定後開始抗-L0X/L0XL治療能預防、降低或緩解高血壓相關的纖 維化。可在診斷或檢測到血壓或全身血壓升高後的2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或 更多天開始這種抗-L0X/L0XL治療。在一些實施方式中，可利用生物標記測定不適當水平的交聯何時可能發生LOX 水平已顯示與C反應性蛋白(CRP)- —種常用的生物標記-有關，當CRP水平高於合適的正 常水平時可開始治療。現有方法和測試試劑盒能更直接地檢測尿液或血液中交聯膠原端肽 的釋放。這些膠原片段的水平升高可表明從修復性纖維化向反應性(不當的)纖維化過渡。 此外，可檢測心臟功能和輸出量，包括與心室有效收縮相關的那些。在一些實施方式中，預見治療持續時間有限。治療只要持續足夠長，從而能防止或 減弱反應性纖維化以防止或減輕心臟機能失調即可。例如，當需要較短的治療持續時間時， 可利用短效Fab抗體片段。或者，可在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多周(包括其間的所有天數)中，利用有限劑量的血清半衰期較長的全長抗體。可採用心臟功能的標準測 試連同評估上述相關生物標記來監測進展並視需要調節劑量。治療持續時間有限提高了該 方法的安全性。用於本文所述組合物給藥的適應症還包括心血管適應症以外發現的纖維化。纖維 化是可作為受傷組織中傷口癒合過程一部分而發生的纖維組織異常累積。物理損傷、炎症、 感染、接觸毒素和其它原因可導致這種組織傷害。纖維化的例子包括皮膚瘢痕形成、瘢痕 瘤、肝纖維化、肺纖維化(例如，矽肺、石棉沉著病)、和腎纖維化(包括糖尿病性腎病和腎小 球硬化症)。此外，纖維化和膠原沉積參與澱粉樣蛋白斑塊的形成，因而造成阿爾茨海 默病的產生和進展。本文所述組合物還考慮可用於治療、預防和/或緩解以下纖維化病症。 皮膚瘢痕和瘢痕瘤形成已知皮膚瘢痕和瘢痕瘤形成涉及過量膠原沉積和/或膠原沉積失調。相對於受傷 皮膚組織的正常成纖維細胞重塑的這種偏差可導致厚而難看的瘢痕。瘢痕瘤已知部分是 傷口癒合失調和隨後膠原沉積升高所致。與正常傷口癒合中所見的瘢痕不同，瘢痕瘤不會 隨時間而褪色或復原。雖然瘢痕瘤通常是良性的皮膚腫瘤，但它們不好看且可累積成更成 問題的皮膚變形禾口 / 或病損(Appleton, I 等，Apoptosis, Necrosis, and Proliferation PossibleImplications in the Etiology of Keloids (凋亡、壞死和增殖可能涉及瘢痕 瘤病因學)，Am. J. Pathol. ,149(5) 1441-1447 (1996))。膠原在皮膚中的累積也涉及硬皮 病-皮膚組織增厚或變硬的許多病症的通用術語，它們的共同特徵是成纖維細胞導致皮 膚組織中膠原的過度產生或失調(Akagi，A等.，Expression of Type XVI Collagen in Human Skin Fibroblasts :EnhancedExpression in Fibrotic Skin Disease (人皮膚成 纖維細胞中XVI型膠原的表達纖維化皮膚疾病中表達增強)，J. Invest. Dermatol. ,113 246-250(1999))。由於膠原沉積在纖維化皮膚病，例如硬皮病和瘢痕瘤形成中的核心作用， 本文所述組合物可用於預防、治療和/或緩解纖維化皮膚病，包括但不限於硬皮病和瘢痕 瘤形成。肝纖維化肝臟纖維化涉及許多肝臟疾病的病理學過程。如前所述，纖維化可作為血色病、 威爾遜病、酒精中毒、血吸蟲病、病毒性肝炎、膽管阻塞、接觸毒素和代謝紊亂的併發症而發 生。不作檢查，肝纖維化會發展成肝硬化(定義為存在包裹的結節)、肝衰竭和死亡。本文公開的組合物和方法可治療肝纖維化，包括但不限於肝硬化和相關病症，例 如慢性病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、酒精性脂肪肝(ASH)、非酒精性脂肪肝 (NASH)、原發性膽汁性肝硬變(PBC)、膽汁性肝硬變和自身免疫性肝炎。例如寄生蟲和病毒感染(例如，HBV、HCV、HIV、血吸蟲)等來源或酒精消費的長 期應激對肝臟的長期傷害通常導致肝臟重塑，可能包裹受損區域並保護其餘肝臟組織免 遭傷害(Li 和 Friedman，Gastroenterol. Hepatol. 14 :618_633，1999)。肝臟纖維化導致 胞外基質改變，包括總膠原含量增加3-10倍和低密度基膜被高密度基質替換，從而損害 了肝細胞、肝臟星形細胞和內皮細胞的代謝和合成功能(Girogescu，Μ.，Non-invasive Biochemical Markers of LiverFibrosis (肝臟纖維化的非侵襲性生物化學標記)， J. Gastrointestin. Liver Dis. , 15(2) 149-159 (2006))。因此，本文所述的組合物可用於 預防、治療和/或緩解纖維變性肝臟疾病，本文考慮了這種應用。
腎臟纖維僕,與肝臟纖維化相似，各種疾病和對腎臟的傷害可導致腎臟纖維化。這種疾病和傷 害的例子包括慢性腎臟疾病、代謝症候群、膀胱輸尿管反流、小管間質性腎臟纖維化、糖尿 病(包括糖尿病性腎病)和造成的腎小球腎炎(GN)，包括但不限於局灶性節段性腎小球硬 化和膜性腎小球腎炎、腎小球毛細血管性GN。現已了解到代謝症候群是包括糖尿病標誌，例如胰島素耐受性以及中樞或內臟肥 胖和高血壓在內 的一組異常情況。在幾乎所有的情況中，葡萄糖失調刺激細胞因子釋放和 上調胞外基質沉積。導致慢性腎臟疾病、糖尿病、代謝症候群和腎小球腎炎的其它因素包括 高脂血症、高血壓和蛋白尿，所有這些進一步傷害腎臟並進一步刺激胞外基質沉積。因此， 不管原發性誘因是什麼，對腎臟的傷害可導致腎臟纖維化和相伴的腎臟功能喪失(Schena， F.禾口 Gesualdo, L. , Pathogenic Mechanisms of Diabetic Nephropathy (糖尿病性腎病 的病理學機制),J. Am. Soc. ^phrol.，16 :S30_33 (2005) ；Whaley-Connel 1, A.，和 Sower, J. R. , Chronic Kidney Disease and the Cardiometabolic Syndrome (慢性腎病禾口心臟代 謝症候群)，J.Clin.Hypert. ,8(8) :546_48 (2006))。因此，本文所述的組合物可用於預防、 治療和/或緩解纖維變性腎病(慢性腎病、糖尿病性腎病、腎小球腎炎、代謝症候群)，本發 明考慮了這種應用。肺纖維化肺纖維化包括許多症候群和疾病。示範性疾病包括特發性肺纖維化(EPF)、特發性 間質性肺炎和急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。肺纖維化還可包括但不限於隱原性纖維化肺 泡炎、慢性纖維形成性間質肺炎、間質性肺病(ILD)和彌散性實質性肺病(DPLD)。包括上述疾病在內的大多數肺纖維化的病理學機制尚不十分清楚，然而，所 有疾病均表徵為炎性細胞的內流和隨後富含膠原的胞外基質的合成及沉積增加(Chua φ, Am J. Respir. Cell. Mol. Biol. ,33 9-13(2005) ；Tzortzaki ， J. Histochem. & Cytochem. ,54(6) 693-700 (2006) ；Armstrong 等，Am. J. Respir. Crit. Care Med. ，160 1910-1915(1999))。由於膠原和胞外基質沉積增加在肺纖維化中確有作用，本文所述組合 物可通過抑制L0X/L0XL而用於肺纖維化的預防、治療和/或緩解。阿爾茨海默病阿爾茨海默病是特徵在於澱粉樣蛋白斑塊累積導致神經元喪失的漸進性神 經變性疾病，還知道阿爾茨海默病中賴氨醯氧化酶活性增加(Gilad等，Neurosci. Lett.， 376(3) :210-13(2005))。澱粉樣蛋白-β含有代表L0X/L0XL活性靶標的多個賴氨酸殘基， 因此，抑制L0X/L0XL能治療、預防或緩解阿爾茨海默病中澱粉樣蛋白斑塊的累積。還知道 澱粉樣蛋白-β斑塊構成其它蛋白質。導致澱粉樣蛋白斑塊形成和含量的一種這樣的 蛋白質是稱為CLAC-P的膠原蛋白。CLAC-P的結構類似於XIII型膠原，但其分布在神經元 中。CLAC-P結合澱粉樣蛋白-β並導致澱粉樣蛋白-β斑塊形成(Soederberg等，J.Biol. Chem.，280(2) 1007-1015 (2005))。因此，本文所述的組合物可用於預防、治療和/或緩解 阿爾茨海默病，包括但不限於防止澱粉樣蛋白-β斑塊形成以及降低澱粉樣蛋白斑塊 的持續性。可採用本文所述方法和組合物治療或預防的異常血管生成包括伴有以下疾病的 異常血管生成類風溼性關節炎、缺血_再灌注相關的腦水腫和損傷、皮質缺血、卵巢超常增生和過度血管形成(hypervascularity)、(多囊性卵巢症候群)、子宮內膜異位、銀屑 病、糖尿病性視網膜病、和其它眼部血管生成疾病，例如早熟性視網膜病變(retinopathy of prematurity)(晶狀體後纖維形成)、肌變性、角膜移植排異、新生血管性青光眼 (neuroscular glaucoma)禾口 OW 症候群(Oster Webber syndrome)。異常血管生成相關疾病需要或誘導血管生長。例如，角膜血管生成包括3個階段 前_血管潛伏期，活性新血管生成和血管成熟及消退。各種血管生成因子，包括炎性反應的 元素，例如白細胞、血小板、細胞因子和類花生酸類物質，或未鑑定的血漿成分的本體和機 制尚待揭示。在另一實施方式中，本發明的藥物製劑可用於治療不良或異常血管生成相關疾 病。該方法包括組合給予患不良或異常血管生成的患者L0X/L0X抑制劑和並非所述LOX/ LOXL抑制劑的抗瘤劑或抗血管生成劑。抑制血管生成和/或血管生成疾病所需的這些藥劑 的具體劑量可取決於病症的嚴重性、給藥途徑和可由主治醫師決定的相關因素。所接受和 有效的每日劑量通常是足以有效抑制血管生成和/或血管生成疾病的用量。按照該實施方式，本發明的藥物製劑可用於治療不良血管生成相關的各種疾病， 例如視 網膜/脈絡膜新血管生成和角膜新血管生成。視網膜/脈絡膜新血管生成的例子 包括但不限於貝斯特病(Bests diseases)、近視、視窩(胚胎)、斯塔格特病(Stargarts diseases)、佩吉特病、靜脈阻塞、動脈阻塞、鐮狀細胞性貧血、結節病、梅毒、彈性纖維假 黃瘤、慢性非特異性呼吸阻塞性疾病(carotid abostructive diseases)、慢性眼葡萄膜 炎/玻璃體炎、分枝桿菌感染、萊姆病、全身性紅斑狼瘡、早熟性視網膜病變、伊爾斯病、 糖尿病性視網膜病、黃斑變性、貝切特病(Bechets diseases)、導致視網膜炎或脈絡膜炎 (chroiditis)的感染、假定的眼組織胞漿菌病、扁平部睫狀體炎、慢性視網膜剝離、高濃度 症候群、弓形體病、外傷和雷射後併發症(post-lasercomplication)、發紅(rubesis)相 關疾病(眼角(angle)的新血管生成)和纖維血管或纖維組織異常增殖導致的疾病，包括 所有形式的增殖性玻璃體視網膜病變。角膜新血管生成的例子包括但不限於流行性角 (膜)結膜炎、維生素A缺乏、接觸鏡過度佩帶、特發性角膜炎、高級邊緣角膜炎(superior limbickeratitis)、乾燥型翼狀胬肉角膜炎(pterygium keratitis sicca)、斯耶格倫綜 合徵(s jogrens)、紅斑痤瘡、小水皰病(phylectenulosis)、糖尿病性視網膜病、早熟性 視網膜病變、角膜移植排異、蠶食性角膜潰瘍、特裡昂邊緣變性(Terrien' s marginal degeneration)、邊緣角質層分離(marginal keratolysis)、多動脈炎、華格納肉樣瘤病 (Wegener sarcoidosis)、鞏膜炎、類天皰瘡樣放射性角膜切開術(periphigoid radial keratotomy)、新生血管性青光眼和晶狀體後纖維組織增生症、梅毒、分枝桿菌感染、脂質變 性、化學品燒灼(chemicalbums)、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純皰疹病毒感染、帶狀皰疹感 染、原生動物感染和卡波西肉瘤。在還有另一實施方式中，本發明藥物製劑可用於治療異常血管生成相關的慢性炎 性疾病。該方法包括組合給予患有異常血管生成相關慢性炎性疾病的患者L0X/L0XL抑制 劑與並非所述L0X/L0XL抑制劑的抗瘤劑或抗血管生成劑。慢性炎症取決於連續形成毛細 管抽芽以維持炎性細胞的內流。內流和炎性細胞的存在產生肉芽腫，因此，維持了慢性炎性 狀態。利用本發明藥物製劑抑制血管生成可防止肉芽腫形成，從而緩解疾病。慢性炎性疾 病的例子包括但不限於炎性腸病，例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎、銀屑病和類風溼性關節炎。炎性腸病，例如克羅恩病和潰瘍性結腸炎的特徵在於胃腸道中各個部位的慢性炎 症和血管生成。例如，克羅恩病是主要影響遠端迴腸和結腸的慢性透壁炎性疾病，但也可能 發生在自口至肛門和肛周區域的胃腸道任何部分。克羅恩病的患者通常具有異常疼痛、發 熱、厭食症、體重喪失和異常腫脹相關的慢性腹瀉。潰瘍性結腸炎也是在結腸黏膜中發生的 慢性、非特異性、炎性和潰瘍性疾病，其特徵在於有血性腹瀉存在。這些炎性腸病通常由遍 布胃腸道的慢性肉芽腫炎症導致，包括炎性細胞圓柱體所圍繞的新毛細管抽芽。利用本發 明藥物製劑抑制血管生成應能抑制抽芽形成並防止肉芽腫形成。炎性腸病還有腸外表現， 例如皮膚病損。這種病損的特徵在於炎症和血管生成，可發生在胃腸道以外的許多部位。利 用本發明藥物製劑抑制血管生成應能降低炎性細胞的內流並防止病損形成。結節病是另一種慢性炎性疾病，其特徵在於是多系統肉芽腫疾病。該疾病的肉芽 腫可以在身體的任何部位形成，因此，症狀依賴於肉芽腫的部位和該疾病是否活躍。血管生 成性毛細管抽芽產生肉芽腫，從而持續供應炎性細胞。利用本發明藥物製劑抑制血管生成， 可抑制這種肉芽腫形成。銀屑病也是慢性和復發性炎性疾病，其特徵在於各種大小的丘疹 和斑塊。利用本發明藥物製劑治療應能防止維持特徵性病損所需的新血管形成並減輕患者 的症狀。類風溼性關節炎(RA)也是慢性炎性疾病，其特徵在於外周關節的非特異性炎症。 據信，關節的滑液襯裡中的血管經歷血管生成。除了形成新的血管網絡，內皮細胞還釋放導 致血管翳生長和軟骨破壞的因子和活性氧中間體。參與血管生成的因子可積極促進並幫助 維持類風溼性關節炎的慢性發炎狀態。單用本發明藥物製劑或與其它抗-RA藥劑聯用來治 療可防止維持慢性炎症所需的新血管形成並減輕RA患者的症狀。8.疾病診斷本發明還提供利用識別不同形式的LOX或LOXL的試劑來診斷、監測、分期或檢測 上述疾病的方法。例如，為此目的可利用針對不同形式的LOX或LOXL (分泌、成熟形式的前 蛋白原)的上述抗體。如上所述，成熟LOX或LOXL被切割，可根據其分子量的改變(免疫印跡)或利用檢 測未切割與切割形式的L0X/L0XL的抗體以及採用各種檢測方法，例如免疫組化方法(IHC) 進行細胞定位來檢測。據信，胞外基質和條件化培養基(例如，參見實施例4)應含有經蛋白酶解加工的 LOX或L0XL，而未切割的L0X/L0XL應定位於胞內。由於從胞外空間攝取，在胞內也可檢測 到一些切割的L0X/L0XL。可以收集個體的樣品，並通過測定無活性或活性LOX水平或不同形式L0X/L0XL水 平進行分析。可先進行該項分析，再開始利用賴氨醯氧化酶-特異性療劑的治療以鑑定活 性L0X/L0XL表達或活性升高的腫瘤。可利用任何樣品進行這種診斷分析，所述樣品包括但 不限於細胞、細胞的蛋白質或膜提取物，諸如痰、血液、血清、血漿或尿液等生物學液體，或 諸如組織樣品、福馬林_固定或冷凍的組織切片等生物學樣品。可採用任何合適的方法來檢測和分析無活性和/或活性L0X/L0XL。本文所用的 術語「樣品」指人、動物的樣品，或指研究樣品，例如，細胞、組織、器官、液體、氣體、氣溶膠、 漿液、膠體或凝結物質。可在體內測試樣品，例如無需從人或動物中取出，或者可在體外測試。可在加工後，例如通過組織學方法測試樣品。術語「樣品」還指新鮮取自人或動物的細 胞、組織、器官或液體，或指經加工或保存的細胞、組織、器官或液體。一個實施方式提供診斷對象的癌症轉移的方法，包括評估血液中活性LOX或 LOXL水平或活性，與參比樣品相比，血液中活性LOX或LOXL水平或活性改變表明有轉移性 腫瘤生長存在。在一些情況中，血液中活性LOX或LOXL水平或活性可以低於較早檢測的， 表明該對象的癌症轉移風險較高；癌症已轉移；或者癌症轉移增加。
另一實施方式提供診斷具有腫瘤的對象中癌症轉移的方法，包括評估腫瘤中活性 LOX或LOXL水平或活性，與參比樣品相比，該腫瘤中活性LOX或LOXL水平或活性改變表明 有轉移性腫瘤生長存在。在一些情況中，腫瘤中活性LOX或LOXL水平或活性可以高於較早 檢測的，表明該對象的癌症轉移風險較高；癌症已轉移；或者癌症轉移增加。參比樣品可源自同一對象，在不同時間取自同一腫瘤或者取自身體的其它部位， 或取自另一個體。檢測活性L0X/L0XL水平可採取免疫測定的形式，其用針對該蛋白的抗體檢測活 性LOX或LOXL蛋白是否存在，例如，特異性結合活性或分泌LOX或LOXL的抗體。免疫測定還可與雷射誘導的螢光聯用(參見，例如各自通過引用納入本文的 Schmalzing 禾口 Nashabeh，Electrophoresis 18 2184~93(1997)；禾口 Bao，J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. 699 :463_80 (1997))。還可按照本發明的方法，利用脂質體免疫測定，例如流 動_注射脂質體免疫測定和脂質體免疫傳感器來測定活性LOX或L0XL2水平(Rongen等， J. Immunol. Methods 204:105-133(1997))。免疫測定，例如酶聯免疫吸附測定(ELISA)特 別適用於本發明方法。還可採用放射性免疫測定來檢測樣品對活性LOX或LOXL是否呈陽 性或檢測活性LOX或LOXL的水平。可採用的放射性免疫測定利用，例如碘-125標記的第 二抗體。此外，可檢測活性LOX或LOXL的活性，因而可忽略無活性酶的含量。可利用含 標記賴氨酸的可溶性彈性蛋白或可溶性膠原作為底物，採用多種方法檢測活性LOX或 LOXL 的酶活性。活性試驗的細節見 Royce 等，「Coppermetabolism in mottled mouse mutants.The effect of copper therapy on lysyloxidase activity in brindled(Mobr) mice(雜色小鼠突變體的銅代謝.銅治療對有斑紋(Mobr)小鼠中賴氨醯氧化酶活性的 作用)」Biochem J. 1982年2月15日；202 (2) :369_371。可採用生色試驗。其中一種 JS^iPalamakumbura "A f luorometric assay for detection of lysyl oxidase enzyme activity inbiological samples (檢測生物學樣品中賴氨醯氧化酶活性的螢光試 驗)」AnalBiochem.2002 年 1 月 15 日；300 (2) :245_51。本文還提供監測對象對治療的反應的方法，包括L0X/L0XL的調節劑，例如癌症、 腫瘤和纖維變性疾病的治療。該方法包括給予對象LOX或LOXL調節劑後檢測該對象中 C-反應活性蛋白或其它急性期反應物水平的改變，其中有改變表明該LOX或LOXL調節劑對 該患者有療效。C-反應活性蛋白是全身性炎症的重要藥效學標記。此外，認為C-反應活 性蛋白提高了 LOX 表達(Li 等，Circulation Research ； (2004) 95 877)。因此，不想受理 論的束縛，與給予LOX或LOXL抑制劑之前相比，C-反應活性蛋白(例如，在對象的血液樣 品中)的水平降低表明該對象對利用LOX或LOXL抑制劑進行治療有反應。方法包括監測 C-反應活性蛋白的水平是升高還是降低，從而表明對象對該治療的反應。
另一實施方式還提供監測對象對治療的反應的方法，包括L0X/L0XL的調節劑，例 如癌症、腫瘤和纖維變性疾病的治療。該方法包括給予對象LOX或LOXL調節劑後檢測該 對象中膠原端肽水平或羥脯氨酸含量的改變，其中有改變表明該LOX或LOXL調節劑對該患 者有療效。所述改變可以是升高或降低。例如，膠原端肽或羥脯氨酸含量降低可以表明有 療效。雖然描述和示出了本發明的示範性實施方式，但普通技術人員可以作出本文所述 發明的許多改進、改變和替代方式，它們無一脫離本發明的構思。因此，所有這些改變、改進 和替代方式應視作屬於本發明的範圍。提供以下實施例是為了說明而非限制 本發明。
實施例實施例1 :EMT/MET試驗為檢測細胞是否處於EMT或MET狀態，用上皮或間充質狀態的細胞蛋白標記，例如 E-鈣粘蛋白、波形蛋白、纖連蛋白和鬼筆毒環肽的特異性抗體染色細胞來檢測F-肌動蛋白 (圖 4)。 羅丹明鬼筆毒環肽染色方案染色之日前24小時接種細胞；24小時後細胞在8_室載玻片中生長至約80%匯 合。隨後一天，吸出培養基，用IX PBS清洗小室。然後在室溫下，用4%低聚甲醛(PFA)固 定細胞20分鐘，再用IX PBS清洗一次。室溫下，用PBS配製的0.5%皂苷(新澤西州菲利 浦斯勃格市JTB公司(JTBaker，Phillipsburg，NJ))處理細胞5分鐘進行透化處理。用IX PBS小心清洗小室一次，向細胞中加入PBS配製的羅丹明鬼筆毒環肽的1 100稀釋液(加 利福尼亞州卡爾斯巴德市英傑公司(Invitrogen，Carlsbad，Ca))，室溫下培育15分鐘。用 IX PBS清洗小室兩次，給載玻片裝上Vectashield (加利福尼亞州伯林格姆市的載體實驗 室(Vector Laboratories，Burlingame，CA))οE-鈣粘蛋白染色方案染色之日前24小時接種細胞；隨後一天細胞在8-室載玻片中生長至約80%匯 合。隨後一天，吸出培養基，用IX PBS清洗小室。然後用冰冷卻的甲醇固定細胞，然後 在-20°C培育2分鐘。細胞用IX PBS清洗一次，向載玻片小室中加入1微克/毫升新澤西 州吉布斯城蓋爾生物化學公司(Calbiochem，Gibbstown，NJ)的E-鈣粘蛋白抗體。載玻片 在37°C再培育1小時。用IX PBS小心清洗小室後，加入第二抗體(抗-小鼠IgG cy3偶連 的，賓夕法尼州西格羅夫市傑克遜免疫研究公司(Jackson Immuno Research,West Grove, Pa))，室溫下培育30-45分鐘。用IX PBS清洗小室兩次，裝上Vectashield (加利福尼亞州 伯林格姆市的載體實驗室)。實施例2 在內源性表達顯著水平L0X/L0XL的細胞中降低EMT/促進MET的LOX/ LOXL抑制劑的試驗BT-549、Hs5788t、MDA-MB-231 或 NCI-H226 細胞表達顯著水平的 L0X/L0XL 並處 於EMT或EMT樣狀態。將細胞以約25-50%匯合接種於紐約州羅徹斯特市N&N國際公司 (Nalgene Nunc International. Rochester,NewYork)的 8-孔室玻璃載玻片上。細胞在含 氧量低(2%氧)、缺氧(0.02%氧)或含氧量正常(21%氧)的條件下培育18小時。將L0X/L0XL抑制劑(例如，抗-L0X/L0XL抗體、L0X/L0XLsiRNA、L0X/L0XL shRNA、小分子抑制劑，例如β APN或D-青黴胺(D-penaciIlamine))和對照(例如，LOX/LOXL有 義寡核苷酸、無關對照抗體、小分子載體，例如DMSO)加入細胞培養液。通過RT-PCR和免疫 印跡分析測定LOX/LOXL水平。48-72小時後，按照實施例1染色細胞。用L0X/L0XL有義寡核苷酸轉染的細胞應 維持EMT特徵性的陽性波形蛋白或纖連蛋白染色以及E-鈣粘蛋白染色水平低，而F-肌動 蛋白的鬼筆毒環肽染色顯示延長和重塑的肌動蛋白細胞骨架。用未有效靶向L0X/L0XL從 而不能實現EMT細胞的MET誘導的候選L0X/L0XL抑制劑處理的細胞也應維持這些EMT特 徵。 用L0X/L0XL抑制劑處理的細胞應減少EMT特徵並表現出E-鈣粘蛋白染色增強和 波形蛋白或纖連蛋白染色降低或可忽略的MET特徵。這些細胞的羅丹明-鬼筆毒環肽染色 應顯示更緊實和規則的肌動蛋白細胞骨架。還採用侵入/遷移試驗來評估細胞的EMT和MET表型，因為侵入和遷移能力增加 與EMT有關(參見，例如Bedogni等，Cancer Res. 64 =2552-2560 (2004)) 使細胞血清消除 24小時，然後將IO4-IO6個細胞一式三份接種在包被和未包被的插片上(例如，BD生物科學 公司(BD Biosciences)的Matrigel 包被插片)，在含氧正常或氧氣消除的條件下培育24 小時(例如，在含氧正常/低氧條件下L0X/L0XL表達不同，如圖33所示)。在整個實驗期 間繼續用L0X/L0XL抑制劑和對照處理。維持EMT狀態的細胞應是侵襲性和遷移性的，與MET細胞相比，更能侵入通過 Matrigel 包被的插片或通過其它表面修飾的插片遷移。採用傷口癒合或刮擦試驗進行類 似分析，其中利用移液管尖在細胞的匯合菌苔中作出擦痕。利用顯微鏡在24-96小時期間 監測該擦痕。侵襲性和遷移性更強的EMT狀態細胞應比侵襲性或遷移性更弱的細胞更快填 充該擦痕。選擇減弱EMT或促進MET的那些L0X/L0XL抑制劑作為進一步開發的候選對象。如圖26A和B所述，篩選抑制細胞侵襲和遷移的mAb。純化和濃縮篩選的最終P印2 上清液(M063-M082，各為50ng和200ng)。使MDA MB 231細胞血清消除24小時，並以20，000 個細胞/孔接種入無血清培養基中。用50ng和200ng抗體血清一式三份處理細胞，並培育 48小時。用鈣黃綠素AM染色侵襲性細胞，用96孔螢光讀數計檢測螢光(485nm激發，520 發射)。實施例3 用L0X/L0XL轉染的細胞檢驗降低EMT/促進MET的L0X/L0XL抑制劑的 試驗MDCK、MCF-7或SW620細胞不表達顯著水平的L0X/L0XL並處於EMT狀態。用表達 L0X/L0XL的質粒轉染細胞以在細胞中誘導EMT (參見，例如圖6)。將轉染的細胞在含氧量正 常(21%氧)、含氧量低(2%氧)或缺氧(0.02%氧)的條件下培育18小時。通過RT-PCR 和免疫印跡分析測定L0X/L0XL表達水平。用L0X/L0XL抑制劑和對照處理轉染的細胞，如實施例2所述測定MET/EMT狀態。 通過RT-PCR和免疫印跡分析測定L0X/L0XL的表達水平。有效的L0X/L0XL抑制劑應阻止轉染細胞的EMT狀態，或誘導其MET(圖7)。用 L0X/L0XL有義寡核苷酸處理的轉染細胞應處於EMT狀態，與未經處理，或用對照，例如無關 對照抗體處理的轉染細胞一樣。如實施例1所述分析處理的轉染細胞的EMT/MET狀態。還如實施例2所述採用侵入和/或遷移試驗分析細胞。選擇減弱EMT和促進MET的那些L0X/L0XL抑制劑作為進一步開發的候選對象。
實施例4 用條件化培養基(CM)處理的細胞檢驗降低EMT/促講MET的L0X/L0XL 抑制劑的試驗從CHO細胞製備CM:將CH0-Loxl2細胞接種入含25ml培養基(MEM+10% FBS,完全的)的T175燒瓶。 48小時後，將培養基替換為20ml SFMII培養基(此時細胞90-95%匯合)。72小時後收集 培養液並經22uM聚乙烯濾膜過濾。利用阿米康(amicon) (15kD截斷值)濃縮器將過濾的 培養液濃縮20-25倍。製備9-10燒瓶的20ml培養液以製得8ml濃縮的條件化培養基以供實驗。用CM處理細胞先將MCF-7細胞以每孔50，000個細胞接種於8_室載玻片，1天後用CM處理。用 完全培養基(MEM+10% FBS, IX L-穀氨醯胺)接種細胞。將500 μ lCho-Loxl2細胞的新鮮 條件化培養基加入含有MCF7細胞的小室。細胞與CM培育48小時。MCF7野生型細胞的條 件化培養基用作負對照。與CM培育48小時後，用羅丹明鬼筆毒環肽染色細胞(圖8)。實施例5 利用條件化培養基(CM)處理細胞的抗_L0XL2mAb阻斷試騎將MDA-MB-231(圖9、10、12)或Hs578t細胞(圖11)以80%匯合接種在T75燒瓶 中，在DMEMUO% FBS和IX L-穀氨醯胺中培養。這些細胞生長72小時以獲取實驗所用的 CM。72小時後，簡單離心CM以除去死細胞和碎片，將CM置於已經以每孔50，000個細胞接 種在8-室載玻片中的MCF-7細胞(圖10、11)或SW620細胞(圖12)上。通常在與條件化 培養基培育48小時後觀察到EMT-樣表型改變。MCF-7或SW620CM用作負對照。進行了兩 個不同的實驗以證明抗-Ioxl mAb抑制與上皮-間充質過渡(EMT)相伴發生的表型改變的 阻斷能力。實驗1:「預-培育」先將MDA-MB-231或Hs578t細胞的Iml CM(離心以除去細胞碎片)與2 μ g或 4 μ g (終濃度)抗-1οχ12預培育1. 5小時，再加入MCF7或SW620細胞。抗-肌動蛋白用作 負mAb對照(圖10E)。然後將條件化培養基加入MCF7或SW620細胞，在37°C ,5% CO2下培 育48小時。用羅丹明鬼筆毒環肽染色MCF7或SW620細胞的肌動蛋白細胞骨架以分析EMT 表型改變的阻斷情況(圖9)。實驗2:「未-預培育」將MDA-MB-231或Hs578t細胞以80 %匯合接種在T25燒瓶中，在DMEM、10 % FBS 和IX L-穀氨醯胺中培養。將抗-L0X12mAb(4yg終濃度)分別加入各燒瓶，用培養基培育 燒瓶72小時。抗-肌動蛋白用作負mAb對照(圖10E)。離心條件化培養基以除去任何細 胞碎片，然後加入MCF7或SW620細胞，在37°C，5% CO2下培育48小時。用羅丹明鬼筆毒環 肽染色MCF7或SW620細胞的肌動蛋白細胞骨架以分析EMT表型改變的阻斷情況(圖11、 12)。實施例6 用轉染細胞的CM處理的細胞的抗_L0XL2mAb阻斷試驗產生Hloxl_2MCD穩定細胞系將PSecTag2hygro-hL0XL2MCD (最小催化結構域，胺基酸TAPDLVLNAE...至讀框末+Myc+His標籤)轉染入Hek293細胞，在潮黴素B選擇壓力下選擇各克隆。利用抗-His抗 體，通過蛋白質印跡測定表達(參見圖22)。產生條件化培養基以供在SW620細胞中進行EMT研究利用均在30ml cDMEM(DMEM+L_穀氨醯胺+10% FBS，無青黴素/鏈黴素)中的12E6 細胞或6E6細胞將hL0XL2MCD Hek293穩定細胞系7號接種入T175燒瓶。細胞生長72小 時，然後收集條件化培養基以便用於下述SW620/EMT實驗中。作為對照，以 相同的密度接種 Hek293細胞並作相同處理。穩定Loxl2_MCD的條件化培養基和MET的誘導將SW620細胞以每孔50，000個細胞接種在含有DMEM、10% FBS和Ix L-穀氨醯胺 的8-室孔載玻片中。從表達人Loxl2-MCD的細胞收集條件化培養基以便用於上述SW620/ EMT試驗。在各室中，將500μ1條件化培養基加入各孔。293細胞的條件化培養基用作負 對照。通常在72-79小時後觀察到EMT-樣表型改變(圖13)。72-96小時後，表達人Loxl2_SRCR結構域1_2和3_4的穩定克隆的CM不誘導 EMT-樣表型改變。實施例7 :L0X/L0XL抑制劑與化療劑的試驗利用實施例2、3或4鑑定的降低EMT/促進MET的L0X/L0XL抑制劑處理BT-549、 Hs5788t、MBA-MD231或NCI-H226腫瘤細胞系，或者諸如MCF-7或SW620等經轉染以表達 L0X/L0XL或用表達L0X/L0XL的細胞的CM處理的細胞系。在用L0X/L0XL抑制劑處理的同時或之後將化療劑，例如烷化劑(例如，順鉬、卡 鉬)、抗代謝物(例如，氨甲蝶呤、吉西他濱)、蒽環類抗生素(例如，多柔比星)、拓撲異構酶 抑制劑(例如，依託泊苷)、有絲分裂抑制劑(例如，紫杉醇)、EGFR抑制劑(例如，埃洛替 尼(erlotinib)或吉非替尼(gef itinib))、或其它藥劑，例如多奇他賽(doclitaxel)、蒽環 類抗生素、5-氟尿嘧啶加入細胞。採用細胞活力和凋亡試驗比較用L0X/L0XL抑制劑和化療劑處理的細胞與單用化 療劑處理的細胞。利用普羅麥格公司(Promega)的CellTiter-Glo 檢測細胞活力，利用普 羅麥格公司的Apo-ONE 檢測凋亡，方案如生產商手冊所述。—式三份繪製各組實驗條件的劑量反應曲線(化療劑量、L0X/L0XL抑制劑劑量、 劑量數的範圍、治療時間)。還利用侵襲和遷移實驗進行分析以測定是否在L0X/L0XL抑制 劑和化療藥物之間觀察到降低細胞侵襲和遷移的協同作用。與單用化療劑處理的細胞相比，與化療劑協同作用的L0X/L0XL抑制劑應降低細 胞活力、增加凋亡細胞數量和/或降低侵襲或遷移能力。選擇與化療劑協同作用的那些 L0X/L0XL抑制劑作為進一步開發的候選對象。實施例8 :L0X/L0XL抑制的藥物敏感性試驗以每孔7，500個細胞接種96孔板，24小時後，將培養基替換為含有各種濃度的順 鉬(新澤西州吉布斯城蓋爾生物化學公司)、埃洛替尼(麻薩諸塞州沃本市LC實驗室(LC Laboratories，Woburn，MA))、紫杉醇(俄亥俄州梭侖市MP生物醫藥公司(MP Biomedicals, Solon，0H))、氨甲蝶呤(新澤西州吉布斯城蓋爾生物化學公司)、氨基丙腈(密蘇裡州 聖路易斯市西格瑪_阿爾德裡奇公司(Sigma-Aldrich，St. Louis, MO))或250納克/孔抗 體的培養基。連續接觸5天後，清洗培養液，按照生產商的使用說明書利用加利福尼亞州聖路易斯-奧比斯波市普羅麥格公司(Promega，San Luis Obispo, CA)的CellTiter-Glo 測 定活細胞數。每種細胞系具有各藥物濃度的三份樣品(圖36、37、38)。對於siRNA藥物敏感性研究，按照生產商(科羅拉多州拉斐特市熱力科學公司 (Thermo Scientific, Lafayette, CO))的使用說明書，利用 Dharmafect 轉染試劑，用 20uM L0X、L0XL2，或非靶向Stealth Select RNAi驗證的寡聚物瞬時轉染細胞，24小時後接觸藥 物。採用定量PCR驗證藥物接觸後的降低水平。利用MISSION shRNA慢病毒系統(聖路 易斯市西格瑪_阿爾德裡奇公司)產生穩定的shRNA細胞系。採用定量PCR驗證LOX或 LOXL2的降低(圖35)。實施例9 :L0X和L0XL2的抗體用表1所列肽免疫小鼠產生識別LOX和L0XL2蛋白的抗體。SEQ ID 1和8用於產 生抗體。篩選產生的抗體以測定抗體是否特異性識別未切割的非活性形式L0X，成熟的活性 形式，或同時識別未切割和切割形式。SEQ ID 2-6所示肽基於成熟的LOX或L0XL2酶。選自表1的肽用於免疫小鼠。給 BALB/c小鼠注射160mg純化的肽。對於初次注射，將肽與完全弗氏佐劑混合(1 1)，皮下 注射。隨後在沒有佐劑存在下進行腹膜內注射。通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定LOX或L0XL2的血清抗體，其中全長或活性 LOX或L0XL2蛋白結合於聚苯乙烯平板。在至少2個月期間進行至少2次免疫後，取出針 對LOX或L0XL2的抗體滴度高的一隻小鼠的脾臟，與P3U1小鼠漿細胞瘤細胞系的細胞融合。 在ELISA試驗中利用全長以及活性形式篩選得到的克隆結合LOX或L0XL2或二者的能力。通過ELISA測定抗體對LOX或L0XL2的單獨或交叉反應的特異性。分離和亞克隆 與LOX或L0XL2有反應活性的雜交瘤產生的抗體。該雜交瘤生長在組織培養基以及腹水中 以用作LOX或L0XL2抗體的來源。為產生LOX或L0XL2的人單克隆抗體，如EP 0239400 (Winter等)所述，通過將其 互補決定區(CDR)取代成人單克隆抗體或單克隆抗體片段來改變上述小鼠單克隆抗體。用 鼠可變區的其它CDR取代人重鏈和輕鏈Ig可變區的CDR。隨後可將這些改變的Ig可變區 與人Ig恆定區組合以產生除取代的鼠CDR外，其組成在總體上是人的抗體。與嵌合抗體相 比，預計這種CDR-取代的抗體不大可能在人中引發免疫應答，因為CDR-取代的抗體含有大 量更少非人的組分。通過⑶R 「嫁接」人源化單克隆抗體的過程稱為「整形」(Riechmarm等， Nature332 :323_327 (1988) ；Verhoeyen 等，Science 239 1534-1536 (1988))。通過遺傳工程改造移植鼠LOX或L0XL2抗體⑶R(例如，鼠單克隆抗體的⑶R，如 Burbelo等，Coll. Relat. Res. 6 153-162 (1986)所述)，藉此通過克隆鼠重鏈和輕鏈可變區 (V)基因區段測定CDR DNA序列，然後通過定點誘變將其轉染至相應的人V區。在該過程的 最後階段，加入所需同種型(通常對於CH是Y I，對於CL是κ)的人恆定區基因區段，人源 化重鏈和輕鏈基因在哺乳動物細胞中共表達以產生可溶性人源化抗體。將這些⑶R轉移至人抗體賦予該抗體原始鼠抗體的抗原結合特性。在結構上，V區 「框架」區上裝了 6個鼠抗體的CDR。CDR-嫁接成功的原因在於小鼠和人抗體之間的框架區 具有極其相似的3-D結構，⑶R的連接點類似，因此可交換⑶R。可如Jones等，Nature 321 522-525(1986) ；Riechmann 等，Nature 332 323-327 (1988) ；Queen 等，Proc. Nat. Acad. Sci.USA 86 10029 (1989)；和 Orlandi 等，Proc. Natl. Acad. ScL USA 86:3833(1989)所示範的製備這種人源化抗體同源物。然而，據信框架區內的某些胺基酸與CDR相互作用並影響總的抗原結合親和力。 直接轉移鼠抗體的CDR來產生人源化抗體而對人V區框架不作任何修飾常導致結合親和力 部分或完全喪失。因此，優選改變接受抗體框架區中的殘基以獲得結合活性。Queen 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86 10029-10033 (1989)和 W090/07861 (蛋白 質設計實驗室公司(Protein Design Labs Inc.))描述了通過組合鼠mAb (抗-Tac)與人 免疫球蛋白框架區和恆定區來製備在接受抗體的框架區中含有修飾殘基的人源化抗體。他 們描述了直接CDR轉移而對人V區框架殘基不作任何修飾常導致的結合親和力喪失問題 的一種解決方法；他們的解決方法涉及兩個關鍵步驟。第一，通過計算機分析原始鼠抗體 的V框架區的最佳蛋白質序列同源性來選擇人V框架區，在該情況中，是抗-TacmAb。在第 二步驟中，通過計算機對鼠V區域的三級結構建模來目測觀察可能與鼠CDR相互作用的框 架胺基酸殘基，然後將這些鼠胺基酸殘基加在同源性人框架上。對於白介素2受體的特異 性抗體(Queen等，1989 [同上])和單純皰疹病毒(HSV)的特異性抗體(Co.等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88 =2869-2873, (1991))，他們的方法利用含有假定的鼠接觸殘基的同源性 人框架，從而導致人源化抗體具有與原始鼠抗體相似的結合親和力。該人源化方法的其它細節見授予Winter等的U. S. 5，225，539 ；授予Boss等的 U. S. 4，816，397 和授予 Cabilly 等的 U. S. 4，816，567 及 U. S. 6，331，415，這些專利均是本領 域技術人員已知的並出於描述示範性製備方法的目的通過引用專門納入本文。如上所述，用具有LOX和L0XL2之間，例如SEQ ID 4和5之間，和SEQID 6和7之 間的非保守性胺基酸的隨機化胺基酸的肽免疫小鼠製備識別LOX和L0XL2的抗體。產生的 抗體應對LOX和L0XL2具有交叉選擇性。選擇對LOX或L0XL2有特異性，或對LOX和L0XL2有交叉反應性的那些L0X/L0XL2 抗體作為進一步開發的候選對象。表1. L0X/L0XL2 免疫原肽 實施例10 產牛與LOX和LOXL成員奪叉反應的杭體用衍生自L0X/L0XL蛋白的高度保守性C-末端區域的肽免疫小鼠產生與LOX和 LOXL成員交叉反應的抗體，該區域還包括催化結構域。針對該區域產生的抗體識別活性形 式的 L0X/L0XL。獲得用於產生抗體的肽的結構域是催化結構域、銅結合結構域、賴氨醯-酪氨醯 醌輔因子結構域和細胞因子受體樣結構域。銅結合結構域和催化結構域的序列見表2，如實 施例9所述，這些序列用於免疫的小鼠。類似地，通過ELISA測定所產生抗體針對全長和加 工形式的LOX、LOXL, L0XL2、L0XL3和L0XL4的特異性。含有LOX、LOXL, L0XL2、L0XL3和L0XL4之間非保守胺基酸的隨機胺基酸的肽也用 於免疫小鼠，從而產生對各種形式的L0X/L0XL蛋白，例如LOX和L0XL，或對所有5種LOX家 族成員具有交叉反應性的抗體。免疫小鼠和產生小鼠及人抗體見實施例9。選擇對LOX和各種LOXL成員具有交叉反應性的L0X/L0XL抗體作為進一步開發的 候選對象。表2 :L0X/L0XL 免疫原肽 實施例11 產牛識別活件L0X/L0XL並降低EMT/促講MET的抗體EMT細胞分泌活性L0X/L0XL。利用實施例9和10產生的抗體處理實施例2、3或 4的EMT細胞。然後如實施例1所述測定細胞的EMT或MET特徵。識別活性L0X/L0XL2的 抗體應降低細胞的EMT和促進細胞的MET。選擇降低細胞的EMT並促進細胞的MET的那些L0X/L0XL抗體作為進一步開發的 候選對象。實施例12 通過抗體抑制L0X/L0XL活件將實施例9或10產生的抗體用於Fogelgren等，J. Biol. Chem. 280 24690-24697(2005)所述的L0X/L0XL活性試驗。簡言之，L0X/L0XL活性試驗反應混合物由 50mM硼酸鈉(pH 8. 2)、1. 2M脲、40uM Amplex紅、0. 1單位/ml辣根過氧化物酶和IOmM 1， 5_ 二氨基戊烷(diamineopentane)(屍胺)底物構成。或者，在生理緩衝液，例如pH 7. 5的 磷酸緩衝液中進行Amplex紅試驗。在有或沒有500uM BAPN或實施例9或10的抗體存在 下將蛋白質，L0X/L0XL加入反應混合物並培育。在560nm下激發螢光產物，在590nm對發 射波長讀數(例如,BMG實驗室技術公司(BMG Labtechnologies Inc. )P0公司(Polarstar Optima))。L0X/L0XL在有BAPN存在下用作負對照，而在沒有BAPN存在下用作正對照。根 據螢光量檢測活性。選擇抑制L0X/L0XL活性的那些L0X/L0XL抗體作為進一步開發的候選對象。實施例13 通i寸L0X/L0XL杭彳本抑制L0X/L0XL結合1；它細胞,或胞,外某質會目分將實施例9或10產生的抗體用於ECM結合試驗。如Fogelgren等，J. Biol. Chem. 280 24690-24697 (2005)所述進行固相結合試驗。4°C，用彈性蛋白原、I型膠原、可 溶性血漿纖連蛋白(PFN)、不可溶細胞纖連蛋白(cFN)、層粘連蛋白或BSA包被康寧公司 (Corning)的高蛋白結合EIA/RIA微量滴定板的各孔過夜。各孔經封閉、洗滌，然後在有 或沒有L0X/L0XL抗體存在下與標記的L0X/L0XL(例如，GST-L0X/L0XL)培育過夜。再次 洗滌各孔，依次用針對L0X/L0XL的標籤的一抗(例如，抗-GST)和過氧化物酶標記的二抗 檢測L0X/L0XL結合量。然後用皮爾斯公司(Pierce)的螢光過氧化物酶底物試劑盒定量 測定過氧化物酶活性。一式三份測定樣品，用統計學軟體計算解離常數(例如，圖墊公司 (Graphpad,Inc.)的 Prism3)。還進行結合試驗，其中利用L0X/L0XL包被微量滴定板各孔。在彈性蛋白原、I型膠 原、pFN、cFN或BSA之前或同時，將實施例9或10的抗體加入各孔。如上所述檢測結合，其 中ECM蛋白用其各自的抗體，或者針對標籤的抗體(如果利用作標籤形式的ECM蛋白)檢 測，從而檢測ECM的結合量。還採用上述試驗進行L0X/L0XL與其它蛋白質，例如細胞受體(例如，攝取受體整 聯蛋白β 1)、BTK(伯頓無丙種球蛋白血症酪氨酸激酶)或其它整聯蛋白的結合，其中利用 細胞受體(例如，攝取受體整聯蛋白β 1)、BTK(伯頓無丙種球蛋白血症酪氨酸激酶)或其 它整聯蛋白替代ECM蛋白。選擇抑制L0X/L0XL結合ECM蛋白、細胞受體和整聯蛋白的那些L0X/L0XL抗體作 為進一步開發的候選對象。實施例14 抑制LOX活性LOX比活性在ΝΙΗ3Τ3細胞的細胞表面上 很明顯。基於Amplex超級紅與1，5_ 二氨基戊烷底物，採用辣根過氧化物酶-偶連的螢光試驗方法定量測定活性。不可逆的小分子 抑制劑，BAPN，用LOX肽產生的單克隆抗體和特異性靶向LOX mRNA的siRNA寡核苷酸抑制 LOX活性(圖15)。
用IOOnM LOX siRNA(英傑斯蒂爾斯公司(Invitrogen Stealth)，HSS106117， AUAACAGCCAGGACUCAAUCCCUGU)或非靴向對照轉染 NIH3T3 細胞。將 25ul Dharmafect (§) 3 號(達瑪康公司(Dharmacon))與ImlOPTIMEM I； (英傑公司(Invitrogen))，室溫下靜置 5分鐘。然後加入50ul 20uM siRNA，混合，室溫下培育該轉染混合物15分鐘。然後將Iml 轉染混合物加入含IxlO6個細胞，生長培養基配製的胰蛋白酶處理細胞懸液中，將得到的混 合物塗布在IOcm2培養皿中。轉染6天後，胰蛋白酶處理細胞，以50，000個細胞/孔再次 塗布在96孔板中。轉染7天後，用2x PBS洗滌細胞並與IOOul以下反應混合物培育PBS 配製的IOOuM Amplex超級紅 (英傑公司)、20mM 二氨基戊烷(弗魯卡公司(Fluka))和 4u/ml辣根過氧化物酶(西格瑪公司(Sigma))。恰在加入二氨基戊烷和HRP之前，將BAPN 和LOX mAb分別加入至ImM和15ug/ml終濃度。37°C，用分子裝置公司的M5平板讀數計 (Molecular Devices M5plate reader)讀數平板。以動力學方式設置平板讀數計來讀取熒 光(激發=544nm，發射=590nm)約2. 5小時。實施例15 抑制L0XL2活件所有平板購自康寧公司。二抗和微微底物購自皮爾斯公司。Amplex紅試劑購自英 傑公司。辣根過氧化物酶(HRP)、1，5-二氨基戊烷、消泡劑購自西格瑪公司。所有ProteOn 試劑購自生物輻射公司(Bio-Rad)。L0XL2購自研發系統公司(R&D systems) 0本項研究所 用的抗體由抗體方案公司(AntibodySolution)製備或通過阿拉貢生物科學公司(Aragen Biosciences)的腹水製備。所有其它試劑均是儘可能高的質量。通過ELISA結合採用基於ELISA的發光來測定抗體與L0XL2的結合。4°C，用50mM硼酸鹽緩衝 液(pH 8.0)配製的0. lyg/mL L0XL2或感興趣抗原包被白色康寧平板過夜。用BioTek 平板洗滌器洗滌平板，室溫下，用PBST (0. 05 %吐溫-20)配製的5 %脫脂奶封閉1小 時。用PBST (0.05%吐溫-20)洗滌平板，然後立即使用或保存於4°C乾燥器內待用。用 PBST (0.01%吐溫-20)連續稀釋待測試的抗體，每孔加入100 μ L各稀釋液。室溫下，平板與 測試品培育1小時，然後用PBST (0. 05%吐溫-20)洗滌。用PBST (0. 05%吐溫-20)配製的 5%脫脂奶將檢測抗體(抗-小鼠HRP偶聯物)稀釋16，000倍，每孔施加100 μ L。平板與檢 測抗體培育1小時，然後用PBST(0. 05% PBST)洗滌。按照生產商的使用說明書，利用皮爾 斯公司的超級信號ELISA微微化學發光底物(SuperSignal ELISA pico chemiluminescent substrate)檢測信號。利用分子裝置公司M5平板讀數計檢測發光，積分時間為500ms， 捕捉所有波長。對數據作背景校正，利用GraFit程序，以朗繆爾等溫方程(Langmuir isothermequation)擬合發光信號對抗體濃度的依賴性。如果抗原濃度與解離常數相似，則 採用緊密結合的二次方程。報導的解離值從依據這些方程的擬合值獲得。朗繆爾等溫方程 緊密結合方程
通過SPR(表面等離振子共振)的結合利用25°C恆溫的生物輻射公司的ProteOn儀器檢測結合親和力。採用兩種方法， 利用胺偶連來測定結合親和力；一種方法中抗體固定，加入抗原(LOX)，而另一種方法中抗 原(L0XL2)固定，加入抗體。利用ProteOn固定試劑盒提供的1 1的NHS與EDC將抗體 或抗原固定在GLC晶片上。首先用NHS/EDC混合物活化晶片，然後使乙酸鹽緩衝液，pH4. 5 配製成1 μ g/mL抗原或抗體流過活化的表面來偶連。這通常產生約500RU的偶連。然後加 入IM乙醇胺給活化的晶片表面封端。將偶連的晶片保存在4°C，用50mM氫氧化鈉再生。用抗體或抗原的一系列PBST(0. 05%吐溫-20)稀釋液檢測偶連的晶片來測定解 離常數。利用未偶連通道作為參比，獲得ProteOn上可用的所有6個通道的數據。利用生 物輻射公司的ProteOn管理軟體分析收集的數據。篩選試驗首先根據ELISA點測試(ELISA point tests)選擇候選抗體。由抗體方案公司對 多抗原進行ELISA，選擇在感興趣抗原中顯示強烈ELISA信號的抗體在酶試驗中作進一步 表徵。當底物1，5-二氨基戊烷脫氨，而酶再生時，L0XL2產生過氧化氫。採用將過氧化物的產生(L0XL2釋放的)與HRP相偶連的生物化學試驗，並檢測 amplex紅向螢光產物的轉化來評估抗體抑制酶活性的能力。將抗體雜交瘤上清液(IOyL) 加到40 μ L酶混合物(50mM硼酸鈉pH 8. 0，5單位/毫升HRP，125nM L0XL2, IOppm消泡劑) 中，室溫下在96孔全區域黑平板(full area black plate)中培育1小時。加入50 μ L底 物溶液(62. 5mM硼酸鈉，100 μ M Amplex紅試劑，20mM 1,5- 二氨基戊烷，IOppm消泡劑)啟 動酶反應，37°C，用分子裝置公司的M5平板讀數計讀數。以動力學模式設置該平板讀數計 來讀取螢光(激發=544nm，發射=590nm)，l小時。數據記錄為螢光與時間反應曲線的斜 率。將這些斜率與向酶混合物中加入雜交瘤培養基的對照比較。低於對照的斜率認為是抑 製劑。IC50 測定採用上述偶連的酶試驗，檢測所選抗體對L0XL2的劑量反應。用PBST (0. 01%吐 溫-20)製備抗體的一系列稀釋液，將10 μ L該稀釋液加入40 μ L酶混合物(50mM硼酸鈉pH 8. 0，5單位/毫升HRP，125nM L0XL2, IOppm消泡劑)，室溫下在96孔全區域黑平板中培育 1小時。加入50 μ L底物溶液(62. 5mM硼酸鈉，100 μ M Amplex紅試劑，20mM 1，5_ 二氨基 戊烷，IOppm消泡劑)啟動酶反應，採用上述條件，用M5平板讀數計讀數。將螢光反應-時 間函數的斜率對抗體濃度作圖，利用GraFit將數據擬合成4參數擬合。該圖的中點是表觀 IC50，還是50%的總反應得到抑制的濃度(例如，圖20)。抑制方式採用下述模型檢測抗體對L0XL2的抑制方式。在這些實驗中，監測抗體濃度升高 下，穩態率(steady state rate)對1，5_ 二氨基戊烷濃度的依賴性。其目的是評估有抗體 存在下底物的Km、kcat或二者是否改變。採用下圖所示模型，利用Grafit總體分析收集的 數據。參數α描述了化合物對底物親和力的作用。α值等於1描述了其中化合物同等結 合游離 酶和 酶_底物複合物的情況(可能是非競爭性抑制)。該值小於1描述了其中化合物結合酶-底物複合物的相互作用(可能是無競爭性抑制)。該值大於1對應於結合游離 酶勝過酶-底物複合物的化合物(可能是競爭性抑制)。β值描述了調節劑對酶速率的作 用。抑制劑的該值小於1(對於完全抑制劑，β =0)，激活劑的該值大於1。Ka是化合物的 解離常數，Ks是底物的米氏常數，k是酶的催化速率。從上述螢光反應-時間函數的斜率測 定穩態率。將數據製作成在幾種固定的抗體濃度下，穩態率對底物(1，5_ 二氨基戊烷)濃 度依賴性的圖，並用GraFit分析(例如，圖21A，利用直接競爭劑，如圖21B所示)。實施例16 誦過免瘡印跡和免,瘡鉬化(IHC)分析檢測丨L0X/L0XL 通過在裂解緩衝液(例如，IOOmMNaH2P04、IOmM Tris_HCL、8M 脲、0· 05 % 吐 溫-20，pH 8.0 ；或EDTA、NP40、Tris、NaCl、PMSF和「完全迷你蛋白酶抑制劑混合物」(羅氏 (Roche)，第11836153001號)；或「萊米力(Laemmli) SDS樣品緩衝液，4X」(波士頓生物產 品公司(Boston BioProducts), BP-110R號)中裂解細胞進行免疫印跡(蛋白質印跡)分 析。將裂解液(通常是15-25微克總蛋白)加載於4-12% Tris-甘氨酸凝膠(加利福尼亞 州卡爾斯巴德市英傑公司)或NuPAGE Novex 4-12% Bis Tris凝膠(英傑公司)上。將大 小分級的蛋白質轉移到PVDF膜(加利福尼亞州卡爾斯巴德市英傑公司)或硝酸纖維素膜 (英傑公司)上。4°C，在含2% BSA、5%奶粉的PBS中封閉免疫印跡過夜。與抗-L0X/L0XL — 抗(單克隆或多克隆)培育後，根據生產商推薦的條件用二抗培育印跡以便檢測，例 如抗-兔IgG-HRP(GE保健公司(GE Healthcare)或傑克遜免疫研究實驗室(Jackson Immunoresearch Lab))、抗-小鼠 IgG-HRP (GE 保健公司)、抗-山羊 IgG-HRP (傑克遜 免疫研究實驗室)、或IRDye680-偶連的山羊抗-小鼠IgG、IRDye680_偶連的驢抗-兔 IgG(洛克藍德公司(Rockland Inc.))。顯色並檢測化學發光信號，採用皮爾斯公司的底 ^ (SuperSignal West Femto Max orPico Max Sensitivity Substrate)
姆公司(Amersham)的 ECL 抗-小鼠 IgG HRP，用 AI 公司(Alpha Innotech)的 Chemiglow West檢測。直接檢測螢光標記的二抗。除了從組織製備的免疫印跡，商品化購得的含有從正常組織和腫瘤組織分離的 大小分級蛋白質的預加載免疫印跡(例如，購自加利福尼亞州PS股份有限公司(ProSci Incorporated, CA))可用於分析L0X/L0XL在正常組織和腫瘤組織中的分子量分布。利用組織切片和安排在組織微陣列中的組織切片檢測正常組織和腫瘤組織中的 L0X/L0XL蛋白質表達和細胞定位(例如，購自賽伯第公司，PS公司(Pro Sci)和其它來 源)。根據生產商的使用說明書，利用BD公司(BiocareMedical)的背景狙擊劑(BACKGROUND sniper)封閉組織樣品以免非特異性結合。在各種緩衝液、pH條件和溫度下進行抗原回收 以確保組織切片中的檢測可靠。利用腫瘤細胞系評估L0X/L0XL的抗體(利用小鼠或家兔 產生，單克隆或多克隆)的IHC特性。根據生產商的使用說明書，將合適的抗體與組織切 片培育(通常在1-10微克/毫升，用稀釋緩衝液稀釋(加利福尼亞州康科德城的BD公司 (Concord, CA)或加利福尼亞州卡平特裡亞(Carpinteria，CA)的DAKO公司)。根據生產商的使用說明書，利用家兔-探針HRP聚合物試劑盒(BD公司的MACH2 或MACH3或DAKO公司的EnVision)或小鼠-探針HRP聚合物試劑盒(BD公司的MACH2或 MACH3或DAKO公司的EnVision)進行檢測。或者，根據生產商的使用說明書，利用辣根過 氧化物酶偶連的抗_小鼠、家兔或山羊IgG(GE保健公司或傑克遜免疫研究實驗室)或瓦克它汀精英ABC試劑盒(Vectastain Elite ABC kit)(抗-小鼠、家兔或山羊，載體實驗室 (Vector laboratories))或EnVision試劑盒(抗小鼠和家兔，DAKO公司)進行檢測。實施例17 檢測兩種形式的L0XL2切割L0XL2，通過蛋白質印跡根據其分子量的改變檢測(圖16、17)。通過層析分 離兩種形式( 圖18)並檢測兩種形式的活性(圖19)。實施例18 :L0X/L0XL2的內在化和攝取在含有10% FBS和IX穀氨醯胺的DMEM中培養Hs578t細胞。將細胞接種在新澤 西州富蘭克林湖BD猛禽公司(BD Falcon,Franklin Lakes,NJ)的8室載玻片中，使之粘著 過夜。對於低匯合，以30-40，000個細胞/載玻片接種細胞。24小時後，採用低匯合檢測胞 質溶膠中的L0X。對於高匯合，以100，000個細胞/載玻片接種細胞。約48-72小時後，採 用高匯合檢測基質和膠原酶相關的L0X。隨後一天，將1 μ g/ml (常規生長培養基中的終濃度)抗-LOX M64或抗-Loxl2M20 單克隆Ab(mAb)加入各小室。對於連續攝取，在不同時間點將mAb與細胞培育例如，3小 時、8小時、24小時(過夜)。連續攝取適當量後，除去培養基，用IX PBS清洗各小室。室 溫下，將細胞在4% PFA(低聚甲醛)中固定20分鐘。固定後，室溫下用IX PBS洗滌細胞5 分鐘，然後室溫下在50mM氯化銨中猝滅10分鐘。室溫下，用IX PBS再次洗滌細胞5分鐘。室溫下，通過加入皂苷緩衝液(含0. 5%皂苷/1% BSA的PBS)透化處理細胞20 分鐘。室溫下，將第二檢測Ab (Alexa氟488驢-小鼠IgG，加利福尼亞州卡爾斯巴德市英傑 公司)加入緩衝液，培育細胞30-45分鐘。然後用3X皂苷緩衝液洗滌細胞。給載玻片裝上 Vectashield (加利福尼亞州伯林格姆市的載體實驗室)。為檢測膠原，先將抗-膠原抗體(1 50，蓋爾生物化學公司的抗-1型膠原家兔多 克隆，新澤西州吉布斯城)培育1小時，再用4% PFA固定細胞。膠原的二抗是驢抗-家兔 Cy3(賓夕法尼州西格羅夫市傑克遜免疫研究公司)。Hs578t 細胞中 Lox 和 Loxl2 的 siRNA 敲減將Hs578t細胞培養在IOcm組織培養平板的含10% FBS和IX穀氨醯胺的DMEM中。 將細胞培養至約75%匯合。細胞達到75%匯合時配製轉染反應/混合物。製備兩種混合物 在15ml錐形試管中，將60 μ 1 20uM siRNA與Iml最佳物質(最終siRNA濃度為IOOnM)。在 另一 15ml錐形試管中，將伊利諾斯州芝加哥熱力科技公司(Thermo Scientific,Chicago, Illinois)的30 μ lDharmafect 3轉染試劑與Iml OptiMEM 混合。室溫下培育兩試管5 分鐘。5分鐘後，將兩試管的內含物混合成一份。室溫下，小心地上下抽吸混合物並培育20 分鐘。用胰蛋白酶處理Hs578t細胞，將之重懸在IOml完全培養基中並加入IOcm組織培 養平板。對於各siRNA條件，將2ml合併的轉染混合物加入IOcm平板。輕輕旋振平板，置 於37°C和5% CO2的培養箱中過夜。無需改變培養基，培養細胞上數日。對於免疫螢光研 究(圖23、24、35)，轉染進行至少5天以確保足夠的敲減和降低的蛋白質水平。總結結果證明低細胞匯合時，LOX和L0XL2並未保持分泌在胞外基質中，而能被腫瘤細 胞再次攝取(隨著抗體內在化)。匹配的siRNA敲減對照支持這種染色模式的特異性(圖 23、24、25)。該細胞匯合時，在細胞外的胞外基質中更易檢測到LOX和L0XL2，重攝取明顯很少。匹配的siRNA敲減對照再次支持染色模式。LoX12mAb處理細胞以替代siRNA敲減得到 抗-Lox和抗-LoX12mAb的內在化和重攝取及其膠原共區域化的相似結果。實施例19 :L0X/L0XL2內在化和攝取的時稈對早已匯合的細胞啟動時程(第O天)。所用的細胞系是同時表達LOX和L0XL2 的乳腺腫瘤細胞系 Hs578t。IHC方案(小室載玻片上的細胞；依據DAKO公司的En Vision+系統-HRP)所有步驟在RT (室溫下)進行，一抗濃度是5 μ g/ml的抗-LOX和15ug/ml 抗-L0XL2。用PBS(X 3)洗滌細胞。然後先進行過氧化物酶封閉(5分鐘)，再用PBS (χ 3) 洗滌。隨後將細胞與用0. 05Μ Tris-HCl,ρΗ 7. 6w/l%BSA稀釋的一抗培育(30培育)。分 別利用M64和M20，LOX和L0XL2單克隆抗體(參見，例如圖26)。然後先用PBS (χ 3)洗滌 細胞，再用4% PFA固定(10分鐘)。隨後先用PBS (χ 3)洗滌細胞，再加入過氧化物酶標記 的聚合物(30分鐘)。然後用PBS (χ 3)洗滌細胞。隨後加入底物-色原(20 μ L DAB/ImL 底物緩衝液)，5-10分鐘。然後先用蒸餾水洗滌細胞，再用蘇木精復染(有時是任選的)、脫 水並用Entellan永久固定。Picro-Sirius 紅(Sirius 紅 F3B)染色方案；膠原組織化學分析採用Siruis Red染色。用4% PFA固定細胞(10分鐘)，然而，固 定不是關鍵性的。然後在室溫下，用Picro-Sirius紅(飽和苦味酸配製的Sirius紅0. 1% (電子顯微鏡公司(Electron Microscopy sciences),目錄號26357-02))染色細胞。然後 用2份酸化水(5ml乙酸加IL蒸餾水)，再用乙醇分級脫水並固定。結果如圖27所示，在第0天，LOX和膠原I早已分泌並與基質結合，但L0XL2定位在胞 質溶膠中既未分泌也未與基質結合。在第5天，分泌更多的LOX和膠原I，L0XL2分泌/與 基質結合。在第9天，L0X、L0XL2、I膠原共同定位在相同區域中。在第1天，檢測到LOX染 色模式改變，表明分泌和/或與基質結合的LOX較少。然而，L0XL2、膠原I和Sirius紅染 色仍彼此類似，未檢測到染色模式有真實改變。第13天和第15天時，所有蛋白質的染色模 式類似於第11天的那些。依據這些結果，LOX和L0XL2分泌的定時分別有一些差異。LOX 和L0XL2的分泌看來受調控並與細胞匯合有關。分泌的定時可調節可用的活性、胞外LOX 和L0XL2，進而可啟動膠原交聯。該實施例連同本文披露的其它實施例證明LOX和L0XL2的分泌受高度調控。細胞 密度低時，本文公開的數據表明分泌的LOX和L0XL2被細胞快速重攝取(具體地說，在細胞 內檢測到LOX和L0XL2抗體，提示它們有效內在化)。細胞密度高時，LOX和L0XL2不再重 攝取，但發現與膠原基質結合(胞外)，如特異性LOX和L0XL2抗體定位所測定的。腫瘤細 胞和肝纖維化細胞的IHC分析表明LOX和L0XL2的調控相似，其中患病區域中胞內和胞外 L0X/L0XL差異分布。實施例20 :L0X和L0XL2組織表達除非另有表述，所用的去封閉小室(decloaking chamber)和溶液購自加利福尼亞 州康科德城的生物保健醫學公司(BioCareMedical)。除非另有表述，所有過程在室溫下進 行。給去封閉小室注入500ml蒸餾水(diH20)。給一個載玻片容器注入200ml通用Decloaker抗原回收溶液，給另一個載玻片容器注入200ml Hot清洗液；將馬裡蘭州弗雷德 裡克市塞伯第公司(Cybrdi,Frederick，Maryland)的組織顯微鏡(TMA)載玻片置於含去封 閉溶液的容器中，然後置於去封閉小室中。對於乳腺TMA，將溫度設置在80°C，30分鐘。一 旦溫度達到90°C，從去封閉抗原回收溶液中取出載玻片，置於含熱清洗液的容器中。通過每 兩分鐘用l/3diH20替換1/3的熱清洗液來緩慢降低熱清洗容器中的溫度，直至容器內的溫 度為室溫。然後用diH20清洗載玻片一次，再用含0. 吐溫-20的PBS清洗一次。
用Peroxidazed-Ι處理載玻片5分鐘，然後用PBS清洗一次，2分鐘。然後用SNIPER 對載玻片作背景封閉5-10分鐘，再用PBS清洗一次，2分鐘。用DV綠色通用稀釋劑(Da Vinci Green Universal Diluent)稀釋一抗(Ab)。利用 5 μ g/ml 家兔多克隆抗 _Loxl2 抗 體和3 μ g/ml單克隆抗-Lox M64。將載玻片與一抗培育2小 時，然後用PBS-吐溫-20清洗 3次，每次清洗2分鐘。利用Mach3聚合物試劑盒，通過加入小鼠或家兔探針來檢測抗原，20 分鐘。然後用PBS-吐溫-20清洗載玻片一次，然後加入小鼠或家兔聚合物，20分鐘。然後 用PBS-吐溫-20清洗載玻片5次，每次2分鐘。將DAB色原加入載玻片，7分鐘，用diH20清 洗一次。將DAB閃光物(DAB sparkle)加入載玻片，1分鐘，用diH20清洗一次。然後用蘇 木精對載玻片作計數器染色30秒-1分鐘，用水清洗5分鐘，隨後用分級乙醇脫水。用賓夕 法尼州哈特菲爾德市電子顯微鏡科學公司的(Electron Microscopy Sciences,Hatfield, Pa)安泰蘭(entellan)固定介質固定載玻片。組織表達見圖28和29。實施例21 肺腺瘤中的LOX和L0XL2表汰對肺腺瘤作LOX和L0XL2的RT-PCR分析。對原發性腫瘤進行分析，但一些與轉移 或復發有關。數據是腫瘤與匹配的毗鄰「正常」組織片的比例，所述組織無需完全正常，腫 瘤和正常的各轉錄物數據描述於圖31和32。L0XL2在10個腫瘤的約4_5個中過表達，並 傾向於與淋巴結轉移或其它復發/轉移相關的已知腫瘤有關(表3)。所用的引物和探針列 於表4。表3.肺腺癌病理學特徵 表 4:qRT_PCR 序列
過表達誘導型cAMP早期阻遏物的轉基因小鼠顯示嚴重的糖尿病並表現出腎小球 肥大、腎小球基底膜增厚和硬化病損。這些小鼠可用作糖尿病性腎病的模型。可將本文所 述化合物給予該模型系統並分析它們預防、治療和/或緩解腎臟纖維化的能力。根據動物實驗的已有方案和指導產生轉基因小鼠。根據以前鑑定的L0X/L0XL抑 製劑的劑量和給藥時間點確定治療組大小、方案和對照。在整個組織學和生物化學分析的 實驗時間範圍的預定時間點監測和/或處死小鼠。組織學分析包括腎臟切片的顯微和免疫組化分析。通過已有的生物化學染色和顯 微分析鑑定腎小球表面區域和腎小球數量。通過用於腎臟切片的電子顯微鏡的已有方法測 定腎小球基底膜增厚。還監測血清和尿液變量以便測定腎臟活性/衰竭。通過包括ELISA和HPLC在內 的已有方法測定血液葡萄糖和胰島素水平。還通過已有試驗監測血清蛋白質，例如肌酸酐 和白蛋白。檢驗尿液樣品的蛋白質水平，包括白蛋白和肌酸酐。採用包括ELISA和HPLC在內的已有試驗檢測尿液中的蛋白質。採用上述動物模型系統，例如糖尿病性腎病小鼠模型，可檢驗本文公開的化合物是否能預防、治療和/或緩解腎臟纖維化。實施例23 心肌缺血/梗死纖維化和ECM重塑的動物樽型根據現有動物處理指南和方案飼養和處理雄性Wistar大鼠。根據動物實驗的已 有方案和指導產生轉基因小鼠。根據以前鑑定的L0X/L0XL抑制劑的劑量和給藥時間點確 定治療組大小、方案和對照。在預定時間點監測和/或處死經歷缺血/再灌注損傷的大鼠， 然後通過χ-射線、顯微CT成像、顯微組織檢查和免疫組化分析。缺血/再灌灃損傷方案麻醉大鼠並置於通風處。外科手術暴露心臟，將迷你-肺冠狀動脈閉合器(基於 導管的閉合系統)置於圍繞所需冠狀動脈。然後閉合胸腔，將閉合器-導管和靜脈導管在 肩胛骨之間取出。手術後，動物先恢復5天再開始缺血/再灌注方案。缺血採用以下時間表通過閉合器_導管實施缺血，所述時間表包括至少一次預處理 閉合，20秒，然後恢復5分鐘，至少一次閉合，2分鐘，然後恢復5分鐘。隨後，可改變閉合時 間，最多30分鐘。可改變缺血方案長度，其中典型的方案長度是4周。每周實施缺血一次， 在整個試驗期間通過超聲心動描記監測心臟功能。試驗結束時對大鼠施以安樂死，切下心 髒並檢測微脈管系統、心室大小和功能以及纖維化程度。在缺血試驗期間，以預定的時間點 和劑量給予L0X/L0XL抑制劑。分組增加給藥劑量和給藥頻率從而足以獲得劑量限制性毒 性和效率。在所有方案期間維持對照動物和方案。iMr試驗期間通過超聲心動描記記錄心室短軸圖像來測定心室大小。分析舒張和收縮 區域，其定義為心臟周期中最小和最大心室腔面積。通過包括顯微CT和X-射線在內的各 種成像和染色技術測定切下的心臟的冠狀動脈流動和微脈管系統。通過心臟組織切片和三 色染色法或其它已知的心臟組織染色法來測定心室纖維化。還進行橫斷面顯微術和組織學 分析以評估心室容量、大小和心室壁變薄。採用動物模型系統，例如上述的心臟ECM重塑系統，可檢驗本文所述化合物是否 能預防、治療和/或緩解心臟纖維化和心臟ECM重塑。實施例24 肺纖維化和ECM重塑的動物模型博萊黴素誘導肺纖維化是評估肺纖維形成，包括IPF、間質性肺炎和ARDS的標準 模型。根據動物處理指南和方案飼養和處理雄性Wi star大鼠。根據以前鑑定的L0X/L0XL抑 製劑的劑量和給藥時間點確定治療組大小、方案和對照。給大鼠氣管內注射確定劑量(通 常是5mg/kg)的博萊黴素。整個治療期間維持對照動物。給予博萊黴素後，給予測試組預定的L0X/L0XL抑制劑並在預定時間點監測和/或 處死以評估肺纖維化。可以改變測試期，其中示範性的測試期是4周。處死後，檢測大鼠肺 的纖維化和膠原含量。通過已有染色方法和顯微術染色並檢查大鼠肺切片中纖維化的存在 和程度。此外，通過已有試驗，例如羥脯氨酸試驗測定大鼠肺的膠原含量。利用動物模型系統，例如上述博萊黴素誘導肺纖維化模型，可檢驗本文所述化合 物是否能預防、治療和/或緩解肺纖維化。
權利要求
一種體內治療或預防對象中腫瘤侵入或轉移的方法，所述方法包括給予該對象有效量的活性賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白的抑制劑。
2.—種體內治療或預防對象中血管生成的方法，所述方法包括給予該對象有效量的活性賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白的抑制劑。
3.一種體內治療或預防對象中纖維化的方法，所述方法包括給予該對象有效量的活性賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白的抑制劑。
4.一種體內降低對象的腫瘤生長的方法，所述方法包括給予該對象有效量的活性賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶_樣蛋白的抑制劑，從而將所 述腫瘤生長降低至少25%、50%、75%、90%或95%。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述腫瘤是轉移性腫瘤。
6.一種增加或提高具有轉移性腫瘤的對象存活機會的方法，所述方法包括給予有此需要的對象有效量的活性賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶_樣蛋白的抑制劑， 從而將所治療對象的存活機會增加或提高一段時期。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述對象的存活增加至少10天、1個月、3個 月、6個月、1年、1. 5年、2年、3年、4年、5年、8年或10年。
8.如權利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是針對 LOX或LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。
9.如權利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是特異 性結合LOX或LOXL中某區域的抗體，所述區域具有選自SEQ ID NO 1_18的胺基酸序列。
10.如權利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是活性 LOX、L0XL2或L0XL4的抑制劑。
11.如權利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑抑制活 性LOX和活性L0XL2。
12.如權利要求1、2、3、4或6所述的方法，其特徵在於，所述活性LOX或LOXL是前蛋白 原經蛋白酶解加工後的LOX或LOXL的成熟形式。
13.一種體內治療或預防對象中腫瘤侵入或轉移的方法，所述方法包括給予該對象有效量的賴氨醯氧化酶的抑制劑和賴氨醯氧化酶-樣蛋白的抑制劑。
14.一種體內降低對象的腫瘤生長的方法，所述方法包括給予該對象有效量的賴氨醯氧化酶的抑制劑和賴氨醯氧化酶-樣蛋白的抑制劑，從而 將所述腫瘤生長降低至少25 %、50 %、75 %、90 %或95 %。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述腫瘤是轉移性腫瘤。
16.一種增加或提高具有轉移性腫瘤的對象存活機會的方法，所述方法包括 給予有此需要的對象有效量的賴氨醯氧化酶的抑制劑和賴氨醯氧化酶-樣蛋白的抑制劑，從而將所治療對象的存活機會增加或提高一段時期。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述對象的存活增加至少10天、1個月、3 個月、6個月、1年、1.5年、2年、3年、4年、5年、8年或10年。
18.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是針對 LOX或LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。
19.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOX抑制劑和所述LOXL抑 製劑不同。
20.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOX抑制劑和所述LOXL抑 製劑不同，二者分別特異性結合LOX和L0XL。
21.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOX抑制劑或所述LOXL抑 製劑是特異性結合LOX或LOXL某區域的抗體，所述區域具有選自SEQ ID NO :1_18的氨基 酸序列。
22.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOX抑制劑和所述LOXL抑 製劑是單一抗體，其中所述抗體對所述LOX和所述LOXL具有結合親和力。
23.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOXL抑制劑是LOXLl、L0XL2 或L0XL4的抑制劑。
24.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOXL抑制劑是L0XL2或 L0XL4的抑制劑。
25.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是活性 LOX、L0XL2或L0XL4的抑制劑。
26.如權利要求13、14或16所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑抑制活 性LOX和活性L0XL2。
27.一種組合物，其包含賴氨醯氧化酶的抑制劑，賴氨醯氧化酶_樣蛋白的抑制劑，和藥學上可接受的運載體。
28.一種治療患有異常細胞增殖、異常血管生成、異常細胞侵入或遷移入局部組織和/ 或遠端部位相關疾病或纖維變性疾病的宿主的方法，所述方法包括組合給予所述宿主治療有效量的賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白中至少之一 的抑制劑和並非LOX或LOXL抑制劑的第二治療劑。
29.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是針對LOX或 LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。
30.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是特異性結合LOX 或LOXL某區域的抗體，所述區域具有選自SEQ ID NO 1_18的胺基酸序列。
31.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是活性L0X、L0XL2 或L0XL4的抑制劑。
32.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑抑制活性LOX和 L0XL2。
33.如權利要求30所述的方法，其特徵在於，所述活性LOX或LOXL是前蛋白原經蛋白 酶解加工後的LOX或LOXL的成熟形式。
34.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述第二治療劑是化療劑。
35.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述第二治療劑是治療性生物劑。
36.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述第二治療劑是射線。
37.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑和所述第二治療劑通過抑制LOX或LOXL協同治療疾病，所述抑制作用使得宿主中的患病細胞對所述治療劑 的抗增殖或促凋亡作用更敏感，並且降低患病細胞的活力。
38.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述異常細胞增殖相關疾病是癌症、腫瘤 或再狹窄。
39.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述纖維變性疾病選自皮膚瘢痕形成、 瘢痕瘤、肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、糖尿病性腎病、硬皮病和腎小球硬化症。
40.一種組合物，其包含賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白中至少之一的抑制劑，並非所述賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白中至少之一的第二治療劑，和藥學上可接受的運載體。
41.一種選擇腫瘤侵入、血管生成或轉移的抑制劑的方法，所述方法包括將處於上皮-間充質過渡(EMT)狀態的細胞與賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白 的抑制劑接觸；和檢測所述細胞的EMT狀態的改變，其中，EMT狀態降低或從EMT向間充質-上皮過渡(MET)狀態改變表明該LOX或LOXL 的抑制劑是腫瘤侵入、血管生成或轉移的抑制劑。
42.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述細胞的EMT狀態具有選自以下的特 徵陽性波形蛋白、陽性纖連蛋白染色，E-鈣粘蛋白染色水平低或不可檢測、F-肌動蛋白的 鬼筆毒環肽染色顯示延長及重塑的肌動蛋白細胞骨架。
43.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述細胞的MET狀態具有選自以下的特 徵波形蛋白的水平低或檢測不到、纖連蛋白染色的水平低或不可檢測，E-鈣粘蛋白染色 陽性或高水平、F-肌動蛋白的鬼筆毒環肽染色顯示生理上正常的肌動蛋白細胞骨架。
44.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，通過測量或檢測與接觸LOX或LOXL抑制 齊U之前的細胞相比，波形蛋白或纖連蛋白染色降低和/或E-鈣粘蛋白染色增加檢測EMT狀 態的降低或從EMT向MET狀態的過渡。
45.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述檢測步驟包括採用體外刮擦試驗來 檢測所述細胞的侵襲或遷移能力。
46.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是針對LOX或 LOXL的抗體、小分子抑制劑、針對LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反義多核苷酸。
47.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述細胞是選自以下的腫瘤細胞系 BT-549、Hs5788t、MBA-MD231、NCI-H226、MCF-7 和 SW620 細胞系。
48.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，還包括在LOX或LOXL抑制劑存在時將所述細胞與並非LOX或LOXL抑制劑的治療劑接觸；和檢測所述細胞活力的改變。
49.一種診斷對象中癌症轉移的方法，所述方法包括評估血液中活性LOX或LOXL的水平或活性，其中與參比樣品相比，血液中活性LOX或LOXL的水平或活性改變表明存在轉移性腫瘤 生長。
50.如權利要求49所述的方法，其特徵在於，血液中活性LOX或LOXL的水平或活性低於參比樣品表明癌症轉移存在或增加。
51.一種診斷具有腫瘤的對象中癌症轉移的方法，所述方法包括評估腫瘤中活性LOX或LOXL水平或活性，其中與參比樣品相比，腫瘤中活性LOX或LOXL水平或活性改變表明存在轉移性腫瘤生長。
52.如權利要求49或51所述的方法，其特徵在於，腫瘤中活性LOX或LOXL水平或活性 高於參比樣品的表明癌症轉移存在或增加。
53.如權利要求49或51所述的方法，其特徵在於，所述評估步驟包括利用結合所述活 性LOX或LOXL的抗體評估所述活性LOX或LOXL的水平。
54.如權利要求49或51所述的方法，其特徵在於，所述評估步驟包括利用結合活性 LOX、L0XL2或L0XL4的抗體評估所述活性LOX或LOXL的水平。
55.如權利要求49或51所述的方法，其特徵在於，所述評估步驟包括利用結合所述活 性LOX和活性LOXL的抗體評估所述活性LOX或LOXL的水平。
56.如權利要求49或51所述的方法，其特徵在於，所述活性LOX或LOXL是前蛋白原經 蛋白酶解加工後的成熟形式LOX或L0XL。
57.一種監測對象對包括L0X/L0XL調節劑在內的治療劑在疾病治療中的反應的方法， 所述方法包括將LOX或LOXL的調節劑給予該對象後檢測該對象中C-反應活性蛋白水平的改變，其中所述改變表明該LOX或LOXL調節劑對該對象有治療作用。
58.如權利要求57所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL的調節劑是LOX或LOXL 的抑制劑。
59.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，與給予所述LOX或LOXL抑制劑之前的那 些水平相比，對象血液樣品中C-反應活性蛋白的水平降低表明該對象對用所述LOX或LOXL 抑制劑治療有反應。
60.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，所述疾病是異常細胞增殖相關疾病。
61.如權利要求60所述的方法，其特徵在於，所述異常細胞增殖相關疾病是癌症、腫瘤 或再狹窄。
62.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，所述疾病是纖維變性疾病。
63.如權利要求62所述的方法，其特徵在於，所述纖維變性疾病選自皮膚瘢痕形成、 瘢痕瘤、肝纖維化、肺纖維化、腎纖維化、糖尿病性腎病、硬皮病和腎小球硬化症。
64.一種治療對象中的病理性心臟病症或疾病的方法，所述方法包括給予該對象有效 量的賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白(LOXL)的抑制劑。
65.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL的抑制劑抑制LOX或 LOXL的活性形式。
66.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述病理性心血管病症或疾病是高血壓、 高血壓性心臟病、心肌梗塞、動脈粥樣硬化或再狹窄。
67.如權利要求66所述的方法，其特徵在於，所述病理性心血管病症或疾病與心血管 纖維化有關，並且所述LOX或LOXL的抑制劑局部給予至心血管纖維化的部位。
68.如權利要求67所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL的抑制劑通過支架給予。
69.如權利要求68所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL的抑制劑包被在所述支架上。
70.如權利要求67所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑通過導管局部給 予至心血管纖維化的部位。
71.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，在所述病理性心血管病症發作前給予所 述LOX或LOXL抑制劑。
72.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，在所述病理性心血管病症發作後給予所 述LOX或LOXL抑制劑。
73.如權利要求72所述的方法，其特徵在於，所述病理性心血管病症是心肌梗塞，在所 述心肌梗塞後至少1、2、3、5或10小時，或在所述心肌梗塞後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13或14天給予所述LOX或LOXL的抑制劑。
74.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL的抑制劑是針對LOX或 LOXL的抗體或其抗原結合片段、小分子抑制劑、針對LOX或LOXL的siRNA、shRNA或反義多 核苷酸。
75.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是特異性結合LOX 或LOXL中某區域的抗體或其抗原結合片段，所述區域具有選自SEQ ID N0:l_18的胺基酸 序列。
76.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是活性L0X、L0XL2 或L0XL4中至少一種的抑制劑。
77.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑抑制活性LOX和 活性L0XL2。
78.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述活性LOX或LOXL是前蛋白原經蛋白 酶解加工後的LOX或LOXL的成熟形式。
79.一種預防對象中的病理性心血管病症或疾病的方法，所述方法包括在不良心血管 事件之前、同時或之後給予該對象有效量的賴氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白 (LOXL)的抑制劑。
80.如權利要求79所述的方法，其特徵在於，所述不良心血管事件是心肌梗塞。
81.如權利要求79所述的方法，其特徵在於，所述不良心血管事件是急性心肌梗塞。
82.如權利要求79所述的方法，其特徵在於，在心肌梗塞後至少1、2、3、5或10小時，或 在心肌梗塞後1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天給予所述抑制劑。
83.一種預防或治療對象中病理性心臟病症或疾病的裝置，所述裝置包括含有賴氨醯 氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白(LOXL)的抑制劑的組件。
84.如權利要求83所述的裝置，其特徵在於，所述組件是支架。
85.如權利要求83所述的裝置，其特徵在於，所述LOX或LOXL的抑制劑的分子量低於 500道爾頓。
86.如權利要求85所述的裝置，其特徵在於，所述LOX或LOXL的抑制劑是包被在支架 上的β-氨基丙腈(BAPN)。
87.如權利要求83所述的裝置，其特徵在於，所述裝置還包括將LOX或LOXL抑制劑局 部遞送至不良心臟事件所致心臟纖維化部位的導管。
88.—種試劑盒，其裝有包含LOX或LOXL的抑制劑和藥學上可接受的賦形劑的藥物 組合物；和如何利用該藥物組合物治療或預防病理性心臟病症或疾病的使用說明書。
89.一種治療對象中纖維化相關疾病的方法，所述方法包括給予該對象有效量的賴 氨醯氧化酶(LOX)或賴氨醯氧化酶-樣蛋白(LOXL)的抑制劑，其中所述纖維化選自肝纖 維化、腎纖維化、肺纖維化、皮膚瘢痕、瘢痕瘤形成和阿爾茨海默病。
90.如權利要求89所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑抑制活性形式的 LOX 或 LOXL。
91.如權利要求89所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是針對LOX或 LOXL的抗體或其抗原結合片段、LOX或LOXL的小分子抑制劑、針對LOX或LOXL的siRNA、 shRNA或反義多核苷酸。
92.如權利要求89所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是特異性結合LOX 或LOXL中某區域的抗體或其抗原結合片段，所述區域具有選自SEQ ID NO :1_18的胺基酸 序列。
93.如權利要求89所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑抑制活性LOX和 活性L0XL2。
94.如權利要求89所述的方法，其特徵在於，所述LOX或LOXL抑制劑是前蛋白原經蛋 白酶解加工後的LOX或LOXL的成熟形式。
全文摘要
本發明提供利用加工形式賴氨醯氧化酶或賴氨醯氧化酶-樣蛋白的抑制劑，LOX的抑制劑和LOXL的抑制劑，或LOX或LOXL的抑制劑與其它治療劑的協同組合來預防和治療異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關各種疾病的新方法和相關組合物及試劑盒。還提供通過將上皮-間充質過渡(EMT)狀態的細胞與候選藥劑接觸並檢測細胞的EMT狀態改變來選擇防止或抑制腫瘤侵入、血管生成和轉移的藥劑的新方法。還提供利用特異性識別加工形式LOX或LOXL的分子或藥劑來診斷或監測異常細胞增殖、血管生成和纖維化相關各種疾病的方法和相關組合物及試劑盒。本文還提供利用包含LOX或LOXL抑制劑的組合物來預防、治療纖維化相關的各種疾病和病症的方法和相關組合物、醫學裝置、系統和試劑盒。這種疾病或病症包括病理性心血管病症和疾病，例如高血壓、高血壓性心臟病、心肌梗塞、動脈粥樣硬化和再狹窄、肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、皮膚瘢痕、瘢痕瘤形成及阿爾茨海默病。
文檔編號A61K39/395GK101842114SQ200880110519
公開日2010年9月22日 申請日期2008年8月1日 優先權日2007年8月2日
發明者A·K·霍爾澤, C·A·加西亞, D·H·柏曼, D·馬歇爾, H·羅德裡格斯, M·奧亞蘇, P·范瓦拉西拉, S·A·麥克考雷, S·奧格, V·E·巴裡, V·史密斯 申請人:阿雷斯託生物科學股份有限公司