微生物協同植物治理錳汙染的方法
2023-11-04 23:41:37
專利名稱：微生物協同植物治理錳汙染的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別涉及一種微生物協同植物治理錳汙染的方法。
背景技術：
錳及其化合物應用於國民經濟的各個領域。其中鋼鐵工業是最重要的領域，用錳量佔90% 95%，主要作為煉鐵和煉鋼過程中的脫氧劑和脫硫劑，以及用來製造合金。其餘5% 10%的錳用於其他工業領域，錳在國民經濟中具有十分重要的戰略地位。隨著錳礦的開採，殘留的固體廢料，排放的汙水等對水體，土壤環境的汙染日夜嚴重。錳是變價元素，按地球化學分類，它是強烈的親氧元素。土壤中的錳主要來自於氧化物和含氧酸鹽，有機質的護膠作用和生物作用對錳的遷移、富集、沉澱起著重要作用。在礦物中，一般錳常和鐵、鎂共生，此外，錳也常和鋅、銅、鎳、鈷、鈣等一起沉澱。錳的主要礦物是軟錳礦(MnO2·ηΗ20)，黑錳礦(Mn3O4)，水錳礦[MnO (OH)]和褐錳礦(Mn2O3) ，在這些礦物中隨著結晶構型的不同，又有α、β、Γ之分，除此之外，還有很多含錳礦物。紫花苜蓿的土壤改良功能紫花苜蓿為多年生豆科草本植物，其根系深而多，生物量高，具有大量的分泌物；細根及根瘤菌更新很快，隨著紫花苜蓿種植年限的延長，耕層土壤有機質、速效養分含量逐漸增加；此外，紫花苜蓿適應性強，這進一步確定了其在貧瘠、退化土壤改良中的重要地位。對土壤重金屬汙染的治理，目前常用的有客土法、淋濾法、吸附固定法等物理方法以及生物還原法、絡合浸提法等化學方法。但這些方法往往工程量大、投資昂貴，對大面積的汙染實施難度大。如對Ikm的汙染土壤進行工程治理，每Im深度土體的耗費高達 800 2400萬美元。生物修復技術可以削弱乃至消除環境汙染物的毒性，降低汙染物風險。同傳統的物理化學方法相比，生物修復具有成本低，不產生二次汙染，生態協調而易於被公眾接受等優點。
發明內容
本發明的目的是提供一種微生物協同植物治理土壤錳汙染的方法，該方法利用微生物協同植物，穩定和去除環境中的錳汙染，恢復受汙染生態系統的正常功能，有利於大範圍治理錳汙染。本發明方法還具有價格低的優點。實現的技術方案是
微生物協同植物治理錳汙染的方法，有以下步驟
1)取菌種R-118和R-2；
2)將挑取菌種R-118和R-2接種到液體LB培養基中，溫度為，200-250r/min的轉速，震蕩培養1-2天，得到經培養後的菌種R-118和R-2 ；
3)將經培養後的菌種R-118和R-2分別用不同的發酵罐培養，罐內壓力為0.05Mpa，發酵36小時，得到R-118和R-2菌種發酵液；
4)將吸附錳汙染較強的植物移栽到含有Mn2+的無土營養液中，加入R-118或R-2菌種發酵液，移至光照充分的條件下，生長5-7天，檢測錳離子含量變化。步驟4)所述的含有Mn2+的無土營養液的配置方法為取NH4NO3 0. 3g，KH2PO4 0. 19g，KNO3 0. 08g溶解混勻後吸取10ml，加水至1L，再加入1. 512g MnSO4混勻。步驟4)中含有Mn2+的無土營養液與菌種發酵液的體積比為75:1。本發明所述的吸附錳汙染較強的植物為豆科、十字花科植物，如紫花苜蓿、油菜寸。所述菌種R-118和R-2的製備方法是1)取錳礦石表面物質，加去離子水攪拌，製成原菌懸液，將原菌懸液均勻塗布在固態PYCM培養基平板上；2)在25 恆溫下培養 1 2天，挑取單菌落劃線純化，在固態PYCM培養基中25 培養，所得錳氧化微生物待選菌株，在液體PYCM培養基，搖床轉速為200r/min，溫度為^°C，培養2_4天，測定培養液中錳離子的含量變化，篩選出錳氧化微生物，得到R-118和R-2錳氧化微生物菌種。由於錳汙染土壤的植物修復是利用錳超量積累植物或超積累植物的超量吸收積累錳的吸收作用來降低或清除土壤錳汙染物。植物對錳金屬汙染位點的修復有三種方式 植物固定、植物揮發和植物吸收，通過這三種方式去除環境中錳離子。微生物對錳汙染的修復主要是對土壤中的錳進行固定、轉移或轉化，改變錳在土壤中的環境化學行為，可促進有毒、有害物質解毒或降低毒性，從而達到生物修復的目的。因此，本發明利用了微生物修復技術和植物修復技術協同作用的原理，
申請人的實驗結果表明，本發明所述方法，植物(紫花苜蓿)能夠耐受錳含量較高的土壤，不但能夠正常生長，而且能促進生長。微生物協調植物吸附錳的能力 ③紫花苜蓿和菌R-118>④紫花苜蓿和菌R_2>⑤紫花苜蓿 > ①菌R-118>②菌R-2。是基於微生物協同植物治理錳汙染的新方法，
通過測定營養液中錳離子含量表明，本實驗所述微生物協同植物治理土壤錳汙染的效果明顯，適用於大範圍推廣使用。
圖1為錳的標準曲線；
圖2為含有Mn2+的無土營養液中Mn2+隨時間的變化曲線。
具體實施例方式本發明所用試劑均採用市售的化學純產品。一.建立標準曲線
①甲醛肟試劑8. 0克鹽酸羥胺溶於50. OmL水中，再加入4. OmL甲醛(37%)，定容於 IOOmL容量瓶。②EDTA溶液(0. 015mol/L)稱取5. 6g乙二胺四乙酸二鈉，定容於IOOOmL容量瓶中。①鹽酸羥胺溶液(5%)準確稱取5. Og鹽酸羥胺，定容於IOOmL容量瓶中。用硫酸錳做標準液(Mn2+)。準確稱取0. 7684g MnSO4 ·Η20，用去離子水溶解後轉移至250mL容量瓶中定容搖勻備用。甲醛肟法測量錳含量的試劑用量及加入順序為先取待測溶液2. OOmL於50mL的容量瓶中，加水約10 mL,再依次加入0. 50mL氨水(1:1)溶液、 0. 60mL 甲醛肟、0. 20mL 鹽酸羥胺(5% )、l.OOmL EDTA (0. 015mol/L)，定容、搖勻，顯色 IOmin,於375nm測定吸光度。將標準液分別稀釋1，4，8，10，20倍，即錳含量分別為lg/L 0. 5g/L
0.25g/L 0. 125g/L 0. lg/L 0. 05g/L.然後分別取2ml於50ml容量瓶中，用甲醛肟法測吸光度，以空白為參比。結果表明，錳含量在0. lg/L-lg/L範圍內有良好的線性關係。回歸方程 y=0. 823x+0. 1123 R2=0. 9996.標準曲線如圖 1 所示。二 .菌種發酵液的製備
1.菌種R-118和R-2的製備
1)取錳礦石表面物質，加去離子水攪拌，製成原菌懸液，將原菌懸液均勻塗布在固態 PYCM培養基平板上；
2)在25 恆溫下培養1 2天，挑取單菌落劃線純化，在固態PYCM培養基中25 培養，所得錳氧化微生物待選菌株，在液體PYCM培養基，搖床轉速為200r/min，溫度為
^°C，培養2-4天，測定培養液中錳離子的含量變化，篩選出得到兩種錳氧化微生物，命名為R-118和R-2菌種。2. LB培養基成分蛋白腖Ig ；酵母膏0. 5g ；NaCl Ig ；瓊脂1. Sg ；蒸餾水IOOml ； PH調至7.0;
3.將菌種R-118和R-2從斜面挑取少量菌種接種到液體培養基中，以備發酵使用。然後，將燒瓶固定在搖床上，進行微生物震蕩培養。固定在搖床上的燒瓶以200-250r/min的轉速運動，溫度保持在培養1-2天。4.菌種發酵罐培養
將兩種菌種分別加入不同的發酵罐培養，罐內壓力保持在0. 05Mpa。發酵36小時後，將菌種發酵液裝入桶內用作野外實驗。三.植物的種植 1)紫花苜蓿的種植
將取土壤(取自重慶理工大學校園內)，去除雜質，分成2份，每份重量為lOOOg，裝入2 個瓷盤中。把紫花苜蓿種子均勻的灑在上述土壤中，表面再覆蓋一層土壤，澆適量的水。將光照培養箱的溫度控制在20°C，每天澆水觀察植物生長狀態，並記錄。植物生長的過程中，應及時補水分和養料。2 )含有Mn2+的無土營養液製備
用分析天平準確稱取NH4NO3 0. 3g, KH2PO4 0. 19g，KN03 0 . 08g溶於IOOml容量瓶中混勻後，吸取IOml加入IL燒杯中，加水至1L，得到無土栽培營養液。再準確稱取1. 512g MnSO4 溶於無土栽培營養液中，得到含有Mn2+的無土營養液。所得含有Mn2+的無土營養液，平均分裝到6個紙杯中。3)種植
為模擬錳汙染環境並且容易檢測，本實施例採用無土栽培紫花苜蓿。
步驟1)所述植物生長至有較強的根系後進行移栽，移栽時先澆適量的水，使土壤潤溼利於植物取出而不損傷根系。取出植物後，用水將根系上的泥土洗淨，將植物固定在泡沫上，5株植物為一個實驗單元，移栽進盛裝有含有Mn2+的無土營養液的紙杯中。放在光照充足的條件下生長。注意每個杯子中植株差距不能過大。四.紫花苜蓿和微生物吸附錳檢測
1.首先將配好的含有Mn2+的無土栽培營養液吸取anl，用甲醛肟法測得初始OD=O. 456。 用標準曲線計算Mn2+含量為，0. 4179g/L.然後將無土栽培液搖勻，分裝到6個紙杯中，每個紙杯150ml含有Mn2+的無土栽培營養液。最後進行紫花苜蓿和細菌吸附試驗。方法如下
①號紙杯為含有Mn2+的無土栽培營養液(做空白對照)；
②號紙杯為含有Mn2+的無土栽培營養液中加入2ml的R-118菌種發酵液(下簡稱為菌 R-118)；
③號紙杯為含有Mn2+的無土栽培營養液中加入aiilR-2菌種發酵液(下簡稱為菌R-2);
④號紙杯為紫花苜蓿移栽在加入anlR-118菌種發酵液的含有Mn2+的無土栽培營養液中(下簡稱為紫花苜蓿和菌R-118)；
⑤號紙杯為紫花苜蓿移栽在加入anlR-2菌種發酵液的含有Mn2+的無土栽培營養液中 (下簡稱為紫花苜蓿和菌R-2);
⑥號紙杯移花苜蓿栽紫在含有Mn2+的無土栽培營養液中(下簡稱為紫花苜蓿)。2.將每個紙杯移至光照充分的條件下讓其生長，每過一天用取2ml營養液用甲醛肟法測其OD值，待所需各組數據穩定後停止。注意，吸取營養液時，先將營養液搖勻。3.實驗結果
從圖2中可以得出紫花苜蓿和微生物吸附錳能力
(1)空白對照中Mn2+含量逐漸增加，導致的原因是由於在開放的環境中，水分的蒸發導致營養液中錳離子的濃度增加。(2)由每條曲線最低點得出，吸附錳的能力③紫花苜蓿和菌R_118>④紫花苜蓿和菌R-2>④紫花苜蓿 > ③菌R-118>②菌R-2.
(3)菌R-118和R-2達到最低後錳離子濃度急劇增加說明隨著時間的推移，適合菌種生長的條件變化，菌種逐漸死亡。Mn2+重新釋放到營養液中濃度又逐漸變高。(4)菌種R-2較菌R-118最先開始出現死亡，說明營養液中的成分更適合菌R-118 生長。(5)紫花苜蓿協同微生物菌種吸附錳的含量最多，但不等於單獨兩者相加的量。(6)紫花苜蓿不僅具有較好的吸附錳能力，並且不會隨時間的變化將Mn2+重新釋放到環境中。結論通過上面的兩個實驗結果可以看出，紫花苜蓿能夠耐受錳含量較高的土壤，不但能夠正常生長，而且能促進生長；吸附錳的能力紫花苜蓿協同菌種吸附錳的含量最多，其中，⑤紫花苜蓿和菌R_118>④紫花苜蓿和菌R_2>②紫花苜蓿 > ③菌R_118>②菌 R-2。
權利要求
1.一種微生物協同植物治理錳汙染的方法，其特徵在於有以下步驟1)取菌種R-118和R-2；2)將挑取菌種R-118和R-2接種到液體LB培養基中，溫度為，200-250r/min的轉速，震蕩培養1-2天，得到經培養後的菌種R-118和R-2 ；3)將經培養後的菌種R-118和R-2分別用不同的發酵罐培養，罐內壓力為0.05Mpa，發酵36小時，得到R-118和R-2菌種發酵液；4)將吸附錳較強的植物移栽到含有Mn2+的無土營養液中，加入R-118或R-2菌種發酵液，移至光照充分的條件下，生長5-7天，檢測錳離子含量變化，錳離子濃度降低。
2.根據專利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟4)所述的含有Mn2+的無土營養液的配置方法為-M NH4NO3 0. 3g，KH2PO4 0. 19g，KNO3 0. 08g溶解混勻後吸取10ml，加水至1L， 再加入1. 512g MnSO4混勻。
3.根據專利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟4)中含有Mn2+的無土營養液與菌種發酵液的體積比為75:1。
4.根據專利要求1所述的方法，其特徵在於，所述吸附錳汙染較強的植物為豆科植物。
5.根據專利要求1所述的方法，其特徵在於，所述菌種R-118和R-2的製備方法是1) 取錳礦石表面物質，加去離子水攪拌，製成原菌懸液，將原菌懸液均勻塗布在固態PYCM培養基平板上；2)在25 恆溫下培養1 2天，挑取單菌落劃線純化，在固態PYCM培養基中25 培養，所得錳氧化微生物待選菌株，在液體PYCM培養基，搖床轉速為200r/ min，溫度為^°C，培養2-4天，測定培養液中錳離子的含量變化，篩選出錳氧化微生物，得到R-118和R-2錳氧化微生物菌種。
全文摘要
本發明公開了一種微生物協同植物治理錳汙染的方法有以下步驟1)取菌種R-118和R-2；2)將菌種接種到液體LB培養基中，溫度為28℃，200-250r/min的轉速，震蕩培養1-2天；3)將經培養後的菌種R-118和R-2用不同的發酵罐培養，罐內壓力為0.05Mpa，發酵36小時，得到兩種菌種發酵液；4)將吸附錳較強的植物移栽到含有Mn2+的無土營養液中，加入兩種發酵液，移至光照充分的條件下，生長5-7天，檢測錳離子含量變化，錳離子濃度降低。該方法利用微生物協同植物，穩定和去除環境中的錳汙染，恢復受汙染生態系統的正常功能，有利於大範圍治理錳汙染。本發明方法還具有價格低的優點。
文檔編號B09C1/00GK102489499SQ20111041747
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月14日 優先權日2011年12月14日
發明者王萬能 申請人:重慶理工大學