一種人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法

2023-11-05 06:33:12

專利名稱：一種人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術及醫學領域，具體地，本發明涉及一種人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法。
背景技術：
腫瘤發病率從 有癌症記錄以來，一直呈上升的趨勢，特別是過去二三十年以來，腫瘤發病率以每年3%-5%的速度增長。隨著腫瘤發病率的增長，針對腫瘤的治療方案也在不斷發展，免疫治療是其中一種重要的治療手段，此種治療手段對於清除腫瘤患者體內殘留的和轉移的腫瘤細胞、防止腫瘤的轉移和復發及提高患者的生存率具有重要的意義。其中細胞生物治療已經初露鋒芒，並成為腫瘤治療的重要發展方向。繼淋巴因子激活殺傷細胞(LAK)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)及CD3單克隆抗體激活的殺傷細胞(CD3AK)後，細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine induced killer,CIK)的殺瘤作用日益受到重視。CIK細胞最早於1991年由美國史丹福大學Schmidt Wolf等首次報導，他們發現在多種細胞因子(幹擾素、CD3單克隆抗體、白介素I和白介素2)作用下，外周血淋巴細胞可以被定向誘導並大量增殖成為腫瘤殺傷細胞。由於此類細胞同時表達CD3和CD56兩種膜蛋白分子，因此具有T細胞強大的抗瘤活性和自然殺傷細胞(NK)的非主要組織相容性複合物(MHC)限制性殺瘤等優點。與其他過繼性免疫治療細胞相比，CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤範圍廣、副作用小、對正常骨髓造血影響輕微等優點。因此，CIK細胞被認為是新一代腫瘤過繼免疫治療的首選方案。Schmidt Wolf 等使用常規密度梯度離心方法分離健康成人外周血，製備單個核細胞懸液，調整細胞濃度為I X IO6個/ml進行培養，於培養第I天在培養體系中加入I X IO3U/ml的幹擾素-Y (Interferon-gamma, IFN-Y ),培養24小時後加入3X 102U/ml的重組人IL-2,lX102U/ml的重組人IL-l，50mg/ml的⑶3單克隆抗體，以後每3天更換一次新鮮培養液並補充重組人IL-2，並調整細胞濃度至2X IO8L'郝希山、任秀寶等將纖連蛋白(Fibronectin, FN)的活性片段作為細胞因子添加到CIK細胞培養體系中，得到的細胞群中含有高比例的在細胞表面同時表達CD3、CD56分子的細胞。CIK細胞體外大量增殖並獲得強大的細胞毒活性與多種因素密切相關，這些因素包括細胞因子IL-1、IL-2、IL-7、IL-12、IFN和⑶3單克隆抗體等，其中IL-2是T細胞分泌的一種細胞因子(由133個胺基酸組成的多肽，相對分子質量約為15 X IO3)。它是人體免疫應答的核心物質，能促進所有亞型的T細胞增殖，是效應最強的細胞因子，雖然CIK細胞的體內殺瘤活性不依賴IL-2的存在，但在體外大量培養時，IL-2可促進CIK細胞增殖和殺傷活性。⑶3單克隆抗體(⑶3McAb)作為一種有絲分裂促進劑可促進細胞增殖。在採自淋巴瘤患者外周血的CIK細胞中加入抗CD3單克隆抗體，並將其與多種淋巴瘤和白血病細胞株共孵育，這些細胞株對於CIK細胞介導的溶細胞作用的敏感性明顯增加。纖連蛋白(fibronectin,FN)是一種位於細胞外基質中的大分子糖蛋白，分子量約550KD。FN由成纖維細胞、血管內皮細胞和巨噬細胞等合成並分泌，參與細胞黏附、遷移、凋亡、形態改變等過程，具有止血、損傷修復等功能。由於FN分子量大，全分子表達存在基因工程上的困難。因此人們試圖表達FN功能多肽並研究其功能，以期代替FN。細胞與FN的連接由整聯蛋白介導，主要是整聯蛋白a 5 ^ 1，又稱極晚期活化抗原VLA-5，可識別FN細胞結合結構域I (Cell-I)的RGD序列；整聯蛋白a 40 I，即VLA-4，可以與細胞結合結構域II(Cell-II)的CSl及CS5結合；硫酸軟骨素蛋白聚糖及⑶44分子可與FN羧基端肝磷脂結合結構域(Heparin-II)結合。美國專利第5198423號中成功構建了含有FN三個關鍵結構域的質粒，並轉入大腸桿菌HB101/pCH102(FERM BP-2800)。研究表明，含有FN三個關鍵的功能結構域，即細胞結合域(cell binding domain)、肝憐脂域(heparin domain)和CS-1區域的多肽能夠發揮FN的主要生理功能。該多肽可參與細胞的附著、伸展、分化和增殖。在培養淋巴細胞時加入該多肽和抗CD3抗體，該多肽能夠與靜息狀態的T細胞表面整合素家族成員VLA-4、VLA-5相結合，抗CD3抗體可與T細胞上的TCR結合，兩者共同作用激活酪氨酸激酶ppl25FAK，然後通過Ras途徑刺激T細胞的增殖和分化。吸附在培養介質上的重組該多肽可以在CD3單克隆抗體的協同作用下刺激T細胞活化。細胞粘附分子(cell adhesion molecule, CAM)是介導細胞與細胞或細胞與外基質間相互接觸和結合的膜表面糖蛋白。細胞間粘附分子-I (intercellular cell adhesionmolecule-1, I CAM-1)是一種重要的細胞粘附分子，它由Rothlein等於1986年在研究淋巴細胞粘附時發現。人ICAM-I基因定位於染色體19P 13. 3-13. 2區，長15. 5k b，含7個外顯子和6個內含子。人ICAM-I為經由長3. 3kb的可誘導的mRNA編碼的單鏈糖蛋白，屬免疫球蛋白超家族，由於糖基化程度不同，不同種類細胞的ICAM-I分子量有所不同，介於76-114kD，其中核心多肽的分子量為55KD。在結構上ICAM-I分為細胞外功能區、跨膜區和胞質區。細胞外功能區由483個胺基酸組成，含有5個免疫球蛋白(Ig)樣功能區，每個Ig樣區由一個單獨的外顯子編碼。信號肽和跨膜區及胞漿區分別由兩個不同的外顯子編碼。其膜外NH2-端的第1,2功能區為淋巴細胞功能相關抗原-I (lymphocyte functionalantigen-l，LFA-l)的結合部位。第2和第3結構域之間有一段連接序列，富含脯氨酸，類似免疫球蛋白的絞鏈區，可發生扭曲。以此連接區為界，氨基端的I-II結構域可結合LFA-I分子和鼻病毒，而羧基端側的III結構域可以結合巨噬細胞分化抗原-I分子(Mac-1)。LFA-I是ICAM-I的主要受體，Mac-I與ICAM-I的親和力較低，且在激活的白細胞上只有一小部分Mac-I (約10% )可介導ICAM-I粘附。ICAM-I的主要胞外功能結構域為NH2段I-II結 構域，經序列分析及文獻檢索，ICAM-IN段Q28-T207的180個胺基酸為主要功能序列，在ICAM-I與LFA-I分子結合過程中發揮關鍵作用。在現有的細胞免疫治療方案中，淋巴細胞體外高效增殖過程十分關鍵，而其中如何提高外周血單個核細胞體外擴增效率依然是目前本領域尚待完善的問題；另一方面，CIK細胞中起到關鍵殺瘤作用的是CD3/CD56雙陽性細胞，因此在提高細胞增殖數量的基礎上，提高⑶3/⑶56雙陽性細胞的比例顯得同樣重要。現有技術得到的CIK細胞中⑶3/⑶56雙陽性細胞的比例僅佔總細胞數的10-30%，無法充分滿足有效治療的需要，因此需要尋找新的培養方法來提高CD3/CD56雙陽性細胞的比例
發明內容

針對現有技術中外周血單個核細胞體外擴增效率及CIK細胞中⑶3/⑶56雙陽性細胞所佔比例均偏低的問題，本發明提供一種提高人體外周血單個核細胞體外擴增效率和CIK細胞中CD3/CD56雙陽性 細胞所佔比例的製備人細胞因子誘導的殺傷細胞的方法。本發明的目的通過以下技術手段得以實現一種人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，包括在人細胞因子誘導的殺傷細胞的前體細胞培養前用含有有效量的融合蛋白和人CD3單克隆抗體的包被液包被細胞培養瓶的步驟，和在所述人細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導及培養全過程中在細胞培養液中添加人CD3單克隆抗體的步驟；其中所述融合蛋白為人細胞間粘附分子-I功能結構域和人纖連蛋白功能結構域融合蛋白，且所述人細胞間粘附分子-I功能結構域為人細胞間粘附分子-I胞外第1、11結構域，所述人纖連蛋白功能結構域為人纖連蛋白的細胞結合域、肝磷脂域和CS-I結構域，所述人CD3單克隆抗體在所述細胞培養液中的濃度低於在所述包被液中的濃度。本發明的細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法中引入融合蛋白ICAM-FN，並在細胞培養全過程中加入CD3單克隆抗體，更好的刺激了淋巴細胞的增殖，同時提高CIK細胞中CD3/CD56雙陽性細胞所佔比例，從而使得外周血單個核細胞體外擴增效率是傳統方法的I. 3倍，所得CIK細胞中⑶3/⑶56雙陽性細胞所佔比例是傳統方法的I. 3-6倍，同時還提高了 CD3/CD8雙陽性細胞所佔比例，增強了 CIK細胞的殺瘤活性，本發明的CIK細胞製備方法相對於傳統方法殺瘤活性提高10-40%。


圖I為本發明構建的pColdlI-ICAM-FN表達質粒；圖2為IPTG誘導前後及不同濃度IPTG誘導的BL21 (DE)表達的ICAM-FN融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中各泳道如下A :蛋白Marker，B :IPTG誘導前陽性菌裂解液上清，C :0. ImM IPTG誘導3h後陽性菌裂解液上清，D :0. 5mM IPTG誘導3h後陽性菌裂解液上清，E 1.0mM IPTG誘導3h後陽性菌裂解液上清；圖3為ICAM-FN融合蛋白表達的Western Blot檢測結果，其中，泳道A :陽性菌裂解液上清；泳道B :空白對照菌裂解液上清；圖4為純化後的ICAM-FN融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，泳道A :純化後的目的蛋白；泳道B :蛋白Marker ；圖5為PI染色檢測CIK細胞活率的流式細胞檢測圖譜，其中活細胞比率為98. 47% ；圖6為CIK細胞生長曲線；圖7為本發明的方法得到的CIK細胞與傳統方法得到的CIK細胞的細胞表型流式細胞檢測圖譜比較，其中，A :傳統方法得到的CIK檢測結果；B:本發明的方法得到的CIK檢測結果；圖8為本發明的方法得到的CIK細胞與傳統方法得到的CIK細胞的殺瘤活性比較，其中，A :傳統方法得到的CIK殺傷效率；B :本發明的方法得到的CIK殺傷效率。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。本發明的實施方案中構建了人細胞間粘附分子-I功能結構域和人纖連蛋白功能結構域融合蛋白ICAM-FN，並在原核細胞中進行表達純化，然後用有效量的重組ICAM-FN和人CD3單克隆抗體包被細胞培養瓶，並用該細胞培養瓶培養經分離得到的人外周血單個核細胞，在該單個核細胞培養過程中於細胞培養液中加入人CD3單克隆抗體進行持續刺激，且人CD3單克隆抗體在細胞培養液中濃度小於前述包被液中濃度，以達到最佳刺激效果，之後檢測由單個核細胞誘導得到的CI K細胞的各項指標。其中所述重組ICAM-FN的原核表達採用低溫誘導的方式進行，以抑制大腸桿菌自身蛋白表達，便於目的蛋白的純化。本發明的實施方案中重組ICAM-FN構建及表達過程中使用的分子生物學方法為常規的分子生物學方法，未詳述的技術方案可從例如《分子克隆實驗指南(第3版)》中獲得。本發明實施例提供一種人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，包括在人細胞因子誘導的殺傷細胞的前體細胞培養前用含有有效量的融合蛋白和人CD3單克隆抗體的包被液包被細胞培養瓶的步驟，和在所述人細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導及培養全過程中在細胞培養液中添加人CD3單克隆抗體的步驟；其中所述融合蛋白為人細胞間粘附分子-I功能結構域和人纖連蛋白功能結構域融合蛋白，且所述人細胞間粘附分子-I功能結構域包含人細胞間粘附分子-I胞外第I、II結構域，所述人纖連蛋白功能結構域包含人纖連蛋白的細胞結合域、肝磷脂域和CS-I結構域，所述人CD3單克隆抗體在所述細胞培養液中的濃度低於在所述包被液中的濃度。本發明的CIK細胞製備方法引入了融合蛋白ICAM-FNjf淋巴細胞進行更有效的刺激，並在細胞培養全過程中加入CD3單克隆抗體，以形成持續的刺激。經測得，該實施例方法得到的外周血單個核細胞體外擴增效率是傳統方法的I. 3倍，得到的CIK細胞中CD3/CD56雙陽性細胞所佔比例為傳統方法的I. 3_6倍，同時提高了 CD3/CD8雙陽性細胞所佔比例，因而增強了 CIK細胞的殺瘤活性，提高了細胞免疫治療的效果。優選地，本發明實施例的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法中，所述細胞培養瓶的包被液中，所述融合蛋白濃度為5-25ii g/ml，優選濃度為10-15ii g/ml，所述人⑶3單克隆抗體濃度為I-IOii g/ml,優選濃度為4-7 V- g/ml,最優選濃度為5 y g/ml。該實施例的優選濃度條件下，可得到最佳的刺激效果，有效提高細胞免疫治療的效果。優選地，本發明實施例的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法中，所述細胞培養液中人CD3單克隆抗體濃度為50-100ng/ml。優選地，本發明實施例的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法中，所述融合蛋白中人細胞間粘附分子-I功能結構域(ICAM-I)和人纖連蛋白功能結構域(FN)通過柔性肽連接，以利用其柔性使融合的兩個結構域ICAM-I和FN在空間上可自由伸展，避免了活性位點的相互掩蓋。優選地，所述柔性肽序列為GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: I)。優選地，本發明實施例的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法中，所述含有柔性肽的人細胞間粘附分子-I功能結構域和人纖連蛋白功能結構域的融合蛋白的DNA序列為 SEQ ID NO:2。優選地，在所述融合蛋白的構建過程中，所述人細胞間粘附分子-I功能結構域的正向引物為Pl (SEQ ID NO: 3)，反向引物為P2 (SEQ ID NO:4);所述人纖連蛋白功能結構域的正向引物為P3 (SEQ ID NO: 5)，反向引物為P4 (SEQ IDNO:6)，通過兩步PCR法得到拼接到一起的目的基因序列SEQ ID N0:2。優選地，本發明實施例的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法中，所述人細胞間粘附分子-I功能結構域和人纖連蛋白功能結構域的融合蛋白於大腸桿菌中表達，大腸桿菌表達載體是分子生物學常用表達載體，具有成本較低，生長周期短的優點。優選地，所述人細胞間粘附分子-I功能結構域和人纖連蛋白功能結構域的融合蛋白的表達載體為pColdll，並採用低溫誘導的方式表達，優選於15°C誘導表達，以抑制大腸桿菌自身蛋白表達，便於目的蛋白的純化。以下結合具體實施例對本發明的實現進行詳細描述。實施例一 I.目的基因的獲得根據人的ICAM-I和FN基因序列，設計兩對引物 人ICAM-I的正向引物P1，反向引物P2;人FN的正向引物P3，反向引物P4。並通過兩步PCR獲得目的基因序列。弓丨物序列如下Pl :5，-CATCATCATCATCAT CATATG^ CAGACATCTGTGTCCCC-3』 (SEQ ID NO: 3)P 2 : 5 ， - ^gaaccaccaccaccgctaccgccaccgcc
GTAGGGGGCCGAGGTGTTCT-3』 (SEQ ID NO:4)p 3 : 5 ， - Iggcggtggcggtagcggtggtggtggttct
CCCACTGACCTGCGATTCAC-3』 (SEQ ID NO:5)P4 :5，-AGACTGCAGGTCGAC AAC( Tl' TTATGTGGAAGGAACATCCAAGAT-3，(SEQ IDNO: 6)Pl引物5』端引入NdeI酶切位點(下劃線且斜體部分)，P2引物5』端引入柔性肽GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: I) cDNA的互補序列(加框部分)，以含有人ICAM_lcDNA序列的質粒(購自Origene)為模板，擴增人ICAM-I胞外第I、II結構域。P3引物5』端引入柔性肽GGGGSGGGGS的cDNA序列(加框部分)，P4引物5』端引入Hind III酶切位點(下劃線且斜體部分)，以美國專利第5198423號中構建的含有人FN三個關鍵結構域的質粒pCH102為模板，擴增人FN的細胞結合域、肝磷脂域和CS-I區域的基因序列。所得兩段基因序列分別以ICAM和FN命名。第一步PCR :按照常規PCR方法分別擴增兩段目的基因，100 U I PCR反應體系，各組分如表I所示表I
模板質粒IuL
PCR 緩衝液(10 X )IOy L
dNTP (2. 5mmol/y L)8y L
MgCl2 (25mmol/uL)8 u L
權利要求
1.一種人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，包括在人細胞因子誘導的殺傷細胞的前體細胞培養前用含有有效量的融合蛋白和人CD3單克隆抗體的包被液包被細胞培養瓶的步驟，和在所述人細胞因子誘導的殺傷細胞的誘導及培養全過程中在細胞培養液中添加人CD3單克隆抗體的步驟；其中所述融合蛋白為人細胞間粘附分子-I功能結構域和人纖連蛋白功能結構域融合蛋白，且所述人細胞間粘附分子-I功能結構域包含人細胞間粘附分子-I胞外第I、II結構域，所述人纖連蛋白功能結構域包含人纖連蛋白的細胞結合域、肝磷脂域和CS-I結構域，所述人CD3單克隆抗體在所述細胞培養液中的濃度低於在所述包被液中的濃度。
2.根據權利要求I所述的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，其特徵在於，在所述包被液中所述融合蛋白濃度為10-15ii g/ml，所述人CD3單克隆抗體的濃度為4-7 ii g/ml，在所述細胞培養液中所述人⑶3單克隆抗體的濃度為50-100ng/ml。
3.根據權利要求I所述的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，其特徵在於，所述融合蛋白中人細胞間粘附分子-I功能結構域與人纖連蛋白功能結構域是通過柔性肽連接。
4.根據權利要求3所述的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，其特徵在於，所述柔性肽胺基酸序列為SEQ ID NO: I。
5.根據權利要求3所述的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，其特徵在於，所述融合蛋白的DNA序列為SEQ ID NO: 2。
6.根據權利要求3所述的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，其特徵在於，構建所述融合蛋白中人細胞間粘附分子-I功能結構域的引物為正向引物Pl :5』 -CATCATCATCATCATCATATGCAGACATCTGTGTCCCC-3』 (SEQ ID NO:3)，反向引物 P2 :5』 -AGAACCACCACCACCGCTACCGCCACCGCCGTAGGGGGCCGAGGTGITCT-3』 (SEQID NO:4); 構建所述融合蛋白中人纖連蛋白功能結構域的引物為正向引物 P3 :5』 -GGCGGTGGCGGTAGCGGTGGTGGTGGITCTCCCACTGACCTGCGAITCAC-3』 (SEQID NO:5), 反向引物 P4 :5』 -AGACTGCAGGTCGACAAGCTITTATGTGGAAGGAACATCCAAGAT-3』 (SEQ IDNO:6)。
7.根據權利要求I所述的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，其特徵在於，所述融合蛋白是在大腸桿菌中表達。
8.根據權利要求7所述的人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，其特徵在於，所述融合蛋白的表達載體為pColdll，並在15-20°C誘導表達。
全文摘要
一種人細胞因子誘導的殺傷細胞的製備方法，包括在人CIK細胞的前體細胞培養前用含有有效量的融合蛋白和人CD3單克隆抗體的包被液包被細胞培養瓶的步驟，和在所述人CIK細胞的誘導及培養全過程中在細胞培養液中添加人CD3單克隆抗體的步驟；其中所述融合蛋白為人細胞間粘附分子-1功能結構域和人纖連蛋白功能結構域融合蛋白，所述人CD3單克隆抗體在所述細胞培養液中的濃度低於在所述包被液中的濃度。本發明的製備方法顯著增加了外周血單個核細胞體外擴增效率及CIK細胞中CD3/CD56雙陽性細胞所佔比例，增強了CIK細胞的殺瘤活性，從而提高了細胞免疫治療的效果。
文檔編號C12N5/0786GK102732481SQ201210194280
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月13日 優先權日2012年6月13日
發明者李志惠 申請人:李志惠, 鄭意端