青蒿琥酯在製備抗肝纖維化製劑中的應用的製作方法

2023-11-04 15:52:47

專利名稱：青蒿琥酯在製備抗肝纖維化製劑中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及有機有效成分是內酯類的醫藥配製品的用途，具體是一種青蒿琥酯在製備抗肝纖維化製劑中的應用。
背景技術：
肝纖維化存在於一切慢性肝病的發病過程中，是慢性肝病的特徵性變化，其結局是肝硬化和肝癌，嚴重影響民眾健康。據統計，慢性乙型、丙型病毒性肝炎患者中1/3可轉化為肝硬化，後者的1/3可轉化為肝癌；酒精性肝病、血吸蟲病以及其它原因的慢性肝病使肝纖維化的發生率增高。一般認為肝纖維化是可以逆轉的，而肝硬化則否。因而阻斷了肝纖維化向肝硬化及肝癌的發病過程，但迄今為止未見確有療效的抗肝纖維，化藥物。
肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)是肝臟細胞外基質的主要來源，肝臟的炎症、損傷等各種因素均可使HSC活化，HSC的活化是肝纖維化的核心。抑制HSC的活化即可使細胞外基質生成減少，誘導活化的HSC凋亡等於消除了細胞外基質的來源，這就從不同環節阻斷了肝纖維化的發生。
1970年代我國科學家首次從黃花蒿(Artemisia annua L.)中分離鑑定出抗瘧有效成分青蒿素，為一種新型的倍半萜內酯。其後人工合成了蒿甲醚、二氫青蒿素、青蒿琥酯等衍生物。青蒿琥酯(artesunate)是青蒿素的水溶性衍生物，蒿甲醚是青蒿素的脂溶性衍生物，雙氫青蒿素是青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚的活性代謝產物，已作為我國開發的抗瘧新藥。
青蒿琥酯對紅細胞內期滋養體有殺滅作用，作用機制與青蒿素相同，即可能是血紅素或Fe2+催化青蒿琥酯(青蒿素)形成自由基破壞瘧原蟲表膜和線粒體結構，導致瘧原蟲死亡，作為起效快、療效確切、副作用小的新型抗瘧藥，青蒿素用於治療間日瘧和惡性瘧。青蒿琥酯抗瘧效果強於青蒿素，近期復發率比青蒿素低，主要用於腦型瘧和各種危重瘧疾的搶救，並可用於預防血吸蟲病。
中國專利85 1 00781 A公開了「抗瘧藥物青蒿酯及其製備方法」，其是由二氫青蒿素與琥珀酸酐在氯仿溶液中，在弱鹼性物質的催化下，經酯化反應生成。其抗瘧活性是青蒿素的5倍，可製成水溶性製劑。
《中國藥理學報》1987；8(1)72-76以「青蒿素丁二酸酯鈉對小鼠脾細胞[3H]尿核苷摻入及細胞膜的作用」為題，報導了青蒿琥酯能抑制小鼠纖維母細胞的[3H]UR滲入。
《醫學研究通訊》1998；27(2)417-8報導了「青蒿素對實驗性矽肺預防、病後治療觀察」，介紹了蒿甲醚50mg腹腔注射或灌胃對實驗性矽肺有預防及病後早期治療作用，能使肺重、肺膠原、肺組織矽含量顯著降低。
《重慶醫科大學學報》1998；23(3)260-262「青蒿素局部治療增殖性瘢痕臨床觀測」，介紹了青蒿素局部用於燒傷後增生性瘢痕，治療後瘢痕厚度及硬度顯著降低。
《Int J Oncol》(國際腫瘤學雜誌)2001，18(4)767-73介紹了青蒿素及其衍生物對白血病、結腸癌等多種腫瘤細胞株有抑制作用。
《Blood Cells Mol Dis》(血液細胞分子疾病)2002，28(2)160-168報告了青蒿琥酯誘導肝癌細胞HepG2株凋亡。
青蒿琥酯，化學名為二氫青蒿素-12-α-琥珀酸單酯，分子式為C19O8H28，分子量是384.4 3，結構式見圖1，是一種新型的具有倍半萜內酯結構的抗瘧藥青蒿素的衍生物，分子內存在過氧基團。
青蒿琥酯為無色結晶或白色結晶性粉末，無臭，幾乎無味。略溶於水，易溶於乙醇、丙酮、氯仿。熔點131℃～136℃，比旋度+10～+14，酸鹼度pH 3.5～5.5。
青蒿琥酯的結構式 發明內容本發明就是為了解決當今臨床上治療肝纖維化藥物貧乏和治療效果不理想的問題，而提供一種用於防治或逆轉肝纖維化的青蒿琥酯在製備抗肝纖維化製劑中的應用。
本發明的醫藥新用途是1.青蒿琥酯在製備抗肝纖維化製劑中的應用。
2.青蒿琥酯在製備對四氯化碳複合因素所致肝纖維化防治作用製劑中的應用。
3.青蒿琥酯在製備對牛血清白蛋白免疫性肝纖維化的防治作用製劑中的應。
4.青蒿琥酯在製備抑制大鼠肝星狀細胞增殖、調節肝星狀細胞周期和誘導肝星狀細胞凋亡製劑中的應用。
本發明證實了青蒿琥酯有抗肝纖維化的作用並初步探討了其作用機制。研究結果對肝纖維化的防治有重要價值。
青蒿琥酯的製備青蒿琥酯是以二氫青蒿素和琥珀酸酐為原料，在氯仿溶劑中，在弱鹼性介質三乙胺或碳酸氫鈉存在下，酯化反應而成。反應路線參見圖10。
使用方法青蒿琥酯用於防治或逆轉實驗性肝纖維化，採用口服給藥。
對四氯化碳複合因素所致肝纖維化，使用28.8mg青蒿琥酯/kg體重，每日一次，用藥44天；對牛血清白蛋白免疫性肝纖維化，使用18.75mg青蒿琥酯/kg體重，每日一次，用藥6周；毒副作用青蒿琥酯及其製劑對肝功能無不良影響；並對肝星狀細胞無細胞毒作用。
藥理作用青蒿琥酯能有效的降低模型大鼠的脂質過氧化物水平，在明顯抑制肝星狀細胞增殖、阻止肝星狀細胞由G0/G1期進入S期、誘導活化的肝星狀細胞凋亡的同時，顯著降低肝星狀細胞分泌羥脯氨酸水平及脂質過氧化物含量。
一.青蒿琥酯對四氯化碳複合因素所致肝纖維化的防治作用的體內實驗採用Wistar大鼠，清潔級，雌雄各半，飼養於清潔級動物室。青蒿琥酯原料藥由桂林南藥股份有限公司提供。秋水仙鹼為Sigma公司產品。羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)(AR，上海康達胺基酸廠，批號920506)。其它試劑為市售分析純試劑。
參照韓德五的方法(「葫蘆素B對實驗型肝炎與肝硬變的防治作用」《中華醫學雜誌》，1979；59(4)206-9)，以四氯化碳複合因素造模。分別對雄性和雌性大鼠按體重隨機區組法分組。設大、中、小劑量的青蒿琥酯用藥組(5.75mmol·L-1，1.92mmol·L-1，0.64mmol·L-1)，同時設正常對照，模型對照(灌胃等體積的蒸餾水)，秋水仙鹼對照組。預防性用藥。肝組織Hyp檢測按Jamall等的方法(Jamall IS，Finelli VN，QueHee SS.A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyprolinein biological tissues.Analytical Biochemistry，1981；112(1)70～5)。常規製備肝組織石蠟切片，HE染色、膠原纖維染色(Masson結締組織三合染色)。纖維化程度判別，根據Scheuer分期(Scheuer PJ.Classification of chronicviral hepatitisa need for reassessment.J Hepatol，1991；13(3)372～4)。脂質過氧化物(lipid peroxide，LPO)的測定方法(Yagi K.A simplefluorometric assay for lipoperoxide in blood plasma.Biochem Med，1976，15，212～6)。
統計分析計量資料用單因素方差分析，方差齊性時用Tukey檢驗，方差不齊時用Tamhane’s檢驗；等級資料用Ridit分析。
病理形態學觀察模型對照組鼠肝匯管區纖維結締組織增生，並向肝小葉內延伸。把肝小葉分隔成許多大小不等的肝細胞島，部分形成假小葉，增生的纖維組織內見炎症細胞浸潤，肝細胞胞漿疏鬆、氣球樣變及脂肪樣變；青蒿琥酯用藥組肝匯管區纖維組織較少，小葉內纖維隔薄，且向小葉內伸展淺，纖維組織內炎症細胞較少，肝細胞變性減輕，隨用藥劑量增大，肝纖維變性減輕更明顯。模型對照組肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量顯著高於正常對照組(P＜0.01)，青蒿琥酯高劑量組明顯低於模型對照組(P＜0.05)；青蒿琥酯高、中劑量組的肝纖維化程度明顯低於模型對照組(P＜0.05)。青蒿琥酯高劑量組和秋水仙鹼組大鼠血清脂質過氧化物(LPO)明顯低於模型對照組(P＜0.01)。
表1.青蒿琥酯對四氯化碳所致肝纖維化肝組織Hyp含量、纖維化程度、血清LPO的影響

與正常對照組比較，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。膠原纖維增生程度，多組比較的Ridit分析，χ2＝18.73，P＜0.05。
按本領域技術人員公知的方法將本發明藥物製備成片劑，採用預防性經口給藥44天，28.8mg青蒿琥酯/kg有明顯的抗肝纖維化作用，療效在一定程度上優於0.1mg秋水仙鹼/kg(用LSD檢驗時，P＜0.05)；9.6mg青蒿琥酯/kg亦有一定效果。
青蒿琥酯有抗四氯化碳複合因素所致肝纖維化大鼠的脂質過氧化損傷的作用。
二.青蒿琥酯對牛血清白蛋白免疫性肝纖維化防治作用的體內實驗採用Wistar大鼠，清潔級，雌性，飼養於清潔級動物室。青蒿琥酯原料藥由桂林南藥股份有限公司提供。牛血清白蛋白(BSA)電泳純，北京雙螺旋微生物培養基製品廠，批號20030310。弗氏不完全佐劑羊毛脂(化學純)50g，液體石蠟(分析純)100ml(均購自天津化學試劑二廠)，加熱至70度混勻，高壓滅菌，室溫存放。丙氨酸氨基轉移酶和天門冬酸氨基轉移酶試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號040408。總蛋白和白蛋白試劑盒，北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號031215。其它試劑為市售分析純試劑。
參照方步武的方法(「益氣活血合劑抗牛血清白蛋白免疫性肝纖維化作用的實驗研究」，《(中國中西醫結合雜誌》，1992，12(12)738-740)造模以牛血清白蛋白福氏不完全佐劑的乳化液皮下多點注射免疫大鼠(共5次)，對血清抗牛血清白蛋白抗體陽性的大鼠於尾靜脈攻擊注射牛血清白蛋白(劑量遞增，共10次)。攻擊注射2次後，將大鼠按體重隨機區組法分為模型對照組(對照組)和青蒿琥酯治療組(治療組)。治療組灌胃青蒿琥酯(採用人的等效劑量，即3.75mg/200g)至停止攻擊注射後2周，同時設正常對照，模型對照組(灌胃等體積的蒸餾水)。按試劑盒說明書的方法檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬酸氨基轉移酶(AST)、總蛋白、白蛋白。其它方法與實施例1相同。
青蒿琥酯對肝組織形態學的影響正常對照組，鼠肝匯管區纖維組織少，肝板以中央靜脈為中心呈條索狀向四周放射樣排列整齊，肝細胞結構正常；模型對照組肝小葉結構破壞，纖維結締組織增生，形成假小葉，可見殘存的肝細胞團，增生的纖維組織中有炎症細胞浸潤，肝細胞不同程度增生，增生的纖維組織附近，可見界板肝細胞核固縮、破裂、溶解。青蒿琥酯治療組多數大鼠肝匯管區有少量膠原纖維，小葉間少見膠原纖維，增生的纖維組織內炎症細胞少，肝細胞無明顯增生。各組肝纖維化程度見表2，青蒿琥酯治療組的肝纖維化程度明顯低於模型對照組(P＜0.01)，青蒿琥酯治療組明顯低於模型對照組(P＜0.01)。青蒿琥酯治療組大鼠血清LPO明顯低於模型對照組(P＜0.05)，見表2。模型對照組大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)明顯高於正常對照組(P＜0.01)，青蒿琥酯治療組大鼠血清ALT明顯低於模型對照組(P＜0.01)，肝功能的其他指標(天門冬酸氨基轉移酶、總蛋白、白蛋白)在三組間差異無統計學意義。
表2.青蒿琥酯對免疫性肝纖維化鼠肝組織Hyp含量、纖維化程度、血清LPO的影響

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。膠原纖維增生程度，多組比較的Ridit分析，x2＝15.02，P＜0.01。
表3.青蒿琥酯對免疫性肝纖維化大鼠肝功能的影響

與正常對照組比較，*P＜0.01；與模型對照組比較，#P＜0.01按本領域技術人員公知的方法將本發明藥物製備成片劑，防治性經口給藥6周，18.75mg青蒿琥酯/kg有明顯的抗大鼠免疫性肝纖維化的作用，同時能降低該模型大鼠的脂質過氧化損傷，可降低肝纖維化大鼠血清丙氨酸氨基轉移酶，對其它肝功能指標無不良影響。
三.青蒿琥酯抑制大鼠肝星狀細胞增殖、調節肝星狀細胞周期和誘導肝星狀細胞凋亡的體外實驗採用肝星狀細胞系HSC-T6(由上海中醫藥大學徐列明教授提供)，為猴病毒40(SV40)轉染的SD大鼠肝星狀細胞(HSC)，其表現型為活化的HSC，可表達高水平的I型膠原。青蒿琥酯粉針劑由桂林南藥股份有限公司提供。主要試劑DMEM全培養基，L-穀氨醯胺，HEPES，胰蛋白酶，碘化丙啶(PI)，均為GIBCO產品，秋水仙鹼為Sigma產品，均由聯星天津生物技術有限公司進口分裝；國產優質胎牛血清由聯星天津生物技術有限公司提供。羥脯氨酸測定試劑盒(批號20050307)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號20041026)均為南京建成生物工程研究所產品。主要儀器CO2孵箱，美國NAPCO(series 5400)；全自動酶標儀，奧地利TECAN公司；倒置顯微鏡，日本OLYMPUS；離心機，1380型低速自動平衡離心機；細胞計數板，上海求精生化儀器廠；流式細胞儀，美國Beckman CoulterEPICS-XL；凝膠成像分析儀，美國Rodak 440CF型產品。
1.基本方法(1)培養液的配製DMEM低糖全培養液含10％胎牛血清、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、1％L-穀氨醯胺。(2)0.25％胰酶消化液NaCl8g KCl 3.2g Na2HPO40.2g KH2PO40.2g加水溶解，再加胰酶2.5g定容至1000ml，0.22μm濾膜過濾除菌。(3)青蒿琥酯的配製稱取10mg青蒿琥酯加入500μl 5％NaHCO3完全溶解後，加DMEM培養液定容至5ml，即終濃度為2mg/ml。用時用全培養液稀釋至所需的濃度。(4)培養條件所有細胞均在37℃，5％CO2的培養箱中培養。(5)細胞傳代鏡下觀察細胞密度約80％時，棄去舊的培養液，加入2ml 0.25％胰蛋白酶，鏡下觀察細胞回縮，胞體趨於變圓，細胞間隙擴大後，立即翻轉培養瓶，棄去消化液，加入1ml全培養液終止消化，倒掉，加入2～3ml全培養液，用吸管吸取培養液反覆吹打瓶壁細胞成細胞懸液，完全培養液調整細胞濃度，以1×105/ml傳代。(6)細胞收集按傳代方法，常規消化細胞，將細胞懸液移入無菌離心管中，室溫下1900r/min離心5分鐘，棄上清即得。(7)細胞凍存常規消化細胞，1900r/min離心5分鐘棄上清，依所需體積量配製細胞凍存液(70％DMEM培養液、20％胎牛血清、10％二甲基亞碸)重懸細胞沉澱，分裝至凍存管，放入-80℃冰箱短期保存。(8)在倒置顯微鏡下進行細胞觀察。
2.主要方法(1)HSC-T6生長曲線的繪製細胞以1×105/ml密度接種於24孔細胞培養板。實驗第二天起，每隔12小時檢測每孔細胞數，每次數3個孔，並計算平均值，直至結束，根據記錄繪製細胞生長曲線。
(2)MTT比色法測定細胞抑制率用5％無酚紅1640全培養液將細胞密度調整為1×105/ml後接種於3塊9 6孔培養板中100μl/孔，24小時後換不同濃度藥物(青蒿琥酯終濃度為1.5，3.125，6.25，12.5，25，50，100μg/ml)的5％無酚紅1640全培養液200μl/孔，每組設6復孔，培養至24、48、72小時，終止培養前4小時加MTT(5mg/ml，以PBS(0.01mol/L，pH 7.4)溶解)20μl/孔，棄上清液加入DMSO100μl/孔，震蕩混勻，於酶標儀570nm處測定各孔吸光度值(A值)。抑制率＝(1-藥物組A值/對照組A值)×100％
(3)流式細胞儀測細胞周期的方法將1×105/ml細胞接種於50ml的培養瓶中，待細胞匯合約70％時換無血清的DMEM培養液培養18小時使細胞同步化；再換含不同濃度藥物(青蒿琥酯濃度6.25，25，50μg/ml，秋水仙鹼濃度6.25μg/ml)的全培養液，對照組加入等量的藥物溶劑，每組設3復瓶，繼續培養48小時收集細胞；用PBS(0.01mol/L，pH7.4)洗滌細胞一遍，用0.5ml PBS懸浮細胞，吹散使之成單細胞懸液，將其滴入4ml 95％冷乙醇中，邊滴邊混勻，4℃固定24小時，再用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)洗一遍；細胞計數，加入碘化丙啶(50μg/ml，含RNAase 100μg/ml)，使細胞終濃度大於1×106/ml，室溫避光染色20分鐘，上機檢測。以PI染色螢光強度(DNA)的不同，將細胞分為G0/G1期、S期、G2/M期，並計算出各期細胞的百分比。
(4)梯狀DNA檢測①提取細胞DNA以1×105/ml細胞接種於50ml的培養瓶中，待細胞匯合約80％時，分別用含不同濃度(0μg/ml、50μg/ml、200μg/ml)青蒿琥酯刺激HSC，24小時後收集細胞按基因組DNA提取試劑盒操作說明書進行。②走膠配膠稱1.3g瓊脂糖溶於100ml 0.5×TBE溶液中，微波加熱使其完全溶解，待瓊脂糖冷卻至60℃左右，加入溴化乙錠(EB，10mg/ml)2.5μl，使其終濃度為0.5μg/μl充分混勻。制膠洗淨凝膠槽涼幹，用瓊脂糖凝膠灌入下槽與橡膠框的縫隙，水平放置在工作檯上，待剛倒入的瓊脂糖完全凝固後，在凝膠槽中插好梳子，再將溫熱的凝膠倒入槽中，厚度約為梳齒高度的2/3處。室溫下凝固拔去梳子，將其放入電泳槽中，加入0.5×TBE電泳液，使液面沒過膠面1mm即可。③電泳將DNA提取物與1/10體積的上樣緩衝液混合，上樣。一側梳孔內加入7μlDNA marker，70V穩壓直流電泳，2小時。結果經凝膠成像系統分析。
3.其它羥脯氨酸和乳酸脫氫酶測定按試劑盒說明書的方法。
倒置顯微鏡下觀察傳代後的HSC，3小時(h)後可見細胞陸續貼壁，呈不規則梭形、星形，有偽足；隨著培養時間的延長，細胞逐漸排列緊密。青蒿琥酯(25μg/ml)處理18h後可見部分細胞逐漸變圓，折光性增強，隨著時間的延長變圓的細胞越來越多，且排列疏鬆，呈分離狀態，漂浮細胞增加。通過繪製HSC-T6生長曲線而得出HSC-T6的對數生長期，取對數生長期的細胞進行下述實驗。青蒿琥酯(1.5μg/ml～100μg/ml)作用24h～72h對HSC-T6呈劑量和時間依賴性地抑制，抑制率30％～60％，100μg/ml和50μg/ml青蒿琥酯對HSC-T6的抑制作用最強，見表4。青蒿琥酯作用於HSC-T6後，培養上清液中羥脯氨酸(Hyp)含量隨青蒿琥酯(12.5μg/ml～100μg/ml)用量增大和作用時間延長(24h～48h)而明顯降低(P＜0.05)，見表5。採用流式細胞技術研究發現青蒿琥酯(12.5μg/ml～50μg/ml)使HSC-T6處於細胞G0/G1期比例隨著劑量的增大而逐漸增高，與正常對照組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)，處於S期的比例則逐漸降低，秋水仙鹼的這些作用與青蒿琥酯相似，見表6。但是青蒿琥酯並不使HSC-T6培養上清液中的乳酸脫氫酶(LDH)活性增高，其水平與空白對照組很接近(P＞0.05)，秋水仙鹼則使培養上清液LDH的活性顯著升高(P＜0.01)，見表7。青蒿琥酯對HSC-T6作用48h後的細胞基因組DNA凝膠電泳，顯示50μg/ml青蒿琥酯組有明顯的凋亡HSC-T6的DNA梯形條帶。
表4.不同濃度的青蒿琥酯刺激不同時間後對HSC-T6的抑制作用

表5.不同濃度的青蒿琥酯刺激不同時間後對HSC-T6分泌膠原的影響

a，b，c，d，e示分別與藥物空白組，12.5μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml青蒿琥酯組比較，均為P＜0.05
表6.青蒿琥酯對HSC-T6細胞周期的影響

與藥物空白對照組比較，*P＜0.05表7.青蒿琥酯對HSC-T6細胞代謝活性的影響

與藥物空白對照組比較，*P＜0.01；與秋水仙鹼組比較，#P＜0.01本發明具有以下優點(1)首次提出青蒿琥酯具有抗肝纖維化的作用，並將青蒿琥酯用於不同病因所致肝纖維化的藥物治療。
(2)本發明為將青蒿素類藥物開發成為抗肝纖維化藥物提供藥效學及作用機制的研究依據，具有將青蒿素類藥物開發成為抗肝纖維化甚至預防肝癌發生等類藥物的價值。
(3)本發明以肝纖維化形成的原理為背景，研究並闡明中藥有效單體成分作用和機制，是發展中醫藥理論的重要方向，為發現新的作用原理和藥物作用的新靶點提供重要依據。


圖1正常大鼠對照組肝組織Masson染色10×10圖2CCl4致大鼠肝纖維化模型對照組肝組織Masson染色10×10
圖3AS高劑量(28.8mg/kg)對CCl4致肝纖維化的作用肝組織Masson染色10×10圖4AS中劑量(9.6mg/kg)對CCl4致肝纖維化的作用肝組織Masson染色10×10圖5A正常大鼠肝組織HE染色10×7.5圖5B正常大鼠肝組織Masson染色10×7.5圖6A免疫性肝纖維化大鼠肝組織HE染色10×7.5圖6B免疫性肝纖維化大鼠肝組織Masson染色10×7.5圖7A青蒿琥酯治療6周的免疫性肝纖維化大鼠肝組織HE染色10×7.5圖7B青蒿琥酯治療6周的免疫性肝纖維化大鼠肝組織Masson染色10×7.5圖8A培養液對照的HSC-T6傳代24小時10×20圖8B傳代24小時後，以25μg/ml青蒿琥酯作用HSC-T6後18小時10×20圖8C培養液對照的HSC-T6傳代42小時10×20圖8D傳代24小時後，以25μg/ml青蒿琥酯作用HSC-T6後24小時10×20圖9HSC-T6的DNA凝膠電泳圖10是由二氫青蒿素(I)和琥珀酸酐為原料製備青蒿琥酯(II)的反應路線。
具體實施例方式
實施例1按本領域技術人員公知的方法將本發明藥物製備成片劑，能呈劑量依賴性地和時間依賴性地抑制HSC增殖，而且對HSC無細胞毒性，陽性對照藥秋水仙鹼雖能抑制HSC增殖但對HSC有明顯的細胞毒性；同時青蒿琥酯能明顯降低HSC培養上清液中的羥脯氨酸的含量；青蒿琥酯能阻止HSC由G0/G1期進入S期，而對G2/M期無影響；青蒿琥酯能誘導活化的肝星狀細胞凋亡。
青蒿琥酯片劑每片含青蒿琥酯50.00mg，微晶纖維素92.75mg，澱粉13.25mg，無水乳糖105.69mg，硬脂酸鎂2.65mg，二氧化矽0.66mg。
採用直接壓片法製成片劑。用法每次1片，每日2-3次。每周用藥5-6天，每3-4周為一療程。孕婦禁用。用藥期間定期檢查網織紅細胞。
實施例2按本領域技術人員公知的方法將本發明藥物製備成青蒿琥酯注射劑在無菌條件下，以二氫青蒿素和琥珀酸酐為原料，在氯仿溶劑中，在弱鹼性介質三乙胺或碳酸氫鈉存在下，經酯化反應，製成青蒿琥酯，用乙醇重結晶，粉碎，得無菌粉末，在無菌室內按無菌操作法分裝，每支60mg。用時以5％碳酸氫鈉0.6ml溶解，然後加5.4ml生理鹽水稀釋，緩慢靜脈注射或肌肉注射。孕婦禁用。用藥期間定期檢查網織紅細胞。
實施例3按本領域技術人員公知的方法將本發明藥物製備成青蒿琥酯栓劑:
青蒿琥酯5g，5％NaHCO3 50ml(溶解青蒿琥酯)，甘油35g，普流羅尼(F68)10g，硬脂酸適量，可製成50粒。
用法每次1粒，每日1-2次，塞入肛內。每周用藥5-6天，每3-4周為一療程。孕婦禁用。用藥期間定期檢查網織紅細胞。
栓劑使用安全方便，減少或避免了腸肝循環。
實施例4按本領域技術人員公知的方法將本發明藥物製備成青蒿琥酯皮膚擦劑將青蒿琥酯溶於苯二甲酸二甲酯，加滲透促進劑氮酮5.63ml及丙二醇4.83ml(此二者終濃度均為5％)，以苯二甲酸二甲酯補充其體積至100ml，青蒿琥酯濃度為10mg/ml-15mg/ml。
用法於背部或腹部皮膚10cm×10cm面積塗抹青蒿琥酯皮膚擦劑，每公斤體重用藥1ml，每日用藥1次，每周用藥5-6天，每3-4周為一療程。孕婦禁用。用藥期間定期檢查網織紅細胞。
權利要求
1.青蒿琥酯在製備抗肝纖維化製劑中的應用。
2.青蒿琥酯在製備對四氯化碳複合因素所致肝纖維化防治作用製劑中的應用。
3.青蒿琥酯在製備對牛血清白蛋白免疫性肝纖維化的防治作用製劑中的應用。
4.青蒿琥酯在製備抑制大鼠肝星狀細胞增殖、調節肝星狀細胞周期和誘導肝星狀細胞凋亡製劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及青蒿琥酯在製備抗肝纖維化製劑中的應用，屬於有機有效成分是內酯類的醫藥配製品的用途。本發明提供的青蒿琥酯對不同原因的肝纖維化有防治作用，並減輕過氧化損傷，無肝毒性；青蒿琥酯能抑制肝星狀細胞增殖、阻止其由G
文檔編號A61P1/16GK1903191SQ20051001467
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月29日 優先權日2005年7月29日
發明者方步武 申請人:方步武