一種基於磁性納米微粒的人胸苷激酶螢光免疫分析新方法

2023-11-08 11:51:57 2

專利名稱：一種基於磁性納米微粒的人胸苷激酶螢光免疫分析新方法
技術領域：
本發明涉及臨床醫學測定方法和檢測分析，特別指一種基於磁性納米微粒 的人胸苷激酶螢光免疫分析新方法，即採用磁性納米技術和現代螢光免疫分析技術結合，對人類工型胸苷激酶(hTKl)血液和組織液實施準確檢測的新方法。
技術背景關於人胸腺嘧啶脫氧核苷激酶I型(hTKl)的技術背景人類I型胸腺嘧啶脫氧核苷激酶，中文簡稱為人類I型胸苷激酶；其英文名 為Human thymidine kinase,簡寫為hTKl。 DNA在合成之前，胸腺嘧啶脫氧核 苷(TdR)被攝入細胞並在轉化成TMP時必須經過磷酸化激酶的催化，而磷酸化反 應過程必須有TK酶的催化。正常生理狀況下，人細胞中的TK主要以兩種同工酶的形式存在，即hTKl 和hTK2。 一般地說，hTKl主要存在於細胞質中，而hTK2則主要存在於亞細胞結 構的線粒體中。由於其中一種同工酶大量存在於胚胎組織，也有學者分別稱它 們為胚胎TK(Fetal TK)和成人TK (Adult TK)。有研究發現，胚胎TK是與細胞 的分裂相關，存在於細胞質中，稱之為hTKl;而成人TK存在於線粒體中，它的 表達與細胞周期無關，又稱之為hTK2。或者將hTKl稱為細胞質胸苷激酶，hTK2 稱為線粒體胸苷激酶。hTKl基因定位在於染色體17q23. 2-q25. 3，靠近於半乳糖 激酶；而hTK2基因則定位於染色體16q22-q23. 1。事實上，在上個世紀80年代已有學者完成了 hTKl基因編碼區域的cDNA分 子克隆及其序列分析。研究表明，TK1全酶分子量為96000道爾頓，其分子結構 為四聚體，等電點聚焦免疫電泳測得其等電點為8.3-8.5。 TKl的四聚體中每一單體a螺旋/ P摺疊區域組成與ATP酶家系類似，其p-環是TK1酶活性調節區域， 即底物反應區域。四聚體中P摺疊區域有一鋅原子與e摺疊區域連接。在這0-絲狀帶摺疊的底部，幹鏈變寬成為一個套索閉環，是dTTP負責TKl活性反饋抑 制調節的的區域，但TK1這套索環結構是不同於其它脫氧核苷酸激酶。hTKl是存在於機體中的重要激酶之一，它作為一種胸苷參與DNA合成的關 鍵激酶，能可逆性催化胸腺嘧啶脫氧核苷與磷酸脫氧核苷之間的轉化，並真實而 客觀地反映著細胞的增殖狀況。正是由於hTKl與細胞分裂密切相關，在細胞分 裂Gl期含量較低，到S期後逐漸升高，至G2期達到最高，因此，編碼hTKl的mRNA 及其所表達的蛋白質也就成為細胞增生的標誌物。可以說，TKl水平的高低與 DNA在細胞周期的S期DNA合成速度密切相關。 一般情況下，所觀察到正常增殖 細胞TKl的水平在細胞周期的Gl和S期交界處開始升高，隨著細胞進入Gl晚 期，TKl酶的水平逐漸急劇上升，直至S和G2期交界處，但在腫瘤細胞中，這種 高TKl水平從S晚期一直持續到M早期。大量離體試驗結果表明，TKl在增殖 細胞和腫瘤細胞周期調控代謝過程具有特殊的意義。通常， 一些非增殖細胞的 TK1和健康人血清和組織中TK1，其含量極微或檢測不到，而在異常增殖細胞或 惡性腫瘤患者中，TK1酶伴隨著腫瘤細胞數的急劇增殖而升高。不同來組織增殖 細胞中細胞周期與TKl信使RNA (TKlmRNA)的表達關係是複雜的，mRNA的剪切 和翻譯也是隨細胞生長狀態變化的，推測TKl水平主要是通過翻譯後調控機制 發揮作用。而且，已有研究表明，增殖細胞生長的不同時期，TKl活性的調控則 主要是通過dTTP反饋抑制途徑和底物循環方式進行調節的。按照現有研究，癌細胞異常或失控的增殖是由於正常細胞的某種或多重突 變的與增殖相關的基因引起的，因此，正常細胞中生長相關的基因突變最終的 導致相關的癌蛋白的過度表達，阻抑蛋白的缺失或突變蛋白產物表達，並伴隨 一系列與細胞生長相關的酶和蛋白質調節失控。由於TKl與細胞異常增殖和腫瘤細胞表達密切相關，即在非增殖細胞和健康人血清中，含量極微或檢測不到， 而在惡性腫瘤患者中伴隨著腫瘤細胞的急劇增殖而升高等特徵，使學術界對TK1的研究引起了廣泛的關注和重視，並認為TK1有可能作為一種有價值的血清學細胞增殖標記物來檢測增殖細胞的增殖活性，適用於惡性腫瘤的細胞增殖度檢測。特別是已有文獻表明，TK1的活性在腫瘤細胞大於總量的95%，而TK2低於 5%，在正常健康人的血清中檢測很低或不可以檢測，因此採用檢測血清TK活性 將評估腫瘤增殖的惡性程度。hTKl在細胞異常增生時含量或活性增高，特別是 在細胞增生旺盛的早期惡性腫瘤患者的體液或血液中更是顯著增高，且hTKl水 平的高低與惡性腫瘤的切除和復發呈降低和升高的趨勢。曾有學者增採用12種 人癌組織進行免疫組化分析，發現TK1均呈現陽性結果，這初步證明了癌症患者 與TK1活力或含量增高有關,且進一步試驗也證明，隨著腫瘤細胞增殖速度明顯 提高，TK1活力增強，DNA合成速度加快，從而促進了腫瘤細胞的進一步增殖，形 成一個病情不斷加重的惡性循環。TK1在血清中保存是穩定的，通常在-2(TC條件下可保存5年以上，其之所 以穩定的可能原因，被認為是TK1在血清中是與其它蛋白質形成一大分子穩定 的複合物有關。不過，關於血清TK1的結構和性質仍然是不清楚的，其中包括 這酶在細胞內被破壞或者是由細胞以活性或非活性的狀態被分泌出去。目前關於hTKl分析測定方法的技術背景由於體內惡性腫瘤細胞的增殖不是按照正常細胞的2倍體分裂方式，根據這 種無休止惡性分裂的腫瘤細胞特徵，建立了腫瘤細胞增殖標誌物的理論基礎。過 去，通過體外培養細胞，觀察到胸苷(Thymidine,簡稱Thd)參與到DNA合成。放 射性同位素標記的胸苷(放射自顯影)或胸苷的類似物可以檢測腫瘤細胞中DNA 合成速度，發現細胞DNA的複製僅僅限定在細胞特定周期(S期)。這種同位素標 記方法檢測腫瘤細胞中DNA合成速度，計數細胞周期中S期細胞數增殖的比例，已被應用於檢測細胞的增殖速度，可用於對患者腫瘤細胞增殖度的檢測和評估患 者預後的十分有意義的參數。S-期細胞增殖指數高預示患者腫瘤預後差。以後採用胸苷的類似物溴代尿苷(BrdU)的攝入法以及它的抗體應用到流式細胞DNA 檢測儀，定量檢測DNA合成的速度與S期細胞增殖的速率相關性，但使用這種同位 素標記胸苷或BrdU的方法需要在活細胞中進行，僅僅是限於研究工作和有限的 患者檢測，且流式細胞計的技術不可能鑑別細胞周期中GfGi期的增殖細胞和非 增殖細胞，加之S期細胞成分複雜，也不可能用流式細胞計的技術分離惡性腫瘤 細胞和良性腫瘤細胞。後來通過免疫組化技術，基因組學和蛋白質組學等等技術 對組織活檢樣本分析，可以檢測到腫瘤細胞中許多與生長相關聯的蛋白質或酶 的水平異常改變，檢測患者腫瘤疾病期中的異常蛋白質或酶升降水平，將疾病發 現或復發風險和後評估提供有意義臨床參數。在血清中檢測這類異常蛋白或腫瘤標誌物的升降水平，可以幫助評估腫瘤早 期發生，腫瘤全切除術後的效果，疾病復發和預後評估。基於腫瘤細胞增殖標 志物的理論基礎是由於腫瘤細胞失出正常細胞生長調控導致細胞惡性增殖，這 一理論引導研究開發一種準確、無侵害性的血清學檢測方法，即在現代儀器可 能檢測出腫瘤以前，將可能更早期檢測已有腫瘤疾病或潛在的惡變，將給患者 提供較好的治療時機。因此，人們一直在尋求與腫瘤細胞增殖生長密切相關的， 同時可用於血清學和組織學的腫瘤細胞增殖標誌物標記物，如CEA， CA19-9， CA125, CA15-3，因其特異性的問題已在臨床應用上有爭議。當然，通過血液循環 類腫瘤標記物不同特性的信息及其對上述標誌物的檢測，仍為臨床提供了許多 有價值的參考和輔助診斷。hTKl在生長旺盛的細胞中表達升高，特別是腫瘤細胞，它是一種較為敏感 的新的肝癌標誌物，它能可逆性催化胸腺嘧啶脫氧核苷與磷酸脫氧核苷之間的 轉化，它與細胞的分裂和增殖有密切關係。而且，hTKl是一好的既適用於血清學也適用於組織學的廣譜型細胞增殖標記物，已用於人群體檢，惡性腫瘤的早期 發現，監控腫瘤患者治療效果和評估預後。人體液中hTKl的水平可以間接地反映體內是否有增生活躍的細胞，hTKl的水平可以判斷腫瘤的發生、發展和預 後。正如前述，細胞DNA合成速度，與其細胞周期S期細胞百分比比值關係己經 被流式細胞計證實，腫瘤組織中與正常組織比較，低分化的腫瘤與高分化腫瘤 比較，低分化腫瘤細胞TK1的檢測值升高；細胞增殖度緩慢的鼠腎癌細胞中的TK1 活性高於正常值的2-5倍。特別是基於在TK1的活性在腫瘤細胞大於總量的95。/。， 而TK2低於5。/。，在正常健康人的血清中檢測很低或不可以檢測，因此採用檢測血 清TK活性將評估腫瘤增殖的惡性程度。而且，採用hTgl活性檢測，對實體腫瘤 細胞增殖度也有許多報導。前列腺癌、胃癌、直腸癌、肺癌、乳腺癌、腦癌、 頭頸癌、卵巢癌、膀胱癌、肉瘤等惡性腫瘤TK1活性較良性腫瘤和正常人明顯增 高並顯示出有統計學意義的差別；而且，TK1的活性檢測同樣適用於檢測癌組織 中細胞中細胞質提取液TK1活性，並被認為是一種評估腫瘤細胞增殖度的好方 法。有研究從多個乳腺癌患者的癌組織中提取細胞的細胞質組分並進行TK1活性 檢測，結果顯示出高的TK1活性與腫瘤增殖度差相關。而且，TK1是一個好的增殖 細胞和腫瘤細胞的標記物，它的濃度變化可以被用於監控手術治療患者的效果。 因此，發明一種更加準確、實用和穩定性好、特異性高的方法檢測hTKl活性或 含量，對於腫瘤早期診斷，特別是乳癌的早期診斷具有特別重要的臨床意義。在過去的臨床和科研工作中，用於檢測或監測hTKl含量或活性的方法主要 有放射免疫法(RIA)、酶聯免疫法、化學發光法、免疫組化法、western blotting 法、點免疫印跡化學發光法、ELISA法、免疫增強化學發光法、壓電石英晶片免 疫傳感器法等。雖然，目前這些實驗室的檢測方法均能較為準確的測定出癌變 組織或體液及血液(血清或血漿)中hTKl的含量或活性，但過去主要採用的放射 免疫法(RlA)檢測血清hTKl的酶活性，即可以通過放射性同位素標記的3H胸苷的方法檢測血清中總量TK活性來表示血清TK1 (簡稱STK1)的活性，但這方法的 靈敏度不高，不適應於臨床血清中TK1的檢測；以後又發展了胸苷類似物-'251-5-碘-2-脫氧尿苷作為底物，建立一種靈敏度較高的血清TK1 (STK)放射性同位素檢 測方法，應用於人血清學腫瘤細胞增殖標記物檢測。儘管國際上已有學者採用1251 標記尿嘧啶核苷放射性酶分析法可測定出hTKl蛋白的活性和含量，但該方法 會部分受到人胸苷激酶2活性的影響，測定方法特異性不高,靈敏度、重複性和 穩定性均較差，臨床用於診斷和鑑別診斷存在著較大的局限性和誤差，且無法進 行臨床的早期診斷，有時甚至出現假陰性或假陽性的結果，而且有一定的放射性 汙染，給臨床診斷和鑑別診斷帶來了很大困難。尤其值得一提的是，採用1251標 記脫氧尿嘧啶不僅半衰期短(僅在4周時間)，且具有放射性汙染，久而久之容易 造成對檢測者健康損傷和環境汙染，而且胸苷類似物-1251-5-碘-2-脫氧尿苷並非 是TK1活性分析的專一性底物,並且在血清TK的活性測定中，對pH和溫度非常 敏感，常產生不準確結果，且需要使用貴重的檢測儀器(Y閃爍儀)，這種檢測需 要特別的設備和熟練技術人員操作，因此，該檢測技術在臨床應用上有很大的局 限性，也很難在臨床上廣泛推廣使用。後來，又有學者採用酶法和夾心ELISA方 法作血清學TK1鑑定，沒有發現健康人血清TK1和癌症患者血清TK1之間有顯著 性差異，認為是夾心ELISA方法不靈敏所致。以後國外有報導，應用Western Blotting檢測血清中hTKl的含量或活性，且能進行定量分析,在對腫瘤細胞的評 估方面遠遠優於胸腺嘧啶摻入法，因為胸苷激酶1測定直接代表該腫瘤中的胸 苷激酶1量而不受體外檢測條件的幹擾,也免除了影響外源性胸腺嘧啶摻入DNA 內的影響，但在臨床應用並不適用；點免疫印跡發光法雖然利用了發光技術的高 靈敏性，並通過X線片曝光，避免了使用發光檢測儀，且可長期保存實驗結果，但 需通過設立標準品對照，並根據斑點的深淺進行定量分析，但因這些方法操作繁 瑣，也難以在臨床上普及應用。而增強發光-免疫點印跡法主要參考印跡法原理，該方法操作複雜和繁瑣，不僅需時長，需要有特異好和靈敏度高的抗TK1抗體作為探測血清或者組織中微量的TK1分子的探針，而且需要大量貴重的儀器設備和 經驗豐富的專業操作人員，不僅無法在基層醫療單位普及應用，在大型綜合性醫 院也很難臨床應用。即使是我們不久前曾研究成功了 hTKl壓電石英晶片免疫傳 感器法，且具有較上述方法更多的特點和優勢，但也存在著檢測時間較長(40-60 分鐘)、檢測難度較大、特別是每次只能測定一個樣品，無法同時批量測定樣品 等，這在臨床上應用幾乎非常困難。尤其是上述所有檢測TK1的方法，基本上都 需要較為昂貴和特殊的儀器設備及配套試劑，或者需要專業檢測設備，加上操作 過程繁瑣，檢測時間較長，技術要求高，需要一定儀器等，無法在基層醫療單位或 家庭普及應用。但是，如果有特異性強、親和力好和靈敏度高的兩種TK1抗體， 免疫夾心法仍是很有前途的方法，這也是本發明採用揚長避短的依據之一。由於hTKl目前定量檢測體液中的hTKl尚無一個滿意的方法,研究和建立及 發明一種新型、靈敏、準確、實用的螢光免疫分析和檢測技術對於觀察和檢測 體液(特別是血液)中的hTKl含量和水平具有重要的診斷價值和臨床意義。目前關於螢光免疫分析測定方法的技術背景螢光免疫技術是標記免疫技術中發展最早的一種，它是將某抗原或抗體用熒 光素進行標記，在與標本中相應的抗體或抗原反應後，測定抗原抗體複合物中 螢光素的一種免疫技術，也被稱為免疫螢光素技術。很早以來就有一些學者試 圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原 物質的定位，而這種以螢光物質標記抗體而進行抗原定位的技術稱為螢光抗體 技術。螢光抗體技術是抗原抗體反應後，利用螢光顯微鏡判定結果的檢測方法， 也是螢光顯微鏡技術；而免疫螢光測定技術，則是在抗原抗體反應後，利用特 殊儀器測定螢光強度而推算被測物濃度的檢測方法。實際上，螢光免疫法按其 反應體系及定量方法不同，還可進一步分做若干種，但都是利用物質吸收外界能量而進入激發狀態，在回復基態時多餘的能量以電磁輻射的形式釋放，即發 出螢光。當停止提供激發能量，螢光現象隨即終止。與放射免疫法相比，螢光 免疫法無放射性汙染，並且大多操作簡便，便於推廣。可以說，螢光免疫測定， 與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用廣泛。螢光免疫技螢光免疫技術正是這種先應用致螢光物質對單克隆抗體進行標 記，檢測相應抗原的方法。目前主要有競爭法和雙抗體夾心法。通常，雙抗夾 心法是先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結合抗體，然 後加受檢標本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體複合物。洗滌除去 未結合物，接著加入螢光標記的抗體，使之與抗原特異性結合，形成抗體一抗 原一抗體複合物。最後根據檢測產物發出的螢光強度，即可對被測蛋白抗原進 行定量。該法重複性好，線性範圍寬，具有快速、敏感、準確的特點。螢光免疫分析(FIA)是歷史最悠久的 -種標記免疫分析，靈敏度很高。它在 臨床疾病(包括惡性腫瘤)診斷方面有著極為廣泛的用途。但是生物樣品(如血清)本身的螢光位於400-600nm，與常用的螢光標記物(如FITC)的螢光發射光譜 產生重疊，從而，容易對自然本底螢光產生過大的幹擾，並直接影響到檢測結 果的敏感性和準確性。現代螢光免疫分析作為一種高靈敏分析技術已被廣泛應用到醫學，生物學 和環境學等領域，尤其是酶促螢光免疫分析，利用具有潛在螢光的底物作為酶 標物催化放大的顯示系統，由於累積放大和螢光的高敏感性，使方法學的靈敏 度提高很多。但傳統的免疫反應都是在酶標板中進行，抗原或抗體分子固定於 酶標板孔表面，由於酶標板孔比表面積小，抗原抗體分子固定量有限。酶標板 孔反應界面相對較小，抗原抗體分子的免疫反應性和標記酶分子的催化活性均 受到影響，造成免疫反應和酶催化反應效率不高，反應不均勻，且耗時長。而 微顆粒由於其比表面積大，具有生物分子固定量大、免疫反應快、分離方便等優點，被作為免疫分析的固相載體已得到研究學者和儀器廠家的重視。ABBOTT 公司採用多孔的塑料微顆粒作為固相載體，鹼性磷酸酶為標記用酶，以4-甲基 傘型酮磷酸鹽(4-MUP)為酶底物，發展了 IMX全自動酶免疫分析系統，其抗原抗體結合反應在塑料微顆粒固相上完成，分析儀需將塑料微顆粒轉移至特定的玻璃纖維上，再加入洗滌緩衝液將沒有結合的抗原或抗體被洗滌下去，而結合於塑料微粒固相上的抗原抗體則因微粒與玻璃纖維的不可逆結合而保留在玻璃纖維上。這種洗滌分離過程的效果雖然比較好，但是過程較為複雜，時間亦比較長。發明內容本發明的目的是針對背景技術中存在的缺點和問題加以改進、創新，提供 一種基於酶催化反應的高靈敏免疫分析技術，其檢測靈敏度可達到pg/ml甚至 更低，完全可滿足血清中hTKl含量檢測的要求，且其使用的酶標記試劑與ELISA 所用一樣，所用標記物製備簡便、儲存時間長、無放射性汙染、檢測重複性好、 製備方法成熟、成本較為低廉。而磁性顆粒(MP)性能穩定，功能化後可方便地 實現抗原或抗體的固定化，並可均勻分散在液相中與相應的抗體或抗原反應， 在外加磁場的作用下，可快速有效地實現免疫複合物與反應液的分離，具有固定 均勻、特異性高、分離快、重現性好等特點，為樣品的分離、富集和提純提供了 很大方便。針對傳統檢測方法的不足，本發明結合酶催化螢光免疫分析技術和 核殼型超順磁性納米顆粒的優點，建立一種快速簡便的高通量人胸苷激酶免疫 檢測技術，用於hTKl的臨床檢測。本發明的目的通過以下技術方案實現本發明hTKl包被的核殼型磁性顆粒(hTKlTMP)的製備包括以下步驟 l)磁性納米顆粒的製備:採用液相共沉澱方法，分別將一定濃度的FeCl3化0 和FeCl2 '犯20在氨性溶液中共沉澱，靜止分層並去掉上層清液後，立即加入濃度為20-30%的四甲基氫氧化銨溶液，再用超聲法分散後，再用砂漏鬥過濾，除去 其中較大的磁性納米顆粒，即可得到顏色為灰褐色、且磁性納米顆粒大小均勻一致的溶液；2) 磁性納米顆粒的氨基矽烷化吸取一定劑量的磁性納米顆粒溶液、並加 入至在100-200 ml異丙醇溶液中；用超聲法將磁性納米顆粒進行分散；同時， 邊攪拌邊加入3-6 g聚乙二醇(PEG-4000)，繼續攪拌10-20min後加入適量蒸 餾水，然後加入O. 1-0.3ml正矽酸乙酯(TES0)水解形成矽殼層；在特定磁場作 用下，用無水乙醇和蒸餾水分別洗滌乾淨後，分散於無水乙醇中再加入適量蒸 餾水後，在不斷攪拌下加入0. 1-0. 3ml 3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)，形成 氨基化矽烷殼層；在特定磁場作用下，分別用無水乙醇和蒸餾水洗滌乾淨後， 分散於PH7. 0-7. 6的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，所得物質即為氨基矽烷化的磁性 納米顆粒(麗Ps);3) 磁性納米顆粒標記人類I型胸苷激酶(hTKl):將上述氨基矽烷化的 磁性納米顆粒(MNPs)用戊二醛活化，用pH7.0-7.6的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)洗 滌乾淨後，再分散於相同的PBS中；然後，直接在此PBS溶液中加入一定劑量 的hTKl (用基因克隆技術，在大腸桿菌中表達hTKl基因，製備得到hTKl的 融合蛋白)，在一定條件下反應O. 5-1.5h，即可將hTKl共價固定於MNPs上， 得到hTKl包被的磁性納米顆粒(hTKl-麗Ps);4) 封閉在hTKl-MP分散溶液中加入甘氨酸溶液反應1 h，即可封閉磁 性納米顆粒表面的活性醛基；最後，用pH7.0-7.6的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)洗滌 乾淨後，再分散於相同的PBS中；5) 保存將hTK卜MNPs保存在4"C的冰箱中備用。 本發明hTKl酶催化螢光檢測包括以下步驟採用競爭免疫分析方法，將待測hTKl與辣根過氧化物酶標記的hTKl單克隆抗體(服P-Ab)反應30-60min，再加入同體積的hTKl-MP，在37'C下競爭反應 30-60min，用pH7. 0-7. 6的磷酸鹽緩衝溶液洗滌乾淨後，在特定磁場作用下分離， 並分散於PH7. 0-7. 6磷酸鹽緩衝溶液中，加入一定濃度的對羥基苯丙酸(HPPA)、 過氧化氫(HA)和磷酸鹽緩衝溶液，反應0.5-lh，在特定磁場作用下分層；移 取上層清液、並置於螢光比色皿中，用紫外光激發，測量可見光處的螢光強度； 測試溶液的螢光強度隨著試樣中的hTKl的濃度增加而減弱，螢光響應與hTKl在 0. 0卜lng/ml之間成線性關係，從而實現對hTKl的準確測定，其檢測下限可達到 0. 008 ng/ml;通常情況下，由於惡性腫瘤(乳癌)等血清樣品中的hTKl濃度約為 ng/ml水平，所以，採用此靈敏度高的方法可以進行人體血清中hTKl濃度的測定。 本發明的技術原理採用競爭免疫分析方法，將待測hTKl和hTKl-MP共同與辣根過氧化物酶標 記的hTKl單克隆抗體(HRP-Ab)競爭反應，並在磁場作用下分離，將結合了 HRP-Ab的hTKl-MP加至對羥基苯丙酸(HPPA)溶液中，催化產生強螢光的二聚體 化合物，導致螢光強度增強(圖1)。待測溶液中hTKl濃度越大，結合到hTK卜MP 的HRP-Ab就越少，螢光強度變化也小，因此可以根據螢光強度的變化來定量溶 液中hTKl的濃度，實現人體血清中hTKl濃度的測定。本發明的主要技術特點① 本發明採用液相共沉澱方法進行磁性納米顆粒的製備，不僅納米顆粒均 勻一致,而且,實際操作容易，方法簡單，試劑成本低廉。② 本發明應用3-氨基丙基三乙氧基矽烷材料，其技術特點是能在該磁性納 米顆粒表面形成生物相容性良好的氨基矽烷化殼層，改善了磁性納米顆粒的分 散性和穩定性，且固定化的hTKl分子的免疫反應活性提高，反應速度加快，其整 個免疫反應可以在40 min以內完成。③ 本發明設計的分析檢測方法結合了磁性納米顆粒富集與酶催化反應的雙重效果，其技術特點是發揮了磁性納米顆粒富集，以提高單位體積內待檢物的濃 度，以及酶催化反應的高效和特異的特點，從而大大提高了該方法對血清中hTKl檢測的靈敏度，其檢測下限可達到0. 008ng/ml。 本發明的主要技術優點① 檢測方法簡單,通過將hTKl抗原事先共價固定於氨基矽烷化的核殼型磁 性納米顆粒上，簡化了測定步驟。② 氨基矽烷化的核殼型磁性納米顆粒性能穩定，生物相容性好，固定化hTKl 抗原具有良好的免疫反應活性，確保了分析方法的高靈敏度。③ 矽烷化的核殼型磁性納米顆粒可均勻分散在液相中與相應的抗體或抗原 反應，具有固定均勻、特異性高、重現性好等特點，由於反應為近均相反應， 反應速度快。④ 在外加磁場的作用下，可快速有效地實現核殼型磁性納米顆粒的免疫復 合物與反應液的分離，為樣品的分離、富集提供了很大方便。⑤方法操作簡單，易於實現自動化檢測，可完成大批量的測試任務。
本方法對hTKl具有良好的響應特異性。⑦ 本方法採用了酶催化方法，利用過氧化物酶催化HPPA氧化形成強螢光二 聚體，可獲得極高的檢測靈敏度。⑧ 本方法結合酶催化技術和核殼型磁性納米顆粒的高生物相容性、分散性 和分離快的特點，可實現hTKl的快速檢測，可望成為一個hTKl新的可靠檢測 方法，用於腫瘤病人早期診斷的臨床檢測。本發明的主要創新點 .① 將3-氨基丙基三乙氧基矽烷在磁性納米顆粒用作為hTKl的固定化載體材 料，確保了 hTKl分子高免疫反應活性，提高了反應速度。② 以辣根過氧化物酶為標記酶，對羥基苯丙酸為底物發展了一種hTKl酶催化螢光免疫分析方法。③ 採用競爭免疫分析方法，並將辣根過氧化物酶標記的hTKl單克隆抗體與待測hTKl先反應一段時間，再和hTKl-MP競爭反應，提高低濃度待測hTKl與 標記抗體的免疫反應效率。④ 在磁場作用下，實現血清中hTKl的富集，提高了 hTKl的檢測靈敏度。


圖1是本發明螢光響應機理示意圖 圖2是hTKl螢光免疫分析示意圖 圖3是螢光響應信號對hTKl濃度的校正曲線具體實施方式
實施例一hTKl包被核殼型磁性顆粒的製備① 磁性納米顆粒(MNPs)的製備分別準確稱取O. 59g FeCl3 H"和 0. 40FeCl2 4H力溶於4 ml 2M的HC1中，使其濃度分別為0.82 M和O. 43 M。迅速 混合於250 ml三口燒瓶中，再迅速滴加40 ml 1 M的氨水，5 min後加入O. 0202g 抗壞血酸(分析純)，攪拌30 min，靜止分層並去掉上層清液，加入1.5 ml 25%的 四甲基氫氧化銨(分析純)溶液，攪拌10min，加入蒸餾水使其總體積為40 ml，超 聲波振蕩15 min，用砂漏鬥過濾，除去大顆粒即得磁性納米顆粒，得到灰褐色磁 性納米顆粒溶液。② 磁性納米顆粒的氨基矽烷化將lml磁性納米顆粒與100ml異丙醇混合併 超聲30min，邊攪拌邊加入3g聚乙二醇(4000,分析純)，繼續攪拌10min後，加入9 ml蒸餾水，再攪拌IO min，加入O. lml四乙氧基矽垸(TEOS，分析純)，攪泮 24h(450rpm/min);在磁場作用下，用無水乙醇和蒸餾水各洗3次，每次3 min,分 散於9.5ml無水乙醇中，加入0.5ml水，攪拌下加0.2 ml 3-氨基丙基三乙氧基矽烷，繼續攪拌8h(450rpm/min)，在磁場作用下用無水乙醇和蒸餾水各洗3次，每次 3min，並分散於5 ml pH7. 4的磷酸鹽緩衝溶液(PB,由1/30M Na2HP04和1/30M KH2P(^ 成比例配成)溶液中備用，所得物質即為氨基矽烷化的磁性納米顆粒。③ 磁性納米顆粒(MNPs)標記hTKl:取lml上述磁性納米顆粒，加入100pl 2.5 %戊二醛活化90min，用pH7. 4的磷酸鹽緩衝溶液洗滌3次，每次3 min，分散於lml pH7.4的磷酸鹽緩衝溶液中，加入20111 0.01mg/ml hTKl，反應l h，得到hTKl包被 的磁性納米顆粒。④ 封閉取l ml hTKl包被核殼型磁性顆粒，加2ml 20mg/ml甘氨酸封閉lh， 用磷酸鹽緩衝溶液洗滌3次，分散於lml磷酸鹽緩衝溶液中。(D保存將hTKl包被核殼型磁性顆粒保存在4°C的冰箱中備用。實施例二hTKl的檢測取20 pl不同濃度(0-2. Ong/ml)的hTKl溶液分別與10|al50ng/ml辣根過氧 化物酶標記的hTKl單克隆抗體(通過用大腸桿菌表達和純化的人胸苷激酶免疫 Balb/C小鼠，免疫小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合，HAT選擇培養和ELISA篩選陽 性克隆，陽性克隆雜交瘤注入小鼠腹腔製備腹水，再純化製得)反應40min，再加 入10^1磁性納米顆粒標記hTK(hTKl-MNPs)，在37t:條件下反應40min，再用磷酸 鹽緩衝溶液(pH二7. 4)洗滌3次，在磁場作用下分離後，分散於1(^1 pH=7. 4磷酸 鹽緩衝溶液中，依次加入150|il pH5. 5磷酸鹽緩衝溶液，20ial 4.4X10、 HPPA 和20pl 8.8X10—4 M &02，反應30min，在磁場作用下，用微量加樣器吸取上層清 液20(^1置於螢光比色皿中，然後用F-4500螢光光度儀(Hitachi High-Technologies Corporation )進行螢光檢測，在286nm處激發，測量407， 處的螢光強度。螢光增強強度與試樣中的hTKl的濃度成反比，實驗結果見圖3。 通過線性回歸分析顯示，螢光響應與hTKl濃度在0. 01ng/ml到lng/ml之間成線性關係，檢測下限為0.008 ng/ml，表明本酶催化螢光免疫分析可以對hTKl進行 準確的測定。 應用實施例對臨床血清樣品檢測利用本方法對4例正常血清樣品和4例肝癌血清樣品，分別進行4次平行 測定。即用微量加樣器分別準確吸取2)lll各種血清樣品置於不同的試管中，再用 pH7. 4磷酸鹽緩衝溶液將各種血清樣品分別稀釋10倍至20 pl，並彩色記號筆做 好標記；然後，分別與10(il 50 ng/ml HRP-Ab反應40min;再分別加入10|il hTKl-麗Ps,在37。C恆溫水浴的條件下反應40min，再分別用磷酸鹽緩衝溶液 (p^7.4)洗滌3次;在磁場作用下進行分離後，將其各自分散於10 pl磷酸鹽緩 衝溶液(p!K7.4)中，依次加入150jLi1 pH5. 5磷酸鹽緩衝溶液、20 pl 4. 4X10—4M HPPA和20(il 8. 8 X 10—4 M HA,反應lh,再在磁場作用下，取上層清液200|a1置於 螢光比色皿中，用F-4500螢光光度儀進行螢光檢測，在波長286nm處激發，測量 波長407nm處的螢光強度。4例正常血清樣品的螢光強度分別為305. 9±4. 2、 302.9±5.7、 299. 3土3.9和300.6士4.0:而4例肝癌血清樣品的螢光強度則分 別為271.5士3. 4、 268. 1 ±5. 5、 270. 5±3. 7和265. 4 ±4.8。結果顯示，肝癌 血清樣品經稀釋10倍後螢光強度約為270， hTKl的濃度都高於2. 0 ng/ml 。正 常的血清樣品螢光強度約為300， hTKl濃度約為0.1 ng/ml。正常的血清樣品 中的hTK含量明顯高於正常血清樣品，表明本方法可以滿足血清中hTKl濃度的本發明實施的注意事項① 所用FeCl3 H20和FeCl2 4H20用量比例應準確；反應過程中添加氨水要 迅速。② 在進行氨基矽烷化反應前需要加入聚乙二醇；另外，氨基矽烷化反應時，一定要攪拌均勻。③ 在進行磁性納米顆粒標記hTKl時，其磷酸鹽緩衝溶液的pH值儘可能控制 為7.4。④ 磁性顆粒封閉時不需要洗滌，磁性顆粒封閉完後要洗滌乾淨；hTKl包被 核殼型磁性顆粒保存在4"C的冰箱中，不要冰凍。 進行hTKl檢測時，應先讓hTKl溶液和辣根過氧化物酶標記的hTKl單克 隆抗體反應後，再加磁性納米顆粒標記hTKl進行競爭反應。⑥ 進行hTKl檢測時，所有酶催化反應時間務必一致，均為30 min;另外,其 底物磷酸鹽緩衝溶液的pH值為5. 5。⑦ 在進行hTKl血清標本檢測時，血清樣品先用pH7. 4磷酸鹽緩衝溶液稀釋 IO倍再進行檢測。⑧ 同樣，在進行hTKl血清標本檢測時，血清標本稀釋液應先與辣根過氧化 物酶標記的hTKl單克隆抗體反應後再加入磁性納米顆粒標記hTKl進行競爭反 應；酶催化反應時間要一致，為30 min;底物磷酸鹽緩衝溶液的pH值為5. 5。⑨ 本發明中要求技術保密的部分先讓hTKl溶液辣根過氧化物酶標記的 hTKl單克隆抗體反應時間10-60 min，再加入磁性納米顆粒標記hTKl進行競爭 反應;酶催化反應底物磷酸鹽緩衝溶液的pH值範圍3. 5-7. 5;血清樣品檢測前用 磷酸鹽緩衝溶液稀釋倍數2-100倍。本發明所述的實施例僅僅是對本發明的優選實施方式進行的描述，並非對 本發明構思和範圍進行限定，在不脫離本發明設計思想的前題下，本領域中的 學者或工程技術人員對本發明的技術方案作出的各種變型和改進，均應落入本 發明的保護範圍，本發明請求保護的技術內容，己經全部記在權利要求書中。
權利要求
1、一種基於磁性納米微粒的人胸苷激酶螢光免疫分析新方法，其特徵在於，hTK1包被的核殼型磁性顆粒(hTK1-MP)的製備包括以下步驟1)磁性納米顆粒的製備採用液相共沉澱方法，分別將一定濃度的FeCl3·H2O和FeCl2·4H2O在氨性溶液中共沉澱，靜止分層並去掉上層清液後，立即加入濃度為20-30％的四甲基氫氧化銨溶液，再用超聲法分散後，再用砂漏鬥過濾，除去其中較大的磁性納米顆粒，即可得到顏色為灰褐色、且磁性納米顆粒大小均勻一致的溶液；2)磁性納米顆粒的氨基矽烷化吸取一定劑量的磁性納米顆粒溶液、並加入至在100-200ml異丙醇溶液中；用超聲法將磁性納米顆粒進行分散；同時，邊攪拌邊加入3-6g聚乙二醇(PEG-4000)，繼續攪拌10-20min後加入適量蒸餾水，然後加入0.1-0.3ml正矽酸乙酯(TESO)水解形成矽殼層；在特定磁場作用下，用無水乙醇和蒸餾水分別洗滌乾淨後，分散於無水乙醇中；再加入適量蒸餾水後，在不斷攪拌下加入0.1-0.3ml 3-氨基丙基三乙氧基矽烷(APTES)，形成氨基化矽烷殼層；在特定磁場作用下，分別用無水乙醇和蒸餾水洗滌乾淨後，分散於pH7.0-7.6的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)中，所得物質即為氨基矽烷化的磁性納米顆粒(MNPs)；3)磁性納米顆粒標記人類I型胸苷激酶(hTK1)將上述氨基矽烷化的磁性納米顆粒(MNPs)用戊二醛活化，用pH7.0-7.6的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)洗滌乾淨後，再分散於相同的PBS中；然後，直接在此PBS溶液中加入一定劑量的hTK1(用基因克隆技術，在大腸桿菌中表達hTK1基因，製備得到hTK1的融合蛋白)，在一定條件下反應0.5-1.5h，即可將hTK1共價固定於MNPs上，得到hTK1包被的磁性納米顆粒(hTK1-MNPs)；4)封閉在hTK1-MP分散溶液中加入甘氨酸溶液反應1h，即可封閉磁性納米顆粒表面的活性醛基；最後，用pH7.0-7.6的磷酸鹽緩衝溶液(PBS)洗滌乾淨後，再分散於相同的PBS中；5)保存將hTK1-MNPs保存在4℃的冰箱中備用。
2、 一種基於磁性納米微粒的人胸苷激酶螢光免疫分析新方法，其特徵在於， hTKl酶催化螢光檢測包括以下步驟採用競爭免疫分析方法，將待測hTKl與辣根過氧化物酵標記的hTKl單克 隆抗體(HRP-Ab)反應30-60min，再加入同體積的hTKl-MP，在37。C下競爭反應 30-60min，用pH7. 0-7. 6的磷酸鹽緩衝溶液洗滌乾淨後，在特定磁場作用下分離， 並分散於pH7. 0-7. 6磷酸鹽緩衝溶液中，加入一定濃度的對羥基苯丙酸(HPPA)、 過氧化氫(H202 )和磷酸鹽緩衝溶液，反應0.5-lh，在特定磁場作用下分層；移 取上層清液、並置於螢光比色皿中，用紫外光激發，測量可見光處的螢光強度； 測試溶液的螢光強度隨著試樣中的hTKl的濃度增加而減弱，螢光響應與hTKl在 0. 01-lng/ml之間成線性關係，從而實現對hTKl的準確測定，其檢測下限可達到 0. 008 ng/ml;通常情況下，由於惡性腫瘤(乳癌)等血清樣品中的hTKl濃度約為 ng/ml水平，所以，採用此靈敏度高的方法可以進行人體血清中hTKl濃度的測定。
全文摘要
本發明涉及一種基於磁性納米微粒的人胸苷激酶螢光免疫分析新方法。本發明建立一種快速簡便的高通量人胸苷激酶(hTK1)免疫檢測技術，用於hTK1的臨床檢測。主要通過戊二醛將hTK1共價固定於氨基矽烷化的超順磁性納米顆粒固定化載體表面，採用競爭性免疫分析方法，以辣根過氧化物酶為酶標記、對羥基苯丙酸為螢光底物，實現了對hTK1的測定。本方面採用的矽烷化的核殼型磁性納米顆粒可均勻分散在液相中，具有固定均勻、特異性高、重現性好、反應速度快等特點，在外加磁場的作用下，可快速有效地實現核殼型磁性納米顆粒的免疫複合物與反應液的分離與富集，分析方法操作簡單、準確、靈敏、快速，易於實現自動化檢測，可完成大批量的測試任務。
文檔編號G01N33/532GK101231288SQ20081003061
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月31日 優先權日2008年1月31日
發明者宇 丁, 丁克祥, 莉 劉, 劉衛國, 吳朝陽, 費定宇 申請人:丁克祥