含有與n－末端共價結合的單個水溶性聚合物的多肽類的製作方法
2023-11-08 08:59:22 1
專利名稱：含有與n－末端共價結合的單個水溶性聚合物的多肽類的製作方法
技術領域：
本發明涉及N-末端與單個水溶性聚合物結合的多肽類。這些多肽類具有的性質使它們有利於用作藥物或診斷試劑。本發明還涉及製備這些多肽類的方法，以及相關的藥物組合物和試劑盒。
背景技術：
本申請引用了許多出版物。這些出版物所公開的內容在此引入本文作為參考，以便更完整地描述與本發明相關的技術領域。
近年來，非抗原的水溶性聚合物，例如聚乙二醇(「PEG」)，已經用來共價修飾有治療或診斷作用的多肽類。例如，據報導，治療性多肽類如白介素(Knauf,M.J.等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)1988,263,15,064；Tsutsumi,Y等，控釋雜誌(J.Controlled Release)1995,33,447)、幹擾素(Kita,Y等，Drug Des.Delivery1990,6,157)、過氧化氫酶(Abuchowski,A.等，生物化學雜誌1977,252,3,582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp,C.O.等，分析生物化學(Anal.Biochem),1983,131,25)和腺苷脫氨酶(Chen,R.等，生物化學生物物理學報(Biochim.Biophy.Acta)1981,660,293)，當它們與PEG共價結合時，能增加它們的體內半衰期，和/或降低它們的免疫原性和抗原性。
然而，這些方法有許多嚴重的缺點。具體地講，在許多情況下，應用具有不同反應部分的甲氧基化PEG("mPEG")通過多肽的氨基結合PEG分子。這些聚合物包括mPEG-琥珀醯亞氨基琥珀酸酯、mPEG-琥珀醯亞氨基碳酸酯、mPEG-亞氨酸酯和mPEG-氰尿酸醯氯。應用這些聚合物的結合通常是非特異性的，也就是說，以任意的方式與多肽的不同氨基結合，而不是專一性地與特定氨基結合。這些非特異性的結合可改變活性部位的胺基酸殘基以致降低多肽的生理活性。同時，得到的結合物可能含有修飾後多肽的非均勻混合物，這樣的混合物在藥物應用中是不希望得到的。
為了解決這些問題，希望聚合物部位特異性地結合到多肽上。對於多肽來說，這樣做可保持生物學活性、延長血液循環時間、降低免疫原性、增加水溶性和增強對蛋白酶消化的抵抗力。通過固相合成已經對強效的生長激素釋放因子類似物的N-末端、側鏈和C-末端進行了部位特異性聚乙醇化(pegylation)(Felix,A.M.等，Int.J.Peptide Protain Res.1995,46,253)。由於特異性聚乙醇化是在將肽裝配到樹脂上的過程中完成的，因此該方法不能應用於現成的多肽。
還有另外一種方法用過氧化鈉氧化N-末端的蘇氨酸，從而在N-末端產生一個活潑醛基，通過此基團，以部位特異性的方式，將多肽結合到脂質體表面的PEG鏈終端(Zalipsky,S.等，生物結合化學(Bioconj.Chem.)1995,6,705)。然而，該方法僅僅限於N-末端為蘇氨酸或絲氨酸的多肽類。
還公開了一種在多肽C-末端特異性地引入活化基團的酶輔助方法，(Schwarz,A.等，酶學方法(Methods Enzymol),1990,184,160；Rose,K.等，生物結合化學1991,2,154；Gaertner,H.F.等，生物化學雜誌1994,269,7224)。典型的是，這些活性基團可以是醯肼、醛基和芳香氨基，這些基團可將功能探針結合到多肽上。然而，這些方法以特異性蛋白酶為基礎，需要極度小心，因此它們的應用範圍受到限制。
用來製備部位特異性結合聚合物的多肽類的另外一個方法是位點特異性的突變。WO 90/12874公開的方法是插入半胱氨酸殘基或用半胱氨酸殘基取代其它殘基對蛋白質進行修飾，再對該蛋白質進行部位導向的聚乙醇化。該出版物還公開了甲氧基化聚乙二醇-紅細胞生成素(「mPEG-EPO」)的製備方法即將半胱氨酸特異性的mPEG衍生物與EPO上重組引入的半胱氨酸殘基反應。類似地，白介素-2經部位導向的突變後在它的糖基化部位進行聚乙二醇化，(Goodson,R.J.等，Bio/Technology 1990,8,343)。
糖蛋白中有碳水化合物可用作修飾的額外靶部位。用PEG-二胺通過過氧化酶的碳水化合物部分對該過氧化酶進行了修飾(Urrutiogoity,M等，生物催化(Biocatalysis)1989,2,145)。WO94/28024描述了通過高碘酸鹽氧化的糖製備mPEG-EPO。化學反應包括mPEG-醯肼和EPO碳水化合物部分的醛基反應生成腙。這種類型的修飾通過氧化反應產生活潑醛基，其中的氧化反應能強有效地氧化碳水化合物部分不同類型的糖殘基和多肽的胺基酸如蛋氨酸殘基。這些方法的缺點源於EPO中碳水化合物部分的不均勻性。由中國倉鼠卵巢細胞表達的EPO有四個碳水化合物鏈，包括三個N-連接鏈分別在24、38和83精氨酸部位，和一個O-連接鏈在126絲氨酸部位。己經識別了共52個不同N-連接的和至少6個O-連接的低聚糖(Rush,R.S.等，分析化學(Anal.Chem.)1995,67,1442；Linsley,K.B等，分析化學1994,219,207)。因此，通過碳水化物鏈修飾EPO或其它蛋白質，聚合物的連接位置和數目是很難控制的。
總之，在現有技術中，把水溶性聚合物連接到多肽的方法有許多嚴重的缺點。這些缺點包括(a)化學計量準確性和連接位置準確性差；(b)需要完成有難度並且勞動強度大的技術如位置特異性突變；(c)需要在連接聚合物的同時應用固相肽合成，而不是在預先存在的多肽上連接聚合物；和(d)識別N-末端胺基酸殘基要求嚴格，必須是蘇氨酸或絲氨酸。
一段時間以來，需要有一種通用的方法，該方法能把水溶性聚合物部位特異性地連接到多肽N-末端的胺基酸殘基上，並且該方法沒有上面所述的缺點。然而，這樣的方法並不存在。
發明概述本發明提供兩種組合物物質。第一種組合物物質基本上由多肽和水溶性聚合物組成，其中水溶性聚合物通過腙鍵或還原腙鍵共價結合到多肽N-末端的α-碳原子上，其條件是(a)聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓，(b)在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失，和(c)多肽N-末端的胺基酸殘基不是絲氨酸或蘇氨酸。
第二種組合物物質基本上由多肽和水溶性聚合物組成，其中水溶性聚合物通過肟鍵或還原肟鍵共價結合到多肽N-末端的α-碳原子上，其條件是(a)聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓，和(b)在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
本發明同時提供把水溶性聚合物共價結合到多肽N-末端α-碳原子上的四種方法。第一種方法，通過腙鍵把聚合物結合到碳原子上，它包括的步驟是(a)使多肽與(i)濃度約為0.1-2.0M的乙醛酸離子或其衍生物，(ⅱ)濃度約為10μM-1M的過渡金屬離子，和(ⅲ)濃度約為10mM-10M的路易斯鹼，在pH約3.0-8.0、溫度約0-100℃的條件下接觸，產生一個具有N-末端α-羰基的轉氨基多肽；和(b)在pH約為1.0-7.5的條件下，使上述轉氨基多肽和水溶性聚合物接觸，所述聚合物上帶有一個與其共價結合的部分，該部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生腙鍵，通過該腙鍵使聚合物結合到多肽的N-末端α-碳原子上，其條件是聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓；在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
第二種方法，通過肟鍵把聚合物結合到碳原子上，它包括的步驟是(a)使多肽與(ⅰ)濃度約為0.1-2.0M的乙醛酸離子或其衍生物，(ⅱ)濃度約為10μM-1M的過渡金屬離子，和(ⅲ)濃度約為10mM-10M的路易斯鹼，在pH約3.0-8.0、溫度約0-100℃的條件下接觸，產生一個具有N-末端α-羰基的轉氨基多肽；和(b)在pH約為1.0-7.5的條件下，使上述轉氨基多肽和水溶性聚合物接觸，所述聚合物上帶有一個與其共價結合的部分，該部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生肟鍵，通過該肟鍵使聚合物結合到多肽的N-末端α-碳原子上，其條件是聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓；在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
第三種方法包括第一種方法的步驟，還有一個更進一步的步驟是還原(b)步驟中所產生的腙鍵。第四種方法包括第二種方法的步驟，還有一個更進一步的步驟是還原(b)步驟中所產生的肟鍵。
本發明還提供一種藥物組合物，它包括有效量的所述第一種或第二種組合物和一種藥學上可接受的載體。
最後，本發明還提供用於製備所述組合物的試劑盒。第一種試劑盒，用來製備所述的第一種組合物，包括(a)乙醛酸離子或其衍生物；(b)過渡金屬離子；(c)路易斯鹼；和(d)分子量約為200-200,000道爾頓的有一個與其共價結合部分的水溶性聚合物，所述部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生腙鍵，通過此肟鍵使該聚合物共價結合到多肽的N-末端α-碳原子上。
第二種試劑盒，用來製備所述的第二種組合物，包括(a)乙醛酸離子或其衍生物；(b)過渡金屬離子；(c)路易斯鹼；和(d)分子量約為200-200,000道爾頓的有一個與其共價結合部分的水溶性聚合物，所述部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生肟鍵，通過此肟鍵使該聚合物共價結合到多肽的N-末端α-碳原子上。
附圖概述
圖1表示N-末端修飾的EPO的製備方案，這是一個包括兩個步驟的反應轉氨基化和聚乙醇化。所用的四種mPEG5000(即分子量為5000道爾頓的mPEG)衍生物分別帶有肼羧酸酯(hydrazine carboxylate,HZC)，醯肼(HZ)，氨基脲(SCZ)和羥胺(oxylamine)官能團。
圖2表示帶有用肼羧酸酯(HZC)部分產生的腙鍵的mPEG-EPO、天然EPO和肼羧酸酯mPEG5000的凝膠過濾色譜，色譜柱為TSKG 3000SWxL柱(7.5×30mm)。流動相為含有100mM NaCl的20mM檸檬酸鈉(pH7.0)。
圖3表示mPEG-5000肼羧酸酯、天然EPO和含有由肼羧酸酯產生的腙鍵的mPEG-EPO的基質輔助雷射解吸飛行時間質譜。
圖4表示通過電泳法對mPEG-EPO特性的鑑定(1)4-15％的SDS-PAGE,Coomassie著色；(2)Western印跡；(3)4-15％的SDS-PAGE，碘著色；和(4)等電點聚焦(IEF,PH3-7)。第1道，MW或PI標記物；第2道，天然EPO；第3道，轉氨基EPO；第4道和第5道分別是用肼羧酸酯(HZC)和醯肼(HZ)部分形成腙鍵的mPEG-EPO。
圖5表示含有用肼羧酸酯(HZC)和醯肼(HZ)部分形成的腙鍵的mPEG-EPO的ELISA分析結果圖。
圖6表示天然EPO、轉氨基EPO和含有用肼羧酸酯(HZC)和醯肼(HZ)部分形成腙鍵的mPEG-EPO的細胞增殖分析結果圖。
圖7表示用肼羧酸酯(HZC)、醯肼(HZ)和氨基脲(SCZ)部分形成腙鍵的mPEG-EPO的exhypoxic小鼠生物分析結果圖。
發明詳述本發明提供兩種組合物物質。第一種組合物物質基本上由多肽和水溶性聚合物組成，其中水溶性聚合物通過腙鍵或還原腙鍵共價結合到多肽N-末端的α-碳原子上，其條件是(a)聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓，(b)除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失，和(c)多肽N-末端的胺基酸殘基不是絲氨酸或蘇氨酸。
第二種組合物物質基本上由多肽和水溶性聚合物組成，其中水溶性聚合物通過肟鍵或還原肟鍵共價結合到多肽N-末端的α-碳原子上，其條件是(a)聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓，和(b)除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
在本申請所用的術語中，「多肽」包括肽和蛋白質。「肽」意思是長度小於10個胺基酸殘基的多肽。「蛋白質」意思是長度等於或大於10個胺基酸殘基的多肽。在本發明中，多肽是天然的也可為重組的(即通過重組DNA技術產生的)，多肽可包括突變(如點突變、插入突變和缺失突變)以及其它共價修飾(如葡萄糖基化和用生物素、抗生蛋白鏈菌素、fluoracine和放射性同位素如I131標記)。並且，每一個所述組合物可包括一條以上多肽，也就是說，每個組合物可為單體(一條多肽與一個聚合物結合)或多體(兩條或更多多肽與一個聚合物結合或彼此結合)。
多肽的例子可包括單克隆和多克隆抗體，細胞因子如M-CSF和GM-CSF，淋巴因子，IL-2,IL-3，生長因子如PDGF和EGF，肽激素如hGH、EPO及其衍生物，血凝集因子如Ⅷ因子，免疫原，酶，酶抑制劑和其它配體。在所述組合物的優選實施方案中，多肽是EPO或其衍生物。EPO可為天然的也可為重組的。EPO衍生物包括但不限於多肽類GGLYLCRFGPVTWDCGYKGG,GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG,GGDYHCRMGPLTWVCKPLGG,VGNYMCHFGPITWVCRPGGG,GGVYACRMGPITWVCSPLGG,VGNYMAHMGPITWVCRPGG,GGTYSCHFGPLTWVCKPQ,GGLYACHMGPMTWVCQPLRG,TIAQYICYMGPETWECRPSPKA,YSCHFGPLTWVCK，和YCHFGPLTWVC，以及下列表1中所示的突變物。
表1突變 相對於wt*的活性參考文獻L5S +/- 9L5S/W51S/M54S/V82S/W88S/L112A/A124S/A125S +/- 9S9A ++++ 3R10A ++++ 3E13A ++++ 3R14L ++++ 3R14A ++3L17A ++++ 3E18A ++++ 3K20A ++++ 3E21A ++++ 3N24Q ++1N24Q/N83Q+ 1N24Q/N38Q/N83Q +++ 1C29Y/C33Y++++ 3A30S/L35S+++ 9A30S/A124S/A125S ++9C33P/R139C ++++ 7L35S/A124S/A125S ++9N38Q ++1N38Q/N83Q++++ 1V41S +/- 9K45A ++++ 3F48S ++++ 3Y49S ++++ 3A50S ++++ 3W51S ++++ 3W51S/V144S + 9W51S/V82S/W88S ++9W51S/V82S/W88S/V144N ++9W51S/V82S/W88S/L112A/I119AA124S/A125S +++ 9W51S/M54S/V82S/W88S/A124SA125S ++9W51S/M54S/V82S/W88S/L112AA124S/A125S + 9W51S/M54S/V82S/W88S/L112AA124S/A125S/L130A +++ 9W51S/M54S/V82S/W88S/I119AA124S/A125S +9W51S/M54S/V82S/W88S/L112AI119A/A124S/A125S +++ 9W51S/M54S/V82S/W88S/A124SA125S/L130A +++ 9W51S/V82S/W88S/A125S/A125SL130A +++ 9K52S ++++ 3M54L ++++10M54S/V56S++++ 9W57S/V82S/W88S/L112A/I119AA124S/A125S +++ 9E62A ++++ 3W64A ++++ 3Q65A ++++ 3G66A ++++ 3L69A ++++ 3L69N ++++ 4S71A +++ 3A73G ++++ 3R76A ++++ 3V82S +/- 9V82S/W88S/V144N ++ 9V82S/W88S/A124S/A125S++++ 9N83Q ++ 9Q92A ++++ 3L93A ++++ 3K97A ++++ 3S100A++++ 3G101A++++ 3L102A++++ 8R103A++ 2S104A++ 3S104N+/- 6L105A++ 8L105F+/- 6T106A++++ 3T107A+++ 8L108A++ 3L109A+++ 8L112A+/- 9L112A/I119S/L130A/I133A ++++ 9P122Q+/- 6A124P/A125T ++++ 4A125T++++ 4A125N/A127S++++ 4L130A +/- 9D136A ++++ 3R139A ++++ 3K140A ++++ 3R143A ++++ 3S146A ++++ 3N147A ++++ 3R150A +++ 3K152A ++3L153A +++ 3K154A ++++ 3L155A ++++ 3Y156A ++3T157A ++++ 3G158A ++++ 3E159A ++++ 3R162K/T163D/G164E/D165L++3R162H/T163H/G164H/D165H/R166H/(167)H ++++ 3AE2-5 ++ 3AE13-17 ++++ 2AE32-36 ++ 3AE43-47 ++ 3AE53-57 ++ 3AE78-82 +3AE111-119 +++ 3AE115-121 +++ 2AE120-122 ++++ 5AE123-125 ++++ 5AE126-129 +++ 5AE163-166 ++++ 3K116 (insertion of LISEEDL)++++ 3*相對於野生型定義如下++++=野生型或更高活性+++ =大約75％的野生型活性++ =大約50％的野生型活性+ =大約25％的野生型活性+/- =被報導為有活性的誘變EPO，然而對於評價相對於野生型的活性來說，數據不完整。
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在本申請中，聚合物的「天然功能」是指該分子在共價修飾其N-末端(-氨基之前的功能。天然功能包括例如酶活性、受體結合(如抗體)、配體結合和免疫原性。
本發明的方法在下面得到更為完整的描述，該方法可引起所共價修飾的多肽失去N-末端α-氨基。因此，多肽必須有這樣的一級結構即當共價修飾之後，其天然功能仍然保持而不會消失。如果多肽消除N-末端α-氨基後，該多肽完成其天然功能的能力降低了99％，那麼，這種消除則能引起多肽天然功能的消失。在一個實施方案中，這種消除使多肽完成其天然功能的能力降低不大於90％。在優選的實施方案中，這種消除使多肽完成其天然功能的能力降低不大於50％。
在本申請中，「腙鍵」是指包括共價結構NH-N=C的鍵，「肟鍵」是指包括共價結構O-N=C的鍵，「還原腙鍵」是指包括共價結構NH-NH-C的鍵，「還原肟鍵」是指包括共價結構O-NH-C的鍵。此處提供含有還原腙鍵或肟鍵的化合物，因為這些鍵具有較高的化學穩定性。
如上所述，在本領域中已知的方法是只要多肽的N-末端胺基酸殘基是蘇氨酸或絲氨酸時，就通過腙鍵把水溶性聚合物連接到多肽的N-末端α-碳原子上。這些已知的方法對於其它N-末端殘基的多肽是無效的。儘管這些已知的方法與本發明所述方法有根本上的不同，但這些方法確實是通過腙鍵得到在N-末端α-碳原子上結合聚合物的N-末端絲氨酸或蘇氨酸多肽類。由於這個原因，本發明的第一種組合物不包括其中多肽的N-末端胺基酸是蘇氨酸或絲氨酸的通過腙鍵結合聚合物的多肽。
本發明所用的水溶性聚合物包括但不限於(a)葡聚糖和葡聚糖衍生物，包括葡聚糖硫酸酯、交聯糊精和羧甲基糊精；(b)纖維素和纖維素衍生物，包括甲基纖維素和羧甲基纖維素；(c)澱粉和糊精，及其衍生物；(d)聚亞烷基二醇及其衍生物，包括PEG、mPEG、PEG均聚物、聚丙二醇均聚物、乙二醇和丙二醇的共聚物，其中所述的均聚物或共聚物是非取代的或一端有烷基取代；(e)肝素和肝素片斷；(f)聚乙烯醇和聚乙烯醚類；(g)聚乙烯吡咯烷酮；(h)a,b-聚(2-羥基乙基)-DL-天冬醯胺；和(i)聚氧乙基化多元醇類。這些聚合物可以是具有寬分子量範圍的直鏈、支鏈或星形聚合物。在優選的實施方案中，聚合物是mPEG。
當這些組合物用作藥物時，該聚合物應是無毒的。並且，當所述聚合物被給定分子量時，這個分子量僅僅是近似值，該值反映的是聚合物分子總體的平均分子量，其中的各個分子由於具有不同數目的亞單位而不同。
在一個實施方案中，PEG或其衍生物的分子量約為700-20,000道爾頓。在優選的實施方案中，PEG或其衍生物的分子量約為5,000道爾頓。並且，在優選的本發明組合物實施方案中，多肽為EPO，聚合物是分子量約為5,000道爾頓的mPEG。
本發明同時提供把水溶性聚合物共價結合到多肽N-末端α-碳原子上的四種方法。第一種方法，通過腙鍵把聚合物結合到碳原子上，它包括的步驟是(a)使多肽與(ⅰ)濃度約為0.1-2.0M的乙醛酸離子或其衍生物，(ⅱ)濃度約為10μM-1M的過渡金屬離子，和(ⅲ)濃度約為10mM-10M的路易斯鹼，在pH約3.0-8.0、溫度約0-100℃的條件下接觸，產生一個具有N-末端α-羰基的轉氨基多肽；和(b)在pH約為1.0-7.5的條件下，使上述轉氨基多肽和水溶性聚合物接觸，所述聚合物上帶有一個與其共價結合的部分，該部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生腙鍵，通過該腙鍵使聚合物結合到多肽的N-末端α-碳原子上，其條件是聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓；在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
第二種方法，通過肟鍵把聚合物結合到碳原子上，它包括的步驟是(a)使多肽與(ⅰ)濃度約為0.1-2.0M的乙醛酸離子或其衍生物，(ⅱ)濃度約為10μM-1M的過渡金屬離子，和(ⅲ)濃度約為10mM-10M的路易斯鹼，在pH約3.0-8.0、溫度約0-100℃的條件下接觸，產生一個具有N-末端α-羰基的轉氨基多肽；和(b)在pH約為1.0-7.5的條件下，使上述轉氨基多肽和水溶性聚合物接觸，所述聚合物上帶有一個與其共價結合的部分，該部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生肟鍵，通過該肟鍵使聚合物結合到多肽的N-末端α-碳原子上，其條件是聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓；在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
第三種方法包括第一種方法的步驟，還有一個更進一步的步驟是還原(b)步驟中所產生的腙鍵。第四種方法包括第二種方法的步驟，還有一個更進一步的步驟是還原(b)步驟中所產生的肟鍵。還原步驟可以通過例如，硼氫化鈉(NaBH4)和氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)，根據已知的方法進行。
乙醛酸離子衍生物包括但不限於乙醛醯胺和苯乙醛醯離子。過渡金屬離子包括但不限於二價銅離子、鎳離子、二價鈷離子或鋅離子。路易斯鹼包括但不限於乙酸鹽和吡啶。
與轉氨基多肽N-末端α-羰基反應形成腙鍵的部分包括但不限於肼羧酸酯、肼、氨基脲、醯肼、硫氨基脲、碳酸二醯肼、卡巴肼、硫卡巴肼和芳基醯肼。與這些部分共價結合的水溶性聚合物可在商業上得到。另外，與轉氨基多肽N-末端α-羰基反應產生肟鍵的部分包括但不限於羥胺(oxylamine)。帶有共價結合的羥胺(以及其它肟形成部分)的水溶性聚合物可在商業上得到。
在所述方法的優選實施方案中，步驟(a)的pH值約為5.0-7.0，步驟(b)的pH值約為3.0-5.0，蛋白質是EPO或其衍生物。
在所述方法的實施方案中，聚合物是PEG及其衍生物。在另一個的實施方案中，PEG或其衍生物的分子量約為700-20,000道爾頓。在優選的實施方案中，PEG或其衍生物的分子量約為5000道爾頓。
在第一種方法的實施方案中，結合在聚合物上的與轉氨基多肽反應的部分是肼羧酸酯。在優選的實施方案中，多肽是EPO，聚合物是分子量約5000道爾頓的mPEG，共價結合到聚合物的部分是肼羧酸酯。
在第二種方法的實施方案中，結合在聚合物上的與轉氨基多肽反應的部分是羥胺。
在每一種所述的方法中，步驟(a)優選的接觸時間是20分鐘-2小時，對於步驟(b)，優選的接觸時間和溫度分別是10-50小時和4℃至室溫。
對於某些多肽，其N-末端被「掩埋」，也就是說，當多肽以天然構象存在時，其末端不與周圍的溶劑或試劑接觸。為了能使多肽的N-末端殘基進行所述方法中必須的反應，有些試劑如四甲基脲或尿素可用來打開這些多肽。
本發明還提供一種藥物組合物，它包括有效量的所述第一種或第二種組合物和一種藥學上可接受的載體。例如，該藥物組合物可以包括治療貧血症患者有效量的mPEG-EPO。
藥學上可接受的載體是本領域技術人員所熟知的，這些載體包括但不限於，0.01-0.1M並且優選0.05M的磷酸鹽緩衝液或0.8％的生理鹽水。並且，這些藥學上可接受的載體可為含水的或不含水的溶液、懸浮液或乳液。非水溶劑的例子為丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和能用於注射的有機酯如油酸乙酯。含水載體包括水，醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水和緩衝介質。腸胃外載體包括氯化鈉溶液、Ringer＇s葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸鹽Ringer＇s或固定油。靜脈內載體包括流體和營養補充劑，電解質補充劑例如基於Ringer＇s葡萄糖等物質的補充劑。還可有防腐劑和其它添加劑例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。
最後，本發明還提供用於製備所述組合物的試劑盒。第一種試劑盒，用來製備所述的第一種組合物，包括(a)乙醛酸離子或其衍生物；(b)過渡金屬離子；(c)路易斯鹼；和(d)分子量約為200-200,000道爾頓的有一個與其共價結合部分的水溶性聚合物，所述部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生腙鍵，通過此肟鍵使該聚合物共價結合到多肽的N-末端α-碳原子上。
第二種試劑盒，用來製備所述的第二種組合物，包括(a)乙醛酸離子或其衍生物；(b)過渡金屬離子；(c)路易斯鹼；和(d)分子量約為200-200,000道爾頓的有一個與其共價結合部分的水溶性聚合物，所述部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生肟鍵，通過此肟鍵使該聚合物共價結合到多肽的N-末端α-碳原子上。
這些試劑可通過預先確定的量裝入所述試劑盒中，也可裝入獨立的隔室中。或者，當該方法允許時，可將某些試劑包含在同一個隔室中。最後，根據本發明的方法，本試劑盒還可包括用來產生還原腙或肟鍵的還原劑，以及合適的緩衝液和反應容器。
通過下面的實施例可更好地理解本發明，然而，本領域技術人員很容易明白這些特別的實施例僅僅用來說明本發明，本發明在權利要求書中得到更完整的描述。
實施例1、轉氨基EPO的製備將含有5mg EPO的20mM檸檬酸鈉(pH6.9)和100mM氯化鈉溶液用Centrion-10(Amicon,Beverly,MA)轉換成100mM乙酸鈉(pH7.0)緩衝液。最終濃度調整至1mg/ml EPO、2M檸檬酸鈉、0.4M乙酸、0.1M乙醛酸和10mM硫酸銅(pH5.5)(圖1)。該反應在室溫下進行兩小時，加入100ml的0.5M EDTA終止反應。應用100mM乙酸鈉(pH4.5)緩衝液通過Sephadex G-25色譜柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)純化轉氨基EPO。
按文獻所述方法(參見Fields,R等，生物化學雜誌1971,121,587)，用2,4-二硝基苯肼估計轉氨基化的程度。在開始幾分鐘和1個小時之後測定370nm處的消光值。吸光度的差別與EPO分子中存在的羰基量成比例。在ABI 420H系統(Applied Biosystems,Foster City,CA)上應用預柱PITC化學法對該轉氨基EPO進行胺基酸分析。結果表明賴氨酸殘基，即非N-末端殘基，未被轉氨基化。
2、用mPEG-肼羧酸酯製備mPEG-EPO將含有轉氨基EPO(1mg)的100mM乙酸鈉溶液(PH4.5)調至0.5M氯化鈉，最終體積為1ml，向其中加入10mg mPEG5000肼羧酸酯(Shearwater Polymers,Hunstville,AL)。室溫下攪拌反應混合物40小時，應用含100mM氯化鈉的20mM檸檬酸鈉緩衝液(7.0)通過Sephacryl S-200柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)進行純化。為了提高結合的產率，還可在反應混合物中加入0.1％SDS。
在凝膠滲透色譜中，與EPO和mPEG5000肼羧酸酯相比，該mPEG-EPO結合物顯示出明顯增加的分子量(圖2)。
應用基質輔助雷射解吸質譜(Finnigan-MAT LaserMAT 2000，線性飛行時間)測定分子量表示mPEG-EPO的特性(圖3)。mPEG5000肼羧酸酯在m/z5157.4處示有離子。EPO顯示一個雙電荷單體(m/z14604)、一個單電荷單體(m/z28569)、一個二聚體(m/z57208)和一個三聚體(85284)。類似地，mPEG-EPO顯示一個雙電荷單體(m/z 17092)、一個單電荷單體(m/z 34279)、一個二聚體(m/z69071)和一個三聚體(102955)。
mPEG-EPO的園二色譜(CD譜)(Jobin-YVON CD6,DichrographSpectrometer Instruments,SA,Edison,NJ)顯示蛋白質保留了存在於天然EPO中的α-螺旋結構(未顯示數據)。此結果表明EPO N-末端的PEG分子不破壞其二級結構。
3、用mPEG-醯肼、mPEG-氨基脲和羥胺製備mPEG-EPO將含有轉氨基EPO(1mg)的100mM乙酸鈉溶液(pH4.5)調整至0.5M氯化鈉、0.1％SDS，最終體積為1ml，加入10-20mg的mPEG5000醯肼、mPEG-氨基脲或羥胺。室溫下攪拌反應混合物40小時，應用含100mM氯化鈉的20mM檸檬酸鈉緩衝液(7.0)通過Sephacryl S-200色譜柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)進行純化。
用4-15％的SDS-PAGE(Bio-Rad,Hercules,CA)對mPEG-EPO進行了分析，所用的方法是Coomassie著色(專用於蛋白質)Western印跡(專用於EPO)和碘著色(專用於PEG)。在SDS-PAGE上，聚合物量的mPEG-EPO結合物比天然EPO的遷移距離小。等電點聚焦模式表明經修飾後，EPO的等電點(PI)沒有顯著變化。然而，轉氨基EPO比天然EPO或mPEG-EPO稍微更酸性一些。
由於通過SDS-PAGE可很好地分開EPO帶和mPEG-EPO帶，因此，該技術可用來監視結合反應的效果。結果發現應用mPEG5000-肼羧酸酯時，結合反應完成程度大於95％；應用mPEG5000-醯肼、mPEG5000-氨基脲或mPEG-羥胺時，反應只完成20％左右。因此，與醯肼、氨基脲或羥胺部分相比，肼羧酸酯對羰基的反應性顯得更強些。
4、mPEG-EPO和抗EPO抗體的反應性應用QuantikineTMIVDTMEPO ELISA試劑盒(RD System,Minneapolis,MN)對mPEG-EPO的抗原性進行了研究。測定包括用EPO單克隆抗體塗覆的微滴定板。將EPO或mPEG-EPO與該塗覆的板相接觸進行反應。清洗板後，加入抗EPO多克隆抗體和辣根過氧化酶的結合物。除去多餘的結合物後，向孔中加入生色團，通過酶反應氧化生色團形成藍色絡合物。檢測該絡合物在450nm處的吸收。
對於含有由肼羧酸酯(HZC)或醯肼(HZ)形成腙鍵的mPEG-EPO，其ELISA分析結果如圖5所示。該數據表明可能由於空間位阻的原因，即使是一個PEG分子結合到EPO的N-末端也顯著地降低EPO結合單克隆抗體的親和力。
5、mPEG-EPO的體外活性應用FDC-P1/HER細胞(鼠造血細胞系)，通過細胞增殖分析測定mPEG-EPO的體外生物活性。該細胞系表達EPO受體並依賴EPO生長。在EPO不存在的條件下使該細胞系生長24小時，然後再往該細胞中加入EPO或mPEG-EPO。培養該細胞42小時後，再往該細胞中加入氚代胸腺嘧啶核苷。6小時之後，通過摻入的胸腺嘧啶核苷確定細胞的生長。
對於轉氨基EPO和含有由肼羧酸酯(HZC)或醯肼(HZ)形成腙鍵的mPEG-EPO，其細胞增殖分析結果如圖6所示。通過ED50測定，與天然EPO相比，轉氨基EPO顯示出全部生物活性。通過ED50測定，含有由肼羧酸酯(HZC)和醯肼(HZ)形成腙鍵的mPEG-EPO分別只保留了38.5％和25％的活性。該數據表明可能由於空間位阻的原因，一個PEG分子結合到EPO的N-末端時可顯著地降低EPO結合單克隆抗體的親和力。
6、mPEG-EPO的體內活性通過exhypoxic小鼠生物測定方法對mPEG-PEO的體內活性進行評估(Coates,P.M.等，自然(Nature),1961,191,1065)。通過暴露在低壓下產生的紅細胞增多症抑制鼠內源性紅細胞的產生。以1單位/鼠的劑量注射EPO或mPEG-EPO結合物。注射EPO或mPEG-EPO結合物48小時之後，施用鐵-59。在注射EPO或mPEG-EPO結合物48、72和96小時之後，測定鐵-59摻入量，該值顯示血中新的紅細胞的產生。
對於含有由肼羧酸酯(HZC)、醯肼(HZ)和氨基脲(SCZ)產生的腙鍵的mPEG-EPO，其exhypoxic鼠的生物測定結果如圖7所示。相對於天然EPO，該mPEG-EPO樣品在體內顯示高活性以及較長的活性持續時間。該體內結果表明mPEG-EPO樣品在體內有較長的循環時間，並在循環過程中持續釋放EPO。
7、mPEG-纖維蛋白17-29二聚體的製備纖維蛋白17-29二聚體有如下結構Gly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg-His-Gln-Ser-Ala-Cys-LysSSGly-Pro-Arg-Val-Val-Glu-Arg-His-Gln-Ser-Ala-Cys-Lys取2mg纖維蛋白17-29二聚體溶於0.5ml的2M乙酸鈉、0.4M乙酸、0.1M乙醛酸和10mM硫酸銅中(pH5.5)。該反應在室溫下進行2小時，加入20ml的0.5M EDTA終止反應。應用100mM乙酸鈉(pH4.5)緩衝液通過SephadexG-10柱(Pharmacia,Piscataway,NJ)對轉氨基纖維蛋白二聚體進行純化。在胺基酸分析中，轉氨基纖維蛋白二聚體顯示明顯減少了甘氨酸，這表明N-末端甘氨酸的轉氨基化。
將含有1mg轉氨基纖維蛋白二聚體的0.5ml的100mM乙酸鈉(pH4.5)加入到10mg的mPEG5000肼羧酸酯中，室溫下攪拌反應混合物24小時。用陰離子交換色譜純化mPEG-纖維蛋白二聚體，色譜柱為HEMA IEC BIO CM色譜柱(Alltech)。流動相A為20mM的乙酸鈉(pH5.5)。流動相B為0.2M MOPS,0.05M磷酸二氫鉀和0.25M的磷酸氫二鉀(pH7.5)。梯度是100％的A洗脫5分鐘，然後0-100％的B洗脫25分鐘。收集14.5分鐘時新出現的峰用於進一步分析，上述峰在未修飾纖維蛋白二聚體(18分鐘)之前出現。雷射解吸質譜表明離子在m/z 8070.9處，這證明一個PEG分子已連接到纖維蛋白二聚體(m/z2986.8)上。
權利要求
1.一種組合物，它基本上由肽或蛋白質和水溶性聚合物組成，其中的水溶性聚合物共價結合到多肽N-末端的α-碳原子上，其條件是(a)多肽與聚合物通過腙鍵或還原腙鍵相互結合，(b)聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓，(c)在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失，和(d)蛋白質N-末端的胺基酸殘基不是絲氨酸或蘇氨酸。
2.一種組合物，它基本上由多肽和水溶性聚合物組成，其中水溶性聚合物共價結合到多肽N-末端的α-碳原子上，其條件是(a)聚合物與多肽通過肟鍵或還原肟鍵相互結合，(b)聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓，和(c)在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
3.根據權利要求1所述的組合物，其中的蛋白質是EPO或其衍生物。
4.根據權利要求1或2所述的組合物，其中的聚合物是PEG或其衍生物。
5.根據權利要求1或2所述的組合物，其中的PEG或其衍生物的分子量約為700-20,000道爾頓。
6.根據權利要求1或2所述的組合物，其中的PEG或其衍生物的分子量約為5,000道爾頓。
7.根據權利要求1所述的組合物，其中的蛋白質是EPO，聚合物是分子量約為5,000道爾頓的mPEG。
8.一種把水溶性聚合物共價結合到多肽N-末端α-碳原子上的方法，包括的步驟是(a)使多肽與(ⅰ)濃度約為0.1-2.0M的乙醛酸離子或其衍生物，(ⅱ)濃度約為10μM-1M的過渡金屬離子，和(ⅲ)濃度約為10mM-10M的路易斯鹼，在pH約3.0-8.0、溫度約0-100℃的條件下接觸，產生一個具有N-末端α-羰基的轉氨基多肽；和(b)在pH約為1.0-7.5的條件下，使上述轉氨基多肽和水溶性聚合物接觸，所述聚合物上帶有一個與其共價結合的部分，該部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生腙鍵，通過該腙鍵使聚合物共價結合到多肽的N-末端α-碳原子上，其條件是聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓；在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
9.一種把水溶性聚合物共價結合到多肽N-末端α-碳原子上的方法，包括的步驟是(a)使多肽與(ⅰ)濃度約為0.1-2.0M的乙醛酸離子或其衍生物，(ⅱ)濃度約為10μM-1M的過渡金屬離子，和(ⅲ)濃度約為10mM-10M的路易斯鹼，在pH約3.0-8.0、溫度約0-100℃的條件下接觸，產生一個具有N-末端α-羰基的轉氨基多肽；和(b)在pH約為1.0-7.5的條件下，使上述轉氨基多肽和水溶性聚合物接觸，所述聚合物上帶有一個與其共價結合的部分，該部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生肟鍵，通過該肟鍵使聚合物共價結合到多肽的N-末端α-碳原子上，其條件是聚合物的分子量約為200-200,000道爾頓；在除去N-末端的α-氨基後，多肽的天然功能並不消失。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其中步驟(a)的pH值約為5.0-7.0。
11.根據權利要求8或9所述的方法，其中步驟(b)的pH值約為3.0-5.0。
12.根據權利要求8或9所述的方法，其中的蛋白質是EPO或其衍生物。
13.根據權利要求8或9所述的方法，其中的聚合物是PEG或其衍生物。
14.根據權利要求13所述的方法，其中的PEG或其衍生物的分子量約為700-20,000道爾頓。
15.根據權利要求14所述的方法，其中的PEG或其衍生物的分子量約為5,000道爾頓。
16.根據權利要求8所述的方法，其中共價結合到聚合物上的部分是肼羧酸酯。
17.根據權利要求8所述的方法，其中的蛋白質是EPO，聚合物是分子量約5,000道爾頓的mPEG，共價結合到聚合物上的部分是肼羧酸酯。
18.根據權利要求9所述的方法，其中共價結合到聚合物上的部分是羥胺。
19.根據權利要求8所述的方法，該方法還包括的步驟是還原步驟(b)產生的腙鍵以形成還原腙鍵。
20.根據權利要求9所述的方法，該方法還包括的步驟是還原步驟(b)產生的肟鍵以形成還原肟鍵。
21.一種藥物組合物，包括有效量的權利要求1或2所述的組合物和藥學上可接受的載體。
22.一種用來製備權利要求1所述組合物的試劑盒，它含有(a)乙醛酸離子或其衍生物；(b)過渡金屬離子；(c)路易斯鹼；和(d)分子量約為200-200,000道爾頓的有一個與其共價結合的部分的水溶性聚合物，所述部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生腙鍵，通過此腙鍵使該聚合物共價結合到多肽的N-末端α-碳原子上。
23.一種用來製備權利要求2所述組合物的試劑盒，它含有(a)乙醛酸離子或其衍生物；(b)過渡金屬離子；(c)路易斯鹼；和(d)分子量約為200-200,000道爾頓的有一個與其共價結合的部分的水溶性聚合物，所述部分可與轉氨基多肽的N-末端α-羰基反應產生肟鍵，通過此肟鍵使該聚合物共價結合到多肽的N-末端α-碳原子上。
全文摘要
本發明提供基本上由多肽和水溶性聚合物組成的組合物,其中的水溶性聚合物通過腙鍵或還原腙鍵,或者肟鍵或還原肟鍵共價結合到多肽N－末端的α－碳原子上。本發明還提供製備該組合物的方法,含有該組合物的藥物組合物和用於製備該組合物的試劑盒。
文檔編號C07K14/505GK1226176SQ97196829
公開日1999年8月18日 申請日期1997年8月1日 優先權日1996年8月2日
發明者Z·P·韋, S·梅農-魯多爾夫, P·戈斯·達斯蒂達 申請人:奧索·麥克尼爾藥品公司