一種快速蛋白純化組合層析柱及一步法白介素純化試劑盒的製作方法

2023-12-08 07:11:21 1

一種快速蛋白純化組合層析柱及一步法白介素純化試劑盒的製作方法
【專利摘要】本實用新型提供一種快速蛋白純化組合層析柱及一步法白介素純化試劑盒，層析柱包括柱體、離子交換樹脂層、三片濾片、凝膠過濾樹脂層、流出口，三片濾片分別設置於柱體內部底面、離子交換樹脂層床面上和凝膠過濾樹脂層床面上，濾片形狀大小與柱體截面相同，孔徑大於被分離蛋白，小於離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂，流出口設置在柱體底部。本實用新型的一種快速蛋白純化組合層析柱，用該層析柱進行蛋白分離與純化，操作方便、快速，可大大節省時間提高工作效率。
【專利說明】一種快速蛋白純化組合層析柱及一步法白介素純化試劑盒

【技術領域】
[0001]本實用新型屬於蛋白分離純化【技術領域】，具體是涉及一種快速蛋白純化組合層析柱及一步法白介素純化試劑盒。

【背景技術】
[0002]蛋白質分離純化是用生物工程下遊技術從混合物之中分離純化出所需要的目標蛋白質的方法，是生物【技術領域】的一個重要技術。該技術難度、成本均高，例如一個生物藥品成本的75%都花在了下遊蛋白質分離純化當中。蛋白質分離純化技術主要有沉澱、透析、層析等，其中層析技術中的常用技術有離子交換層析和分子篩(凝膠過濾)。
[0003]離子交換層析(1n Exchange Chromatography, IEC)是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組份離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年,Thompson等人在研究土壤鹼性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用於胺基酸的分析。目前，離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用於各種生化物質如胺基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。根據離子交換樹脂的性能，分為陽離子交換樹脂與陰離子交換樹脂。若被分離物質為帶正電荷的鹼性蛋白質，它們在酸性溶液中較穩定，親和力強，故採用陽離子交換劑，而酸性物質，在鹼性溶液中較穩定，則使用陰離子交換劑，如果欲分離的物質是兩性離子，一般考慮在它穩定的pH值範圍內帶有何種電荷，作為交換劑的選擇。離子交換樹脂的優點主要是處理能力大，分離範圍廣，分離容量高，能除去各種不同的離子，可以反覆再生使用，工作壽命長，運行費用較低(雖然一次投入費用較大)。
[0004]凝膠過濾是利用凝膠(如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等)的多孔性，根據被分離物質的分子大小、形狀不同擴散到凝膠孔隙內的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。凝膠層析法已廣泛用於酶、蛋白質、胺基酸、多糖、激素、生物鹼等物質的分離提純。凝膠過濾的優點主要有分離條件溫和，蛋白質不易變性，收率高，重現性好，工作範圍廣，分離分子量的覆蓋面大等。
[0005]由於離子交換樹脂與凝膠過濾樹脂的分離原理上不同，兩種層析交替地使用可以用來分離、純化高純度蛋白。然而，這樣的蛋白分離純化過程是一個非常繁瑣的過程。通常蛋白粗提液先被添加到離子交換樹脂層析柱後，經過洗柱、梯度洗脫、收集不同時間流出的組分，使蛋白粗提液被分離成多個組分，每個組分還需經過其他方法(如SDS-PAGE凝膠電泳)進一步分析找出含目標蛋白組分，然後將含目標蛋白組分添加到凝膠過濾樹脂層析柱上進一步分離，收集不同時間流出的組分，再經過其他方法(如SDS-PAGE凝膠電泳)分析找出含相對高純度目標蛋白的組分。這樣的蛋白分離純化過程不僅需要多個層析柱，還需要設計複雜的緩衝液體系，沒有專業培訓，無法從事該類工作。因此，有必要開發一種簡單的快速蛋白分離純化層析柱。


【發明內容】

[0006]本實用新型要解決的問題是提供一種聯合使用離子交換樹脂與凝膠過濾樹脂的層析柱，用該層析柱進行蛋白分離與純化，操作方便、快速，可大大節省時間，提高工作效率。
[0007]為解決上述技術問題，本實用新型採用的技術方案是:一種快速蛋白純化組合層析柱，包括柱體、離子交換樹脂層、三片濾片、凝膠過濾樹脂層、流出口，所述三片濾片分別設置於柱體內部底面、離子交換樹脂層床面上和凝膠過濾樹脂層床面上，濾片形狀大小與柱體截面相同，孔徑大於被分離蛋白，小於離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂，流出口設置在柱體底部。
[0008]進一步的，所述離子交換樹脂層的填充高度是柱體內徑的0.3-3倍，所述凝膠過濾樹脂層的填充高度是所述離子交換樹脂層填充高度的2倍以上。
[0009]進一步的，所述凝膠過濾樹脂層的填充高度是所述離子交換樹脂層填充高度的5-20倍之間。
[0010]進一步的，所述柱體為塑料柱、玻璃柱或金屬柱。
[0011]進一步的，所述柱體形狀為圓柱形、方柱形或橢圓柱形。
[0012]進一步的，所述濾片為塑料濾片或紙濾片。
[0013]一種含有上述快速蛋白純化組合層析柱的一步法白介素純化試劑盒，還包括裝有緩衝液的試劑瓶。
[0014]進一步的，所述緩衝液包括甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液和Tris-HCl緩衝液中的一種或兩種。
[0015]本實用新型具有的優點和積極效果是:
[0016]1、本實用新型採用將離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂分層放入同一層析柱中，中間用濾片隔開，一次上柱即可同時進行離子交換層析與凝膠過濾層析，無需複雜的洗滌和梯度洗脫等程序，無需使用多個層析柱，操作便捷，普通實驗人員在簡單培訓後即可熟練操作，節約時間，節省試劑耗材；
[0017]2、全部純化過程只需要一種緩衝液，無需設計多種梯度鹽度緩衝液及不同pH值的緩衝液，使操作簡單、方便，提高工作效率；
[0018]3、本實用新型的包含快速蛋白純化組合層析柱的白介素純化試劑盒，一步法快速分離純化白介素蛋白，獲得高純度的目標蛋白，試劑成本低。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1是本實用新型的1-型快速蛋白純化組合層析柱。
[0020]圖2是本實用新型的I1-型快速蛋白純化組合層析柱。
[0021]圖1和圖2中:1.柱體，2.離子交換樹脂層，3.濾片，4.凝膠過濾樹脂層，5.流出□。
[0022]圖3是本實用新型的一種含有快速蛋白純化組合層析柱的一步法白介素純化試劑盒。
[0023]圖3中:6.快速蛋白純化組合層析柱，7.緩衝液瓶，8.盒子。

【具體實施方式】
[0024]下面結合具體實施例對本實用新型作進一步說明，但不限定本實用新型的保護範圍。
[0025]實施例1
[0026]如圖1所示，一種快速蛋白純化組合層析柱(1-型)，在直徑20mm、長300mm的圓形塑料層析柱柱體1內自下而上分別是塑料濾片3、S印hadex G_50凝膠過濾樹脂層4、塑料濾片3、DEAE陰離子交換樹脂層2、塑料濾片3，塑料濾片3的形狀大小與柱體1截面相同，孔徑大於被分離蛋白，小於DEAE陰離子交換樹脂和Sephadex G_50凝膠過濾樹脂。
[0027]—種快速蛋白純化組合層析柱(1-型)的製備方法，包括如下步驟:
[0028](1)選取一直徑20mm、長300mm的圓形塑料層析柱空柱體1,清潔後在柱體1底部放入一片與柱體1內徑等同的塑料濾片3 ；
[0029](2)取10g活化的Sephadex G_50凝膠過濾樹脂，用水溶脹充分後，取少量裝入柱體1，靠重力沉降讓水流出，反覆裝入樹脂、沉降，直至沉降後凝膠過濾樹脂層4的床高達200mm,剩餘Sephadex G_50凝膠過濾樹脂不再裝入，在此床面上輕輕壓入一片與柱體1內徑等同的塑料濾片3;
[0030](3)取2g活化的DEAE陰離子交換樹脂，用水溶脹充分後，取少量添加在凝膠過濾樹脂層4床面上的濾片3上方，靠重力沉降讓水流出，反覆裝入樹脂、沉降，直至沉降後樹脂層的床高達30mm，剩餘DEAE陰離子交換樹脂不再裝入，在此床面上再輕輕壓入一片與柱體1內徑等同的塑料濾片3;
[0031](4)層析柱製備完畢，如果立即使用，可用緩衝液平衡柱子後使用；如果不立即使用，可用30%乙醇水溶液平衡柱子後，分別用上下蓋子蓋住層析柱下方出口嘴及層析柱上面柱口，置於冰箱4-8 V冷藏備用。
[0032]實施例2
[0033]如圖2所示，一種快速蛋白純化組合層析柱(I1-型)，在直徑20mm、長300mm的圓形塑料層析柱柱體1內自下而上分別是塑料濾片3、DEAE陰離子交換樹脂層2、塑料濾片3、Sephadex G_50凝膠過濾樹脂層4、塑料濾片3，塑料濾片3的形狀大小與柱體1截面相同，孔徑大於被分離蛋白，小於DEAE陰離子交換樹脂2和Sephadex G_50凝膠過濾樹脂4。
[0034]一種快速蛋白純化組合層析柱(I1-型)的製備方法，包括如下步驟:
[0035](1)選取一直徑20mm、長300mm的圓形塑料層析柱空柱體1，清潔後在柱底放入一片與柱體1內徑等同的塑料濾片3 ；
[0036](2)取2g活化的DEAE陰離子交換樹脂，用水溶脹充分後，取少量裝入柱體1，靠重力沉降讓水流出，反覆裝入樹脂、沉降，直至沉降後DEAE陰離子交換樹脂層2的床高達25mm，剩餘DEAE陰離子交換樹脂不再裝入，在此床面上再輕輕壓入一片與柱體1內徑等同的塑料濾片3 ；
[0037](3)取10g活化的S印hadex G_50凝膠過濾樹脂，用水溶脹充分後，取少量添加在DEAE陰離子交換樹脂床面上的濾片3上方，靠重力沉降讓水流出，反覆裝入樹脂、沉降，自至沉降後凝膠過濾樹脂層4的床高達200mm，剩餘S印hadex G-50凝膠過濾樹脂不再裝入，在此床面上輕輕壓入一片與柱體1內徑等同的塑料濾片3 ；
[0038](4)層析柱製備完畢，如果立即使用，可用緩衝液平衡柱子後使用；如果不立即使用，可用30 %乙醇水溶液平衡柱子後分別用上下蓋子蓋住層析柱下方出口嘴及層析柱上面柱口，置於冰箱4-8 °C冷藏備用。
[0039]實施例3
[0040]如圖3所示，一種含有快速蛋白純化組合層析柱的一步法白介素純化試劑盒，包括一個1-型快速蛋白純化組合層析柱6、一個裝有20X甘氨酸-氫氧化鈉濃縮緩衝液的緩衝液瓶7、一個盒子8。
[0041]一種一步法白介素純化試劑盒的製備方法，包括如下步驟:
[0042](1)按實施例1所述的方法製備一個1-型快速蛋白純化組合層析柱；
[0043](2)配製20X濃縮的pH = 10的500mM甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液，包括如下步驟:
[0044]1)稱取甘氨酸(分子量:70.07)35g，加去離子水至1L，攪勻使充分溶解便得500mM甘氨酸溶液，稱取氫氧化鈉(分子量:40)20g，加去離子水至1L，攪勻使充分溶解便得0.5N氫氧化鈉溶液；
[0045]2)取500mM甘氨酸溶液500ml，取0.5N氫氧化鈉溶液320ml，在攪拌並測定pH值情況下向500mM甘氨酸溶液中逐步加入0.5N氫氧化鈉溶液直至pH = 10為止，便得20X濃縮的pH = 10的甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液，裝入塑料瓶中，置於冰箱4-8°C冷藏備用。
[0046](3)取上述製備的1-型快速蛋白純化組合層析柱6 —個和一個裝有500ml的20X甘氨酸-氫氧化鈉濃縮緩衝液的緩衝液瓶7，合裝在一個盒子8裡，得到一步法白介素純化試劑盒。
[0047]實施例4
[0048]用一步法白介素純化試劑盒純化重組人白介素-4 (rhIL-4，分子量14.8KD，等電點9.3)的方法，包括如下步驟:
[0049](1)取實施例3所述的一步法白介素純化試劑盒一套，包含一個1-型快速蛋白純化組合層析柱6和一瓶20X濃縮甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液7 ；
[0050](2)從試劑盒中取20X濃縮緩衝液50ml，用去離子水稀釋成IX緩衝液1000ml ；
[0051](3)從試劑盒中取出1-型快速蛋白純化組合層析柱6，打開層析柱上面和下面蓋子，取IX緩衝液100ml，逐量從柱上方添加於快速蛋白純化組合層析柱，使其通過層析柱，以洗滌並平衡柱內樹脂緩衝體系；
[0052](4)將含rhIL-4的大腸桿菌表達的粗提液2ml用500ml的IX緩衝液透析過夜；
[0053](5)將透析過的蛋白粗提液，加在平衡過的1-型快速蛋白純化組合層析柱6的上層樹脂上，靠自重讓蛋白粗提液流入樹脂中，然後取50ml的IX緩衝液，逐量加入層析柱，使目標蛋白被分離後流出，用紫外檢測儀在280nm波長處檢測流出峰，或將檢測信號輸入色譜工作站系統，繪製洗脫曲線；
[0054](6)從檢測到蛋白流出組分開始按每1ml分量收集流出液組分，用SDS-PAGE電泳檢測各組分中目標蛋白純度和含量；
[0055](7)根據SDS-PAGE電泳圖分析，保存具有純度最高的目標蛋白IL_4的流出液組分。
[0056]實施例5
[0057]用一步法白介素純化試劑盒純化重組人白介素-7(rhIL_7，分子量17.2KD，等電點8.9)的方法，包括如下步驟:
[0058](1)取一步法白介素純化試劑盒一套，包含一個I1-型快速蛋白純化組合層析柱6和一瓶 PH = 8 的 20mM Tris-HCl 緩衝液 500ml ；
[0059](2)打開I1-型快速蛋白純化組合層析柱上面和下面蓋子，取Tris-HCl緩衝液約100ml，逐量從柱上方添加於快速蛋白純化組合層析柱6，使其通過層析柱，以洗滌並平衡柱內樹脂緩衝體系；
[0060](3)將含rhIL-7的大腸桿菌表達的粗提液3ml用500mlTris-HCl緩衝液透析過夜，將透析過的蛋白粗提液，加在平衡過的I1-型快速蛋白純化組合層析柱6的上層樹脂上，靠自重讓蛋白粗提液流入樹脂中，然後取50ml的IX緩衝液，逐量加入層析柱，使目標蛋白被分離流出，用紫外檢測儀在280nm波長處檢測流出峰，或將檢測信號輸入色譜工作站系統，繪製洗脫曲線；
[0061](4)從檢測到蛋白流出組分開始按每2ml分量收集流出液組分，用SDS-PAGE電泳檢測各組分中目標蛋白純度和含量；
[0062](5)根據SDS-PAGE電泳圖分析，保存具有純度最高的目標蛋白IL_7的流出液組分。
[0063]以上對本實用新型的較佳實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本實用新型的較佳實施例，不能被認為用於限定本實用新型的實施範圍。凡依本實用新型申請範圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬於本實用新型的專利涵蓋範圍之內。
【權利要求】
1.一種快速蛋白純化組合層析柱，其特徵在於:包括柱體(1)、離子交換樹脂層(2)、三片濾片(3)、凝膠過濾樹脂層(4)、流出口(5)，所述三片濾片(3)分別設置於柱體(1)內部底面、離子交換樹脂層(2)床面上和凝膠過濾樹脂層(4)床面上，濾片(3)形狀大小與柱體截面相同，孔徑大於被分離蛋白，小於離子交換樹脂和凝膠過濾樹脂，流出口(5)設置在柱體⑴底部。
2.根據權利要求1所述的一種快速蛋白純化組合層析柱，其特徵在於:所述離子交換樹脂層(2)的填充高度是柱體(1)內徑的0.3-3倍，所述凝膠過濾樹脂層(4)的填充高度是所述離子交換樹脂層(2)填充高度的2倍以上。
3.根據權利要求2所述的一種快速蛋白純化組合層析柱，其特徵在於:所述凝膠過濾樹脂層(4)的填充高度是所述離子交換樹脂層(2)填充高度的5-20倍之間。
4.根據權利要求1或2所述的一種快速蛋白純化組合層析柱，其特徵在於:所述柱體(1)為塑料柱、玻璃柱或金屬柱。
5.根據權利要求1或2所述的一種快速蛋白純化組合層析柱，其特徵在於:所述柱體(1)形狀為圓柱形、方柱形或橢圓柱形。
6.根據權利要求1或2所述的一種快速蛋白純化組合層析柱，其特徵在於:所述濾片(3)為塑料濾片或紙濾片。
7.一種包含權利要求1-6任一項所述的層析柱的一步法白介素純化試劑盒，其特徵在於:還包括裝有緩衝液的試劑瓶(7)。
8.根據權利要求7所述的一步法白介素純化試劑盒，其特徵在於:所述緩衝液包括甘氨酸-氫氧化鈉緩衝液和Tris-HCl緩衝液中的一種或兩種。
【文檔編號】B01D15/20GK204198642SQ201420535246
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年9月17日 優先權日:2014年9月17日
【發明者】鄒潮, 馬蕾 申請人:哈德遜（天津）生物技術有限責任公司