樣品中感興趣結構的高空間解析度成像的製作方法

2023-11-02 23:41:17

專利名稱：樣品中感興趣結構的高空間解析度成像的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於樣品中感興趣結構的高空間解析度成像的方法，所述方法包括權 利要求1的前序部分的特徵。
背景技術：
WO 2006/127692 A2公開一種用於樣品中感興趣結構的高空間解析度成像的方 法，其中使用以所謂的可光學變換(phototransformable)的光學標記為形式的可切換熒 光染料對感興趣結構進行標記。將標記的子組(subgroup)分別激活為該標記的子組能夠 被激發以發射螢光的狀態。各自的子組包括如此少的標記以使得這些標記位於到彼此的距 離大於用於將樣品成像到傳感器陣列上的空間解析度極限的位置。這使得在將子組的標記 激發為發螢光之後，能夠以比應用於將樣品成像到傳感器陣列上的空間解析度的衍射極限 更好的解析度定位(localize)螢光的初始位置，從而也以該提高的解析度分別記錄被標 記的感興趣結構的點。在WO 2006/127692中限定了可光學變換的光學標記，其中這些光學 標記能夠由激活信號開啟到這些光學標記可以被激發以發射螢光的狀態。該激活信號可以 與隨後將標記激發為螢光的激發光相同。在WO 2006/127692中公開的可光學轉換的光學 標記的更加具體的實施例僅僅包括可光學激活的螢光蛋白質，即只有在已經吸收了至少一 個光量子之後才變為螢光團的分子，或者換句話說，這些分子在成為螢光之前需要被初始 開啟。激活或者切換過程需要改變分子的分子結構(原子團的重新定位或者甚至鍵的斷開 或者形成鍵合)。WO 2006/127692公開的方法也被稱為PALM(光學激活的定位顯微術)。
被稱為STORM(隨機光學重構顯微術)並且由Rust等人在Nature Methods, 3, 793-796(2006)中描述的類似方法同樣使用可切換為螢光狀態的分子，即可切換的螢光染 料，儘管這些不是蛋白質而是可光學切換的有機螢光團，尤其是螢光染料Cy3和Cy5。已知 這些青色素(cyanine)染料能夠在不同的構象(conformational)狀態，特別是同質異構狀 態，之間切換。
PALM和Storm方法的缺陷在於，不能夠預測樣品中感興趣結構將何時被記錄到這 樣完全的程度而使得確定進一步分子的位置將不會提供任何附加的有用信息並且因此終 止了該方法。
^fc C. Geisler, A. SchOnle, C. von Middendorff, H. Bock, C. Eggeling, A. Enger 和 S.W.Hell 在 Appl.Phys.A 88,223-226(2007)中發表的標題為 「Resolution of λ /IOin fluorescence microscopy using fast single molecule photo-switching，，的文章中描 述了一種用於樣品中感興趣結構的高空間解析度成像的方法，該方法包括權利要求1的前 序部分的特徵，並且被稱為PALMIRA(具有獨立運行的採集的PALM)。這裡，使用可切換的 螢光蛋白質標記樣品中感興趣結構。具體地說，是名稱為rshstLime的蛋白質，通過波長 為488nm的光，不僅在其初始狀態下被激發為發螢光而且還被部分地關閉為非螢光狀態並 且自此再次被局部切換回到其螢光狀態。內在機制是螢光團的構象改變。利用僅具有單一 波長的光，可切換的螢光蛋白質的這些特性使得能夠交替地建立蛋白質的可發螢光的分子的子組，在該子組中，可發螢光的分子位於比衍射極限大的共同間隔處，並且將可發螢光的 分子激發為發螢光。從而能夠連續，即以高頻率，記錄圖像，該圖像註冊(register)螢光分 子的交替子組，並且能夠以超出衍射極限的精度確定圖像中各自註冊的分子的位置。利用 圖像的求和，以比衍射極限精細的空間解析度記錄樣品中的結構。
由上面解釋的方法使用的可切換螢光蛋白質已經在US 2004/0212799A1和US 2006/0038993 Al中描述的用於樣品中感興趣結構的高空間解析度成像的方法(被稱為 RES0LFT (可逆可飽和的光學螢光轉換))中首次使用。
與基本上公知並且可用的螢光染料的總數量相比較，可用於RESOLFT、PALMIRA、 PALM和STORM方法的可切換蛋白質和螢光團的範圍很小。既可切換(處於一種切換狀態 下)又能夠發螢光的染料非常稀少。因此，通過複雜的方法合成和優化染料。除此之外，切 換行為和發螢光行為強烈依賴於分子的化學環境。對於可切換的螢光蛋白質和可切換的 有機螢光團都是如此。這一缺陷被認為是根本性的，並且除此以外其還與以下事實相關聯 即，分子的發螢光和切換是相互競爭的分子過程，即來自相同激發狀態的分子過程經常彼 此競爭。與不可切換的有機螢光團和不可切換的螢光蛋白質的多樣性相比較，可切換的熒 光染料在其發螢光狀態下的亮度，即在重複激發期間來自分子的螢光的相對產量，也通常 是很小的。然而，為了獲得可由用於對感興趣結構成像的前述方法而實現的高空間解析度， 不得不容忍(date being tolerated)由於可切換的蛋白質或者螢光團導致的強烈限制。
在所謂的GSD (基態耗盡)顯微術(S. Bretschneider 等人在 Phys. Rev. Lett. 98， 218103(2007)中發表的標題為 「Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving」的文章)中，通過將位於各自測量點外部的各自螢光染 料從其電子基態轉換為暗電子狀態來克服用於對樣品中由螢光染料標記的結構成像的衍 射極限，其中在電子基態下，各自螢光染料能夠通過激發光被激發為發螢光，並且在暗電子 狀態下，螢光染料無法發螢光。這在通過削減具有與激發光相同波長的光來將測量點處的 剩餘分子激發為發螢光之前進行。暗電子狀態通常是三重狀態，而螢光染料的基態是單重 狀態。分子通常被從該暗狀態熱返回，即非(光學)切換，到電子基態，從而僅具有單一波 長的光，即激發光，對於執行本實驗是必需的。發明內容
本發明的問題在於提供一種用於樣品中感興趣結構的高空間解析度成像的方法， 所述方法包括權利要求1的前序部分的特徵，其利用被稱為PALMIRA、PALM和STORM的方法 的解析度優點並且避免關於適合的可切換螢光染料的有限數量的缺點。
通過根據獨立權利要求1的方法解決所述問題。該新穎方法的優選實施例在從屬 權利要求2到20中限定。
尤其令人驚奇的是，儘管本發明的方法與被描述為PALMIRA的方法具有基本相同 的過程，但是本發明的方法不具有可切換的蛋白質或者螢光團。而是使用其中第一狀態和 第二狀態是物質的不同電子狀態的一種物質作為該新穎方法中的螢光染料，即該物質的狀 態僅在電子方面彼此不同。然後，該物質沒有落入US 2004/0212799 Al和US 2006/0038993 Al中用於標記的物質的定義中，並且可以是任何傳統的不可切換的螢光染料。除了電子基 態之外，實際上所有傳統的螢光染料都具有電子暗狀態，這些螢光染料能夠從該電子基態被激發為發螢光，並且這些螢光染料可以利用具有與能夠用於激發螢光的相同波長的光以 由於激發導致的相關速率轉換為電子暗狀態。這些通常是作為可發螢光基態的單重狀態和 作為暗狀態的三重狀態。在正常的螢光顯微術中，螢光染料到其非螢光三重狀態而不是其 激發的單重狀態的部分轉換，特別是利用激發光的高強度，被認為是一缺點，因為其降低了 來自樣品的螢光的產量。在本發明中，可以特別利用這一效果，因為僅在來自分子的螢光被 隔離註冊時，即與相鄰分子的螢光分開時，才以好於衍射極限的解析度記錄可以用於標記 樣品中感興趣結構的物質的任何單獨分子的位置。為此，僅有很少分子應該分別處於第一 狀態下。
在本發明的新穎方法中，實現修改樣品中螢光染料的非螢光第二狀態的壽命的措 施通常是有利的。然而，與傳統的螢光顯微術相比較，這通常涉及延長而非縮短非螢光第二 狀態的壽命。造成這樣的壽命延長的措施包括將樣品冷卻到低溫，在該低溫下將熱激發降 低到碰撞誘發的轉換，降低樣品中終止螢光染料的三重狀態的氧氣濃度，例如利用結合氧 氣的葡萄糖氧化酶或者通過在真空中進行測量，或者將樣品固定或嵌入到例如PVA的聚合 物中。非螢光第二狀態的增加壽命使得即使利用具有第一波長的光的較低強度也能夠將熒 光染料的大部分保持在非螢光第二狀態下。
然而，有時，在該新穎方法中，有目的地降低螢光染料的非螢光第二狀態的壽命以 增加從樣本收集的螢光的強度並且因而降低總的測量時間，特別是利用螢光染料的低的初 始濃度，甚至是更有利的。這可包括例如利用具有增加螢光染料到其螢光狀態的返回速率 的第二波長的光照射樣本。
使傳統螢光染料從其三重狀態進行光學漂白的公知風險在該新穎方法中同樣沒 有問題。嚴格地說，對於螢光染料的分子的基礎部分來說，在已經被泵浦(pump)到其非熒 光第二狀態或者不同的螢光第二狀態之後足以一次返回到其螢光第一狀態。在該返回之 後，分子被單獨註冊。它們的隨後命運(fate)是無關緊要的。例如，它們可以再次進入到 三重狀態並且由此狀態進行光學漂白。
在本發明的新穎方法中，在註冊剩餘的未漂白分子之前，甚至可以故意執行螢光 染料的部分光學漂白。在螢光染料的分子不超出樣品中的特定空間密度時，能夠尤其有利 地執行該新穎方法，這是因為，之後保持在第一狀態下的分子的特定百分比同樣不超出特 定空間密度，這對於能夠分開註冊單獨分子是必要的。另一方面，如果樣品中螢光染料的實 際濃度超出該特定的空間濃度，則會難於單獨註冊分子。為了避免這一困難，可以通過利用 具有所述一個波長或者另一個波長的光的高強度的光學漂白永久關掉(turn off)過量的 螢光染料，即被轉換為不同於第一狀態和第二狀態的持續暗狀態。該持續暗狀態通常不僅 在電學上而且例如也在化學上與根據本發明的用於單獨分子的註冊中使用的第一狀態和 第二狀態不同，在該持續暗狀態下，記錄用於註冊單獨分子的圖像的步驟中不再涉及螢光 染料。
利用對於本領域的普通技術人員公知的不可切換的可商購的螢光染料，例如若丹 明(MiodamineWG，成功執行本發明的新穎方法。與使用該螢光染料的傳統螢光顯微術相 比，偏離於樣本製備中的不同優選細節，為了被執行，具有一個波長的光的強度僅需要利用 通過傳感器陣列記錄圖像的頻率進行調諧。通過許多螢光顯微鏡實現對於此必需的設備需 求。這裡，僅需要修改根據本發明的方法的具有一個波長的光的強度的控制。作為替代，改變通過傳感器陣列或者包括該傳感器陣列的照相機的圖像記錄的頻率。因此，新的螢光顯 微鏡的區別僅在於對於具有一個波長的光的強度的控制的特殊設計。優選地，在這種情況 下，對於由傳感器陣列記錄的單獨圖像，提供在線圖像處理。
為了將具有一個波長的光的強度調節到實際上使得能夠將空間上彼此分離的單 個分子的螢光註冊在單個圖像中的值，該評估是便利的。設置用於具有一個波長的光的強 度的值可以是恆定值。這也包括具有比所記錄的圖像的圖像頻率高很多的頻率的非常快的 脈衝序列。然而，該具有一個波長的光的強度也可以具有利用圖像記錄的序列臨時調製的 強度輪廓(profile)，例如為了在單獨圖像之間有意建立處於第一狀態下的物質的分子的 子組，並且為了在單獨圖像的記錄期間將建立的子組的分子主要激發為發螢光。而且，在這 種情況下，可以將具有一個波長的光連續地(具有時間調製的強度輪廓)或者以在圖像的 記錄中沒有被解析的脈衝形式(同樣具有時間調製的強度輪廓)引導到各自感興趣區域 上。
單獨記錄的圖像的在線評估可以用於確定物質的空間不可分的螢光分子，因此光 的強度可以改變，直到這樣不可分的螢光分子的密度落入所選擇的閾值之下(通常限定較 低閾值)。通過在線評估記錄的圖像，確定表現出物質的可分離螢光分子的最大密度，並且 改變光的強度以使得從下面達到用於這樣的可分的螢光分子的密度閾值(通常限定較高 閾值)，可以進一步限定適合的強度範圍。這是期望的，因為一方面處於螢光狀態的分子不 具有如此高的濃度而使得它們不再被彼此單獨註冊是重要的，並且另一方面低於該極限的 濃度應該儘可能得高以利用每一個圖像獲得關於感興趣結構的儘可能多的信息。而且，照 射光的強度應該足夠高但同時儘可能低以避免潛在的光損壞。
也可以使用物質對於具有一個波長的光的初始暴露來通過傳感器陣列記錄樣品 中全部物質的螢光的強度分布，該初始曝光主要用於將其基本上轉換為其第二狀態。該強 度對應於具有樣品在傳感器陣列上的成像的空間解析度的樣品中物質的濃度分布。
樣品中物質的濃度分布表示利用樣品中的物質標記的感興趣結構的位置的概況。 這簡化了該新穎方法的進一步步驟，因為其因此能夠例如集中於樣品中部分被標記的結構 實際存在的那些區域中。這對於利用可切換的以及上述全部可激活的螢光團來說通常是 不可能的，因為可切換的以及上述全部可激活的螢光團的大部分在初始時不處於螢光狀態 下，這由於缺乏信號而導致不存在概況。
取決於樣品中物質的濃度分布，也可以對於每一個區域調節具有一個波長的光的 強度以進行更加詳細的檢查，或者至少可以被預設到大致適合的值，並且隨後進行精細調 節。而且，可以以樣品中物質的濃度分布為基礎限定用於樣品的相同區域的進一步圖像記 錄的局部(local)終止標準。樣品的區域的附加圖像的信息內容減少，同時取決於各自區 域中物質的濃度的信息內容也減少。如果僅有該物質的非常少的分子存在於區域中，則為 了記錄分子的高百分比的位置，相對少的圖像就足夠。在這方面進一步的圖像僅貢獻冗餘 信息。對於區域中物質的非常高的濃度，該情況不同。這裡，即使利用許多圖像，並且每一 個進一步的圖像使新信息可用，也僅記錄樣品中物質的較小部分。
具體地說，在該新穎方法中，可以將在連續圖像中註冊的分子的每一個位置不僅 輸入到樣品中感興趣結構的高解析度整體圖像中，但是與樣品在傳感器陣列上的成像的 PSF(點擴散函數)或者導出的函數進行卷積(convolute)，而且也可以輸入到初始記錄的強度分布的重構中。在該重構已經接近初始記錄的強度分布或者具有一定保真度的推導分 布時，不期望利用來自進一步圖像的進一步分子的位置的關於感興趣結構的重要的進一步 信息。對於與PSF或者相關函數的卷積，可以將各自分子的亮度考慮為加權因子。可以採 用各種值作為重構與初始記錄的強度分布的相似度的度量，例如互相關、歸一化輕度分布 的二次偏差或者簡單的差分、或者強度分布的空間頻率(傅立葉變換)之間的偏差。
該新穎性方法尤其很好地適用於利用不可切換的螢光團標記樣品的感興趣結 構，通過利用基因技術修改生物樣品以使得該生物樣品本身表現為不可切換的螢光染料 或者表現為對於該不可切換的螢光染料或者對於耦合到其的結合體的特定結合部位。按 照這種方式，利用經由所謂的小標籤或者諸如FIAsh，snap tag或者halo tag的自標記 蛋白質標籤的不可切換有機染料尤其有利地標記樣品中的感興趣結構。這些和類似的概 念對於本領域的普通技術人員來說基本上是公知的，例如參見http://WWW. promega. com/ cnotes/cn011/cn011_02. htm 或者 http://www. covalys. com/ 或者 BioForum Europe 6， 51-59(2005)。這使得能夠使用廣泛傳統的螢光染料以高解析度對生物樣品中的蛋白質進 行成像。
對於在該新穎方法中採用的螢光染料，其第二狀態是非螢光，即不能夠發螢光並 且因此是完全暗的，並不是關鍵的。也可以是與第一電子狀態不同的螢光。如果螢光染料 在這種情況下由與在其第一電子狀態下相同的光激發為第二狀態下的螢光，則由該螢光染 料在其第一電子狀態下發射的螢光能夠與由該螢光染料在第二電子狀態下發射的螢光區 分開是重要的。
應該理解，該新穎方法可以與對於本領域的普通技術人員熟悉的各種措施結合， 特別是來自被稱為PALM和STORM的方法領域的措施。尤其包括對於樣品中分子的註冊位置 的多彩色成像和三維解析度的措施，即也對於這些位置沿ζ方向的空間解析度。這些措施 包括螢光染料從其第一狀態的多光子激發，對於螢光以及到其非螢光第二狀態的轉換，通 過將具有一個波長的激發光聚焦到各自感興趣平面上並且使用具有高數字孔徑4-pi配置 的兩個互相相對的物鏡以將樣品暴露於具有一個波長的光和/或註冊來自該樣品的螢光。 在隨後將光僅聚焦到平面的一個或者多個單獨點的情況下，在該方法的所有步驟期間，例 如在每一個單獨圖像的記錄期間，利用這些點掃描該平面。將具有一個波長的光聚焦到樣 品的單獨點中可以有利地與來自樣品的螢光的共焦註冊結合。作為替代，可以利用例如由 圓柱透鏡形成的具有一個波長的光的光片沿與將樣品成像到傳感器陣列上的方向正交的 方向暴露樣品。該過程對於本領域的普通技術人員來說被公知為SPIM(選擇性平面照射)。
實現了比衍射極限更好的空間解析度的用於執行該新穎方法的螢光顯微鏡與幾 個已知的螢光顯微鏡的不同之處在於，不需要用於精細地在空間上構造來自任何光源的任 何光的措施來提高解析度；而是，通過實現對於具有一個波長的光的光源的控制足以調節 根據該方法的具有一個波長的光的強度。
可以附加提供至少一個光學檢測器，在該光學檢測器上成像與傳感器陣列的多個 像素相對應的樣品的區域，以觀察來自該區域的單獨光子的發射的時間先後順序。如已經 結合該新穎方法所解釋的，利用這樣的光檢測器，能夠非常快速地，即特別是即使在傳感器 陣列讀取之前，建立是否僅將物質的一個或者多個分子的測量信號的強度註冊在各自區域 中，例如如果沒有發現該強度僅來自單個分子則終止有利於新企圖的註冊。在到目前為止傳感器陣列的讀取通常是對於結束該新方法的循環的速率限制因素的情況下，這是非常重 要的。適於執行該新穎方法以及該新穎的螢光顯微鏡的傳感器陣列包括CCD並且優選的是 傳統設計的CMOS傳感器陣列。然而，在選擇時，有必要確保能夠快速讀取以及暗噪聲和讀 取噪聲足夠小以在執行該新穎方法時獲得良好的信噪比。


參照下面的附圖將更好地理解本發明。附圖中的部件不必表示為真實尺寸，而是 強調清晰地說明本發明的原理。在附圖中，相同的附圖標記指代各附圖中的相同部件。
圖1示意性表示用於根據本發明的方法對樣品中感興趣結構進行高空間解析度 成像的螢光顯微鏡的結構。
圖2(A)示出了由所述新穎方法記錄的作為感興趣結構的PtK2細胞的微管蛋白 (microtubuli)的整體圖像。該結構利用染料若丹明6G進行染色。所述細胞所處的介 質是具有葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶的緩衝劑水溶液(50mM三羥甲基氨基甲烷，pH 7.5， IOmM NaCl，葡萄糖氧化酶(Sigma，G2133)，40 μ g/ml 過氧化氫酶(Roche Applied Science, 106810),10% (w/v)葡萄糖)。對於整體圖像記錄的單獨圖像的數量是61440，曝光時間是 5ms。光強度是恆定於50kW/cm2。
圖2 (B)是對應於圖2 (A)中相同對象的解析度限制圖像的重構。該重構通過61440 個單獨圖像的求和來生成。圖2(B)右下方處的小圖像示出了圖2(A)和2(B)的標記位置 處的輪廓，藉助該輪廓可以清晰地看出該新穎方法的解析度提高。
圖3說明了如何使用其暗狀態「切換」常規的不可切換螢光團。(a)單重基態&到 第一被激發單重狀態S1的重複激發(Exc)引出螢光(Flu)發射並且將分子「切換」到具有 長壽命(τ)的三重狀態T1或者其它暗狀態D。(b)由螢光染料I h6G、Att0532以及Atto532 加傳統用於增加螢光強度的三重淬滅劑(β_巰基乙醇；βΜ)發射的螢光強度對從用於發 螢光的染料發出的連續激發光的強度。(c)在最大暗狀態擱置(shelve)(參見附錄表1)之 後活性螢光團的恢復。(d)考慮每2-ms時間間隔(time bin)檢測的光子數量(/= 115kW/ cm2) PVA中單個Atto532分子的螢光時間軌跡。
圖4示出了由根據本發明的被稱為伴隨有單獨分子返回的基態耗盡顯微術 (GSDIM)的方法記錄的子衍射解析度圖像。(a，b)嵌入在PVA中的PtK2-細胞的免疫染色 (Atto532,綠色或者Atto565，紅色)微管和過氧化物酶的GSDIM圖像。在右上角示出了落 射螢光(印ifluorescence)圖像。(b)中的螢光團標籤相對於(a)中反向。(c)水緩衝劑中 的PtK2細胞的免疫染色(I h6G)微管。(d，e)細胞介質中人類神經膠質瘤細胞的免疫染色 (Atto532)整聯蛋白-β -3集群的衍射限制(d)和⑶SIM(e)記錄。(f，g)利用Citrine-Map2 標記的活性PtK2細胞的落射螢光(f)和GSDIM(g)圖像微管細胞骨架。比例條，lym。彩 色條表明每點(spot)定位的事件數量。照相機幀數量72，000(a)，82，000(b)，61，000 (c) 和31，000(d-g)；通過增加全部幀的總體信號獲得落射螢光圖像。照相機幀速率100Hz (a， b)，200Hz (c-g)。雷射強度和波長10kff/cm2 (a)，20kff/cm2 (b)，115kff/cm2 (c_e)，2. 5kff/ cm2(f, g)，532nm(a-e)和 488nm(f，g)。事件的總數量:413, 668 (綠色)和 39，694(紅色) (a)，29，819(綠色)和 176，443 (紅色)(b) ,870, 699(c)，130，117(d, e)，738，395 (f，g)。
圖5說明了通過加入405nm(a)或者671nm(b)光，螢光團從暗狀態到亮單重系統的返回的加速並且因而GSDIM顯微術中圖像採集的加速；注意到，這些波長位於染料的吸 收最大值之外。
具體實施方式
現在將更加詳細地參照附圖。圖1示意性圖示了螢光顯微鏡101。在執行根據本 發明的用於利用螢光顯微鏡101對樣品102中感興趣結構進行高空間解析度成像時，經由 鏡132提供來自光源104的具有一個波長(黑色線)的光103，並且光103利用透鏡135聚 焦到物鏡136中。光103用於樣品102中整個感興趣區域的大面積照明。來自樣品102中 的螢光染料的螢光105(灰色線)同樣由物鏡收集，在這種情況下是相同的物鏡6，並且利用 二向色鏡110與光103分離，而且如果需要，可以通過適合的螢光濾波器139進一步濾波。 結合物鏡135，透鏡109確保螢光染料的螢光分子在傳感器陣列106上的適當成像。
在使用螢光顯微鏡101執行根據本發明的方法的優選實施例時，執行下列步驟
首先，利用不可切換的螢光染料對樣品中感興趣結構進行染色。
然後將樣品嵌入到適合的環境中。這可以例如是PVA，或者可選地是從其中提取了 氧的水介質(例如對於活性細胞)。該措施通常是必需的，因為利用現代技術和傳統的熒 光染料，在沒有氧濃度降低的水溶液中暗三重狀態的壽命不夠長到能夠分離單獨的分子事 件。可以例如通過增加葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶來實現氧減少。這樣的水緩衝劑對於顯 微術來說是廣泛公知的介質。一種也適合於活性細胞應用的原理的介質是
具有IOmM HEPES, 10% (ν/ν)葡萄糖氧化酶(5mg/ml, Sigma,G2133), 2% (ν/ν)過 氧化氫酶 Omg/ml，Roche Applied Science, 106810)的88% (v/v)Gibco-DMEM(Invitrogen Corporation, Carlsbad, California)。
有時，在標記密度，即在螢光染料的空間密度太高時，在開始實際測量之前，必須 通過樣品的適合曝光對螢光染料的分子的足夠部分進行不可逆漂白。在任何情況下，通過 在開始測量之前使其發光，必須將分子的足夠大的部分從其螢光第一狀態泵浦到其暗的第 二狀態，以使得保持在螢光狀態下的很少分子在傳感器陣列上的圖像彼此距離得比傳感器 陣列上的解析度極限更遠。取決於環境和螢光染料，典型強度在1和lOOkW/cm2之間。可以 在開始發光時由傳感器陣列記錄的螢光的強度分布示出了感興趣結構的解析度限制的圖 像。這可以隨後用作終止標準的參考。實際上，為了記錄感興趣結構的解析度限制的圖像， 不得不調節包括傳感器陣列的照相機的曝光時間或者放大倍數，或者由於照相機將通常優 化用於檢測單個分子，不得不使用強度濾光器。作為替代，在用於將分子的多樣性轉換為暗 狀態的光信號之前，可以使用具有低亮度的光信號，以記錄衍射限制的參考圖像。
一旦已經將足夠部分的分子泵浦為暗狀態，可以沒有延遲地開始實際測量，並且 在任何情況下，這必須在比暗狀態的壽命更短的時間段內進行。處於亮的第一狀態的分子 在被轉換回到暗的第二狀態之前發射螢光的平均時間表示單獨圖像的優化曝光時間。在所 使用的示例中，這導致2到IOms的典型曝光時間。在該時間期間，在被轉換回到暗狀態之 前，來自每一個分子的平均1000個數量級的光子被記錄在檢測器上。
在測量期間，例如如果通過不可逆漂白丟失了分子，則可調節光的強度以實現處 於第一狀態下的分子的優化密度。
整個測量的時段由單獨圖像的數量及其曝光時間表示。所需的單獨圖像的數量由選擇的終止標準表示。對於更加複雜的結構，典型地記錄高達100，000個單獨圖像。因此 總體記錄時間是分鐘數量級的。
下面更加詳細地解釋根據本發明的被稱為伴隨有單獨分子返回的基態耗盡顯微 術(GSDIM)的方法的具體實施例。
伴隨有單獨分子返回的基態耗盡顯微術(GSDIM)
本方法涉及以將普通螢光團的大多數「切換」到暗狀態，例如三重，並且計算剩餘 的或者已經自發返回到基態的那些螢光團的位置為基礎，利用該普通螢光團的遠場螢光納 米顯微術。(這裡以非常廣泛的方式使用術語「切換」，並不專門指代在更加具體的意義上 被認為可切換的螢光團)。單個雷射器的連續寬視野照射以及連續操作的照相機產生若丹 明和螢光蛋白質標記的(活性)樣本的雙色圖像，驗實了簡單而強大的超解析度方案。
幾十年來，一直假設任何遠場光學顯微鏡的解析度受限於光的波長的大約一半。 在發現了基本的螢光團轉換可以用於抵消衍射的限制作用u之後，這種觀點已經改變。更 具體地說，開啟螢光或者關閉螢光的轉換使得能夠順序記錄比衍射極限更加接近的對象。 因此，並不令人驚訝的是，目前使用的所有遠場螢光納米顯微術形態都依賴於使用螢光切 換的變型的時間序列讀取。在激勵的發射耗盡(STED)顯微術1中，使用去激勵束切換染料 的螢光能力。在基態耗盡(GSD)顯微術2』3中，將螢光團切換到暗的三重狀態。與STED相比 較，飽和構圖的激發顯微術(SPEM或者SSIM)4』5將螢光切換到其最大值。所有這些策略已 經延伸到切換可光學激活的螢光蛋白質和可光學切換的(光致色變的)有機螢光團6。它 們全部使用在空間中平移的一個或者許多強度零為特徵的光分布切換螢光，限定出螢光在 給定的時間點7處打開或者關斷的坐標。
這在光學激活定位(PALM)8』9或者隨機光學重構顯微術(STORM)"1中是不同的，其 中在隨機光學重構顯微術中在空間中逐分子地隨機切換標記的螢光能力。稀疏而隨機開啟 (激活)的分子的螢光衍射模式被記錄在照相機上，允許以精確度 △/ Vm計算其位置，其 中Δ表示衍射最大值的寬度並且m表示檢測的光子數量"。顯然，為了使該概念成立，必 須使分子從暗狀態循環到亮狀態，產生m個可檢測的光子，並且隨後返回到暗狀態。因此， PALM和STORM使用「可光學激活的」蛋白質或者有機化合物，其中通過吸收光子引出分子的 螢光能力。通過該「激發」光子提供的能量開啟螢光團，例如，通過改變化學鍵或者異構化狀 態。這樣的化合物的示例是光學可激活的蛋白質EosFP8和PA-GFP9，「受限的(caged) 」若 丹明12以及可光學異構化的青色素染料Cy3和Cy5，這已經用作激活器-發射器對「1和單 個可光學激活的標籤13』14。
儘管已經提供了出色的圖像，但是這些可光學激活的化合物在生物兼容性，標籤 化以及切換性能方面具有局限。此外，它們會需要專用的激活雷射器8_1(1』12』14。但是至少，對 於「可激活」化合物的明顯需求縮窄了這些技術的範圍。這裡報告的結果示出了可以使用 標準標記的基礎轉換在不需要光學激活的情況下執行通過隨機單分子切換和定位的遠場 螢光納米顯微術將螢光團切換到其三重狀態T1或者另一亞穩的暗狀態，同時記錄仍然剩 餘或者已經返回到基態&的那些螢光團。利用普通的螢光團操作並且使光學激活呈現為 可選或者可省略，伴隨有單獨分子返回的基態耗盡顯微術(GSDIM)擴展了遠場光學納米顯 微術的概念範圍和可應用性。
具有10_3到IOOms壽命(τ )並且實際上在全部螢光團中共同的、最低的三重狀態T1是切換分子的主要候選2。此外，T1用作到具有類似或者甚至更長的1到104ms15的τ的 其它暗狀態D的入口(圖3a)。在時段τ之後，分子返回到&，在該狀態下這些分子能夠被 重複激發到螢光狀態S1，產生計算其位置所需的m個可檢測光子的爆發。相同的重複激發 也將螢光團關閉，因為來自S1的分子與T1交叉的典型概率是0.1%。如果τ KS1 的 3ns螢光壽命(τη)長 107倍，則連續波照射強度_1 > Ι3 = Κν/(Φ 3εδ τ)將&分 子的一部分最小化到ε ^ Tfl/Oisc τ << 10%;hv是激活光子的能量並且δ是&中分 子的光子吸收截面。注意，剩餘的&分子的最小部分不依賴於I。
由於較大暗狀態群體(population)的存在，來自一批(bulk)若丹明染料的信號， 特別是嵌入在聚(乙烯基-乙醇)(PVA)中的若丹明6G(I h6G)和Atto532，隨著所使用的 532-nm激活束的強度增加而降低(圖北)。值得注意的是，活性染料的大部分在幾十毫秒 內恢復(圖3c)。三重淬滅劑巰基乙醇的加入降低了 τ並且因此增加了 ε。該實驗 表明切換機制中T1的關鍵作用。在單分子級別上，T1或者D的瞬間群體誘發快速的隨機開 關切換；平均接通時間是幾毫秒並且斷開時間稍微大一些(圖3d)。在螢光(接通)單重系 統中花費的時間 500，因此螢光團明亮地發射，且m的分布在峰值處為1，000 光子。
嵌入在PVA中並且利用若丹明衍生物Atto532 (發射最大值 550nm)和 Atto565(發射最大值飛90nm)免疫標記的哺乳動物細胞(PtK2系)的微管纖絲和過氧化物 酶的雙彩色GSDIM圖像示出了傳統圖像中缺失的細節(圖^，4b)。使用同時用於激活和 耗盡的532-nm連續波(CW)雷射器以及連續運行的照相機記錄圖像。GSDIM圖像的解析度 < 30nm(參見附錄)。
兩種染料的發射峰值之間的差異只是40nm。無論如何，在將短通( 590nm)信道16中檢測的單個隔離發射器的 信號相比，能夠以> 90%的置信度進行區分。傳統的批記錄要求數學上未混合。
由常規染料的單重系統提供光子爆發m的事實解釋了 m容易超出500個光子的原 因。由於ε τη/Φ^τ，螢光團的τ和Φ is。的大值改善了切換，但是大的Φis。還降低 由ndet。fl/。is。近似的m，並且因而與I無關。(!！她和Φη分別表示儀器的檢測效率和熒 光量子產量。)因此，使用具有0is。<0. 和大的τ的標記。後者通過PVA環境提供， 其降低三重淬滅氧的移動性並且產生附加的暗狀態15。放置在PVA中的許多螢光團，包括 Alexa488, Texas Red, FITC，若丹明 110 和 Oregon Green 產生 ε ^ 10% 以及大於毫秒的 τ ；它們都適合於GSDIM(附錄表1)。m可能大於真正的可光學切換的螢光團中的值，因為 後者進入到關閉狀態的概率通常較高。GSDIM得益於標準螢光團對於大的螢光量子產量優 化的事實。
接下來，將樣本浸入到包含氧清除劑的水溶液中，通過將τ從大約毫秒增加到 lO-lOOms，能夠使ε <10% (附錄表1)。浸入到包含葡萄糖氧化酶作為氧清除劑的TRIS緩 衝劑中的利用I h6G免疫染色的微管的GSDIM圖像顯示了優越的解析度(圖2c)。值得注意 的是，在諸如具有氧清除系統的HEPES緩衝劑的Dulbecco修改的Eagle介質(HDMEM)的細 胞介質中，GSDIM也是可行的。利用Atto532標記的人類神經膠質瘤細胞的整聯蛋白-β_3 的集群通過GSDIM比通過傳統記錄能夠被更好地解析(圖4d，4e)。
螢光蛋白質也能夠被有效轉換到諸如三重或者不同質子狀態17的亞穩的暗狀態。 所有測試的螢光蛋白質，即EGFP，EYFP, Citrine和WiiYFP在水介質中具有ε彡10%並 且τ > 1，並且因而適合於GSDIM(附錄表1)。表示熔化於微管相關聯的蛋白質Map2的 Citrine的活性PtK2細胞的GSDIM圖像，產生微管細胞骨架的標記，說明了與傳統的寬視野 圖像(圖4f，4g)相比較通過GSDIM的標記解析度增益，而解析度C40nm)和對比度仍然稍 微低於依賴於免疫染色的記錄(圖。這是由於螢光蛋白質比有機染料通常更快地 切換到暗狀態的事實，將光子的數量m局限為束(參見附錄方法)。而且，在該分子結構中 Citrine分子的平均關閉時間相當長(> Is ；附錄表1)，這限制了在不可逆漂白之前開關 循環的數量。結果，重構的GSDIM圖像的對比度也降低。相比而言，Mi6G分子返回得更快， 更加光學穩定並且更加經常返回。無論如何，由於這些蛋白質在純水環境中暗狀態的壽命 更短(50ms)，Citrine的更強的光學漂白看起來不是基本特性，這意味著Citrine通常比上 述示例中的蛋白質更加光學穩定。儘管壽命的實質變化歸因於PH或者分子氧濃度的變化 (附錄表1)，但是該示例顯現出在GSDIM的特定應用中分子環境的相關性。
螢光耗盡而非激活提供傳統的第一圖像，給出樣本的概覽以及何時停止隨機圖片 組件的指示。由於少於一個單重狀態的分子被允許存在於衍射區域中，在該區域中有用熒 光團的可允許的總數量是1/ ε ^ Oisc τ / τ fl，這是染料和環境的函數。對於密集標記的樣 本的補救是在成像之前對一些螢光團進行漂白(圖4)或者使它們處於非常長期活性的暗 狀態下。同樣，幾個剩餘的螢光團的返回速率1/τ可能會在後來的照相機幀中太低，減慢 了圖像採集。在這種情況下，可以隨後通過經由暗狀態吸收17對暗狀態(T1或者D)進行附 加的光減少來加速該返回(圖幻。通過在圖4的記錄中增加375-nm光來應用該過程，從 圖如中數量為 20，000的圖像幀以及圖4b和如中數量為 10，000的圖像幀開始；在圖如 和4g的記錄中不使用附加的光。注意，這種類型的激活是可選的並且仍然應用於常規螢光 團。由於GSDIM單獨記錄分子，其要求螢光團僅恢復到H
總而言之，說明了以利用基本螢光團轉換切換單獨發射器為基礎的遠場螢光納米 顯微術。激發並且隨後交叉到亞穩的三重(暗)狀態關閉標記，而其到基態的自發返回將 它們再次開啟，誘發計算其位置所需的光子的爆發。通過隨機記錄單獨分子的位置，GSDIM 實質上與GSD顯微術不同(使用零切換光強度限定發射器的位置)。二者的概念均依賴於 相同的分子機制，但是強調在作為實際元素的暗狀態和亮狀態之間切換的事實能夠進行超 解析度成像。
在任何情況下，強度-零，基於總體的方案以及基於隨機單個分子的方案保持確 定附近分子位置的互補形態。後者的形態具有需要較少切換周期的優點，這也歸因於GSDIM 當前呈現出比GSD顯微術更容易應用的事實。而且，GSDIM尤其簡單利用自由操作的照相 機進行連續的落射螢光記錄允許利用多個標準染料和螢光蛋白質進行納米級圖像的計算 構建。
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附錄
圖5示出了在PVA (黑色方塊)中Atto532以及嵌入在包含氧清除系統(空心圓) 的水緩衝劑中的PtK2細胞中的Atto532-免疫染色的微管的基態耗盡之後已經恢復的熒 光信號的一部分。測量了探針-泵-探針模式中的螢光恢復。在耗盡之前，第一探針脈衝 (532nm)建立參考信號。通過對於PVA具有聚焦強度/ = lkW/cm2並且對於水溶液具有聚 焦強度lOOkW/cm2的IOms脈衝(532nm)，然後跟隨持續0. 5ms並且產生/ = 100ff/cm2的第 二探針脈衝(532nm)實現耗盡。第二探針脈衝相對於耗盡脈衝延遲10ms。如曲線所繪製 的，在泵浦和第二探針脈衝之間的時段中照射具有強度I4(l5nm(a)的405nm光以及具有強度 I671nm(b)的671nm光增加了在耗盡和第二探針脈衝之間的時間段中恢復的螢光的部分。染 料在其暗狀態下對405nm或者671nm光的吸收可以經由較高的激發狀態誘發暗狀態減少， 如對於反向系統間交叉u所觀察的。由於較強的暗狀態吸收以及到單重系統的反向交叉 和/或由於多個長持續的暗狀態的存在，在PVA中效果會更強。
附錄表1
對於幾個標準螢光團的光學暗狀態擱置的參數最大暗狀態群體[D]和暗狀態恢 復時間τ
權利要求
1.一種用於對樣品中的感興趣結構進行高空間解析度成像的方法，具有步驟 -從一組物質中選擇一種物質，-這些物質包括具有第一螢光特性的第一狀態以及具有第二螢光特性的第二狀態； -這些物質能夠由具有一個波長的光激發以自發地發射螢光； -這些物質能夠通過所述具有所述一個波長的光從所述第一狀態轉換到其第二狀態；並且-這些物質能夠從其第二狀態返回到其第一狀態； -利用所述物質的分子標記所述樣品的感興趣結構；-將所述樣品成像在傳感器陣列上，所述成像的空間解析度極限大於(即差於)所述樣 品中所述物質的最接近的相鄰分子之間的平均間隔；-在具有比所述樣品在所述傳感器陣列上成像的所述空間解析度極限大的尺寸的至少 一個區域中使所述樣品暴露於所述具有所述一個波長的光，所述物質的部分所述分子被所 述具有所述一個波長的光交替激發以自發地發射螢光並且被轉換到其第二狀態，並且所述 物質中分別處於所述第一狀態的所述分子的至少10%與其處於所述第一狀態的最接近的 相鄰分子的距離大於所述樣品在所述傳感器陣列上成像的所述空間解析度極限；-在所述樣品連續暴露於所述具有所述一個波長的光的期間，在由所述傳感器陣列記 錄的多個圖像中註冊從所述物質的分子的所述區域自發地發射的所述螢光；以及-根據由所述傳感器陣列記錄的所述圖像確定所述樣品中分別處於所述第一狀態的所 述物質的所述分子的位置，所述分子與其處於所述第一狀態的最接近的相鄰分子的距離大 於所述樣品在所述傳感器陣列上成像的所述空間解析度極限，其特徵在於，所述第一狀態 和所述第二狀態是所述物質的不同電子狀態。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述物質是不可切換的。
3.如權利要求1或者2所述的方法，其特徵在於，所述第一狀態是單重狀態並且所述第 二狀態是所述物質的三重狀態。
4.如權利要求1到3中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在開始將所述樣品暴露於 所述具有所述一個波長的光時，將所述光的強度設置得如此高，以將所述物質轉換到其第 二狀態，直到所述物質的超過90%的所述分子已經被轉換到所述第二狀態。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，在開始將所述樣品暴露於所述具有所述一 個波長的光時，將所述光的強度設置得如此高，以將所述物質轉換到其第二狀態，直到所述 物質的基本上全部所述分子已經被轉換到所述第二狀態。
6.如權利要求1到5中的至少一項所述的方法，其特徵在於，所述物質選擇自包括諸如 以下物質的物質的子組-自發地從其第二狀態返回到其第一狀態的物質；-通過所述具有所述一個波長的光的作用從其第二狀態返回到其第一狀態的物質；以及自發地和通過所述具有所述一個波長的光的作用返回到其第一狀態的物質。
7.如權利要求1到6中的至少一項所述的方法，其特徵在於，實施修改所述樣品中所述 螢光染料的所述第二狀態的壽命的至少一個措施。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於，實施延長所述樣品中所述螢光染料的所述第二狀態的所述壽命的至少一個措施。
9.如權利要求1到8中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在記錄所述圖像之前，借 助於高強度的光通過光學漂白將部分所述物質轉換到與所述第一狀態和所述第二狀態不 同的持續暗狀態，所述光選自所述具有所述一個波長的光以及具有另一波長的光。
10.如權利要求1到9中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在所述圖像的所述記錄 期間，將所述具有所述一個波長的光的所述強度設定為恆定值。
11.如權利要求1到10中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在所述圖像的所述記錄 期間，將所述具有所述一個波長的所述光的所述強度設定為利用所述圖像的所述記錄的序 列進行時間調製的強度輪廓。
12.如權利要求1到11中的至少一項所述的方法，其特徵在於，將所述具有所述一個波 長的光連續導向到所述樣品的所述區域上。
13.如權利要求1到11中的至少一項所述的方法，其特徵在於，將所述具有所述一個波 長的光以在所述圖像的所述記錄期間沒有被解析的快速脈衝形式導向到所述樣品的所述 區域上。
14.如權利要求1到13中的至少一項所述的方法，其特徵在於，關於單獨記錄的圖像是 否顯示所述物質的不可分的螢光分子，對所述單獨記錄的圖像進行在線評估，並且其特徵 在於，所述光的所述強度發生變化，直到這樣的不可分的螢光分子的密度下降到低於特定 閾值。
15.如權利要求1到14中的至少一項所述的方法，其特徵在於，關於單獨記錄的圖像顯 示所述物質的可分的螢光分子的最大密度，對所述單獨記錄的圖像進行在線評估，並且其 特徵在於，所述光的所述強度發生變化，直到達到這樣的可分的螢光分子的密度閾值。
16.如權利要求1到15中的至少一項所述的方法，其特徵在於，在開始將所述樣品暴露 於所述具有所述一個波長的光時，通過所述傳感器陣列以所述樣品在所述傳感器陣列上成 像的所述空間解析度記錄所述樣品中整個物質的所述螢光的強度分布。
17.如權利要求1到16中的至少一項所述的方法，其特徵在於，基於所述樣品中整個物 質的所述螢光的所述強度分布限定用於所述樣品的相同區域的進一步圖像的記錄的終止 標準。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，將所述多個圖像中的一個圖像中註冊的 所述物質的分子的每一個位置與所述樣品在所述傳感器陣列上成像的PSF(點擴散函數) 或者根據其推導的函數進行卷積，並且其特徵在於，將該重構與初始記錄的強度分布進行 比較。
19.如權利要求1到18中的至少一項所述的方法，其特徵在於，通過利用基因技術修 改生物樣品以使得所述生物樣品自身表現所述物質，以所述物質標記所述樣品的感興趣結 構。
20.如權利要求1到18中的至少一項所述的方法，其特徵在於，通過利用基因技術修改 生物樣品以使得所述生物樣品表現具有對於所述物質的特定結合部位或者耦合到所述物 質的聯接體的蛋白質，以所述物質標記所述樣品的感興趣結構。
全文摘要
對於樣品中感興趣結構進行高空間解析度成像，從一組物質中選擇一種物質，這些物質具有兩個不同的電子狀態螢光第一狀態以及非螢光第二狀態；這些物質能夠通過將其激發為螢光的光從其第一狀態部分地轉換到其第二狀態，並且這些物質能夠從其第二狀態返回到其第一狀態；將所述樣品的感興趣結構成像在傳感器陣列上，所述成像的空間解析度極限大於(即差於)所述樣品中所述物質的最接近的相鄰分子之間的平均間隔；在具有比所述空間解析度極限大的尺寸的區域中使所述樣品暴露於光，部分所述物質被所述光交替激發以發射螢光並且被轉換到其第二狀態，並且所述物質中分別處於所述第一狀態的所述分子的至少10％與其處於所述第一狀態的最接近的相鄰分子的距離大於所述空間解析度極限；並且在所述樣品連續暴露於所述光的期間在由所述傳感器陣列記錄的多個圖像中註冊由所述物質從所述區域自發地發射的螢光。
文檔編號G01N21/64GK102037347SQ200980118266
公開日2011年4月27日 申請日期2009年5月20日 優先權日2008年5月21日
發明者A·舍恩勒, A·艾格納, C·埃格林, J·弗林, M·博西, S·黑爾 申請人:馬克思-普朗克科學促進協會