液相色譜－串連質譜法測定人參中真菌毒素含量的方法
2023-11-03 05:03:22
專利名稱：液相色譜－串連質譜法測定人參中真菌毒素含量的方法
技術領域：
本發明涉及人參中真菌毒素含量的測定方法，具體涉及採用液相色譜-串連質譜法測定人參中真菌毒素含量的方法。
背景技術：
真菌毒素(Mycotoxin)，也稱黴菌毒素，是真菌產生的次級代謝產物，一般同時具有毒性強和汙染頻率高的特點。由於真菌的寄生和真菌毒素的產生，嚴重影響農作物的產量，降低農產品和飼料品質，造成巨大經濟損失。人或動物攝入被真菌毒素汙染的農、畜產品，或通過吸入及皮膚接觸真菌毒素可引發多種中毒症狀。如致幻，催吐，出血症，皮炎，中樞神經受損，甚至死亡。動物試驗和流行病學的調查結果還證實，許多真菌毒素還可在體內積累後產生致癌、致畸、致突變、類激素中毒，白細胞缺乏症等，對機體造成永久性損害(參 見張藝兵等，農產品中真菌毒素的檢測分析[M]北京化學工業出版社，2006)。目前研究關注的真菌毒素主要集中在黃麴黴毒素(aflatoxin)，赭麴黴毒素(0A),嘔吐毒素(DON),伏馬毒素(FUM),玉米赤黴烯酮(ZEN), T-2毒素及展青黴素(PAT)等。隨著對真菌毒素危害的深入研究，公眾逐漸認識到其對社會經濟和人類健康造成的嚴重威脅，各國政府對藥品食品中真菌毒素的分布及檢測也都予以了極大的關注，特別是歐盟及美國等發達國家更是對此設定了嚴格的限量規定。食品方面，我國已相繼出臺了很多有關真菌毒素的法定標準(參見GB2715-2005食品中真菌毒素限量[S]和GB2761-2005食品中真菌毒素限量[S])，但在藥品領域，除中國藥典收載了黃麴黴毒素的檢測方法(參見中國人民共和國藥典2010年版[S])外，尚無其他標準出臺。而已有的食品標準均為針對單一的真菌毒素進行檢測，尚無同時檢測多成分殘留的標準出臺。因此，急需開發藥品特別是人參中真菌毒素多成分殘留的高效測定方法。
發明內容
鑑於現有技術的上述缺陷，本發明提供一種採用液相色譜-串聯質譜測定人參中真菌毒素含量的方法。該方法可用於人參中真菌毒素殘留的篩查，為擬定藥品中真菌毒素的標準提供技術服務。本發明通過如下技術方案實現提供一種用於測定人參中真菌毒素含量的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟(I)用HLB柱對待測人參樣品進行預處理；(2)通過液相色譜-串連質譜法測定經預處理後的人參樣品中一種或多種真菌毒
素的含量。根據本發明的一個優選的實施方式，所述真菌毒素包括黃麴黴毒素、T-2毒素、伏馬毒素B1、玉米赤黴烯酮、嘔吐毒素或赭麴黴毒素A ;其中所述黃麴黴毒素包括黃麴黴毒素B1、黃麴黴毒素B2、黃麴黴毒素G1或黃麴黴毒素G2。
根據本發明的一個優選的實施方式，所述HLB柱在預處理人參樣品前先用甲醇洗脫，再用水洗脫。根據本發明的一個優選的實施方式，所述人參樣品的預處理包括用甲醇提取待測人參樣品，上HLB柱並收集流出HLB柱的溶液的步驟；或包括用甲醇提取待測人參樣品，上HLB柱並用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液的步驟。根據本發明的ー個特別優選的實施方式，人參樣品的預處理包括精密稱取人參樣品粉末，精密加入甲醇溶液，超聲處理，離心，濾過，精密吸取上清液，用水稀釋，搖勻，取稀釋後的溶液通過已經處理好的HLB柱，直至有適量空氣通過，收集流出HLB柱的溶液，用氮氣緩慢吹乾，精密加入甲醇溶液使溶解，即得；或在樣品上HLB柱後用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，氮氣緩慢吹乾後，精密加入甲醇溶液使溶解，離心，取上清液，即得。根據本發明的一個優選的實施方式，所述步驟(2)中液相色譜-串連質譜法的色 譜條件為採用C18柱，流動相由A相和B相組成，A相為甲醇，B相為甲酸，採用梯度洗脫。優選地，所述C18柱的粒徑為I. 7 5 μ m,柱內徑2. I 4. 6mm,柱長為5 IOcm,更優選為ACQUITY UPLC BEH C18柱；B相的濃度為O. 01 O. 05%，優選O. 01% (體積);A B體積比為5 95%: 95 5%，優選流速為O. 2 O. 4ml/min，優選O. 3ml/min。根據本發明的一個優選的實施方式，所述步驟(2)中液相色譜-串連質譜法的質譜條件為採用電噴霧離子源，採用正負離子模式進行數據採集，去簇電壓為-100 120伏、碰撞池能量為-48 53伏。本發明方法還包括用各種真菌黴素的標準品繪製標準曲線，並由此計算人參樣品中各種真菌黴素的含量。本發明方法為首次應用於人參中真菌毒素多成分殘留的檢測與分析。本發明方法在藥品真菌毒素的多成分殘留的檢測中，可以有效排除幹擾、保證待測物的穩定。該測定分析方法靈敏度高、專屬性強、準確度好，可用於人參或類似藥材中真菌毒素的多成分殘留測定。本發明方法通過液相色譜-串連質譜對人參樣品進行進樣分析，檢測人參中多種真菌毒素的殘留量，分析成本低、同時又減少了假陽性，提高了測定的準確性，有較強的實用性。該方法對人參中真菌毒素多成分殘留的檢測具有重要指導意義，對新藥等關鍵技術有良好的指導意義，可應用於新藥研發質控等多個方面。該方法可有效應用於國家標準的制訂、企業新藥的研發、企業現有產品質控方法的提升。
圖I為負離子模式的混合標準品溶液(I)的總離子流圖；圖2為負離子模式的混合標準品溶液(2)的總離子流圖；圖3為正離子模式的混合標準品溶液(2)的總離子流圖；圖4為負離子模式的供試品溶液⑴的總離子流圖；圖5為負離子模式的供試品溶液(2)的總離子流圖；圖6為正離子模式的供試品溶液(2)的總離子流圖；圖7為負離子模式的加樣回收供試品溶液(I)的總離子流圖；圖8為負離子模式的加樣回收供試品溶液(2)的總離子流圖9為正離子模式的加樣回收供試品溶液(2)的總離子流圖。
具體實施例方式實施例II、材料與方法I. I主要儀器與試劑API 4000串聯四極杆質譜儀(美國應用生物系統公司)，ACQUITY UltraPerformance LC液相色譜儀(美國Waters公司)，MIKRO 200R離心機(德國Hettich公司)，超純水機(美國Millipore公司)。黃麴黴毒素、T-2毒素、伏馬毒素B1、玉米赤黴烯酮、嘔吐毒素或赭麴黴毒素A標準品(美國SUPELC0公司);こ臆、甲酸、甲酸銨均為色譜純。HLB浄化柱(Waters公司)。I. 2實驗方法I. 2. I色譜條件ACQUITY UPLC BEH C18 (I. 7 μ m，2. I X 100mm);以 100 % 甲醇為流動相 A 相，以O. 01%甲酸為流動相B相，流速O. 3ml/min ;按下表進行梯度洗脫表I、流動相梯度
權利要求
1.用於測定人參中真菌毒素含量的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟 (1)用HLB柱對待測人參樣品進行預處理； (2)通過液相色譜-串連質譜法測定經預處理後的人參樣品中ー種或多種真菌毒素的含量。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述真菌毒素選自黃麴黴毒素、T-2毒素、伏馬毒素B1、玉米赤黴烯酮、嘔吐毒素或赭麴黴毒素A。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述黃麴黴毒素選自黃麴黴毒素B1、黃麴黴韋素B2、黃麴黴韋素G1或黃麴黴韋素G2。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述HLB柱在預處理人參樣品前先用甲醇洗脫，再用水洗脫。
5.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述步驟(I)中待測人參樣品的預處理包括用甲醇提取待測人參樣品，上HLB柱並收集流出HLB柱的溶液的步驟；或包括用甲醇提取待測人參樣品，上HLB柱並用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液的步驟。
6.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述步驟(I)中待測人參樣品的預處理包括精密稱取人參樣品粉末，精密加入甲醇溶液，超聲處理，離心，濾過，精密吸取上清液，用水稀釋，搖勻，取稀釋後的溶液通過已經處理好的HLB柱，直至有適量空氣通過，收集流出HLB柱的溶液，用氮氣吹乾，精密加入甲醇溶液使溶解；或在樣品上HLB柱後用甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，氮氣吹乾後，精密加入甲醇溶液使溶解，離心，取上清液。
7.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中液相色譜-串連質譜法的色譜條件為採用C18柱，流動相由A相和B相組成，A相為甲醇，B相為甲酸，採用梯度洗脫。
8.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述步驟(2)中液相色譜-串連質譜法的質譜條件為採用電噴霧離子源，採用正負離子模式進行數據採集，去簇電壓為-100 120伏、碰撞池能量為-48 53伏。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述C18柱的粒徑為I.7 5 μ m，柱內徑.2.I 4. 6mm,柱長為5 10cm。
10.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述C18柱為ACQUITYUPLC BEH C18柱。
11.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，其中B相的濃度為O.01 O. 05%。
12.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，其中B相的濃度為0.01%。
13.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，其中A B體積比為5 95% 95 .5%。
14.根據權利要求7所述的方法,其特徵在於,其中流動相的流速為O.2 O. 4ml/min。
全文摘要
本發明公開一種液相色譜-串連質譜法測定人參中真菌毒素含量的方法，其特徵在於，該方法包括如下步驟(1)對待測人參樣品進行預處理；(2)通過液相色譜-串連質譜法測定經預處理後的人參樣品中一種或多種真菌毒素的含量。該測定方法靈敏度高、專屬性強、準確度好，可用於人參或類似藥材中真菌毒素的多成分殘留測定。
文檔編號G01N30/72GK102692469SQ20111006738
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月21日 優先權日2011年3月21日
發明者於建, 吳趙雲, 夏晶, 孫健, 孟茜, 季申, 張甦, 張道廣, 李麗敏, 毛丹, 毛秀紅, 王少敏, 王枚博, 王柯, 王欣美, 簡龍海, 胡青, 苗水, 許勇, 郟徵偉, 鄭榮, 鍾吉強, 陸繼偉, 陳銘, 陳靜 申請人:上海市食品藥品檢驗所