一種銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝的製作方法
2023-11-10 05:27:27
一種銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝，以銀杏根皮為原料，經粉碎至粗粉，加高濃度的乙醇提取，濃縮，加水稀釋，經聚醯胺吸附樹脂吸附洗脫，洗脫液濃縮，乙醇重結晶，得到的粗結晶經高效液相色譜分離，製得萜內酯提取物，其總內酯含量≥95%，總銀杏酸含量≤1ppm。本發明方法克服了現有生產技術缺陷，具有生產工藝穩定可控、操作簡便、產品質量高且穩定、成品得率高、生產成本較低等特點，且能將銀杏根皮變廢為寶，充分發揮其經濟價值。
【專利說明】一種銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝，屬於中藥製劑【技術領域】。
【背景技術】
[0002]銀杏萜內酯是一類銀杏葉和銀杏根皮中特有的重要活性化合物，由倍半萜內酯和二萜內酯組成，主要成分包括銀杏內酯A、銀杏內酯B、銀杏內酯C、銀杏內酯J和白果內酯。銀杏酸(GA)為銀杏葉提取物中的毒副作用成分，具有致敏性、細胞毒性和免疫毒性等作用，對人類健康存在潛在危害，主要存在於銀杏葉、銀杏果及銀杏根皮中；德國於1997年開始嚴格限定銀杏葉製劑中GA水平在5ppm以下，歐洲藥典在GBE標準中沿用了 5ppm的GA限度要求，中國藥典2010年版也限定GBE中GA含量應在IOppm以下。
[0003]銀杏萜內酯具有抑制血小板聚集、抑制血栓形成、保護血管內皮細胞、擴張冠狀動脈等作用，為強血小板活化因子(PAF)拮抗劑。銀杏內酯中每個內酯所起的作用有所不同，其中銀杏內酯B的PAF (血小板活化因子)的選擇性抗PAF的活性最強，其次為銀杏內酯A和銀杏內酯C ;銀杏內酯A有抗焦慮作用，而銀杏內酯B和C則並未有抗焦慮作用；白果內酯為神經系統、精神病的藥物，對因年老而出現的呆傻現象有奇異的療效，也用於治療神經病、腦病和脊髓病，症狀包括:感覺異常，軟癱或麻痺性痴呆，非正常神經反射，肌肉萎縮，肌肉痙攣，震顫，表面性或深度敏感性失調，頭痛和四肢痛，語言失調，視力和聽力失調，玄暈，神經失調和缺乏集中性，記憶力減退及定向力消失等。
[0004]銀杏萜內酯提取物除了作為製藥原料以外，在國內還被大量用於保健品和食品的開發，在國外被作為一種優良的膳食補充劑而大量使用，因此，近年來，國內外市場上對萜內酯提取物的需求不斷增加。而目前市場上`絕大部分的萜內酯提取物來源於銀杏葉，對於銀杏根皮中內酯提取物的開發較少。
[0005]由於銀杏葉中萜內酯含量較銀杏根皮中含量高，且銀杏葉提取物中萜內酯含量達6-12%，故目前大多數萜內酯提取物的製備都從銀杏葉或銀杏葉提取物中分離得到，相關的文獻報導也很多，但銀杏葉或提取物的原料成本較高。由於銀杏根皮中萜內酯總含量僅
0.1-0.2%左右，一般被老百姓視作廢料處理，而市場上純度> 90%的萜內酯提取物價格為數萬至十萬元每公斤，以價格低廉的銀杏根皮為原料產業化製備高純度萜內酯提取物具有較大的潛在市場。
[0006]經檢索，目前關於銀杏根皮萜內酯提取物製備的文獻和專利較少，例如文獻《銀杏根皮中萜內酯提取工藝研究》中僅考察了根皮內酯含量測定的提取工藝參數，並非大生產工藝。部分研究報導的製備工藝中採用水、鹼水浸泡或回流提取，如專利97107809.2《銀杏內酯的提取方法和含有銀杏內酯的製劑》、201110071505.3《一種銀杏內酯的提取精製方法》和201210116022.5《提取分離銀杏內酯A、B、C、J、M及白果內酯的工藝》，由於銀杏萜內酯極性較小，難溶於水，易溶於乙醇、甲醇等有機溶劑，故採用水提工藝的內酯轉移率遠低於醇提工藝，提取效率較低；而鹼水提取還會破壞其中含量較高的白果內酯。部分研究也有針對其中GA、GC單體的分離，如專利201010294667.9《一種從銀杏樹根皮中提取銀杏內酯A、C的製作工藝》和201110067186.9《從銀杏根皮中分離、純化銀杏內酯C的方法》，單體製備分離的工藝相對較複雜，同時損失了其他萜內酯成分，生產成本遠高於混合內酯的製備成本，大生產採用有機溶劑萃取對生產設備要求較高，安全性存在一定隱患，且內酯GA、GC單體開發的市場需求量遠不如內酯提取物的市場需求大，不適宜大批量製備。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在於:利用廉價的銀杏根皮原料，提供一種生產工藝穩定可控、操作簡便、成品轉移率高、產品質量高且穩定、生產成本較低的高純度銀杏萜內酯的製備工藝，將銀杏根皮變廢為寶，充分發揮其經濟價值。
[0008]為了實現上述目的，本發明採用的技術方案包括: 本發明提供了一種銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝，以銀杏根皮為原料，銀杏根皮粉碎，加乙醇溶液提取；提取液濃縮，加水稀釋，經聚醯胺吸附樹脂吸附洗脫；收集吸附殘液和水洗脫液，濃縮，用乙醇重結晶；經高效液相色譜分離，得到萜內酯提取物，其總內酯含量> 95%、總銀杏酸含量< lppm，成品轉移率高，工藝恆穩性好。
[0009]本發明具體步驟如下:
步驟1，乙醇提取:取粉碎後的銀杏根皮，加10-15倍量的質量分數為60-80%乙醇水溶液回流提取2-3次，提取液濃縮至無醇，得濃縮液；其中乙醇含量< 5%。
[0010]由於根皮中纖維成分較多，粉碎程度不同會直接影響提取效率，因此本發明所述的粉碎後的根皮明確為:粉碎至粗粉，即過24目篩。
[0011]所述的10-15倍量的60-80%乙醇水溶液回流提取2-3次，優選條件為用12倍量的70%乙醇水溶液加熱回流提取3次。
[0012]步驟2，聚醯胺吸附樹脂純化:濃縮液加純化水稀釋至密度為1.0-1.lg/mL(50°C )，上聚醯胺吸附樹脂，加3-4倍柱體積的水洗脫，收集吸附殘液和水洗脫液，濃縮，得稠膏。
[0013]所述的上柱液優選稀釋至密度為1.01-1.03 g/mL (50°C)。
[0014]所述的聚醯胺樹脂粒度為100-200目。
[0015]所述的水洗的用量優選條件為加3倍柱體積的純化水洗脫。
[0016]所得稠膏密度為1.2-1.5 g/mL (50°C)，優選條件為1.3-1.4 g/mL。
[0017]步驟3，粗結晶的製備:稠膏加入一定量的乙醇至溶液濃度為20-40%，60°C水浴加熱使其完全溶解，過濾，濾液置冰箱冷藏，重結晶；結晶後母液再重複操作，得粗結晶；
所述的乙醇水溶液優選條件為30%乙醇水溶液。
[0018]所述的冰箱冷藏條件為0_4°C，保存8_12h ;優選重結晶冰箱冷藏條件為0_2°C。
[0019]優選母液重結晶次數為3次。
[0020]步驟4，製備分離:粗結晶用適量甲醇水溶解，經高效液相色譜分離，重複進樣，合併內酯部位流分，減壓濃縮，乾燥，即得純度> 95%的萜內酯提取物。
[0021]所述的適量甲醇水溶解，優選條件為加質量分數為60-80%的甲醇水溶液，溫水浴加熱，使其處於過飽和溶解狀態。
[0022]所述的高效液相色譜分離，優選條件為採用C18製備色譜柱，流動相為30-50%甲醇-水，紫外檢測波長為218nm，流速為200-500mL/min，進樣量為50_100mL/次，重複進樣，收集BB至GB間的五個內酯流分。
[0023]所述的乾燥方式優選減壓乾燥、冷凍乾燥或微波乾燥之一。
[0024]本發明銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝，步驟I中採用60-80%乙醇水溶液作為提取溶劑，在保證內酯提取完全的情況下，摒棄了部分大極性成分的進入，減少了幹擾，這也是研究工藝不需要採用有機溶劑萃取的主要因素之一。
[0025]步驟2採用聚醯胺吸附樹脂進行純化，可以去除部分脂溶性成分，以減少其對重結晶過程的幹擾，尤其是對根皮中的已知毒性成分銀杏酸進行了有效的去除，為保證產品質量安全起到了很好的控制作用。
[0026]步驟3通過低醇度乙醇的數次重結晶，所得粗結晶中的總內酯轉移率達到80%以上，總內酯含量達到95%左右，達到了良好的重結晶效果。
[0027]步驟4採用高效液相色譜分離，收集從BB到GB在內的5個成分的內酯流分，分離要求就遠比分離單體的低得多，採用的流動相甲醇-水可重複回收利用，大幅降低了生產成本，製備量可達到公斤級以上的生產要求，符合生產預期。
[0028]本發明提出的一種銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝，具有如下優
點
1.按本發明生產的高純度銀杏萜內酯提取物，總內酯含量>95%，總銀杏酸含量≤ lppm,廣品質量聞且穩定；
2.本發明的成品轉移率高，如總內酯轉移率達到80%以上，總內酯含量達到95%以
上；
3.本發明方法不需要有機溶劑萃取，具有生產工藝安全、穩定可控，操作簡便，生產成本較低，經濟效益好的優點。
[0029]具體實施方案:
下面的實施例，用於進一步說明和描述本發明，但並不意味著本發明盡顯於此。實施例中取值為本發明所述範圍的任意具體數值，均為可實施。
[0030]本研究採用的銀杏內酯含量測定方法見《中國藥典》銀杏葉提取物的相關項目；高效液相分離的色譜條件如下:
色譜柱:Agilent C18 pursuit製備色譜柱；
流動相:30-50%甲醇-水；
紫外檢測波長:218nm ；
流速:200-500mL/min ；
進樣量:50-100mL/次。
[0031]實施例1
銀杏根皮，去雜，粉碎至粗粉(過24目篩)，取銀杏根皮粗粉100kg，加入質量分數為60%的乙醇1000kg，加熱回流提取2次，合併兩次提取液，減壓濃縮至無醇(乙醇含量小於5%)，得濃縮液；加水稀釋至50°C下密度為1.0g/mL，稀釋液上100目聚醯胺吸附樹脂吸附，用3倍柱體積的純化水洗脫，收集吸附殘液和水洗脫液，減壓濃縮至密度1.25g/mL (50°C)，得稠膏；加入一定量的乙醇至溶液濃度為20%，60°C水浴加熱使其完全溶解，過濾，濾液迅速置冰箱冷藏8h，重結晶，其冰箱冷藏溫度為0-4°C ;重結晶後母液再依據上述重結晶方法反覆重結晶3次，合併所有結晶，得粗結晶；粗結晶經高效液相色譜分離，重複進樣，合併收集BB至GB間的五個內酯流分，濃縮，減壓乾燥(60°C /0.08MPa)，得高純度銀杏萜內酯提取物。產品總內酯轉移率為80.7%，總內酯含量為96.2%，總銀杏酸含量為0.52ppm。
[0032]實施例2
取銀杏根皮粗粉100kg，加入80%乙醇1200kg，加熱回流提取3次，合併兩次提取液，減壓濃縮至無醇，加水稀釋至50°C下密度為1.05g/mL，稀釋液上200目聚醯胺吸附樹脂吸附，用4倍柱體積的純化水洗脫，收集吸附殘液和水洗脫液，減壓濃縮至密度1.42g/mL(50°C )，加入一定量的乙醇至溶液濃度為40%，60°C水浴加熱使其完全溶解，過濾，濾液迅速置冰箱冷藏12h，重結晶。重結晶後母液再反覆重結晶3次，合併所有結晶，得粗結晶。粗結晶經高效液相色譜分離，重複進樣，合併收集BB至GB間的五個內酯流分，濃縮，減壓乾燥，得高純度銀杏萜內酯提取物。總內酯轉移率為86.1%，總內酯含量為97.1%，總銀杏酸含量為0.37ppm。
[0033]實施例3
取銀杏根皮粗粉500kg，加入70%乙醇7500kg，加熱回流提取3次，合併兩次提取液，減壓濃縮至無醇，加水稀釋至50°C下密度為1.10g/mL，稀釋液上300目聚醯胺吸附樹脂吸附，用4倍柱體積的純化水洗脫，收集吸附殘液和水洗脫液，減壓濃縮至密度1.31g/mL(50°C )，加入一定量的乙醇至溶液濃度為30%，60°C水浴加熱使其完全溶解，過濾，濾液迅速置冰箱冷藏10h，重結晶。重結晶後母液再反覆重結晶3次，合併所有結晶，得粗結晶。粗結晶經高效液相色譜分離，重複進樣，合併收集BB至GB間的五個內酯流分，濃縮，減壓乾燥(60°C /0.08MPa)，得高純度銀杏萜內酯提取物。總內酯轉移率為84.3%，總內酯含量為95.8%，總銀杏酸含量為0.69ppm。
[0034]實施例4
取銀杏根皮粗粉500kg，加入75%乙醇6000kg，加熱回流提取3次，合併兩次提取液，減壓濃縮至無醇，加水稀釋至50°C下密度為1.04g/mL，稀釋液上100目聚醯胺吸附樹脂吸附，用4倍柱體積的純化水洗脫，收集吸附殘液和水洗脫液，減壓濃縮至密度1.29g/mL(50°C),加入一定量的乙醇至溶液濃度為30%，60°C水浴加熱使其完全溶解，過濾，濾液迅速置冰箱冷藏10h，重結晶。重結晶後母液再反覆重結晶3次，合併所有結晶，得粗結晶。粗結晶經高效液相色譜分離，重複進樣，合併收集BB至GB間的五個內酯流分，濃縮，減壓乾燥，得高純度銀杏萜內酯提取物。總內酯轉移率為85.3%，總內酯含量為96.4%，總銀杏酸含量為
0.28ppm。
[0035]實施例5
取銀杏根皮粗粉500kg，加入75%乙醇5500kg，加熱回流提取3次，合併兩次提取液，減壓濃縮至無醇，加水稀釋至50°C下密度為1.07g/mL，稀釋液上200目聚醯胺吸附樹脂吸附，用4倍柱體積的純化水洗脫，收集吸附殘液和水洗脫液，減壓濃縮至密度1.35g/mL(50°C )，加入一定量的乙醇至溶液濃度為30%，60°C水浴加熱使其完全溶解，過濾，濾液迅速置冰箱冷藏10h，重結晶。重結晶後母液再反覆重結晶3次，合併所有結晶，得粗結晶。粗結晶經高效液相色譜分離，重複進樣，合併收集BB至GB間的五個內酯流分，濃縮，減壓乾燥(60°C /0.08MPa)，得高純度銀杏萜內酯提取物。總內酯轉移率為84.6%，總內酯含量為95.8%，總銀杏酸含量為0.74ppm。[0036]實施例6
依據專利申請號201110071505.3《一種銀杏內酯的提取精製方法》的製備方法測定製得成品的轉移率，內酯的含量。具體如下:
取銀杏根皮粉碎後過40目篩，稱取50kg，加乙酸鈉溶液200L，浸泡3小時，過濾，棄去濾液，得到濾渣；濾渣加50-70°C熱水浸提3次，每次加熱水300L，提取時間為4小時/次，過濾，得浸提液；將浸提液濃縮至總體積的1/10，得濃縮液；濃縮液用4倍量的95%乙醇水溶液溶解，攪拌40min，過濾，濾液回收乙醇，至醇度< 5%，即得無醇濃縮液；濃縮液用醋酸乙酯萃取3次，醋酸乙酯與濃縮液的比例為1:2，合併萃取液；萃取液濃縮，減壓乾燥(600C /0.08MPa),即 得內酯提取物。測得總內酯含量為78.4%，總內酯轉移率為56.8%。結果顯示，該方法製備內酯提取物轉移率較低，且總內酯含量不高。
【權利要求】
1.一種銀杏根皮中低酸高純度萜內酯提取物的製備工藝，以經粉碎的銀杏根皮為原料，加乙醇溶液提取；提取液濃縮，加水稀釋，經聚醯胺吸附樹脂吸附洗脫；收集吸附殘液和水洗脫液，濃縮，加乙醇溶液重結晶；再經高效液相色譜分離，得到低酸高純度萜內酯提取物，其總內酯含量> 95%，總銀杏酸含量95%的低酸萜內酯提取物。
2.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵是步驟I)所述的60-80%乙醇水溶液為:每公斤銀杏根皮加入10-15倍的60-80%乙醇水溶液，回流提取。
3.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵是步驟I)所述的濃縮至無醇為:濃縮至乙醇含量小於5%。
4.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵是步驟2)所述的聚醯胺樹脂粒度為100-200目；所述的水洗的用量為3-4倍柱體積；所述的稠膏為50°C下密度為1.2-1.5 g/mT.n
5.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵是步驟3)所述的一定量乙醇水溶液為:加入一定量的乙醇至溶液濃度為20-40% ;所述的濾液置冰箱冷藏為:濾液置冰箱0-4°C，冷沉8-12h。
6.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵是步驟3)所述的結晶後母液再重複操作為:結晶後母液濃縮，再用20-30倍量的20-40%乙醇水溶液重結晶，操作3次。
7.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵是步驟4)所述的粗結晶用適量甲醇水溶解為:粗結晶一定量加60-80%的甲醇水溶液,溫水浴加熱,使其處於過飽和溶解狀態。
8.根據權利要求1所述的製備工藝，其特徵是步驟4)所述的經高效液相色譜分離為:採用C18製備色譜柱，流動相為30-50%甲醇-水，紫外檢測波長為218nm，流速為200-500mL/min，進樣量為50_100mL/次，重複進樣，收集BB至GB間的五個內酯流分。
【文檔編號】A61K36/16GK103610708SQ201310576700
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】姚建標, 王如偉, 葉劍鋒, 方玲, 吳旭明, 金輝輝, 胡林水 申請人:浙江康恩貝製藥股份有限公司, 浙江康恩貝藥品研究開發有限公司