從野棉花葉中提取酵母菌抑制劑的方法
2023-11-10 04:58:27 2
專利名稱：從野棉花葉中提取酵母菌抑制劑的方法
技術領域：
本發明涉及ー種酵母菌抑制劑的提取方法，特別是涉及ー種從野棉花幹葉中提取酵母菌抑制劑的方法，屬於中草藥活性成分的提取領域。
背景技術：
食品腐敗微生物會引起食品發生化學或物理性質變化，從而使食品失去原有的營養價值、組織性狀及色、香、味。植物性和動物性食品原料在收穫、運輸、加工和貯藏過程中，都會受到微生物的汙染。在能引起食品腐敗變質的微生物中，起主要作用的，除了我們熟知 的一些細菌和黴菌外，酵母菌也扮演著非常重要的角色。在高濃度糖分的糖漿、果醬、濃縮果汁等食品中，使其變質起主要作用的有魯氏酵母、羅氏酵母、蜂蜜酵母、義大利酵母、異常漢遜氏酵母、漢氏德巴利氏酵母、膜醭畢赤氏酵母等。其中羅氏酵母和漢氏德巴利氏酵母還具有較強的耐鹽性，因此又稱為耐鹽性酵母。酵母菌對多數糖有分解作用，部分菌種還能氧化有機酸，具有耐高濃度糖和鹽的特性，通常在果汁、煉乳中引起腐敗。如煉乳球擬酵母、球擬酵母使煉乳罐頭產氣而膨脹，嚴重時發生爆裂。它們在果汁、果醬中繁殖後，改變內容物的風味，並產生汁液渾濁和沉澱，當大量產ー氧化碳後，使容器膨脹和爆裂。而假絲酵母屬是引起充氣或不充氣軟飲料產生渾濁的腐敗菌之一。其中，啤酒酵母ceiwisiae)是常見的酵母菌,細胞呈圓形或橢圓性，有的有假絲，主要分布在果皮、果汁、果園土壌中。啤酒酵母是麵包生產和酒精發酵最重要的屬，同時也引起食品的腐敗，產生酒精和ニ氧化碳。由此可見，酵母菌對食品腐敗的作用不可小視。目前，人們在生產應用中，為了防止酵母菌對食品的破壞作用，通常把一些抗生素，如鏈黴素、放線菌酮、制黴菌素等作為酵母菌抑制劑添加到食品中。很顯然，如果人體長時間過量食用抗生素，肯定對身體造成巨大傷害。山梨酸是國際糧農組織和衛生組織推薦 的高效安全的防腐保鮮劑，但是對酵母菌的抑制作用有限，在實際生產過程中必須添加很多的山梨酸，才能真正達到預期的效果，經濟上不是很划算。因此，開發更多廉價、有效、作用更少的酵母菌抑制劑供食品エ業選擇使用就顯得尤為重要。我國中藥資源豐富，從天然植物中尋找新的低毒、高效的酵母菌抑制劑一直是國內外的研究熱點。野棉花(Jnenione vitifolia),又叫打破碗花花,為毛莨科銀蓮花屬植物。野棉花在生產應用上主要用於殺蟲，具有土農藥的美稱，在四川、湖南等地野棉花被廣泛應用於殺滅蛆蟲和孑孓。野棉花中的活性成分主要為原白頭翁素，具有抗小麥赤黴病和水稻白葉枯病的功能。然而，通過本發明實驗研究還發現，野棉花的こ醇抽提物對酵母菌等真菌具有抑制活性，且活性成分穩定，與原白頭翁素不同，易於製備與保存。
發明內容
本發明的目的在於提供一種從野棉花葉中提取酵母菌抑制劑的方法。該方法エ藝簡單、操作方便，所提取得到的酵母抑菌劑抑菌活性強、純度高。本發明的目的是通過以下的技術方案來實現的
一種從野棉花葉中提取酵母菌抑制劑的方法，其特徵在於エ藝步驟如下
A、將野棉花的幹葉粉碎，於容器中按料液比lg:4(T50ml加入こ醇，在室溫下震蕩36 40小時後，分離出上清液，再將上清液於50°C濃縮乾燥3(T50min，得こ醇浸膏；
B、先將步驟A的こ醇浸膏分散於蒸餾水中，料水比為Ig:2(T30ml，再加入與蒸餾水等體積的正己烷震蕩萃取3 4次，收集水相萃取物；
C、將步驟B的水相萃取物濃縮到2(T25ml後，上MCI-GEL反相樹脂層析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脫,洗脫流速為lml/min,收集具有活性的100wt%甲醇洗脫峰流份，於50°C濃縮乾燥3(T50min後即得到酵母菌抑制劑。
步驟A所述粉碎的野棉花幹葉的平均粒度為20(T300Mffl。步驟A所述こ醇浸膏的收率為2(T25%。步驟C所述酵母菌抑制劑的收率為8 15%。本發明製備得到的酵母抑制劑通過下述方法進行的性能測試顯示
將具有活性的洗脫峰流份以0. 2mm的薄層矽膠板進行展開，展開劑為氯仿甲醇=7ml:3 ml。用5wt%的硫酸噴霧後加熱顯色，具有最高活性洗脫峰的Rf值為0. 5^0. 6。本發明突出的技術效果表現在
(1)整個エ藝過程簡單、操作方便，先以こ醇提取野棉花，所得浸膏再以水、正己烷震蕩提取，最後再經MCI-GEL反相樹脂層析柱，按規定濃度的水-甲醇作梯度洗脫得到酵母菌抑制劑。在整個提取分離過程中除使用到こ醇及低毒的正己烷外，未涉及其他有毒溶劑，環保，成本低；
(2)按本發明方法及所設定的エ藝參數從野棉花中提取的酵母菌抑制劑，其抑菌活性強、純度高。實驗證明，在濃度為10mg/ml(2mg/dic)時,對酵母菌的抑菌圈直徑為14 16mm。
具體實施例方式 下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是本實施例只用於對本發明進行進ー步說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制。實施例I :
A、將IOg野棉花的幹葉粉碎，平均粒度為200Mm，於容器中加入400mlこ醇，在室溫下震蕩36小時，分離出上清液，再將上清液於50°C濃縮乾燥30min，得こ醇浸膏2. lg，收率為21%。B、將步驟A的こ醇浸膏分散於50ml蒸餾水中，然後用50ml正己烷震蕩萃取3次，收集水相萃取物。C、將步驟B的水相萃取物濃縮到20ml後，上MCI-GEL反相樹脂層析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脫,洗脫流速為lml/min,收集具有活性的100wt%甲醇洗脫峰流份，於50°C濃縮乾燥30min後即得到白色固體狀的酵母菌抑制劑0. 17g，收率為 8. 3%。實施例2:
A、將IOg野棉花的幹葉粉碎，平均粒度為250Mm，於容器中加入450mlこ醇，在室溫下震蕩38小吋，分離出上清液，再將上清液於50°C濃縮乾燥40min，得こ醇浸膏2. 48g，收率為24. 8%。B、將步驟A的こ醇浸膏分散於60ml蒸餾水中，然後用60ml正己烷震蕩萃取4次，收集水相萃取物。C、將步驟B的水相萃取物濃縮到25ml後，上MCI-GEL反相樹脂層析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脫,洗脫流速為lml/min,收集具有活性的100wt%甲醇洗脫峰流份，於50°C濃縮乾燥50min後即得到白色固體狀的酵母菌抑制劑0. 3g，收率為 12. 1%。實施例3: A、將IOg野棉花的幹葉粉碎，平均粒度為300Mm，於容器中加入500ml，在室溫下震蕩40小時，分離出上清液，再將上清液於50°C濃縮乾燥50min，得こ醇浸膏2. 3g，收率為23%。B、將步驟A的こ醇浸膏分散於55ml蒸餾水中，然後用55ml正己烷震蕩萃取3次，收集水相萃取物。C、將步驟B的水相萃取物濃縮到23ml後，上MCI-GEL反相樹脂層析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脫,洗脫流速為lml/min,收集具有活性的100wt%甲醇洗脫峰流份，於50°C濃縮乾燥40min後即得到白色固體狀的酵母菌抑制劑0. 34g，收率為 14. 7%。實施例4 :抗菌活性試驗
以上述實施例1-3提取得到的酵母菌抑制劑為例，其抗菌活性試驗方法及結果如下I)供試菌株包括大腸桿菌(Escherichia coli ATCC 25922),鼠傷寒沙門氏菌{Salmonella typhimurium ATCC 14028),金黃色葡萄球菌(Staphylpcoccus aureusATCC 25923)，枯草芽孢桿菌{Bacillus subtil is ATCC 21216)，蠟狀芽孢桿菌{Bacilluscereus ATCC 10231),側抱芽抱桿菌(Bacillus laterosporus ATCC 64)，黃麴黴(.Aspergillus flavus ATCC 204304),黑麴黴(メ印ぽがバ狀 niger ATCC 16404),根黴(.Rhizopus oryzae ATCC 9363),青黴citrinum ATCC 14994),白色念珠菌{Candida albicans ATCC 10231),啤酒酵母菌(feccAarc ァces cerevisiae ATCC 9763)。本實驗中的實驗菌株由四川大學食品科學與技術四川省重點實驗室提供。2)細菌固體培養基為牛肉膏蛋白腖培養基，其主要組成成分如下
牛肉膏0. 5g，蛋白腖lg，氯化鈉0. 5g，瓊脂2g，水100ml，滅菌前用濃度2M NaOH調pH值為7. 2 4。真菌及酵母培養基為土豆培養基，其主要組成成分如下去皮後的馬鈴薯200g，蔗糖 20g，水 IOOOmL,瓊脂 20g。3)抗菌活性測定採用牛津杯法。牛津杯在121°C條件下高壓滅菌20min，冷卻乾燥備用；將受試物用95%甲醇溶液稀釋成10mg/ml溶液並用0. 22 y m細菌濾器過濾除菌備用；將牛津杯放置於已冷卻的含菌雙碟平板表面，吸取200 的受試物稀釋液分別注入牛津杯中，然後放入37°C培養36h，觀察各平板抑菌圈直徑大小。每組4個平板，每個平板放置2個牛津杯，重複3次，用遊標卡尺測定並記錄結果，抑菌圈直逕取平均值。4)測試結果如表I所示
表I 實施例1-3提取物抗菌活性結果
權利要求
1.一種從野棉花葉中提取酵母菌抑制劑的方法，其特徵在於エ藝步驟如下 A、將野棉花的幹葉粉碎，於容器中按料液比lg:4(T50ml加入こ醇，在室溫下震蕩36 40小時後，分離出上清液，再將上清液於50°C濃縮乾燥3(T50min，得こ醇浸膏； B、先將步驟A的こ醇浸膏分散於蒸餾水中，料水比為Ig:2(T30ml，再加入與蒸餾水等體積的正己烷震蕩萃取3 4次，收集水相萃取物； C、將步驟B的水相萃取物濃縮到2(T25ml後，上MCI-GEL反相樹脂層析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脫,洗脫流速為lml/min,收集具有活性的100wt%甲醇洗脫峰流份，於50°C濃縮乾燥3(T50min後即得到酵母菌抑制劑。
2.根據權利要求I所述從野棉花葉中提取酵母菌抑制劑的方法，其特徵在於步驟A所述粉碎的野棉花幹葉的平均粒度為20(T300Mm。
3.根據權利要求I所述從野棉花葉中提取酵母菌抑制劑的方法，其特徵在於步驟A所 述こ醇浸膏的收率為20 25%。
4.根據權利要求I所述從野棉花葉中提取酵母菌抑制劑的方法，其特徵在於步驟C所述酵母菌抑制劑的收率為8 15%。
全文摘要
本發明涉及一種從野棉花幹葉中提取酵母菌抑制劑的方法，屬於中草藥活性成分的提取領域。該方法的工藝步驟如下A、將野棉花的幹葉粉碎後加入乙醇，室溫下震蕩分離出上清液，再將上清液濃縮乾燥得乙醇浸膏；B、將乙醇浸膏分散於蒸餾水中，再加入己烷震蕩萃取3～4次，收集水相萃取物；C、將水相萃取物濃縮後，上MCI-GEL反相樹脂層析柱，用水-甲醇梯度洗脫，收集具有活性的甲醇洗脫峰流份，經濃縮乾燥後即得到酵母菌抑制劑。本發明工藝簡單、操作方便，環保，成本低；所提取得到的酵母抑菌劑的抑菌活性強、純度高；濃度為10mg/ml時對酵母菌的抑菌圈直徑為14～16mm。
文檔編號A23L3/3472GK102742920SQ20121024696
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月17日 優先權日2012年7月17日
發明者劉敬宗, 山口五十磨, 徐正君, 李利華, 鍾凱, 陳榮軍, 高曉玲, 高鴻 申請人:四川農業大學