一種中鏈烷烴的生產方法

2023-11-10 16:29:57

一種中鏈烷烴的生產方法
【專利摘要】本發明屬於生物化工領域，特別涉及一種中碳鏈烷烴的生產方法。烷烴主要來源於石油和天然氣，也可以通過自然界中一些物種的新陳代謝產生，但是這些微生物生產烷烴的量很低。隨著現代分子生物學尤其是合成生物學的飛速發展，調控烷烴合成過程中相關酶的表達，使微生物細胞只需通過簡單的代謝就可以產生烷烴，是生產可再生能源的前沿技術。該方法為傳統石化燃料供給不足、新型生物燃料不能完全替代石化燃料等問題提供了一個絕佳的解決方案。與其他菌株相比，大腸桿菌具有遺傳背景清楚、易於改造、生長速度快、適合高密度發酵等優點，是微生物法合成化學品和燃料的理想菌株。利用大腸桿菌生產生物烷烴是一種不爭地、不靠天、可持續生產的新途徑。
【專利說明】一種中鏈烷烴的生產方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物化工領域，特別涉及一種中碳鏈烷烴的生產方法。
【背景技術】
[0002]烷烴，是化石能源的主要組分，比如石油的分離產物汽油、柴油以及航空燃油等，都是由不同碳鏈長度的烷烴組成的。而近年來，隨著化石能源的日趨枯竭，以及原油消耗量的激增，化石能源供給量不足和怎樣實現可持續發展，已經成為人類所必須關注的問題。因此，關於如何利用可再生能源替代化石燃料的研究，逐漸成為新生的熱點課題。
[0003]目前應用最為廣泛的化石能源替代品，主要包括燃料乙醇、燃料丁醇以及生物柴油等。但是這幾種替代物在應用過程中，都存在許多問題，比如醇類汽油極易形成分層並且腐蝕發動機橡膠、生物柴油原料成本及生產工藝能耗均較高等，致使它們不可能完全替代汽油、柴油等烴類物質。所以，為化石能源尋求一種更好的可再生替代物，即一種低成本、高效率的烷烴生產方法，可謂迫在眉睫。 [0004]烷烴主要來源於石油和天然氣，也可以通過自然界中一些物種的新陳代謝產生，比如植物的角質層蠟、昆蟲的信息素等，但是學術界對於利用微生物這一「細胞工廠」來生產烷烴的研究卻少之又少。隨著現代分子生物學尤其是合成生物學的飛速發展，利用基因工程的手段，調控烷烴合成過程中相關酶的表達，使微生物細胞只需通過簡單的代謝就可以產生烷烴，是生產可再生能源的前沿技術。該方法為傳統石化燃料供給不足、新型生物燃料不能完全替代石化燃料等問題提供了一個絕佳的解決方案。與其他菌株相比，大腸桿菌具有遺傳背景清楚、易於改造、生長速度快、適合高密度發酵等優點，是微生物法合成化學品和燃料的理想菌株。利用大腸桿菌生產生物烷烴是一種不爭地、不靠天、可持續生產的新途徑。
[0005]與公知技術相比，本發明具有以下優點:
[0006](I)直接利用微生物以可再生生物質為原料代謝得到的烷烴，可大大緩解化石能源供給不足的問題。
[0007](2)通過本發明得到的烷烴，與石油中的烷烴無異，更接近化石燃料本身的性質，克服了燃料乙醇、燃料丁醇、生物柴油等存在的一系列問題，利用率極高。
[0008](3)微生物只需通過簡單的代謝便可產生烷烴，生產周期短，不受場地、季節等因素影響，不佔用耕地資源，容易實現工業化生產。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在於提供一種在重組大腸桿菌(Escherichia coli)，以自然界中大量存在並可再生的脂肪酸為原料，合成烷烴的可再生能源工藝路線，使微生物可以作為細胞工廠，發酵生產烷烴。
[0010]本發明首先對來自大腸桿菌K12菌株中的醯基輔酶A合成酶基因進行過表達，構建基因工程菌，即將基因fadD克隆至原核表達載體pACY⑶uet-Ι中，得到重組質粒pACY⑶uet-fadD，質粒I。表達的醯基輔酶A合成酶可以通過外源性流加C14:0/C16:0等中鏈脂肪酸的方式，催化脂肪酸生成代謝產物酯醯輔酶A，並使這一前體物質在宿主細胞中得到積累。
[0011]再異源表達來自不動桿菌ADPl (Acinetobacter baylyi)中的醯基輔酶A還原酶。具體為將不動桿菌中醯基輔酶A還原酶基因acr克隆至原核表達載體pETDuet-Ι中，得到重組質粒pETDuet-acr，質粒2。表達的醯基輔酶A還原酶可以催化細胞中積累的酯醯輔酶A還原為C14/C16的脂肪醛。
[0012]最後,異源表達來自念珠藻(Nostoc punctiforme)中的醒脫羰基酶。即將醒脫羰基酶基因dc克隆至原核表達載體質粒2中，得到重組質粒pETDuet-acr-dc,質粒3。表達的醛脫羰基酶可以催化脂肪醛脫去羰基，生成烷烴。
[0013]將重組質粒I/質粒3共同轉入大腸桿菌BL21 (DE3)中，IPTG誘導重組質粒進行共表達，即可通過外源性流加C14:0/C16:0脂肪酸的方式，使脂肪酸逐步代謝生成C13/C15等碳鏈長度不等的烷烴，其中外源性流加C14:0脂肪酸得到的烷烴產量為2.17mg/L，外源性流加C16:0脂肪酸得到的烷烴產量為1.81mg/L，從而得到利用重組大腸桿菌直接合成烷烴的可再生資源工藝路線。
[0014]本發明提供的方法，在大腸桿菌中表達特異性調控醯基輔酶A合成、醯基輔酶A還原以及醛脫羰基反應的關鍵酶基因，可以利用微生物代謝天然脂肪酸得到的烷烴，並進行高密度發酵，為可再生烷烴的合成開闢一條新的途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:DNA瓊脂糖凝膠電泳。右側為純化後的大腸桿菌中醯基輔酶A合成酶基因PCR產物，1686bp。左側為DNA大小標準品。
[0016]圖2:構建的重組載體pACYCDuet-fadD的圖譜，fadD基因克隆於pACYCDuet-Ι載體，基因兩端帶有NCO I和EcoR I位點。將其編號為質粒I。
[0017]圖3:DNA瓊脂糖凝膠電泳。右側為純化後的不動桿菌中醯基輔酶A還原酶基因PCR產物，888bp。左側為DNA大小標準品。
[0018]圖4:構建的重組載體pETDuet-acr的圖譜,acr基因克隆於pETDuet-Ι載體,基因兩端帶有NCO I和BamH I位點。將其編號為質粒2。
[0019]圖5:DNA瓊脂糖凝膠電泳。右側為純化後的念珠藻中醛脫羰基酶基因PCR產物，699bp。左側為DNA大小標準品。
[0020]圖6:構建的重組載體pETDuet-acr-dc的圖譜，dc基因克隆於pETDuet-acr載體，基因兩端帶有Bgl II和Hind III位點。將其編號為質粒3。
[0021]圖7:含有質粒I/質粒3的工程大腸桿菌經誘導後，外源性流加C14:0脂肪酸，其培養液中燒烴的生產情況；C13表示tridecane ；C15表示pentadecane。
[0022]圖8:含有質粒I/質粒3的工程大腸桿菌經誘導後，外源性流加C16:0脂肪酸，其培養液中燒烴的生產情況；C13表示tridecane ；C15表示pentadecane。
【具體實施方式】
[0023]本發明提供的一種利用重組大腸桿菌直接合成烷烴的可再生能源工藝路線，使天然脂肪酸得到有效利用。本發明通過以下方案解決這一技術問題:首先以大腸桿菌基因組DNA為模板，設計相應的引物並添加相應克隆酶切位點，擴增fadD基因，其核酸序列如序列I所示，各自所編碼的胺基酸序列如序列2所示。PCR擴增後回收穫得目的基因DNA片段，酶切後連接至原核表達載體pACY⑶uet-Ι的相應酶切位點上，將連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞中，篩選獲得陽性重組質粒pACY⑶uet-fadD(質粒I),其質粒圖譜如圖2所示。質粒經純化、電泳檢測、測序鑑定目的基因。
[0024]再利用全基因合成的方法分別合成acr基因，其核酸序列如序列3所示，各自所編碼的胺基酸序列如序列4所示，並添加相應克隆酶切位點，酶切後連接至原核表達載體pETDuet-Ι的相應酶切位點上，將連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞中，篩選獲得陽性重組質粒pETDuet-acr (質粒2)，其質粒圖譜如圖4所示，並以同樣的方法鑑定目的基因。
[0025]最後，利用全基因合成的方法分別合成dc基因，其核酸序列如序列5所示，各自所編碼的胺基酸序列如序列6所示，並添加相應克隆酶切位點，酶切後連接至原核表達載體pETDuet-acr的相應酶切位點上，將連接產物轉化到大腸桿菌感受態細胞中，篩選獲得陽性重組質粒pETDuet-acr-dc (質粒3),其質粒圖譜如圖4所示，並以同樣的方法鑑定目的基因。
[0026]將重組質粒1/3在大腸桿菌BL21 (DE3)中共同誘導表達與外源性流加脂肪酸後，繼續培養，在重組大腸桿菌細胞內即可獲得C13/C15等碳鏈長度不等的烷烴。
[0027]實驗步驟
[0028]I)採用的菌種
[0029]大腸桿菌BL21(DE3)
[0030]2)採用的培養基
[0031]LB培養基(蛋白腖10g/L，酵母提取物5g/L，NaC15g/L，121°C溼熱滅菌20min)，若配製平板培養基，則需加入1.5%瓊脂粉；選擇性LB培養基:50ml的LB培養基中加入50 μ L左右0.1 %的氨苄青黴素溶液與氯黴素溶液。
[0032]3)實驗方法:
[0033]分別以,利用博邁德試劑盒法所提取的大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株基因組、利用全基因合成技術合成的一個來自不動桿菌ADPl (Acinetobacter baylyi)中的醯基輔酶A還原酶[acyl-CoA reductase]基因DNA和一個來自念珠藻(Nostoc punctiforme)中的醒脫羰基酶[aldehyde decarboxylase]基因DNA為模板，PCR擴增獲得帶有相應克隆酶切位點的醯基輔酶A合成酶[acyl-CoA synthetase]基因、醯基輔酶A還原酶基因以及醛脫擬基酶基因。
[0034]用膠回收試劑盒回收目的片段，用相應的限制性內切酶分別酶切醯基輔酶A合成酶基因fadD片段和原核表達載體pACY⑶uet-Ι，並於16°C過夜連接，即為構建好的原核表達載體質粒I ;再用相同的方法將醯基輔酶A還原酶基因acr片段與原核表達載體pETDuet-Ι連接，即為構建好的原核表達載體質粒2 ;最後用相同的方法將醛脫羰基酶基因dc片段與質粒2連接，即為構建好的原核表達載體質粒3。
[0035]將構建好的重組質粒I/質粒3利用電轉化方法，共同轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中，即可獲得產醯基輔酶A合成酶、醯基輔酶A還原酶和醛脫羰基酶的工程大腸桿菌。將工程大腸桿菌按I %的接種量接種到50mL LB液體培養基中，37°C快速振蕩培養，在培養液中加入誘導劑IPTG與外源性流加脂肪酸後繼續在30°C培養48h，誘導表達目的蛋白；提取發酵液中的烷烴，測定C13/C15等烷烴的產量，即為製備好的不同碳鏈長度的烷烴。
[0036]下面結合實施例對本發明的具體方法做進一步的說明:
[0037]實施例1
[0038]I大腸桿菌中醯基輔酶A合成酶的克隆與重組載體的構建
[0039]1.1大腸桿菌中醯基輔酶A合成酶的克隆
[0040]利用博邁德試劑盒法提取大腸桿菌(Escherichia coli)K12菌株基因組，以大腸桿菌基因組DNA為模板，根據GenBank序列設計引物，並添加相應的酶切位點(NC0 I和EcoR I )和保護鹼基，PCR擴增fadD編碼的醯基輔酶A合成酶[acyl-CoA synthetase]基因，該基因誘導表達的醯基輔酶A合成酶可使脂肪酸通過代謝生成酯醯輔酶A。
[0041]PCR擴增醯基輔酶A合成酶基因fadD所用引物如下:
[0042]上遊引物:5』 -CATGCCATGGGCAAGAAGGTTTGGCTTAACC-3 』 [0043]下遊引物:5』 -CGGAATTCCGGCTCAGGCTTTATTGTCCACT-3 』
[0044]PCR反應體系含有0.2 μ L基因組DNA，上下遊引物各0.25 μ L，dNTPs混合液1.6 μ L, 10XBuffer2 μ L,pyrobest聚合酶0.4 μ L,加雙蒸水補至20 μ L。反應條件為預變性 94°C 4min，變性 94°C lmin，退火 55°C lmin，延伸 72°C lmin50s，循環 30 次，72。。IOmin,4°C保存。
[0045]這樣即可PCR擴增克隆到目的醯基輔酶A合成酶基因fadD:
[0046]該基因序列長度為1686bp，PCR擴增結束後利用PCR回收試劑盒回收目的基因，並利用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得到的目的DNA條帶為1686bp (如圖1所示)。
[0047]1.2重組載體質粒I的構建
[0048]將克隆的fadD基因與pACYCDuet-Ι載體(購於Novagen公司)用相同的酶(NC0 I和EcoR I )進行雙酶切，37°C酶切4小時，載體與外源基因片段按摩爾比1:3-1:10的比例，利用NEB的T4DNA連接酶16°C連接過夜，用該連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，塗布帶有氯黴素抗性LB瓊脂平板，37°C過夜培養後，挑取適量單菌落，在LB培養基中過夜培養，並進行菌落PCR。用試劑盒提取質粒，進行質粒酶切驗證，測序結果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列I所示，編碼如序列2所示的胺基酸序列。由於該基因的起始密碼子為稀有起始密碼子TTG，故在PCR擴增基因時將其改為常見起始密碼子ATG，特此說明。
[0049]所構建的重組載體質粒I的圖譜(見圖2)。
[0050]實施例2
[0051]I不動桿菌中醯基輔酶A還原酶的克隆與重組載體的構建
[0052]1.1不動桿菌中醯基輔酶A還原酶的克隆
[0053]利用全基因合成的方法合成不動桿菌(Acinetobacterbaylyi)中的醯基輔酶A還原酶[acyl-CoA reductase]基因DNA。該基因誘導表達的醯基輔酶A還原酶可以催化細胞中積累的酯醯輔酶A發生還原反應，生成C14/C16的脂肪醛。
[0054]以上述合成的不動桿菌中醯基輔酶A還原酶基因DNA為模板，根據GenBank序列設計引物，並添加相應的酶切位點(NC0 I和BamH I )與保護鹼基。
[0055]PCR擴增醯基輔酶A還原酶基因acr所用引物如下:
[0056]上遊引物:5』 -GCAGCCCATGGCTAGCATGAACGCTAAAC-3 』[0057]下遊引物:5，-CCGCTGGATCCTTACCAGTGTTCACCTGG-3』
[0058]PCR反應體系含有0.2 μ L基因組DNA，上下遊引物各0.25 μ L，dNTPs混合液
1.6 μ L, 10XBuffer2 μ L,pyrobest聚合酶0.4 μ L,加雙蒸水補至20 μ L。反應條件為預變性 94°C 4min，變性 94°C lmin，退火 55°C lmin，延伸 72°C lmin，循環 30 次，72°C 10min,4°C保存。
[0059]這樣即可PCR擴增克隆到目的醯基輔酶A還原酶基因acr:
[0060]該基因序列長度為888bp，PCR擴增結束後利用PCR回收試劑盒回收目的基因，並利用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得到的目的DNA條帶為888bp (如圖3所示)。
[0061]1.2重組載體質粒2的構建
[0062]將克隆的acr基因與pETDuet_l載體(購於Novagen公司)用相同的酶(NC0 I和BamH I )進行雙酶切，37°C酶切4小時，載體與外源基因片段按摩爾比1:3_1:10的比例，利用NEB的T4DNA連接酶16°C連接過夜，用該連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，塗布帶有氨苄青黴素抗性LB瓊脂平板，37°C過夜培養後，挑取適量單菌落，在LB培養基中過夜培養，並進行菌落PCR。用試劑盒提取質粒，進行質粒酶切驗證，測序結果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列3所示，編碼如序列4所示的胺基酸序列。由於該基因的起始密碼子為稀有起始密碼子GTG，故在合成該基因時將其改為常見起始密碼子ATG，特此說明。 [0063]所構建的重組載體質粒2的圖譜(見圖4)。
[0064]實施例3
[0065]I念珠藻中醛脫羰基酶的克隆與重組載體的構建
[0066]1.1念珠藻中醛脫羰基酶的克隆
[0067]利用全基因合成的方法合成念珠藻(Nostocpunctiforme)中的醒脫羰基酶[aldehyde decarboxylase]基因DNA。該基因誘導表達的醒脫羰基酶可以催化脂肪醒脫去羰基，生成烷烴。
[0068]該基因交予公司合成，合成後為pUCE-dc質粒和含有該質粒的菌株。將菌株甘油管接種到LB液體培養基中進行培養，並用omega試劑盒提取質粒，這樣即可克隆到含有醛脫擬基酶基因dc的質粒:
[0069]該基因序列長度為699bp，利用I %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所得到的目的DNA條帶為699bp (如圖5所示)ο
[0070]1.2重組載體質粒3的構建
[0071]將克隆的dc基因與重組載體質粒2用相同的酶(Bgl II和Hind III)進行雙酶切，37°C酶切4小時，載體與外源基因片段按摩爾比1:3-1:10的比例，利用NEB的T4DNA連接酶16°C連接過夜，用該連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，塗布帶有氨苄青黴素抗性LB瓊脂平板，37°C過夜培養後，挑取適量單菌落，在LB培養基中過夜培養，並進行菌落PCR0用試劑盒提取質粒，進行質粒酶切驗證，測序結果正確即獲得陽性重組載體。測定其序列如序列5所示，編碼如序列6所示的胺基酸序列。
[0072]所構建的重組載體質粒3的圖譜(見圖6)。
[0073]實施例4
[0074]I含有acr/dc基因工程大腸桿菌的構建[0075]將構建好的含有醯基輔酶A還原酶acr/醛脫羰基酶dc的重組載體質粒3，通過化學轉化(即42°C熱激)的方法，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，塗布帶有氨苄青黴素抗性LB瓊脂平板，37°C過夜培養後，挑取陽性菌落，即獲得了含有acr/dc所表達的醯基輔酶A還原酶/醛脫氫酶的工程大腸桿菌質粒3，-80°C保存該菌株。
[0076]實施例5
[0077]I含有fadD/acr/dc基因工程大腸桿菌的構建
[0078]1.1含有acr/dc大腸桿菌感受態細胞的製作
[0079]將含有質粒3的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株按照1%。的接種量接種到LB液體試管培養基中，37°C，160rpm振蕩過夜，製作一級種子液。將此一級種子液按照1%的接種量接種到50mL LB液體培養基中(內含50 μ L氨苄青黴素)，37°C，160rpm振蕩培養約2.5h，當OD600約為0.5時，將菌液置於冰上冷卻30min。於4°C，以4000rpm,離心5min,收集菌體，並用預冷的10%的甘油重懸細胞，重複此過程4-5次，最後用預冷的ImLlO %的甘油重懸細胞，並於冰上分裝，便製得含有質粒3的大腸桿菌感受態細胞，_80°C保存該細胞。
[0080]1.2含有fadD/acr/dc基因工程大腸桿菌的構建
[0081]將構建好的含有醯基輔酶A合成酶基因fadD的重組載體質粒1，通過電轉化的方法，轉化到含有質粒3的大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，塗布帶有氨苄青黴素與氯黴素的雙重抗性LB瓊脂平板，37 °C過夜培養後，挑取陽性菌落，即獲得了含有fadD/acr/dc所表達的醯基輔酶A合成 酶/醯基輔酶A還原酶/醛脫氫酶的工程大腸桿菌質粒I/質粒3，_80°C保存該菌株。
[0082]實施例6
[0083]I烷烴的氣相色譜-質譜聯用檢測方法
[0084]對甲基叔丁醚所萃取的烷烴進行氣相色譜-質譜聯用檢測，氣相色譜-質譜條件如下:島津GCMS-QP2010，HP_5ms色譜柱，載氣:高純氦氣(99.999% )，進樣口溫度:280°C，載氣柱頭壓:100.2kPa，分流比10:1 ;程序升溫:起始60。。，維持4min ；5°C /min升溫至160°C ；80°C /min升溫至300°C，保持3min ;質譜運行時間:2.5_25min，掃描片段:80_800amuo
[0085]實施例7
[0086]外源性流加C14:0脂肪酸生產烷烴
[0087]I中鏈烷烴的合成
[0088]將工程大腸桿菌質粒I/質粒3按I %的接種量接種到50mL LB液體培養液中(內含50 μ L的氨苄青黴素與50 μ L的氯黴素)，37°C，160rpm振蕩培養約3h，當OD6tltl約為0.6時，在菌液中加入0.4mM誘導劑IPTG，同時外源性流加C14:0脂肪酸，至終濃度為培養液的1%。，繼續在30°C條件下振蕩培養48h，培養過程中每隔12h外源性流加葡萄糖至終濃度為培養液的1%。培養液在8000rpm條件下，離心10min，並在工作3s、間歇3s、工作70次的條件下進行細胞破碎。取含有烷烴的細胞破碎液保存，為後續檢測工作做準備。
[0089]2中鏈烷烴的提取
[0090]取1.5mL細胞破碎液,加入400 μ L甲基叔丁醚,在振蕩儀上振蕩lmin,並上下顛倒搖勻，充分進行萃取，SOOOrpm離心2min，分離並收集有機層。這樣即可獲得一定濃度的中鏈烷烴。[0091]3中鏈烷烴的氣質檢測
[0092]對甲基叔丁醚萃取的烷烴進行氣相色譜-質譜聯用檢測，氣相色譜條件如實施例6所示，結果見圖7。從最終氣相圖譜中可分析得出:質粒I/質粒3重組大腸桿菌所產生的C13/C15的烷烴產量為2.17mg/L。
[0093]實施例8
[0094]外源性流加C16:0脂肪酸生產烷烴
[0095]I中鏈烷烴的合成
[0096]將工程大腸桿菌質粒I/質粒3按I %的接種量接種到50mL LB液體培養液中(內含50 μ L的氨苄青黴素與50 μ L的氯黴素)，37°C，160rpm振蕩培養約3h，當0D600約為0.6時，在菌液中加入0.4mM誘導劑IPTG，同時外源性流加C16:0脂肪酸，至終濃度為培養液的1%。，繼續在30°C條件下振蕩培養48h，培養過程中每隔12h外源性流加葡萄糖至終濃度為培養液的1%。培養液在8000rpm條件下，離心10min，並在工作3s、間歇3s、工作70次的條件下進行細胞破碎。取含有烷烴的細胞破碎液保存，為後續檢測工作做準備。
[0097]2中鏈烷烴的提取
[0098]取1.5mL細胞破碎液,加入400 μ L甲基叔丁醚,在振蕩儀上振蕩lmin,並上下顛倒搖勻，充分進行萃取，SOOOrpm離心2min，分離並收集有機層。這樣即可獲得一定濃度的中鏈烷烴。
[0099]3中鏈烷烴的氣質檢測
[0100]對甲基叔丁醚萃取的烷烴進行氣相色譜-質譜聯用檢測，氣相色譜條件如實施例6所示，結果見圖8。從最終氣相圖譜中可分析得出:質粒I/質粒3重組大腸桿菌所產生的C13/C15的烷烴產量為1.81mg/L。
【權利要求】
1.一種中鏈烷烴的生產方法，其特徵在於，包括: 步驟1、首先將來自大腸桿菌K12菌株中的醯基輔酶A合成酶基因fadD克隆至原核表達載體，得到重組質粒1，經IPTG誘導，可以通過外源性流加C14:0/C16:0等中鏈脂肪酸的方式，催化脂肪酸生成代謝產物酯醯輔酶A。 步驟2、再將不動桿菌中的醯基輔酶A還原酶基因acr克隆至原核表達載體，得到重組質粒2，經IPTG誘導，可以催化細胞中積累的酯醯輔酶A還原為C14/C16的脂肪醛。 步驟3、最後將念珠藻中的醛脫羰基酶基因dc克隆至原核表達載體，得到重組質粒3，經IPTG誘導，可以催化脂肪醛脫去羰基，生成烷烴。 步驟4、將得到的重組質粒1/3共同轉至BL21 (DE3)中，經外源性流加C14:0/C16:0等中鏈脂肪酸與IPTG誘導表達後，可以生產中鏈烷烴。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的來自大腸桿菌中醯基輔酶A合成酶基因fadD的核酸序列如序列I所示，各自所編碼的胺基酸序列如序列2所示。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，將fadD基因克隆至雙啟動子表達載體pACY⑶uet-Ι，得到重組質粒pACY⑶uet-f adD，質粒I，其中醯基輔酶A合成酶基因置於T7promoterl下遊，由T7啟動子驅動表達。
4.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述的來自不動桿菌中醯基輔酶A還原酶基因acr的核酸序列如序列3所示，各自所編碼的胺基酸序列如序列4所示。
5.根據權利 要求1所述的方法，其特徵在於，所述acr基因克隆至雙啟動子表達載體pETDue t-1，得到重組質粒pETDue t-acr，質粒2，其中醯基輔酶A還原酶基因置於T7promoterl下遊，由T7啟動子驅動表達。
6.根據權利要求1所述方法，其特徵在於，所述的來自念珠藻中醛脫羰基酶基因dc的核酸序列如序列5所示，各自所編碼的胺基酸序列如序列6所示。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述dc基因克隆至雙啟動子表達載體pETDuet-acr,得到重組質粒pETDuet-acr-dc,質粒3,其中醒脫羰基酶基因置於T7promoterl下遊，由T7啟動子驅動表達。
8.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，已轉入重組質粒1/3的重組大腸桿菌，經添加0.4mM IPTG誘導醯基輔酶A合成酶、醯基輔酶A還原酶、醛脫氫酶表達後，可經外源性流加C14:0/C16:0等中鏈脂肪酸的方式，催化脂肪酸代謝生成C13/C15等碳鏈長度不等的中鏈烷烴。
【文檔編號】C12R1/01GK104004790SQ201410271433
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2013年12月23日
【發明者】劉珞, 顏紅, 王芳, 譚天偉, 鄧利 申請人:北京化工大學