淡紫紫孢菌及其協同生物質修復汙染水體重金屬的方法與流程

2023-11-09 19:28:17

本發明屬於環境微生物
技術領域：
，尤其涉及一株淡紫紫孢菌及其協同生物質修復汙染水體重金屬的方法。
背景技術：
：隨著人類社會工業經濟的發展和農業生化用品的增加，重金屬汙染的問題日漸尖銳，已經成為全球關注的重大環境問題之一。重金屬汙染會造成農田土壤肥力退化，農產品品質降低，而且加快環境水質惡化，並通過食物鏈，最終影響到人類健康。鎘是一種毒性很大的重金屬，其化合物也大都屬於毒性物質。鎘用途很廣，顏料、合金、電鍍、電池、冶金等都要用到鎘。隨著現代工農業生產的發展，「三廢」的排放、汙水灌溉及農藥、除草劑和化肥的使用越來越多，土壤和水體中鎘的含量顯著增加，植物和環境系統中的cd汙染問題日趨嚴峻，從而使農產品的安全性受到嚴重威脅。正是由於這樣一些原因，國際和國內對於重金屬汙染及其防治的研究已經成為環境、化學、生命科學等相交叉的重點和熱點研究領域，相關應用性研究側重於分析重金屬汙染的來源、防治措施和環境修復等方面。目前國內外治理重金屬汙染，主要採用離子交換、化學沉澱、溶劑提取等傳統的物理化學方法。由於需要複雜的設施設備以及破壞土層結構，物理化學修復法的投資成本較高，並且它們還會影響土壤或水體本生的母質性質甚至會破壞土壤或水體生物的多樣性，所以對於大面積受汙染的土壤或水體不宜使用。生物修復技術因其獨有的優勢逐漸被推到人們的關注範圍之內。生物修復是指一切以生物為主體來治理環境汙染的技術。它包括利用動物、植物和微生物吸收、轉化、降解土壤和水體中的汙染物，使環境中汙染物的濃度降低，或將汙染物轉化為其他無汙染物質，以及使汙染物穩定化，避免其向環境中擴散。在環境保護研究方面，微生物修復也成為很多研究者的興趣所在。針對微生物對重金屬抗性和富集的研究是利用微生物修復重金屬汙染的一個很好的途徑。cn103409346a公開了一種重金屬抗性果膠桿菌np22，其活化後可製備重金屬吸附劑，對重金屬鎘的最大吸附量可達到113mg/g；cn103952333b公開了一種具有鎘耐性的假單胞菌tcd-1，其對包括鎘、鉛和鎳的多種重金屬均具有耐性，在重金屬鎘汙染的溼潤土壤中添加該菌液，其能修復鎘對水稻生長的抑制作用。目前為止，大多數文獻公開的微生物修復重金屬汙染對象為土壤，對於重金屬汙染的水體環境的微生物修復研究較少；另外，對於利用淡紫紫胞菌在重金屬汙染水體中的修復作用至今未見報導。技術實現要素：鑑於現有技術中存在的問題，本發明的目的在於提供一種淡紫紫孢菌及其協同生物質修復汙染水體重金屬的方法。為達此目的，本發明採用以下技術方案：本發明提供了一株淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)，其保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13169，保藏日期為2016年10月27日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼為100101。本發明還提供了一種重金屬汙染水體修復劑，其包括如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)。本發明提供的重金屬汙染水體修復劑中，除了包括所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)外，還可以包括生物質。本發明中，將生物質與所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)共同培養於汙染水體中時，二者具有協同增效作用，其能夠由單獨使用淡紫紫孢菌實現接近35％的鎘去除效率提升到62％以上的鎘去除效率。本發明中對生物質不做特殊限定，本領域技術人員公知的生物質材料均可用於本發明，不過，優選的生物質是玉米秸稈與苜蓿乾草的混合物，二者的質量比優選為1:1，此配比下能使鎘的去除效率至少達到62％以上。本發明提供的重金屬汙染水體修復劑，其用於修復重金屬鎘。本發明還提供了如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)在修復汙染水體重金屬中的用途。本發明還提供了如上所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)協同生物質在修復汙染水體重金屬中的用途。本發明中，所述生物質優選秸稈粉，進一步優選玉米秸稈和苜蓿乾草的混合物，所述玉米秸稈和苜蓿乾草的質量比優選為1:1。通過將所述的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)協同生物質用於鎘汙染水體中，培養第5天時，鎘離子的去除率可達到62％以上。與現有技術方案相比，本發明至少具有以下有益效果：本發明提供的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)能夠降解重金屬汙染水體中的鎘離子，其協同生物質在溶液體系中培養5天時可使鎘離子的去除率達到62％以上。附圖說明圖1是本發明的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)對鎘離子模擬體系中可溶性鎘離子的去除效率；圖2是本發明的淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)協同生物質對鎘離子模擬體系中可溶性鎘離子的去除效率。下面對本發明進一步詳細說明。但下述的實例僅僅是本發明的簡易例子，並不代表或限制本發明的權利保護範圍，本發明的保護範圍以權利要求書為準。具體實施方式為便於理解本發明，本發明列舉實施例如下。本領域技術人員應該明了，所述實施例僅僅是幫助理解本發明，不應視為對本發明的具體限制。實施例1淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)的獲得和鑑定1、土樣來源土樣採自湖南省桂陽縣某廢棄礦。2、試劑與儀器2.1試劑氯化鎘(cdcl2·2.5h2o)、氯化鈉，分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；馬鈴薯浸粉、葡萄糖、蛋白腖，分析純，購自北京奧博星(aobox)生物技術有限責任公司。2.2儀器臺式冷凍恆溫搖床thz-c-1，蘇州培英實驗設備有限公司；臺式高速微量(冷凍型)離心機d3024r，美國賽洛捷克(scilogex)公司；石墨爐原子吸收儀aa-6800，日本shimadzu公司。3、方法3.1菌種的篩選3.1.1真菌培養基配方馬鈴薯葡萄糖液體培養基(pdb)：馬鈴薯浸粉5g，葡萄糖15g，蛋白腖10g，氯化鈉5g；將各組分溶於1升蒸餾水中滅菌備用；馬鈴薯葡萄糖固體培養基(pda)：馬鈴薯浸粉5g，葡萄糖15g，蛋白腖10g，氯化鈉5g，瓊脂粉6克；將各組分溶於1升蒸餾水中滅菌倒平板；3.1.2篩選方法(1)取10g土樣至90ml無菌水中，加入適量玻璃珠，30℃，180r/min振蕩培養20min，製成土壤懸液，取出後靜置；(2)取5ml土壤懸液上清加入到含2mmol/lcdcl2的pdb培養基中，同樣條件下分別振蕩培養24h和72h；(3)取3ml步驟(2)所得菌懸液於新鮮滅菌的含4mmol/lcdcl2的pdb培養基中，同樣條件下分別振蕩培養24h和72h；(4)取3ml步驟(3)所得菌懸液於新鮮滅菌的含10mmol/lcdcl2pdb培養基中，同樣條件下分別振蕩培養24h和72h；(5)將步驟(4)所得菌懸液梯度稀釋10倍、100倍和1000倍，分別塗布於含不同濃度cdcl2(4mmol/l、6mmol/l、8mmol/l、10mmol/l)的pda固體平板培養基上，並置於28℃的恆溫箱中倒置培養；(6)觀察平板上真菌菌落生長狀況，純化單菌落，轉接pda斜面培養基保藏。3.2菌種分子生物學鑑定(1)取出3.1.2保藏的真菌斜面，用接種環取0.5cm×0.5cm左右大小菌絲塊接入新鮮滅菌的pdb培養基(250ml錐形瓶盛裝50ml培養液)，於28℃、200r/min振蕩培養48h；(3)按照全式金dna提取試劑盒中的說明書操作，提取真菌總dna；(4)真菌dna按照表1-2的反應條件(引物見表1-1)擴增後送上海生物工程有限公司測序；(5)完成序列在ncbi資料庫比對鑑定，並通過mega6分析軟體建立菌種發育進化樹，最終確定菌種的分類地位。表1-1表1-2篩選目標真菌的its序列如下：tcccttgcagcagctgttctgccgctcgagcggtgcacaatgtgctctgattgcggcgattacccctccttgcacagtcaaaattttctgtgacttgtcgccagctttgtgtggggctcattaccccgccacgctgcacaggtgtctcatttgcccctcaacaccaaaaattcgcacggagcaccaacagcatgctgacgcgtgagataacaggaagccgccgagctcggcaagggttccttcaagtacgcgtgggtccttgacaagctcaaggccgagcgtgagcgtggtatcaccatcgacattgccctctggaagttcgagactcccaagtactatgtcaccgtcattggtacgtcgactcgcgcgagactggtcgcaatttccacgtcgctaacgtgcttgaacagacgctcccggccaccgtgacttcatcaagaacatgatcactggtacctcccaggctgactgcgctatcctcattatcgctgccggcactggtgagttcgaggctggtatctccaaggatggccagacccgtgagcacgctctgctcgcctacaccctcggtgttaagcagctcatcgtcgctatcaacaagatggacaccaccaagtggtctgaggcccgtttccaggagatcatcaaggagacctccaacttcatcaagaaggtcggctacaaccccaagaccgtcgctttcgtccccatctctggtttccacggcgacaacatgctttccccctccaccaactgcccctggtacaagggctgggagaaggagaccaaggctggcaagtccaccggcaagaccctccttgaggccatcgactccatcgagccccccaagcgccccagcgacaagcccctccgccttccccttcaggatgtgtacaagatcggcggtatcggcacagtccctgtcggccgtatcgagactggtgtcatcaagcccggcatggtcgtgaccttcgctccttccaacgtcaccaccgaagtcaagtccgttgagatgcaccacgagcagctctccgagggtgtccccggtgacaacgtcggcttcaacgtcaagaacgtctccgtcaaggagatccgtcgtggcaacgtcgccggtgactccaagaacgacccccctctgggtgccgcttctttcgatgcccaggtcatcgtcctcaaccaccccggccagg將測得的菌株序列通過blast程序與genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的its序列進行同源性比對分析，查找相同或相似的核苷酸序列，然後利用序列比對和系統發育分析軟體mega6.0構建系統進化樹。在mega軟體中，構建系統進化樹的方法使用neighbor-joining法，鹼基替代模型選擇kimura雙參數模型，進化樹可靠性檢驗選用自展檢驗(bootstrap)1000次重複檢測，dna序列變異中的轉換和顛換賦於相同的加權值。目標真菌經分析鑑定為淡紫紫胞菌(purpureocilliumlilacinum)。實施例2淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)對鎘的去除效率1.1試驗方法(1)菌種製備：取出保藏的菌種斜面，用接種環取0.5cm×0.5cm大小菌絲塊接入到含10mmol/lcd2+的50ml滅菌pdb液體培養基中，培養24小時；(2)4mmol/lcd2+溶液製備：稱取182.8mg的cdcl2·2.5h2o於250ml三角瓶中，加入100ml無菌水中，超聲中充分溶解；(3)含鎘廢水生物去除模擬體系構建：將培養24h的菌液按照千分之一的濃度加入4mmol/lcd2+水體中，於28℃、200r/min恆溫培養箱中振蕩培養。分別檢測1d、2d、3d、4d、5d時cd2+含量，每個時間點做三個重複，並設置不加菌液的空白對照；(4)水體中鎘離子待測樣製備：觀察水體中菌株生長狀態，於每個時間點取出對應的三個重複轉移至100ml離心管(離心管提前稱重)，10000r/min離心10min，上清液收集用於鎘離子的檢測。1.2去除效率的測定利用上述步驟1.1-(3)中製備的待測樣，測量五個時間點所對應水體的cd2+含量。測量儀器為石墨爐原子吸收儀aa-6800，結果取三個重複的平均值，分別以時間點和cd2+濃度為橫縱坐標繪製鎘離子濃度變化曲線，評價該菌株對cd2+的去除效果，其結果具體如表2和圖1所示。表2時間(day)對照(ppm)處理(ppm)去除率(％)14.05353.424315.5224.08553.076524.7034.07252.757532.2944.07052.743532.6054.08252.654234.99通過表2可以看出，利用鎘離子模擬體系，實施例1中得到的淡紫紫孢菌菌株在處理1天後，鎘離子濃度由原來的4.0535ppm變為3.4243ppm，去除率為15.52％，處理3天後，鎘離子濃度由4.0725ppm變為2.7575ppm，去除率為32.29％，處理5天後，鎘離子濃度由4.0825變為2.6542ppm，去除率達到34.99％，證明該淡紫紫孢菌菌株可以用於含鎘離子的廢水處理，並在5天內具有近35％以上的去除率。實施例3淡紫紫孢菌(purpureocilliumlilacinum)與生物質的鎘協同去除效率1.1試驗方法(1)菌種製備：取出保藏的菌種斜面，用接種環取0.5cm×0.5cm大小菌絲塊接入到含10mmol/lcd2+的50ml滅菌pdb液體培養基中，培養24小時；(2)4mmol/lcd2+溶液製備：稱取182.8mg的cdcl2·2.5h2o於250ml三角瓶中，加入100ml無菌水中，超聲中充分溶解；(3)含鎘廢水生物去除模擬體系構建：以cdcl2·2.5h2o配製4mmol/lcd2+溶液(無菌水)，將培養24小時的菌液按照千分之一的濃度加入4mmol/lcd2+水體中，同時按照反應體系質量比的5％加入秸稈粉(由玉米秸稈和苜蓿乾草按質量比1:1混合)，於28℃，200r/min振蕩培養。分別檢測1d、2d、3d、4d、5d時cd2+含量，每個時間點做三個重複，並設置不加菌液的空白對照；(4)水體中鎘離子待測樣製備：觀察水體中菌株生長狀態，於每個時間點取出對應的三個重複轉移至100ml離心管(離心管提前稱重)，10000r/min離心10min，上清液收集用於鎘離子的檢測。1.2去除效率的測定利用上述步驟1.1-(3)中製備的待測樣，測量五個時間點所對應水體的cd2+含量。測量儀器為石墨爐原子吸收儀aa-6800，結果取三個重複的平均值，分別以時間點和cd2+濃度為橫縱坐標繪製鎘離子濃度變化曲線，評價該菌株對cd2+的去除效果，其結果具體如表3和圖2所示。表3時間(day)對照(ppm)處理(ppm)去除率(％)14.05353.092423.7124.08552.968127.3534.07252.749332.4944.07051.861854.2654.08251.517162.84通過表3可以看出，利用重金屬模擬體系，實施例1中得到的淡紫紫孢菌菌株協同秸稈粉在處理1天後，鎘離子濃度由原來的4.0535ppm變為3.0924ppm，去除率為23.71％，處理3天後，鎘離子濃度由原來的4.0855ppm變為2.7493ppm，去除率為32.49％，處理5天後，鎘離子濃度由原來的4.0825ppm變為1.5171ppm，去除率達到62.84％。由上述結果還可以看出，對比實施例2單獨採用淡紫紫孢菌菌株的情況，該淡紫紫孢菌菌株與生物質協同作用可將鎘去除率提高至62％以上，說明其與生物質二者之間具有協同增效作用，可以獲得更好的鎘去除效果。申請人聲明，本發明通過上述實施例來說明本發明的詳細結構特徵，但本發明並不局限於上述詳細結構特徵，即不意味著本發明必須依賴上述詳細結構特徵才能實施。所屬
技術領域：
的技術人員應該明了，對本發明的任何改進，對本發明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發明的保護範圍和公開範圍之內。以上詳細描述了本發明的優選實施方式，但是，本發明並不限於上述實施方式中的具體細節，在本發明的技術構思範圍內，可以對本發明的技術方案進行多種簡單變型，這些簡單變型均屬於本發明的保護範圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術特徵，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進行組合，為了避免不必要的重複，本發明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發明的各種不同的實施方式之間也可以進行任意組合，只要其不違背本發明的思想，其同樣應當視為本發明所公開的內容。當前第1頁12