從發酵技術培養物中提取多粘菌素b、e的方法
2023-11-10 09:05:32 1
專利名稱：從發酵技術培養物中提取多粘菌素b、e的方法
技術領域：
本發明涉及一種從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法。
背景技術：
多粘菌素也稱硫酸粘菌素，英文通用名=Polymyxin BSulfate,分子式 C56H98N16O13H2SO4,分子量1301. 56。多粘菌素是1947年發現由多粘桿菌(Bacillus polymyxa)所產生，由多種胺基酸 和脂肪酸組成的一族鹼性多肽類抗生素的總稱，不同菌種所產生的多粘菌素，由於所含氨 基酸和脂肪酸的不同，又分為多粘菌素A、B、C、D、E、M。多粘菌素B (polymyxin B)又分為 Bl和B2，多粘菌素E (polymyxin E,colistin,)又分為El和E2，多粘菌素M又稱多勝菌素 甲，多粘菌素B和多粘菌素E 二者具有相似的藥理作用，應用較廣，多粘菌素B多用於人用 藥，多粘菌素E多用於獸用藥。本品為抗革蘭氏陰性桿菌的抗生素，對大多數的革蘭氏陰性桿菌有較強的抗菌 作用，對綠膿桿菌的作用更為顯著，對大腸桿菌、沙門氏菌、痢疾桿菌、流感桿菌、百日咳杆 菌、產氣桿菌及肺炎桿菌等也有良好的作用。多粘菌素對生長繁殖期和靜止期的細菌都有 效，其殺菌作用機制是改變細菌細胞的滲透性。多肽類抗生素具有表面活性，因其中含有 親脂性官能基團(帶陽電荷的游離氨基)，可引入脂蛋白，和細胞膜磷脂中的磷酸根結合， 使細菌合成的胞漿膜的成分發生改變，細胞膜表面積增大，破壞了原來胞漿膜的屏蔽功能， 使其通透性增加，導致細胞內成分大量外漏而死亡。細菌對本品不易產生耐藥性。口投消 化道不易吸收，排洩迅速，毒性小，無副作用，多粘菌素E是最安全的禽畜促生長抗生素之 一。同時多粘菌素B及其類似結構物被發現具有抗內毒素作用(CN1583245、CN1493368、 W02006/108586.W02006/112934)引起了廣泛關注。多粘菌素已通過由枯草芽孢桿菌經生物發酵產生，多粘菌素B的發酵單位一般可 以達到lg_2g/L。通過適當的抗生素提取技術就可以從多粘菌素髮酵液中分離純化出多粘 菌素。US2565057公布了通過活化活性炭的特徵吸附來獲得多肽類抗生素的方法。通過調 節PH值，酸性條件下吸附雜質，調節pH值中性條件下吸附產品，最後用丙酮解析。該提取 方法由於活性炭的吸附選擇性較差，造成收率損失，且成品含量較低。同時活性炭的大量使 用不利於工業擴大化生產。專利GB742589、GB782926、W02007/142611等都涉及到用樹脂提取分離多粘菌素 B、E的方法。專利GB742589、GB782926公布的方法為濾液用弱酸性陽離子樹脂吸附，通過 PH3-5水溶液來解析，繼續用陰離子樹脂或強酸性陽離子樹脂來純化。專利W02007/142611 涉及到用非離子聚苯乙烯樹脂來吸附濾液，用有機溶劑的水溶液來解析。由於多粘菌素類 抗生素髮酵單位較低，樹脂法生產存在工時過長、吸附收率難以提高等缺點，提高了該產品 的生產成本。專利GB9798887公布的方法為通過反應萃取到有機溶劑(如二辛脂、二壬酯)中， 達到分離富集的目的。此操作需在濾液pH7. 0條件下進行，此時產品的穩定性差，生產收率 較低，且由於運用到有機溶媒，增加了環保費用，對產品質量也有一定的影響。
專利CN1583245涉及到一種用泡沫分離的方法從多粘菌素E的發酵液中提取分離 的方法。該方法的使用局限性較大，對發酵液質量有較高的要求。同時勞動生產率較低，不 利於生產的連續操作。且泡沫分離機的使用也提高了產品的成本。
發明內容
本發明的目的是提供一種從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，以簡 便、高效從發酵液中提取多粘菌素B、E為特徵，解決了其它提取方法生產過程中勞動強度 高、工序長、提取收率低造成的生產成本較高的問題，是一種經濟、綠色環保的適於產業化 生產的提取方法。本發明的目的是以如下方式實現的本發明以通過工業上常用的微生物培養手段 培養可以生產多粘菌素B、E的芽孢桿菌的發酵液或發酵液經預處理後的產物為對象，經過 一定的工序及工藝條件後得到多粘菌素B、E成品。該方法包括發酵技術培養物直接鹼化； 固液分離收集菌渣；然後調節PH值至1. 0-6. 0使多粘菌素B、E從菌渣中溶解；然後通過納 濾濃縮去除無機鹽；然後噴幹得到成品。具體方法如下在0_25°C條件下將發酵技術培養物用鹼性物質調節pH值至10. 0-14. 0後攪拌 30分鐘；固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離鹼沉澱，固液分離採用一般抗生素提取 純化專業技術人員所能利用的固液分離方法，如板框過濾、重力離心、離心過濾、錯流過濾 等；將通過固液分離技術得到的游離鹼沉澱用酸性物質或溶液調節PH值至1.0-6.0，待多 粘菌素B、E游離鹼沉澱溶解後，選用任一種常規的固液分離方法，如離心過濾、抽濾、板框 過濾等將溶解液進行固液分離得到多粘菌素B、E鹽的濃縮液，為提高色澤度可以通過加入 0. 06-0. 1% (W/V)的高錳酸鉀攪拌30分鐘對得到的濃縮液進行脫色處理，然後經納濾去除 無機鹽，最後噴幹得到成品。多粘菌素B、E發酵技術培養物包括多粘菌素B、E發酵液、多粘菌素B、E發酵液通 過固液分離技術得到的上清液，優選多粘菌素B、E發酵液。鹼性物質為工業上常用的鹼性物質，包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水。固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離鹼沉澱以5-10倍游離鹼沉澱體積的無 鹽水洗滌2-4次後再加入酸性物質或溶液調節pH值。將發酵技術培養物用鹼性物質調節pH值優選12. 5-13. 5。將發酵技術培養物用鹼性物質調節pH值至10. 0-14. 0時的溫度優選5_15°C。酸性物質為工業上常用的酸性物質，包括硫酸、磷酸、草酸、鹽酸。用酸性物質調節溶液pH值優選3. 0-4. 5。本發明以簡便、高效從發酵液中提取多粘菌素B、E為特徵，解決了其它提取方法 生產過程中勞動強度高、工序長、提取收率低造成的生產成本較高的問題，具有不使用溶 媒、成本低、環保、收率高、對發酵液及設備的特性要求低的特點。
具體實施例方式實施例1多粘菌素B發酵液3.01^含量1.78/1。先將發酵液降溫至15°C ；再用4mol/L的 KOH溶液調節pH至12. 5後攪拌30分鐘並保持溫度15°C ；將鹼化的發酵液在3000轉速下
4離心15分鐘後，收集離心物，以60ml無鹽水洗滌兩次後，然後用1. Omol/L的HCL溶液調節 上清液PH至3. 0-4. 0使多粘菌素B沉澱溶解；抽濾溶解液，得到濃縮液加0. 08 %高錳酸鉀 攪拌30分鐘，抽濾所得脫色濃縮液，納濾處理，所得除鹽的濃縮液噴幹進風溫度120°C，出 風溫度80°C，得多粘菌素B鹽酸鹽4. 10克，含量80. 5%。實施例2多粘菌素B發酵液4.01^含量1.58/1。先將發酵液降溫至20°C ；再用4mol/L的 NaOH溶液調節PH至13. 5後攪拌30分鐘並保持溫度20°C ；將鹼化的發酵液在3000轉速下 離心20分鐘後，收集離心物，以75ml無鹽水洗滌兩次後，然後用1. Omol/L的H2SO4溶液調 節上清液PH至3. 0-4. 0使多粘菌素B沉澱溶解。抽濾溶解液，得到濃縮液加0. 07 %高錳酸 鉀攪拌30分鐘，抽濾所得脫色濃縮液，納濾處理得到除鹽的濃縮液，噴幹進風溫度120°C， 出風溫度75°C，得多粘菌素B硫酸鹽4. 76克，含量80. 0%。實施例3多粘菌素E發酵液3. OL含量5g/l。先將發酵液降溫至20°C ；再用4mol/L的NaOH 溶液調節pH至11. 0後保持溫度20°C攪拌30分鐘；將鹼化的發酵液在3000轉速下離心15 分鐘後，收集離心物，以100無鹽水洗滌三次後，然後用1. Omol/L的H2SO4溶液調節上清液 PH至3. 0-4. 0使多粘菌素E沉澱溶解；抽濾溶解液，得到濃縮液加0. 1 %高錳酸鉀攪拌30 分鐘，抽濾所得脫色濃縮液，納濾處理得到除鹽的濃縮液，噴幹進風溫度110°C，出風溫度 75°C，得多粘菌素E硫酸鹽13克，含量81.5%。
權利要求
一種從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，其特徵在於在025℃條件下將發酵技術培養物用鹼性物質調節pH值至10.0 14.0後攪拌30分鐘；固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離鹼沉澱；將通過固液分離技術得到的游離鹼沉澱用酸性物質或溶液調節pH值至1.0 6.0，待多粘菌素B、E游離鹼沉澱溶解後，經固液分離得到多粘菌素B、E鹽的濃縮液，經納濾去除無機鹽，最後噴幹得到成品。
2.根據權利要求1所述的從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，其特徵在於 多粘菌素B、E發酵技術培養物包括多粘菌素B、E發酵液、多粘菌素B、E發酵液通過固液分 離技術得到的上清液。
3.根據權利要求1所述的從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，其特徵在於 鹼性物質為工業上常用的鹼性物質，包括氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水。
4.根據權利要求1所述的從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，其特徵在於 固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離鹼沉澱以5-10倍游離鹼沉澱體積的無鹽水洗滌 2-4次後再加入酸性物質或溶液調節pH值。
5.根據權利要求1所述的從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，其特徵在於 將發酵技術培養物用鹼性物質調節PH值為12. 5-13. 5。
6.根據權利要求1所述的從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，其特徵在於 將發酵技術培養物用鹼性物質調節PH值至10. 0-14. 0時的溫度保持在5-15°C。
7.根據權利要求1所述的從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，其特徵在於 酸性物質為工業上常用的酸性物質，包括硫酸、磷酸、草酸、鹽酸。
8.根據權利要求1所述的從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，其特徵在於 用酸性物質調節溶液PH值為3. 0-4. 5。
全文摘要
一種從發酵技術培養物中提取多粘菌素B、E的方法，在0-25℃條件下將發酵技術培養物用鹼性物質調節pH值至10.0-14.0後攪拌30分鐘；固液分離收集菌渣得到多粘菌素B、E游離鹼沉澱；將通過固液分離技術得到的游離鹼沉澱用酸性物質或溶液調節pH值至1.0-6.0，待多粘菌素B、E游離鹼沉澱溶解後，經固液分離得到多粘菌素B、E鹽的濃縮液，經納濾去除無機鹽，最後噴幹得到成品。本發明以簡便、高效從發酵液中提取多粘菌素B、E為特徵，解決了其它提取方法生產過程中勞動強度高、工序長、提取收率低造成的生產成本較高的問題，具有不使用溶媒、成本低、環保、收率高、對發酵液及設備的特性要求低的特點。
文檔編號C07K1/14GK101974075SQ20101051667
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月12日 優先權日2010年10月12日
發明者於雪梅, 左良成, 常曉菲, 張利強 申請人:山東魯抗醫藥股份有限公司