AXMI‑205殺蟲基因和它的使用方法與流程

2023-11-10 12:49:02 7

AXMI-205殺蟲基因和它的使用方法對相關申請的交叉參考本申請要求在2009年7月2日提交的美國臨時申請系列號61/222,778的權益，所述臨時申請的內容完整併入本文作為參考。發明領域本發明涉及分子生物學領域。提供了編碼殺蟲蛋白的新基因。這些蛋白質和編碼它們的核酸序列可用於製備殺蟲製劑和生產轉基因抗蟲植物。發明背景DDT(二氯-二苯基-三氯乙烷)的引入和隨後向合成化學殺蟲劑濫用的發展導致水和食品來源的汙染、非靶標有益昆蟲的被毒害和昆蟲害蟲對化學殺蟲劑抗性的發展。在化學殺蟲劑的濫用對環境的不利影響上增加的公眾關注推動了尋找用於昆蟲害蟲控制的備選方法。一種有希望的備選方案已經是使用生物學控制劑。有Bt(蘇雲金芽孢桿菌，一種革蘭氏陽性土壤細菌)作為有效的生物殺蟲劑的安全應用的詳實記錄並且可得到δ-內毒素基因在農作物植物中表達的很多報告。Bt轉基因農作物只需要很少的殺蟲劑噴霧，這不僅節約成本和時間，還減少了健康風險。在一些情況下，昆蟲可以發展出對不同的殺蟲劑化合物的抗性，所述抗性增加了鑑定用於害蟲控制的備選生物學控制劑的需要。發明概述提供了賦予細菌、植物、植物細胞、組織和種子的殺蟲活性的組合物和方法。組合物包括編碼殺害蟲和殺昆蟲多肽序列的核酸分子、包含這些核酸分子的載體和包含該載體的宿主細胞。組合物也包括殺蟲多肽序列和這些多肽的抗體。所述核苷酸序列可用於DNA構建體或者表達盒中用於在生物包括微生物和植物中的轉化和表達。該核苷酸或者胺基酸序列可以是合成序列，其已經被設計用於在生物，包括但不限於微生物或植物中表達。組合物也包含轉化的細菌、植物、植物細胞、組織和種子。特別地，提供了編碼殺蟲蛋白的分離的或者重組的核酸分子。此外，包含了相應於殺蟲蛋白的胺基酸序列。特別地，本發明提供分離的核酸分子，其包含編碼在SEQIDNO：2，3，4，5，6，7或者8中顯示的胺基酸序列的核苷酸序列，或者在SEQIDNO：1，9，10或者11中給出的核苷酸序列以及它們的變體和片段。也包含與本發明的核苷酸序列互補的核苷酸序列或者與本發明的序列雜交的序列。提供了產生本發明的多肽和使用這些多肽來控制或者殺死鱗翅目害蟲、鞘翅目害蟲、線蟲或者雙翅目害蟲的方法。也包括檢測樣品中本發明的核酸和多肽的方法和試劑盒。本發明的組合物和方法在產生具有增強的害蟲抗性或者耐受性的生物中是有用的。這些生物和組合物包含期望用於農業目的的生物。本發明的組合物對於產生具有殺蟲活性的改變的或者改進的蛋白質，或者對於檢測產品或者生物中殺蟲蛋白或者核酸的存在也是有用的。附圖簡述圖1顯示了AXMI-205(SEQIDNO：2)與來自發光光杆狀菌(Photorhabdusluminescens)(SEQIDNO：14)和密執安棍狀桿菌(Clavibactermichiganensis)(SEQIDNO：15)的MACPF蛋白的比對。發明詳述本發明涉及在生物特別是植物或者植物細胞中調節害蟲抗性或者耐受性的組合物和方法。「抗性」意指害蟲(例如昆蟲)在攝食或者與本發明的多肽接觸時被殺死。「耐受性」意指害蟲的運動、進食、繁殖或者其他功能的損傷或者減弱。所述方法涉及用編碼本發明的殺蟲蛋白的核苷酸序列轉化生物。特別地，本發明的核苷酸序列可用於製備具有殺蟲活性的植物和微生物。因此，提供了轉化的細菌、植物、植物細胞、植物組織和種子。組合物是細菌種類的殺蟲核酸和蛋白質。所述序列可用於表達載體的構建中用於隨後轉化到目的生物中，作為探針用於分離其他同源的(或者部分同源的)基因，或者通過本領域已知的方法如結構域交換或者DNA改組用於產生改變的殺蟲蛋白。蛋白質可用於控制或者殺死鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和線蟲類害蟲種群並且用於產生具有殺蟲活性的組合物。「殺蟲毒性」或者「殺蟲蛋白」意指對一種或者多種害蟲具有毒性活性的毒素或者與此種蛋白質具有同源性的蛋白質，所述害蟲包括但不限於鱗翅目、雙翅目和鞘翅目或者線蟲綱的成員。已經從生物包括例如芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、雙酶梭菌(Clostridiumbifermentans)和波林芽孢桿菌(Paenibacilluspopilliae)中分離出殺蟲蛋白。殺蟲蛋白包括從本文公開的全長核苷酸序列推導的胺基酸序列和比全長序列更短的胺基酸序列，這是由於使用備選的下遊起始位點或者由於加工產生了較短的具有殺蟲活性的蛋白質。加工可以在表達該蛋白質的生物中發生或者在攝食該蛋白質後在害蟲中發生。因此，本文提供的是賦予殺蟲活性的新分離的或者重組的核苷酸序列。也提供了殺蟲蛋白的胺基酸序列。從該基因的翻譯得到的蛋白質允許細胞控制或者殺死攝食它的害蟲。分離的核酸分子以及它們的變體和片段本發明的一個方面涉及分離的或者重組的核酸分子，其包含編碼殺蟲蛋白和多肽或者它們的生物學活性部分的核苷酸序列以及足夠用作雜交探針的核酸分子，所述探針用於鑑定編碼具有序列同源性區域的蛋白質的核酸分子。此處使用的術語「核酸分子」意在包括DNA分子(例如重組DNA、cDNA或者基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸類似物產生的DNA或者RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或者雙鏈的，但優選地是雙鏈DNA。此處使用的「分離的」核酸序列(或者DNA)指的是不再處於它的天然環境中的核酸序列(或者DNA)，例如在體外或者在重組的細菌或者植物宿主細胞中。在一些實施方案中，「分離的」核酸不含在該核酸來源的生物基因組DNA中天然位於該核酸側翼(即位於該核酸的5』和3』末端的序列)的序列(優選地蛋白質編碼序列)。為本發明的目的，當使用「分離的」時指的是除了分離的染色體以外的核酸分子。例如，在多種實施方案中，編碼殺蟲蛋白的分離的核酸分子可以含有少於約5kb，4kb，3kb，2kb，1kb，0.5kb或者0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列在核酸來源的細胞的基因組DNA中天然地位於該核酸分子的側翼。基本上不含細胞物質的殺蟲蛋白包括蛋白質製劑，其具有少於約30％，20％，10％，或者5％(以乾重計)的非殺蟲蛋白(此處也指作「汙染蛋白質」)。編碼本發明的蛋白質的核苷酸序列包括在SEQIDNO：1，9，10或者11中給出的序列，和它們的變體、片段和互補序列。「互補序列」意指核苷酸序列，其與給定的核苷酸序列足夠互補以致它能與該給定的核苷酸序列雜交從而形成穩定的雙鏈體。在SEQIDNO：2，3或者4中給出了此種核苷酸序列編碼的殺蟲蛋白的相應的胺基酸序列。本發明也包含編碼殺蟲蛋白的這些核苷酸序列的片段的核酸分子。「片段」意指編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以編碼殺蟲蛋白的生物學活性部分，或者它可以是使用在下文公開的方法可用作雜交探針或者PCR引物的片段。編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少約50個，100個，200個，300個，400個，500個，600個，700個，800個，900個，1000個，1100個，1200個，1300個，1350個，1400個，1450個，1500個，1550個，1600個連續核苷酸，或者多達編碼本文公開的殺蟲蛋白的全長核苷酸序列中存在的核苷酸數目，所述核苷酸的數目取決於預期的用途。「連續的」意指彼此直接相鄰的核苷酸殘基。本發明的核苷酸序列的片段將編碼蛋白質片段，所述蛋白質片段保留殺蟲蛋白的生物學活性，並且因此保留殺蟲活性。「保留活性」意指預期該片段將具有殺蟲蛋白的至少約30％，至少約50％，至少約70％，80％，90％，95％或者更高的殺蟲活性。在一個實施方案中，殺蟲活性是殺鞘翅目的活性。在另一個實施方案中，殺蟲活性是殺鱗翅目的活性。在另一個實施方案中，殺蟲活性是殺線蟲的活性。在另一個實施方案中，殺蟲活性是殺雙翅目的活性。測定殺蟲活性的方法在本領域是眾所周知的。見，例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人，(1985)J.ofEconomicEntomology78：290-293；和美國專利號5,743,477，將它們全部完整併入本文作為參考。編碼殺蟲蛋白的核苷酸序列的片段，其編碼本發明的蛋白質的生物學活性部分，將編碼至少約15個，25個，30個，50個，75個，100個，125個，150個，175個，200個，250個，300個，350個，400個，450個，500個，550個或者600個連續的胺基酸，或者多達在本發明的全長殺蟲蛋白中存在的胺基酸總數目。在一些實施方案中，片段是相對於SEQIDNO：2，3或者4至少約1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個，11個，12個，13個，14個，15個，16個，17個，18個，19個，20個，25個或者更多胺基酸的N-末端或者C-末端截短。在一些實施方案中，本文包含的片段例如通過蛋白水解或者通過在編碼序列中插入終止密碼子，從C-末端除去1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個，11個，12個，13個，14個，15個，16個，17個，18個，19個，20個，25個或者更多的胺基酸得到。通過與SEQIDNO：1，9，10或者11的核苷酸序列具有足夠的同一性的核苷酸序列編碼本發明優選的殺蟲蛋白。「足夠的同一性」意指胺基酸或者核苷酸序列，使用本文描述的一種比對程序，使用標準參數與參考序列相比，所述胺基酸或者核苷酸序列具有至少約60％或者65％的序列同一性，約70％或者75％的序列同一性，約80％或85％的序列同一性，約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或者更高的序列同一性。本領域技術人員將認識到通過考慮密碼子的簡併性、胺基酸的相似性、可讀框的位置等等，可以合適地調整這些值來確定兩種核苷酸序列編碼的蛋白質的相應的同一性。為確定兩種胺基酸序列或者兩種核酸的百分比同一性，序列被比對以用於最優的比較目的。兩種序列之間的百分比同一性是序列共有的相同位置的數目的函數(即百分比同一性＝相同位置的數目/位置的總數目(例如，重疊位置)x100)。在一個實施方案中，兩種序列的長度相同。在另一個實施方案中，在參考序列的全長中進行比較(例如在SEQIDNO：1，9，10或者11中的一個的全長中進行，或者在SEQIDNO：2，3，4，5，6，7，或者8中的一個的全長中進行)。使用與下文描述的那些相似的技術，允許或不允許空位，可以確定兩種序列間的百分比同一性。在計算百分比同一性中，通常計數正確匹配。使用數學算法可以實現兩種序列之間的百分比同一性的確定。用於兩種序列比較的數學算法的一個非限制性實例是Karlin和Altschul在(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264中的算法，在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877中所述算法被修改。此種算法被整合進Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403中的BLASTN和BLASTX程序中。用BLASTN程序，評分＝100，字長＝12可以進行BLAST核苷酸搜索來得到與本發明的殺蟲樣的核酸分子同源的核苷酸序列。用BLASTX程序，評分＝50，字長＝3可以進行BLAST蛋白質搜索來得到與本發明的殺蟲蛋白分子同源的胺基酸序列。為得到用於比較目的的空位比對，可以使用如Altschul等人在(1997)NucleicAcidsRes.25：3389中描述的空位BLAST(在BLAST2.0中)。備選地，可以使用PSI-Blast來進行迭代搜索，其檢測分子間的遠源關係。見Altschul等人，(1997)同上。當使用BLAST，空位BLAST，和PSI-Blast程序時，可以使用各自程序的默認參數(如BLASTX和BLASTN)。也可以通過檢查人工進行比對。用於序列比較的數學算法的另一個非限制性實例是ClustalW算法(Higgins等人，(1994)NucleicAcidsRes.22：4673-4680)。ClustalW比較序列和比對整個胺基酸或者DNA序列，並且因此可以提供關於整個胺基酸序列的序列保守性的數據。ClustalW算法被用於一些商業上可得到的DNA/胺基酸分析軟體包中，如VectorNTI程序組(InvitrogenCorporation，Carlsbad，CA)的ALIGNX模塊中。在用ClustalW比對胺基酸序列後，可以評估百分比胺基酸同一性。用於ClustalW比對分析的軟體程序的非限制性的實例是GENEDOCTM。GENEDOCTM(KarlNicholas)允許評估多種蛋白質之間的胺基酸(或者DNA)相似性和同一性。用於序列比較的數學算法的另一個非限制性實例是Myers和Miller(1988)CABIOS4：11-17中的算法。將這種算法整合到ALIGN程序(版本2.0)中，所述ALIGN程序是GCGWisconsin遺傳學軟體包，版本10(從Accelrys，Inc.，9685ScrantonRd.，SanDiego，CA，美國得到)的一部分。當使用ALIGN程序比較胺基酸序列時，可以使用PAM120權重殘基表，12的空位長度罰分和4的空位罰分。除非指出相反，否則GAP版本10(其使用Needleman和Wunsch在(1970)J.Mol.Biol.48(3)：443-453中的算法)將用於確定序列的同一性或相似性，使用以下的參數：對於核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用50的空位權重和3的長度權重和nwsgapdna.cmp得分矩陣；對於胺基酸序列的％同一性和％相似性，使用8的空位權重和2的長度權重和BLOSUM62得分程序。也可以使用等同的程序。「等同的程序」意指任何序列比較程序，對於任一被考慮的兩種序列，當與GAP版本10產生的相應的比對比較時，產生具有相同的核苷酸殘基匹配和相同的百分比序列同一性的比對。本發明也包含變體核酸分子。編碼殺蟲蛋白的「變體」的核苷酸序列包括這些序列，其編碼本文公開的殺蟲蛋白但是因為遺傳密碼的簡併性而在保守性上不同以及這些上文討論的足夠同一的那些序列。使用公知的分子生物學技術，如下文概述的聚合酶鏈反應(PCR)和雜交技術可以鑑定天然存在的等位基因變體。變體核苷酸序列也包括合成來源的核苷酸序列，例如通過使用定點誘變已經產生所述核苷酸序列但是仍然編碼本發明公開的殺蟲蛋白，如下文討論。本發明包含的變體蛋白質有生物學活性，就是說它們仍然具有天然蛋白預期的生物學活性，即保留殺蟲活性。「保留活性」意指變體將具有至少約30％，至少約50％，至少約70％，或者至少約80％的天然蛋白的殺蟲活性。測定殺蟲活性的方法在本領域是眾所周知的。見，例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人，1985)J.ofEconomicEntomology78：290-293；和美國專利號5,743,477，將它們全部完整併入本文作為參考。技術人員將進一步理解可以通過本發明的核苷酸序列的突變引入改變，從而導致編碼的殺蟲蛋白的胺基酸序列的改變，而不改變蛋白質的生物學活性。因此，通過將一個或者多個核苷酸的取代、添加或者缺失引入到本文公開的相應的核苷酸序列中可以產生變體分離的核酸分子，以便將一個或者多個胺基酸取代、添加或者缺失引入到編碼的蛋白質中。通過標準技術如定點誘變和PCR-介導的誘變可以引入突變。本發明也包含這些變體核苷酸序列。例如，可以在一個或者多個預測的非必需的胺基酸殘基上進行保守的胺基酸取代。「非必需的」胺基酸殘基是可以從殺蟲蛋白的野生型序列改變而不會改變生物學活性的殘基，然而「必需的」胺基酸殘基是生物學活性需要的。「保守的胺基酸取代」是其中胺基酸殘基用具有相似側鏈的胺基酸殘基代替。在本領域已經確定了具有相似側鏈的胺基酸殘基家族。這些家族包括具有鹼性側鏈的胺基酸(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側鏈的胺基酸(例如天冬氨酸、穀氨酸)，具有不帶電的極性側鏈的胺基酸(例如甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側鏈的胺基酸(例如，丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，具有β-分枝的側鏈胺基酸(例如，蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和具有芳香側鏈的胺基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。可以在非保守區域進行保持功能的胺基酸取代。通常，對於保守的胺基酸殘基或者位於保守基序中的胺基酸殘基不進行此種取代，所述殘基對蛋白質的活性是必需的。保守的並且對蛋白質的活性是必需的殘基的實例包括，例如，在相似的或者相關的毒素與本發明的序列的比對中包含的全部蛋白質之間相同的殘基(例如在同源蛋白質的比對中相同的殘基)。保守的但可以允許保守胺基酸取代並且仍然保持活性的殘基的實例包括，例如在相似的或者相關的毒素與本發明的序列的比對中包含的全部蛋白質中只具有保守取代的殘基(例如在比對同源蛋白質中包含的全部蛋白質之間只具有保守取代的殘基)。然而，本領域的技術人員將理解功能變體在保守殘基中可以有微小的保守或非保守的改變。備選地，通過在全部或者部分編碼序列隨機引入突變，如通過飽和誘變可以製備變體核苷酸序列，並且可以篩選得到的突變體賦予殺蟲活性的能力來鑑定保持活性的突變體。在誘變後，可以重組表達編碼的蛋白質，並且可以使用標準測定技術測定蛋白質的活性。使用如PCR、雜交等方法可以鑑定相應的殺蟲序列，此種序列具有與本發明的序列基本的同一性。見，例如，Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning：ALaboratoryManual.(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)和Innis，等人，(1990)PCRProtocols：AGuidetoMethodsandApplications(AcademicPress，NY)。在雜交方法中，全部或者部分的殺蟲核苷酸序列可以用於篩選cDNA或者基因組文庫。構建這種cDNA或者基因組文庫的方法在本領域是公知的並且在Sambrook和Russell，2001，前文中公開了。所稱作的雜交探針可以是基因組DNA片段、cDNA片段、RNA片段或者其它的寡核苷酸，並且可以用可檢測基團如32P，或者任何其他的可檢測標記如其他的放射性同位素、螢光化合物、酶或者酶輔因子標記。可以通過基於本文公開的殺蟲蛋白編碼核苷酸序列標記合成的寡核苷酸製備用於雜交的探針。可以額外地使用基於核苷酸序列或者編碼的胺基酸序列中保守的核苷酸或者胺基酸殘基設計的簡併引物。探針通常包含核苷酸序列區，所述序列區在嚴格條件下與編碼本發明的殺蟲蛋白或者它們的片段或者變體的核苷酸序列的至少約12個，至少約25個，至少約50個，75個，100個，125個，150個，175個，或者200個連續核苷酸雜交。製備用於雜交的探針的方法在本領域是公知的並且在Sambrook和Russell，2001，上文中公開了，將其併入本文作為參考。例如，本文公開的完整殺蟲蛋白序列，或者它的一個或者多個部分可以用作能與相應的殺蟲蛋白樣序列和信使RNAs特異性雜交的探針。為實現在多種條件下特異性地雜交，此種探針包括獨特的並且優選地至少約10個核苷酸的長度或者至少約20個核苷酸的長度的序列。通過PCR可以將此種探針用於從選擇的生物中擴增相應的殺蟲序列。此種技術可以用於從期望的生物中分離其他的編碼序列或者作為診斷測定來確定生物中編碼序列的存在。雜交技術包括平板接種的DNA文庫(噬菌斑或者菌落，見例如Sambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)的雜交篩選。可以在嚴格條件下進行此類序列的雜交。「嚴格條件」或者「嚴格雜交條件」意指條件，在所述條件下探針將與它的靶序列雜交達到比與與其他的序列雜交可檢測的更高程度(例如，至少是背景的2倍)。嚴格條件是序列依賴的並且在不同的環境中將不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑑定出與探針100％互補的靶序列(同源探測)。備選地，可以調整嚴格條件來允許序列中的一定錯配以便檢測更低程度的相似性(異源探測)。通常，探針少於約1000個核苷酸的長度，優選地少於500個核苷酸的長度。通常，嚴格條件將是那樣的條件，在所述條件下鹽濃度低於約1.5MNa離子，通常是在pH7.0至8.3下約0.01至1.0MNa離子濃度(或者其他的鹽)，並且對於短探針(例如10至50個核苷酸)溫度至少是約30℃，對於長探針(例如多於50個核苷酸)溫度至少是約60℃。嚴格條件也可以通過添加去穩定劑如甲醯胺實現。示例性的低嚴格條件包括在37℃用30至35％的甲醯胺，1MNaCl，1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的緩衝液雜交，並且在50至55℃下用1X至2XSSC(20XSSC＝3.0MNaCl/0.3M檸檬酸鈉)洗滌。示例性的中等嚴格條件包括在37℃用40至45％的甲醯胺，1.0MNaCl，1％SDS雜交，並且在55至60℃用0.5X至1XSSC洗滌。示例性的高嚴格條件包括在37℃用50％的甲醯胺，1MNaCl，1％SDS雜交，並且在60至65℃用0.1XSSC洗滌。任選地，洗滌緩衝液可以包含約0.1％至約1％的SDS。雜交的持續時間一般少於約24小時，通常約4至約12小時。特異性通常是雜交後洗滌的函數，關鍵因子是離子強度和最終洗滌溶液的溫度。對於DNA-DNA雜合體，Tm可以從Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式近似得到：Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是單價陽離子的摩爾濃度，％GC是DNA中鳥嘌呤和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是雜交溶液中甲醯胺的百分比，並且L是鹼基對中雜合體的長度。Tm是(在確定的離子強度和pH下)50％的互補靶序列與完全匹配探針雜交的溫度。對於每1％的錯配，Tm降低約1℃；因此，可以調整Tm、雜交和/或洗滌條件來與期望同一性的序列雜交。例如，如果要尋找≥90％同一性的序列，可以將Tm降低10℃。一般，對於在確定的離子強度和pH下的特定序列和它的互補序列，選擇的嚴格條件比熱解鏈溫度(Tm)低約5℃。然而，重度嚴格條件可以利用比熱解鏈溫度(Tm)低1，2，3或者4℃下的雜交和/或洗滌；中度嚴格條件可以利用比熱解鏈溫度(Tm)低6，7，8，9或者10℃下的雜交和/或洗滌；低嚴格條件可以利用比熱解鏈溫度(Tm)低11，12，13，14，15或者20℃下的雜交和/或洗滌。使用該等式，雜交和洗滌組合物，以及期望的Tm，技術人員將理解雜交嚴格性和/或洗滌溶液的變化是固有描述的。如果錯配的期望程度導致少於45℃(水溶液)或者32℃(甲醯胺溶液)的Tm，優選地增加SSC的濃度以便可以使用更高的溫度。在Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes，PartI，Chapter2(Elsevier，NewYork)；和Ausubel等人，eds.(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology，Chapter2(GreenePublishing和Wiley-Interscience，NewYork).SeeSambrook等人，(1989)MolecularCloning：ALaboratoryManual(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork)中發現核酸雜交的廣泛指導。分離的蛋白質和它們的變體以及片段在本發明中也包含殺蟲蛋白。「殺蟲蛋白」意指具有在SEQIDNO：2，3或者4中給出的胺基酸序列的蛋白質。其片段、生物學活性部分和變體(如SEQIDNO：5，6，7和8)也被提供並且可用於實施本發明的方法。「分離的蛋白質」用於指不再處於它的天然環境中的蛋白質，例如在體外或者在重組的細菌或者植物宿主細胞中。「片段」或者「生物學活性部分」包括多肽片段，其包含與SEQIDNO：2，3或者4中給出的胺基酸序列具有足夠的同一性並且顯示殺蟲活性的胺基酸序列。殺蟲蛋白的生物學活性部分可以是例如10個，25個，50個，100個，150個，200個，250個或者更多個胺基酸長度的多肽。可以通過重組技術製備此類生物學活性部分並且評估其殺蟲活性。測定殺蟲活性的方法在本領域是眾所周知的。見，例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人，(1985)J.ofEconomicEntomology78：290-293；和美國專利號5,743,477，它們全部完整併入本文作為參考。此處使用的片段包含SEQIDNO：2，3或者4中的至少8個連續的胺基酸。然而，本發明包含其他的片段，如蛋白質中多於約10個，20個，30個，50個，100個，150個，200個，250個，300個，350個，400個，450個，500個，550個或者更多胺基酸的任一片段。在一些實施方案中，片段是相對於SEQIDNO：2，3或者4至少約1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個，11個，12個，13個，14個，15個，16個，17個，18個，19個，20個，25個或者更多胺基酸的N-末端或者C-末端截短(例如SEQIDNO：7或者8)。在一些實施方案中，本文包含的片段例如通過蛋白水解或者通過在編碼序列中插入終止密碼子除去C-末端1個，2個，3個，4個，5個，6個，7個，8個，9個，10個，11個，12個，13個，14個，15個，16個，17個，18個，19個，20個，25個或者更多胺基酸得到。「變體」意指蛋白質或者多肽，其具有與SEQIDNO：2，3，4，5，6，7或者8的胺基酸序列至少約60％，65％，約70％，75％，約80％，85％，約90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或者99％同一性的胺基酸序列。變體也包括核酸分子編碼的多肽，所述核酸分子在嚴格條件下與SEQIDNO：1，9，10或者11的核酸分子或者它們的互補序列雜交。變體包括由於誘變導致胺基酸序列不同的多肽。本發明包含的變體蛋白質是有生物學活性的，就是說它們持續具有天然蛋白期望的生物學活性，即保留殺蟲活性。在一些實施方案中，變體具有改進的活性。測定殺蟲活性的方法在本領域是眾所周知的。見，例如Czapla和Lang(1990)J.Econ.Entomol.83：2480-2485；Andrews等人，(1988)Biochem.J.252：199-206；Marrone等人，1985)J.ofEconomicEntomology78：290-293；和美國專利號5,743,477，它們全部完整併入本文作為參考。在一些實施方案中，變體蛋白質或者多肽在胺基酸位置上包含一個或者多個取代，所述胺基酸位置選自相對於SEQIDNO：2的307位，315位，317位，349位，351位，353位，355位，395位，399位，407位，419位，435位，443位，465位，467位，483位，487位，495位，497位，499位，509位和513位。在特定的實施方案中，取代是在所引用的位置上丙氨酸取代天然胺基酸。也包含編碼變體蛋白質或者多肽的核苷酸序列。細菌基因，如本發明的axmi基因，經常在接近可讀框的起始處具有多個甲硫氨酸起始密碼子。通常，在一個或者多個這些起始密碼子處的翻譯起始將導致功能蛋白質的產生。這些起始密碼子可以包括ATG密碼子。例如，SEQIDNO：3和4代表了SEQIDNO：1編碼的備選起始位點蛋白質。然而，細菌如芽孢桿菌屬也將密碼子GTG識別為起始密碼子，並且在GTG密碼子處起始翻譯的蛋白質在第一個胺基酸上含有甲硫氨酸。很少的情況下，細菌系統中的翻譯可以在TTG密碼子處起始，儘管在這種情況下TTG編碼甲硫氨酸。此外，通常不確定先驗(priori)，其中這些密碼子在細菌中天然地被使用。因此，理解使用一種備選的甲硫氨酸密碼子也可以導致殺蟲蛋白的產生。這些殺蟲蛋白被包含在本發明中並且可用於本發明的方法中。將理解，當在植物中表達時，為合適的翻譯將需要把備選的起始密碼子改變成ATG。也包含針對本發明多肽的抗體，或者它們的變體或者片段。產生抗體的方法在本領域是眾所周知的(見，例如Harlow和Lane(1988)Antibodies：ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarbor，NY；美國專利號4,196,265)。改變的或者改進的變體認識到通過多種方法可以改變殺蟲蛋白的DNA序列，並且這些改變可以導致DNA序列編碼與本發明的殺蟲蛋白的胺基酸序列不同的蛋白質。可以通過包括SEQIDNO：2，3或者4的一個或者多個胺基酸的胺基酸取代、缺失、截短和插入的多種方式改變這種蛋白質，包括多達約2，約3，約4，約5，約6，約7，約8，約9，約10，約15，約20，約25，約30，約35，約40，約45，約50，約55，約60，約65，約70，約75，約80，約85，約90，約100，約105，約110，約115，約120，約125，約130，約135，約140，約145，約150，約155或者更多的胺基酸取代、缺失或者插入。此類操作的方法在本領域是公知的。例如，可以通過DNA中的突變製備殺蟲蛋白的胺基酸序列的變體。這也可以通過誘變的幾種形式中的一種和/或定向進化完成。在一些方面，在胺基酸序列上編碼的改變將基本上不影響蛋白質的功能。這種變體將具有預期的殺蟲活性。然而，理解通過在本發明的組合物上使用這種技術可以改進殺蟲蛋白賦予殺蟲活性的能力。例如，可以在宿主細胞中表達殺蟲蛋白，所述宿主細胞在DNA複製時顯示高比率的鹼基錯誤摻入，如XL-1Red(Stratagene，LaJolla，CA)。在此種株系中增殖後，可以分離DNA(例如通過製備質粒DNA，或者通過PCR擴增並且將得到的PCR片段克隆到載體中)，在非誘變的株系中培養殺蟲蛋白突變，並且例如通過進行測試殺蟲活性的測定鑑定具有殺蟲活性的突變基因。一般，蛋白質被混合併用於餵食測定。見，例如Marrone等人，(1985)J.ofEconomicEntomology78：290-293。此種測定可以包括植物與一種或者多種害蟲接觸並且確定植物存活和/或引起害蟲死亡的能力。在Schnepf等人，(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62：775-806中發現了突變導致增加的毒性的實例。備選地，可以在許多蛋白質的蛋白質序列的氨基末端或者羧基末端進行改變而基本上不會影響活性。這可以包括通過現代分子方法如PCR引入的插入、缺失或者改變，所述PCR包括PCR擴增，由於在所述PCR擴增中在使用的寡核苷酸中包括胺基酸編碼序列，所述PCR擴增改變或者延伸蛋白質編碼序列。備選地，添加的蛋白質序列可以包括完整的蛋白質編碼序列，如在本領域常用的以產生蛋白質融合物的那些。這種融合蛋白常用於(1)增加目的蛋白質的表達(2)引入方便蛋白質的純化、蛋白質的檢測或者本領域已知的其他實驗用途的結合結構域、酶促活性或者表位(3)蛋白質向亞細胞細胞器中的靶向分泌或者翻譯，所述細胞器如革蘭氏陰性細菌的周質空間，或者真核細胞的內質網，後者常導致蛋白質的糖基化。本發明的變體核苷酸和胺基酸序列也包含從誘變和重組基因方法如DNA改組得到的序列。通過這種方法，一個或者多個不同的殺蟲蛋白編碼區可用於產生具有期望性質的新的殺蟲蛋白。以此種方式，從相關序列多核苷酸群體中產生重組多核苷酸文庫，所述相關序列多核苷酸包含具有基本上序列同一性的序列區域並且可以在體外和體內被同源重組。例如，使用這種方法，可以在本發明的殺蟲基因和其他已知的殺蟲基因之間改組編碼目的結構域的序列基序來得到新基因，所述新基因編碼具有改進的目的性質如增加的殺蟲活性的蛋白質。本領域已知這種DNA改組策略。見，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri等人，(1997)NatureBiotech.15：436-438；Moore等人，(1997)J.Mol.Biol.272：336-347；Zhang等人，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri等人，(1998)Nature391：288-291；和美國專利號5,605,793及5,837,458。結構域交換或者改組是用於產生改變的殺蟲蛋白的另一個機制。可以在殺蟲蛋白之間交換結構域來得到具有改進的殺蟲活性或者靶標譜的雜合或者嵌合毒素。產生重組蛋白質和測試它們的殺蟲活性的方法在本領域是眾所周知的(見，例如，Naimov等人，(2001)Appl.Environ.Microbiol.67：5328-5330；deMaagd等人，(1996)Appl.Environ.Microbiol.62：1537-1543；Ge等人，(1991)J.Biol.Chem.266：17954-17958；Schnepf等人，(1990)J.Biol.Chem.265：20923-20930；Rang等人，91999)Appl.Environ.Microbiol.65：2918-2925)。載體可以在用於目的植物中表達的表達盒中提供本發明的殺蟲序列。「植物表達盒」意指能在植物細胞中導致從可讀框中表達蛋白質的DNA構建體。通常這些包含增強子和編碼序列。通常，此類構建體也將包含3』非翻譯區。這種構建體也包含方便肽的共翻譯或者翻譯後轉運至某些細胞內結構如葉綠體(或其他質體)，內質網或高爾基體的「信號序列」或者「前導序列」。「信號序列」意指已知或者懷疑導致共翻譯或者翻譯後肽的跨細胞膜轉運的序列。在真核細胞中，這種信號序列通常涉及向高爾基體中的分泌，一些導致糖基化。細菌的殺蟲毒素通常合成為前毒素，所述前毒素在靶害蟲的腸中被蛋白水解激活(Chang(1987)MethodsEnzymol.153：507-516)。在本發明的一些實施方案中，信號序列位於天然序列中或者可以來源於本發明的序列。「前導序列」意指任何序列，當其被翻譯時，導致足夠引發肽鏈的共同翻譯轉運至亞細胞細胞器的胺基酸序列。因此，這包括通過進入內質網，進入液泡，質體包括葉綠體，線粒體等等的前導序列靶向轉運和/或糖基化。「植物轉化載體」意指DNA分子，其對於植物細胞的有效轉化是必需的。這種分子可以由一個或者多個植物表達盒組成，並且可以被組裝成超過一種「載體」DNA分子。例如，二元載體是植物轉化載體，其利用兩種非連續的DNA載體來編碼植物細胞轉化需要的全部順式和反式-作用功能(Hellens和Mullineaux(2000)TrendsinPlantScience5：446-451)。「載體」指的是為在不同的宿主細胞之間轉移設計的核酸構建體。「表達載體」指的具有在外來細胞中摻入、整合或者表達異源DNA序列或者片段的能力的載體。該盒將包括與本發明的序列有效連接的5′和3′調節序列。「有效連接」意指啟動子和第二序列間的功能連接，其中啟動子序列起始和介導相應於第二序列的DNA序列的轉錄。通常，有效連接指的是被連接的核酸序列是連續的，並且必要時連接兩種蛋白質編碼區，是連續並且在相同的可讀框中。另外，所述盒可以額外包含待共轉化至生物中的至少一個額外的基因。備選地，可以在多種表達盒上提供額外的基因。「啟動子」指的是發揮指導下遊編碼序列轉錄的功能的核酸序列。啟動子以及其他的轉錄以及翻譯調節核酸序列(也稱作「控制序列」)一起對於目的DNA序列的表達是必需的。這種表達盒提供了使殺蟲序列的插入處於調節區域的轉錄調節下的多種限制酶切位點。表達盒將包括5′至3′方向的轉錄、轉錄和翻譯起始區(即啟動子)、本發明的DNA序列、在植物中有功能的翻譯和轉錄終止區(即終止區)。對於植物宿主和/或本發明的DNA序列，啟動子可以是天然的或者類似的、外源的或者異源的。此外，啟動子可以是天然序列或者備選地是合成序列。在啟動子對於植物宿主是「天然的」或者「同源的」情況下，預期在引入啟動子的天然植物中發現該啟動子。在對於本發明的DNA序列，啟動子是「外源的」或者「異源的」情況下，預期對於本發明的有效連接的DNA序列，啟動子不是天然或者天然存在的啟動子。終止區可以與轉錄起始區是天然的、可以與有效連接的目的DNA序列是天然的、可以與植物宿主是天然的、或者可以從其他的來源得到(即對於啟動子、目的DNA序列、植物宿主或者它們的任何組合是外源的或者異源的)。方便的終止區可從根癌農桿菌的Ti-質粒如章魚鹼合酶和胭脂氨酸合酶終止區得到。也見Guerineau等人，(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell64：671-674；Sanfacon等人，(1991)GenesDev.5：141-149；Mogen等人，(1990)PlantCell2：1261-1272；Munroe等人，(1990)Gene91：151-158；Ballas等人，(1989)NucleicAcidsRes.17：7891-7903；和Joshi等人，(1987)NucleicAcidRes.15：9627-9639。適當時，基因可以被優化以增加在轉化的宿主細胞中的表達。就是說，可以使用宿主細胞優選的密碼子合成基因來提高表達，或者以宿主優選的密碼子選擇頻率使用密碼子合成基因。通常，基因的GC含量將增加。對於宿主優選的密碼子選擇的討論，見，例如Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.92：1-11。合成植物優選的基因的方法在本領域是可得到的。見，例如，美國專利號5,380,831，和5,436,391，和Murray等人(1989)NucleicAcidsRes.17：477-498，將其併入本文作為參考。在一個實施方案中，將殺蟲蛋白靶向葉綠體中表達。在這種方式中，其中殺蟲蛋白不是直接插入到葉綠體中，表達盒將另外含有編碼將殺蟲蛋白導向葉綠體中的轉運肽的核酸。這種轉運肽在本領域是已知的。見，例如VonHeijne等人，(1991)PlantMol.Biol.Rep.9：104-126；Clark等人，(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa等人，(1987)PlantPhysiol.84：965-968；Romer等人，(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421；和Shah等人，(1986)Science233：478-481。為在葉綠體中表達可以優化靶向葉綠體的殺蟲基因以解決在植物細胞核和這種細胞器之間密碼子選擇的不同。這樣，可以使用葉綠體優選的密碼子合成目的核酸。見，例如，美國專利號5,380,831，其併入本文作為參考。植物轉化本發明的方法涉及將核苷酸構建體引入到植物中。「引入」意指對植物以這樣的方式呈遞核苷酸構建體，使得構建體進入植物細胞的內部。本發明的方法不需要將核苷酸構建體引入植物的特定的方法，只要核苷酸構建體進入至少一個植物細胞的內部。將核苷酸構建體引入植物的方法在本領域是已知的，其包括但不限於，穩定轉化方法、瞬時轉化方法、和病毒介導的方法。「植物」意指整株植物、植物器官(如，葉、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚及其後代。植物細胞可以是分化或者未分化的(如愈傷組織、懸浮培養細胞、原生質體、葉細胞、根細胞、韌皮部細胞、花粉)。「轉基因植物」或「轉化植物」或「穩定轉化的」植物或者細胞或者組織，是指已經將外源的核酸序列或DNA片段摻入或者整合到植物細胞中的植物。這些核酸序列包括外源的，或者在未轉化的植物細胞中不存在的那些，以及可能是內源的，或者在未轉化的植物細胞中存在的那些。「異源的」通常指的是核酸序列，其對於它們存在的細胞或者天然基因組的部分不是內源的，並且已經通過感染、轉染、顯微注射、電穿孔、顯微投射等等被添加到細胞中。本發明的轉基因植物表達本文公開的一種或者多種殺蟲序列。在多種實施方案中，轉基因植物進一步包含用於昆蟲抗性的一種或者多種額外的基因，例如用於控制鞘翅目，鱗翅目，異翅目或線蟲害蟲的一種或者多種額外的基因。本領域的技術人員將理解轉基因植物可以包含賦予目的農學性狀的任何基因。植物細胞的轉化可以通過本領域已知的幾種技術中的一種完成。可以修飾本發明的殺蟲基因來得到或者增強在植物細胞中的表達。通常表達此種蛋白質的構建體將含有驅動基因轉錄的啟動子以及允許轉錄終止和多聚腺苷化作用的3』非翻譯區。這種構建體的組織在本領域是眾所周知的。在一些情況下，改造基因是有用的，以便得到的肽是分泌的或者被靶向至植物細胞中。例如，可以改造基因使其含有信號肽來促進肽轉移到內質網中。改造植物表達盒使其含有內含子以便表達需要內含子的mRNA加工也是優選的。通常這種「植物轉化盒」將被插入到「植物表達載體」中。這種植物轉化載體可以包含實現植物轉化需要的一種或者多種DNA載體。例如，在本領域使用包含超過一種連續的DNA片段的植物轉化載體是常規的實踐。在本領域這些載體通常被稱作「二元載體」。二元載體以及具有輔助質粒的載體通常被用於農桿菌介導的轉化，其中實現有效轉化需要的DNA區段的大小和複雜性是相當大的，並且將功能分開到不同的DNA分子上是有利的。二元載體通常含有包含T-DNA轉移需要的順式作用序列(如左邊界和右邊界)的質粒載體，被改造的以便能在植物細胞中表達的選擇標記，和「目的基因」(被改造的能在植物細胞中表達的基因，希望從所述植物細胞產生轉基因植物)。在這種質粒載體上也存在細菌複製需要的序列。順式作用序列以允許有效地轉移進植物細胞並在其中表達的方式排列。例如，選擇標記基因和殺蟲基因位於左邊界和右邊界之間。通常第二質粒載體含有介導T-DNA從農桿菌轉移至植物細胞的反式作用因子。這種質粒通常含有允許農桿菌感染植物細胞的毒性功能(Vir基因)、和通過在邊界序列的切割介導的DNA轉移以及vir介導的DNA轉移，如在本領域是理解的(Hellens和Mullineaux(2000)TrendsinPlantScience5：446-451)。幾種類型的農桿菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105，等等)可用於植物轉化。第二質粒載體對於通過其他方法如顯微投射、顯微注射、電穿孔、聚乙二醇等轉化植物不是必需的。通常，植物轉化方法涉及將異源的DNA轉移至靶植物細胞中(如未成熟或成熟的胚、懸浮培養物、未分化的愈傷組織、原生質體等)，隨後通過應用合適選擇的最大閾值水平(取決於選擇標記基因)來從一組未轉化的細胞團中回收轉化的植物細胞。外植體通常被轉移到新鮮供應的相同培養基中並且進行常規培養。隨後，轉化細胞在被接種到補充了最大閾值水平的選擇試劑的再生培養基後分化成苗。然後，將苗轉移到選擇性生根培養基來回收生根的苗或者小植株。然後轉基因小植株長成成熟的植物並且產生能育的種子(例如Hiei等人，(1994)ThePlantJournal6：271-282；Ishida等人，(1996)NatureBiotechnology14：745-750)。外植體通常被轉移到新鮮供應的相同培養基中並且進行常規培養。在Ayres和Park(1994)CriticalReviewsinPlantScience13：219-239和Bommineni和Jauhar(1997)Maydica42：107-120中發現了產生轉基因植物的技術和方法的一般描述。因為轉化的材料含有許多細胞；轉化和未轉化的細胞存在於任一塊受試愈傷組織或組織或細胞組中。殺死未轉化細胞並且允許轉化細胞增殖的能力導致轉化的植物培養物。通常，除去未轉化細胞的能力是對轉化的植物細胞的快速回收和轉基因植物的成功產生的限制。轉化方案以及將核苷酸序列引入到植物中的方案可能不同，所述方案取決於轉化靶向的植物或者植物細胞的類型，即單子葉植物或雙子葉植物。轉基因植物的產生可以通過幾種方法中的一種進行，所述方法包括但不限於顯微注射、電穿孔、直接基因轉移、通過農桿菌將異源DNA引入植物細胞中(農桿菌介導的轉化)、用附著到顆粒上的異源外來DNA轟擊植物細胞、射彈顆粒加速器、氣溶膠束轉化(美國公開的申請號20010026941；美國專利號4,945,050；國際公開號WO91/00915；美國公開的申請號2002015066)，Lec1轉化以及用於轉移DNA的多種其他的非顆粒直接介導的方法。葉綠體的轉化方法在本領域是已知的。見，例如Svab等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：8526-8530；Svab和Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：913-917；Svab和Maliga(1993)EMBOJ.12：601-606。該方法依賴於含有選擇標記的DNA的顆粒槍遞送和通過同源重組將DNA靶向質體基因組。此外，質體轉化可以通過核編碼的和質體定向的RNA聚合酶的組織優選的表達導致的沉默質體攜帶的的轉基因的反式激活實現。在McBride等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305中已經報告了這種系統。在異源外來DNA整合進入植物細胞後，可以在培養基中應用最大閾值水平的合適選擇來殺死未轉化的細胞並且通過定期轉移至新鮮培養基中分離和增殖在該選擇處理中存活的推定的轉化細胞。通過連續的傳代和用適合的選擇攻擊，鑑定和增殖了用質粒載體轉化的細胞。然後分子和生物化學方法可以用於證實被整合的異源目的基因在轉基因植物的基因組中的存在。已經被轉化的細胞可以根據常規方式長成植物。見，例如McCormick等人，(1986)PlantCellReports5：81-84。然後這些植物可以生長，並且用相同轉化的株系或者不同的株系對其傳粉，得到的雜種具有所鑑定的期望表型特徵的組成型表達。可以生長兩代或者多代來確保期望表型特徵的表達是穩定維持的並且是遺傳的，然後收穫種子來確保已經實現期望表型特徵的表達。以這種方式，本發明提供轉化的種子(也被稱作「轉基因種子」)，其具有本發明的核苷酸構建體，例如被穩定摻入到它們的基因組中的本發明的表達盒。植物轉化的評估將異源外來DNA引入到植物細胞中後，通過多種方法如核酸、與整合基因相關的蛋白質和代謝物的分析證實異源基因在植物基因組中的轉化或者整合。PCR分析是在移植到土壤之前的較早的階段篩選轉化細胞、組織或者苗中摻入基因的存在的快速方法(Sambrook和Russell(2001)MolecularCloning：ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY)。使用目的基因或者農桿菌載體背景等特異的寡核苷酸引物進行PCR。通過基因組DNA的DNA印跡分析可以證實植物轉化(Sambrook和Russell，2001，上文)。通常，從轉化體中提取總DNA，用合適的限制性酶消化，在瓊脂糖凝膠中分級分離並轉移到硝酸纖維素或尼龍膜上。然後，根據標準技術(Sambrook和Russell，2001，上文)例如用放射性標記的32P靶DNA片段探測膜或者「印跡」來證實引入的基因整合到植物基因組中。在RNA印跡分析中，根據本領域常規使用的標準方法(Sambrook和Russell，2001，上文)從轉化體的特定組織中分離RNA，在甲醛瓊脂糖凝膠中分級分離，並且印跡到尼龍濾膜上。然後使用本領域已知的方法(Sambrook和Russell，2001，上文)，通過濾膜與來源於殺蟲基因的放射性探針的雜交測試殺蟲基因編碼的RNA的表達。可以使用與殺蟲蛋白上存在的一個或者多個表位結合的抗體，通過標準方法(Sambrook和Russell，2001，上文)對轉基因植物進行蛋白質印跡、生化測定等等來證實殺蟲基因編碼的蛋白質的存在。植物中的殺蟲活性在本發明的另一方面，可以產生表達具有殺蟲活性的殺蟲蛋白的轉基因植物。上文描述的方法例如可以用於產生轉基因植物，然而其中轉基因植物細胞產生的方式對於本發明不是關鍵的。按照實驗者的自行決定可以使用本領域已知或者描述的方法，如農桿菌介導的轉化、生物射彈轉化和非顆粒介導的方法。通過本領域描述的常用方法，例如通過愈傷組織的轉化、轉化的愈傷組織的選擇以及從此種轉基因愈傷組織中再生可育植物可以分離表達殺蟲蛋白的植物。在這種方法中，可以使用任何基因作為選擇標記，只要它在植物細胞中的表達賦予鑑定或者選擇轉化細胞的能力。已經開發了在植物細胞中使用的很多標記，如對氯黴素，氨基糖苷G418，潮黴素等等的抗性。編碼葉綠體代謝中涉及的產物的其他基因也可以用作選擇標記。例如，提供對植物除草劑如草甘膦，溴苯腈，或咪唑啉酮等抗性的基因可以發現特定的用途。已經報告了此類基因(Stalker等人，(1985)J.Biol.Chem.263：6310-6314(溴苯腈抗性腈水解酶基因)；和Sathasivan等人，(1990)Nucl.AcidsRes.18：2188(AHAS咪唑啉酮抗性基因)。此外，本文公開的基因了用作評估細菌或者植物細胞的轉化的標記。在植物、植物器官(如葉、莖、根等)、種子、植物細胞、繁殖體、胚或其後代中檢測轉基因存在的方法在本領域是眾所周知的。在一個實施方案中，通過測試殺蟲活性檢測轉基因的存在。可測試表達殺蟲蛋白的可育植物的殺蟲活性，並且所述植物顯示為進一步育種選擇的最優活性。測定殺蟲活性的方法在本領域是可得到的。通常，混合蛋白質並且用於攝食測定。見，例如Marrone等人，(1985)J.ofEconomicEntomology78：290-293。本發明可以用於任何植物種類的轉化，其包括但不限於單子葉植物和雙子葉植物。目的植物的實例包括但不限於玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥和油菜、芸苔(Brassicasp.)、紫花苜蓿、黑麥、粟、紅花、花生、紅薯、木薯、咖啡、椰子、菠蘿、柑桔樹、可可、茶、香蕉、鱷梨、無花果、番石榴、芒果、橄欖、番木瓜、腰果、澳洲堅果、杏仁、燕麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。蔬菜包括但不限於西紅柿、萵苣、四季豆、利馬豆、豌豆和Curcumis屬成員，如黃瓜、哈密瓜、甜瓜。觀賞植物包括但不限於杜鵑花、繡球花、木槿、玫瑰、鬱金香、水仙花、牽牛花、康乃馨、一品紅和菊花。優選地，本發明的植物是農作物(例如玉米、高粱、小麥、向日葵、番茄、十字花科植物、辣椒、馬鈴薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、菸草、大麥、油菜等等)。在殺蟲控制中的用途使用包含本發明的核苷酸序列或者其變體的菌株作為殺蟲劑來控制殺蟲或者來改造其他的生物的一般方法在本領域是已知的。見，例如美國專利號5,039,523和EP0480762A2。含有本發明的核苷酸序列或者其變體的芽孢桿菌菌株，或者已經被基因改造而含有殺蟲基因和蛋白質的微生物可以用於保護農作物和產品免於害蟲的損害。在本發明的一個方面，當產生毒素(殺蟲劑)生物的完整的，即未裂解的細胞被應用於靶害蟲的環境中時，用延長所述細胞中產生的毒素的活性的試劑處理該細胞。備選地，通過將殺蟲基因引入到細胞宿主中產生殺蟲劑。殺蟲基因的表達直接或者間接導致殺蟲劑在細胞內的產生和維持。在本發明的一個方面，當將這些細胞應用於靶害蟲的環境中時，在延長所述細胞中產生的毒素活性的條件下處理該細胞。得到的產品保留毒素的毒性。然後可以根據常規技術配製這些天然的經封裝的殺蟲劑用於應用到容納靶害蟲的環境中，如土壤，水和植物的葉子。見，例如EPA0192319，和其中引用的參考文獻。備選地，可以配製表達本發明基因的細胞以便允許得到的物質作為殺蟲劑應用。殺蟲組合物通常以組合物的形式應用本發明的活性成分並且可以與其他的化合物一起同時或者連續地應用於農作物區域或者待處理的植物中。這些化合物可以是化肥、除草劑、抗凍劑、表面活性劑、去垢劑、殺蟲肥皂、休眠噴灑油、聚合物、和/或緩釋或可生物降解的載體製劑，在所述製劑的單次應用後允許靶區域的長期給藥。它們也可以是選擇性除草劑、化學殺蟲劑、殺病毒劑、殺微生物劑、殺變形蟲劑、殺蟲劑、殺真菌劑、殺細菌劑、殺線蟲劑、殺軟體動物劑或者這些製劑的一些的混合物，如果期望，與其他的農業上可接受的載體、製劑領域通常使用的表面活性劑或應用促進佐劑一起使用。適合的載體和佐劑可以是固體或者液體並且對應於製劑技術中通常使用的物質，如天然或者可再生的礦物質、溶劑、分散劑、潤溼劑、增粘劑、粘合劑或肥料。同樣，可以將製劑製備成可食用的「誘餌」或者做成害蟲的「陷阱」來允許被殺蟲製劑的靶害蟲取食或者攝食。應用本發明的活性成分或者本發明的農用化學品組合物的方法包括葉應用，種子包衣和土壤應用，所述農用化學品組合物含有本發明的細菌菌株產生的至少一種殺蟲蛋白。應用的次數和應用的速率取決於相應的害蟲侵襲的強度。可以將組合物製備成粉劑、粉塵劑、彈丸劑、粒劑、噴霧劑、乳劑、膠體劑、溶液劑劑等等，並且可以通過常規方法製備，所述方法如對包含多肽的細胞培養物的乾燥、冷凍乾燥、勻漿、提取、過濾、離心、沉降、或濃縮。在含有至少一種此類殺蟲多肽的全部這種組合物中，多肽可以以按重量計約1％至約99％的濃度存在。通過本發明的方法，可以在給定區域內殺死鱗翅目、雙翅目、異翅目、線蟲或鞘翅目害蟲或者減少這些害蟲的數目，或者可以預防性地應用到環境領域來防止敏感害蟲的侵襲。優選地，害蟲攝食或者接觸殺蟲有效量的多肽。「殺蟲有效量」意指能引起至少一種害蟲死亡或者能顯著地減慢害蟲的生長、攝食或正常的生理髮育的殺蟲劑的量。這種量將取決於這些因素而變，所述因素為例如待控制的特定的靶害蟲、特定的環境、位置、植物、農作物、或待處理的農業位置、環境條件、以及殺蟲有效多肽組合物應用的方法、比率、濃度、穩定性和數量。製劑可以根據氣候條件，環境考慮，和/或應用的頻率和/或害蟲侵襲的嚴重性而不同。可以通過用期望的農業上可接受的載體配製細菌細胞、晶體和/或孢子懸浮液或者分離的蛋白質組分來製備所描述的殺蟲組合物。可以在施用之前以一種適合的方式配製組合物，所述方式如凍幹、冷凍乾燥、乾燥、或在含水的載體、介質或合適的稀釋劑，如生理鹽水或其他緩衝液中。經配製的組合物可以是粉塵或者顆粒物質，或者油(植物油或者礦物油)中的混懸劑，或者水或者油/水乳劑，或者可溼性粉劑，或者與適合農業應用的任何其他的載體物質組合的形式。適合的農業載體可以是固體的或者液體的，並且在本領域是已知的。術語「農業上可接受的載體」覆蓋在殺蟲製劑技術中通常使用的全部佐劑、惰性組分、分散劑、表面活性劑、增粘劑、粘合劑等；這些對於殺蟲製劑領域的技術人員是眾所周知的。使用常規的製劑技術通過多種方法可以將製劑與一種或者多種固體或者液體佐劑混合併且製備，所述方法為例如通過將殺蟲劑組合物和適合的佐劑均勻混合，摻和和/或研磨。在美國專利號6,468,523中描述了適合的製劑和應用方法，將所述專利併入本文作為參考。也可以用一種或者多種化學組合物，包括一種或者多種除草劑，殺蟲劑或殺真菌劑處理植物。示例性的化學組合物包括：水果/蔬菜除草劑：莠去津(Atrazine)、除草定(Bromacil)、敵草隆(Diuron)、草甘膦(Glyphosate)、利谷隆(Linuron)、嗪草酮(Metribuzin)、西瑪津(Simazine)、氟樂靈(Trifluralin)、吡氟禾草靈(Fluazifop)、草銨膦(Glufosinate)、氯吡嘧磺隆(HalosulfuronGowan)、百草枯(Paraquat)、炔草胺(Propyzamide)、稀禾定(Sethoxydim)、氟丙嘧草酯(Butafenacil)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron)、Indaziflam；水果/蔬菜殺蟲劑：涕滅威(Aldicarb)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillusthuriengiensis)、甲萘威(Carbaryl)、克百威(Carbofuran)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(deltamethrin)、地亞農(Diazinon)、馬拉硫磷(Malathion)、阿維菌素(Abamectin)、氟氯氰菊酯/β-氟氯氰菊酯(Cyfluthrin/Beta-Cyfluthrin)、順式氰戊菊酯(Esfenvalerate)、高三氟氯氰菊酯(Lambda-cyhalothrin)、滅蟎醌(Acequinocyl)、聯苯肼酯(Bifenazate)、甲氧蟲醯肼(Methoxyfenozide)、雙苯氟脲(Novaluron)、環蟲醯肼(Chromafenozide)、噻蟲啉(Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinotefuran)、嘧蟎酯(fluacrypyrim)、唑蟲醯胺(Tolfenpyrad)、可尼丁(Clothianidin)、螺蟎酯(spirodiclofen)、γ-氯氟氰菊酯(gama-cyhalothrin)、螺甲蟎酯(spiromesifen)、艾克敵(spinosad)、氯蟲苯甲醯胺(Rynaxypyr)、溴氰蟲醯胺(Cyazypyr)、乙基多殺菌素(Spinoteram)、殺鈴脲(Triflumuron)、螺蟲乙酯(Spirotetramat)、吡蟲啉(Imidacloprid)、氟蟲雙醯胺(Flubendiamide)、硫雙威(Thiodicarb)、氰氟蟲腙(Metaflumizone)、氟啶蟲胺腈(Sulfoxaflor)、丁氟蟎酯(Cyflumetofen)、Cyanopyrafen、吡蟲啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、Spinotoram、硫雙威(Thiodicarb)、氟啶蟲醯胺(Flonicamid)、甲硫威(Methiocarb)、氨基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin-benzoate)、二唑蟲(Indoxacarb)、Fozthiazate、苯線磷(Fenamiphos)、硫線磷(Cadusaphos)、吡丙醚(Pyriproxifen)、苯丁錫(Fenbutatin-oxid)、噻蟎酮(Hexthiazox)、滅多威(Methomyl)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮；水果/蔬菜殺真菌劑：多菌靈(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、EBDC、硫、甲基硫菌靈(Tbiophanate-methyl)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、霜脲氰(Cymoxanil)、氟啶胺(Fluazinam)、福賽得(Fosetyl)、異菌脲(Iprodione)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、甲霜靈/精甲霜靈(Metalaxyl/mefenoxam)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、噻唑菌胺(Ethaboxam)、丙森鋅(Iprovalicarb)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、環醯菌胺(Fenhexamid)、延胡索酸咪唑(Oxpoconazolefumarate)、氰霜唑(Cyazofamid)、咪唑菌酮(Fenamidone)、苯醯菌胺(Zoxamide)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、環氟菌胺(Cyflufenamid)、啶醯菌胺(Boscalid)；穀類植物除草劑：異丙隆(Isoproturon)、溴苯腈(Bromoxynil)、碘苯腈(Ioxynil)、苯氧基類(Phenoxies)、氯磺隆(Chlorsulfuron)、炔草酸(Clodinafop)、禾草靈酸(Diclofop)、吡氟草胺(Diflufenican)、唑禾草靈(Fenoxaprop)、雙氟磺草胺(Florasulam)、氟草煙(Fluroxypyr)、甲磺隆(Metsulfuron)、醚苯磺隆(Triasulfuron)、氟酮磺隆(Flucarbazone)、碘甲磺隆(Iodosulfuron)、丙苯磺隆(Propoxycarbazone)、氟吡醯草胺(Picolinafen)、甲磺胺磺隆(Mesosulfuron)、氟丁醯草胺(Beflubutamid)、唑啉草酯(Pinoxaden)、醯嘧磺隆(Amidosulfuron)、噻磺隆(Thifensulfuron)、苯磺隆(Tribenuron)、氟啶嘧磺隆(Flupyrsulfuron)、磺醯磺隆(Sulfosulfuron)、Pyrasulfotole、甲氧磺草胺(Pyroxsulam)、氟噻草胺(Flufenacet)、肟草酮(Tralkoxydim)、Pyroxasulfon；穀類植物殺真菌劑：多菌靈(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、環丙唑醇(Cyproconazole)、嘧菌環胺(Cyprodinil)、丁苯嗎啉(Fenpropimorph)、氟環唑(Epoxiconazole)、醚菌酯(Kresoxim-methyl)、苯氧喹啉(Quinoxyfen)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、矽氟唑(Simeconazole)、啶氧菌酯(Picoxystrobin)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、醚菌胺(Dimoxystrobin)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、氟嘧菌酯(Fluoxastrobin)；穀類植物殺蟲劑：樂果(Dimethoate)、三氟氯氰菊酯(Lambda-cyhalthrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、α-氯氰菊酯(alpha-Cypermethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、聯苯菊酯(Bifenthrin)、吡蟲啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、啶蟲脒(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、Clorphyriphos、甲胺磷(Metamidophos)、乙醯甲胺磷(Oxidemethon-methyl)、抗蚜威(Pirimicarb)、甲硫威(Methiocarb)；玉米除草劑：莠去津(Atrazine)、甲草胺(Alachlor)、溴苯腈(Bromoxynil)、乙草胺(Acetochlor)、麥草畏(Dicamba)、二氯吡啶酸(Clopyralid)、二甲吩草胺(S-)Dimethenamid)、草銨膦(Glufosinate)、草甘膦(Glyphosate)、異唑草酮(Isoxaflutole)、精異丙甲草胺(S-Metolachlor)、甲基磺草酮(Mesotrione)、煙嘧磺隆(Nicosulfuron)、氟嘧磺隆(Primisulfuron)、玉嘧磺隆(Rimsulfuron)、磺草酮(Sulcotrione)、甲醯胺磺隆(Foramsulfuron)、苯吡唑草酮(Topramezone)、Tembotrione、苯嘧磺草胺(Saflufenacil)、酮脲磺草吩(Thiencarbazone)、氟噻草胺(Flufenacet)、Pyroxasulfon；玉米殺蟲劑：克百威(Carbofuran)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、聯苯菊酯(Bifenthrin)、氟蟲腈(Fipronil)、吡蟲啉(Imidacloprid)、高三氟氯氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、七氟菊酯(Tefluthrin)、特丁硫磷(Terbufos)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、可尼丁(Clothianidin)、螺甲蟎酯(spiromesifen)、氟蟲雙醯胺(Flubendiamide)、殺鈴脲(Triflumuron)、氯蟲苯甲醯胺(Rynaxypyr)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、硫雙威(Thiodicarb)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、聯苯菊酯(Bifenthrin)、蝨蟎脲(Lufenuron)、殺蟲隆(Triflumoron)、七氟菊酯(Tefluthrin)、丁基嘧啶磷(Tebupirimphos)、乙蟲腈(Ethiprole)、溴氰蟲醯胺(Cyazypyr)、噻蟲啉(Thiacloprid)、啶蟲脒(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、阿維菌素(Avermectin)、甲硫威(Methiocarb)、螺蟎酯(spirodiclofen)、螺蟲乙酯(Spirotetramat)；玉米殺真菌劑：種衣酯(Fenitropan)、福美雙(Thiram)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)；稻除草劑：丁草胺(Butachlor)、敵稗(Propanil)、四唑嘧磺隆(Azimsulfuron)、苄嘧磺隆(Bensulfuron)、氰氟草酯(Cyhalofop)、殺草隆(Daimuron)、四唑醯草胺(Fentrazamide)、咪唑磺隆(Imazosulfuron)、苯噻草胺(Mefenacet)、嗪草酮(Oxaziclomefone)、吡嘧磺隆(Pyrazosulfuron)、稗草畏(Pyributicarb)、二氯喹啉酸(Quinclorac)、禾草丹(Thiobencarb)、茚草酮(Indanofan)、氟噻草胺(Flufenacet)、四唑醯草胺(Fentrazamide)、氯吡嘧磺隆(Halosulfuron)、嗪草酮(Oxaziclomefone)、雙環磺草酮(Benzobicyclon)、環酯草醚(Pyriftalid)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、雙草醚(Bispyribac)、丙炔草酮(Oxadiargyl)、乙氧磺隆(Ethoxysulfuron)、丙草胺(Pretilachlor)、甲基磺草酮(Mesotrione)、Tefuryltrione、草酮(Oxadiazone)、唑禾草靈(Fenoxaprop)、Pyrimisulfan；稻殺蟲劑：地亞農(Diazinon)、殺螟硫磷(Fenitrothion)、仲丁威(Fenobucarb)、久效磷(Monocrotophos)、丙硫克百威(Benfuracarb)、噻嗪酮(Buprofezin)、呋蟲胺(Dinotefuran)、氟蟲腈(Fipronil)、吡蟲啉(Imidacloprid)、異丙威(Isoprocarb)、噻蟲啉(Thiacloprid)、環蟲醯肼(Chromafenozide)、噻蟲啉(Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinotefuran)、可尼丁(Clothianidin)、乙蟲腈(Ethiprole)、氟蟲雙醯胺(Flubendiamide)、氯蟲苯甲醯胺(Rynaxypyr)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、啶蟲脒(Acetamiprid)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、溴氰蟲醯胺(Cyazypyr)、艾克敵(spinosad)、Spinotoram、氨基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin-benzoate)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、毒死蜱(Chlorpyriphos)、殺螟丹(Cartap)、對甲胺磷(Methamidophos)、醚菊酯(Etofenprox)、三唑磷(Triazophos)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、克百威(Carbofuran)、丙硫克百威(Benfuracarb；稻殺真菌劑：甲基硫菌靈(Thiophanate-methyl)、嘧菌酯(Azoxystrobin)、環丙醯亞胺(Carpropamid)、敵瘟磷(Edifenphos)、嘧菌腙(Ferimzone)、異稻瘟淨(Iprobenfos)、稻瘟靈(Isoprothiolane)、戊菌隆(Pencycuron)、烯丙苯噻唑(probenazole)、咯喹酮(Pyroquilon)、三環唑(Tricyclazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、雙氯氰菌胺(Diclocymet)、稻瘟醯胺(Fenoxanil)、矽氟唑(Simeconazole)、噻醯菌胺(Tiadinil)；棉花除草劑：敵草隆(Diuron)、伏草隆(Fluometuron)、MSMA、乙氧氟草醚(Oxyfluorfen)、撲草淨(Prometryn)、氟樂靈(Trifluralin)、唑草酮(Carfentrazone)、烯草酮(Clethodim)、精吡氟禾草靈(Fluazifop-butyl)、草甘膦(Glyphosate)、氟草敏(Norflurazon)、二甲戊(Pendimethalin)、嘧草硫醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟啶磺隆(Trifloxysulfuron)、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草銨膦(Glufosinate)、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、噻苯隆(Thidiazuron)；棉花殺蟲劑：乙醯甲胺磷(Acephate)、涕滅威(Aldicarb)、毒死蜱(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、馬拉硫磷(Malathion)、久效磷(Monocrotophos)、阿維菌素(Abamectin)、啶蟲脒(Acetamiprid)、甲胺基阿維菌素苯甲酸鹽(EmamectinBenzoate)、吡蟲啉(Imidacloprid)、二唑蟲(Indoxacarb)、高三氟氯氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、艾克敵(spinosad)、硫雙威(Thiodicarb)、γ-氯氟氰菊酯、螺甲蟎酯(spiromesifen)、啶蟲丙醚(Pyridalyl)、氟啶蟲醯胺(Flonicamid)、氟蟲雙醯胺(Flubendiamide)、殺鈴脲(Triflumuron)、氯蟲苯甲醯胺(Rynaxypyr)、Beta-Cyfluthrin、螺蟲乙酯(Spirotetramat)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、氟蟲雙醯胺(Flubendiamide)、溴氰蟲醯胺(Cyazypyr)、艾克敵(spinosad)、Spinotoram、γ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、硫雙威(Thiodicarb)、阿維菌素(Avermectin)、氟啶蟲醯胺(Flonicamid)、啶蟲丙醚(Pyridalyl)、螺甲蟎酯(spiromesifen)、氟啶蟲胺腈(Sulfoxaflor)、丙溴磷(Profenophos)、三唑磷(Thriazophos)、硫丹(Endosulfan)；棉花殺真菌劑：土菌靈(Etridiazole)、甲霜靈(Metalaxyl)、五氯硝基苯(Quintozene)；大豆除草劑：甲草胺(Alachlor)、滅草松(Bentazone)、氟樂靈(Trifluralin)、氯嘧磺隆(Chlorimuron-Ethyl)、氯酯磺草胺(Cloransulam-Methyl)、唑禾草靈(Fenoxaprop)、氟磺胺草醚(Fomesafen)、吡氟禾草靈(Fluazifop)、草甘膦(Glyphosate)、甲氧咪草煙(Imazamox)、咪唑喹啉酸(Imazaquin)、咪唑乙煙酸(Imazethapyr)、精異丙甲草胺(S-)Metolachlor)、嗪草酮(Metribuzin)、二甲戊(Pendimethalin)、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草銨膦(Glufosinate)；大豆殺蟲劑：高三氟氯氰菊酯(Lambda-Cyhalothrin)、滅多威(Methomyl)、對硫磷(Parathion)、硫雙威(Thiocarb)、吡蟲啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、啶蟲脒(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、氟蟲雙醯胺(Flubendiamide)、氯蟲苯甲醯胺(Rynaxypyr)、溴氰蟲醯胺(Cyazypyr)、艾克敵(spinosad)、Spinotoram、氨基阿維菌素苯甲酸鹽(Emamectin-benzoate)、氟蟲腈(Fipronil)、乙蟲腈(Ethiprole)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、γ和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、螺蟲乙酯(Spirotetramat)、Spinodiclofen、殺鈴脲(Triflumuron)、氟啶蟲醯胺(Flonicamid)、硫雙威(Thiodicarb)、高效氟氯氰菊酯(Beta-Cyfluthrin)；大豆殺真菌劑：嘧菌酯(Azoxystrobin)、環丙唑醇(Cyproconazole)、氟環唑(Epoxiconazole)、粉唑醇(Flutriafol)、吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、戊唑醇(Tebuconazole)、肟菌酯(Trifloxystrobin)、丙硫菌唑(Prothioconazole)、四氟醚唑(Tetraconazole)；甜菜除草劑：氯草敏(Chloridazon)、雙苯胺靈(Desmedipham)、乙氧呋草黃(Ethofumesate)、甲雙苯胺靈(Phenmedipham)、野麥畏(Triallate)、二氯吡啶酸(Clopyralid)、吡氟禾草靈(Fluazifop)、環草定(Lenacil)、苯嗪草酮(Metamitron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、噻草酮(Cycloxydim)、氟胺磺隆(Triflusulfuron)、吡喃草酮(Tepraloxydim)、喹禾靈(Quizalofop)；甜菜殺蟲劑：吡蟲啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、噻蟲啉(Thiacloprid)、啶蟲脒(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、γ/λ氯氟氰菊酯、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮、七氟菊酯(Tefluthrin)、氯蟲苯甲醯胺(Rynaxypyr)、Cyaxypyr、氟蟲腈(Fipronil)、克百威(Carbofuran)；卡諾拉油菜除草劑：二氯吡啶酸(Clopyralid)、禾草靈酸(Diclofop)、吡氟禾草靈(Fluazifop)、草銨膦(Glufosinate)、草甘膦(Glyphosate)、吡唑草胺(Metazachlor)、氟樂靈(Trifluralin)、胺苯磺隆(EthaMetsulfuron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、喹禾靈(Quizalofop)、烯草酮(Clethodim)、吡喃草酮(Tepraloxydim)；卡諾拉油菜殺真菌劑：嘧菌酯(Azoxystrobin)、多菌靈(Carbendazim)、咯菌腈(Fludioxonil)、異菌脲(Iprodione)、咪鮮胺(Prochloraz)、乙烯菌核利(Vinclozolin)；卡諾拉油菜殺蟲劑：克百威(Carbofuran)、有機磷農藥類、擬除蟲菊酯類、噻蟲啉(Thiacloprid)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、吡蟲啉(Imidacloprid)、可尼丁(Clothianidin)、噻蟲嗪(Thiamethoxam)、啶蟲脒(Acetamiprid)、呋蟲胺(Dinetofuran)、β-氟氯氰菊酯(β-Cyfluthrin)、γ和λ氯氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯(Fluvaleriate)、乙蟲腈(Ethiprole)、艾克敵(spinosad)、Spinotoram、氟蟲雙醯胺(Flubendiamide)、氯蟲苯甲醯胺(Rynaxypyr)、溴氰蟲醯胺(Cyazypyr)、4-[[(6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)-酮。「害蟲」包括但是不限於昆蟲、真菌、細菌、線蟲、蟎、蜱等。昆蟲害蟲包括選自鞘翅目(Coleoptera)、雙翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(Lepidoptera)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、纓翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Isoptera)、蝨目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特別地選自鞘翅目、鱗翅目和雙翅目的昆蟲。鞘翅目包括肉食亞目(Adephaga)和多食亞目(Polyphaga)。肉食亞目包括步甲總科(Caraboidea)和豉甲總科(Gyrinoidea)、而多食亞目包括水龜甲總科(Hydrophiloidea)、隱翅甲總科(Staphylinoidea)、花螢總科(Cantharoidea)、郭公甲總科(Cleroidea)、叩甲總科(Elateroidea)、花甲總科(Dascilloidea)、泥甲總科(Dryopoidea)、丸甲總科(Byrrhoidea)、扁甲總科(Cucujoidea)、芫菁總科(Meloidea)、花蚤總科(Mordelloidea)、擬步甲總科(Tenebrionoidea)、長蠹總科(Bostrichoidea)、金龜總科(Scarabaeoidea)、天牛總科(Cerambycoidea)、葉甲總科(Chrysomeloidea)和象甲總科(Curculionoidea)。步甲總科包括虎甲科(Cicindelidae)、步甲科(Carabidae)和龍蝨科(Dytiscidae)。豉甲總科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龜甲總科包括水龜甲科(Hydrophilidae)。隱翅甲總科包括葬甲科(Silphidae)和隱翅甲科(Staphylinidae)。花螢總科包括花螢科(Cantharidae)和螢科(Lampyridae)。郭公甲總科包括郭公甲科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩甲總科包括叩甲科(Elateridae)和吉丁甲科(Buprestidae)。扁甲總科包括瓢甲科(Coccinellidae)。芫菁總科包括芫箐科(Meloidae)。擬步甲總科包括擬步甲科(Tenebrionidae)。金龜總科包括黑蜣科(Passalidae)和金龜科(Scarabaeidae)。天牛總科包括天牛科(Cerambycidae)。葉甲總科包括葉甲科(Chrysomelidae)。象甲總科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)。雙翅目包括亞目長角亞目(Nematocera)、短角亞目(Brachycera)和環裂亞目(Cyclorrhapha)。長角亞目(Nematocera)包括大蚊科(Tipulidae)、毛蠓科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、蠓科(Ceratopogonidae)、搖蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和癭蚊科(Cecidomyiidae)。短角亞目包括水虻科(Stratiomyidae)、虻科(Tabanidae)、劍虻科((THerevidae)、食蟲虻科(Asilidae)、擬蜂虻科(Mydidae)、蜂虻科(Bombyliidae)和長足虻科(Dolichopodidae)。環裂亞目(Cyclorrhapha)包括無縫組(Aschiza)和有縫組。無縫組包括科蚤蠅科(Phoridae)、食蚜蠅科(Syrphidae)和眼蠅科(Conopidae)。有縫組包括無瓣類(Acalyptratae)和有瓣類(Calyptratae)。無瓣類包括斑蠅科(Otitidae)、實蠅科(Tephritidae)、潛蠅科(Agromyzidae)和果蠅科(Drosophilidae)。有瓣類包括科蝨蠅科(Hippoboscidae)、狂蠅科(Oestridae)、寄蠅科(Tachinidae)、花蠅科(Anthomyiidae)、蠅科(Muscidae)、麗蠅科(Calliphoridae)和麻蠅科(Sarcophagidae)。鱗翅目包括鳳蝶科(Papilionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛺蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、大蠶蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、燈蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidaee)。對於主要作物的本發明昆蟲害蟲包括：玉米：玉米螟(Ostrinianubilalis)、歐洲玉米鑽心蟲(Europeancornborer)；小地老虎(Agrotisipsilon)、黑地蠶(blackcutworm)；谷實夜蛾(Helicoverpazea)、美洲棉鈴蟲(cornearworm)；草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、秋夜蛾(fallarmyworm)；西南玉米杆草螟(Diatraeagrandiosella)、西南玉米鑽心蟲(southwesterncornborer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)、小玉米莖鑽心蟲(lessercornstalkborer)；小蔗螟(Diatraeasaccharalis)、甘蔗鑽心蟲(surgarcaneborer)；玉米根葉甲(Diabroticavirgifera)、西方玉米根蟲(westerncornrootworm)；長角葉甲barberi亞種(Diabroticalongicornisbarberi)、北方玉米根蟲(northerncornrootworm)；黃瓜十一星葉甲食根亞種(Diabroticaundecimpunctatahowardi)、南方玉米根蟲(southerncornrootworm)；紋路叩甲屬(Melanotusspp.)、鐵線蟲(wireworms)；圓頭犀金龜(Cyclocephalaborealis)、圓頭獨角仙(northernmaskedchafer(蠐螬))；圓頭無斑犀金龜(Cyclocephalaimmaculata)、南方圓頭犀金龜(southernmaskedchafer(蠐螬))；日本金龜(Popilliajaponica)、日本甲蟲(Japanesebeetle)；玉米銅色跳甲(Chaetocnemapulicaria)、玉米跳甲(cornfleabeetle)；玉米谷喙甲(Sphenophorusmaidis)、玉米谷象(maizebillbug)；玉米縊管蚜(Rhopalosiphummaidis)、玉米蚜(cornleafaphid)；玉米根蚜(Anuraphismaidiradicis，cornrootaphid)；美洲谷長蝽(Blissusleucopterusleucopterus)、麥蝨(chinchbug)；赤腿黑蝗(Melanoplusfemurrubrum)、赤腿蚱蜢(redleggedgrasshopper)；血黑蝗(Melanoplussanguinipes)、遷徙蚱蜢(migratorygrasshopper)；玉米種蠅(Hylemyaplatura)、玉米種蛆(seedcornmaggot)；美洲黍潛葉蠅(Agromyzaparvicornis)、玉米斑潛葉蠅(cornblotleafminer)；玉米黃呆薊馬(Anaphothripsobscrurus)、草薊馬(grassthrips)；竊葉蟻(Solenopsismilesta，thiefant)；二斑葉蟎(Tetranychusurticae)、二點葉蟎(twospottedspidermite)；高粱：玉米禾螟(Chilopartellus)、高粱鑽心蟲(sorghumborer)；草地夜蛾，秋夜蛾；谷實夜蛾，美洲棉鈴蟲；南美玉米苗斑螟，小玉米莖鑽心蟲；粒膚地老虎(Feltiasubterranea，granulatecutworm)；Phyllophagacrinita，蠐螬；偽金針蟲屬(Eleodes)、Conoderus和Aeolus屬某些物種，鐵線蟲；黑甲負泥蟲(Oulemamelanopus)、(穀類植物跳甲)；玉米銅色跳甲(Chaetocnemapulicaria)、玉米跳甲(cornfleabeetle)；玉米谷喙甲(sphenophorusmaidis)、玉米谷象(maizebillbug)；玉米縊管蚜(Rhopalosiphummaidis)、玉米蚜(cornleafaphid)；蔗黃偽毛蚜(Siphaflava)、甘蔗黃蚜(yellowsugarcaneaphid)；美洲谷長蝽(Blissusleucopterusleucopterus)、麥蝨(chinchbug)；高粱癭蚊(Contariniasorghicola)、高粱蠓(sorghummidge)；硃砂葉蟎(Tetranychuscinnabarinus)、棉紅蜘蛛(carminespidermite)；二斑葉蟎(Tetranychusurticae)、二點葉蟎(twospottedspidermite)；小麥：美洲一星粘蟲(Pseudaletiaunipunctata)、行軍蟲(armyworm)；草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)、秋夜蛾(fallarmyworm)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)、小玉米莖鑽心蟲(lessercornstalkborer)；Agrotisorthogonia，西部切根蟲(westerncutworm；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpuslignosellus)、小玉米莖鑽心蟲(lessercornstalkborer)；黑甲負泥蟲，禾穀跳甲；三葉草葉象(Hyperapunctata)、車軸草葉象甲(cloverleafweevil)；黃瓜十一星葉甲食根亞種，南方玉米根蟲；俄羅斯麥蚜(Russianwheataphid)；麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)、綠蟲(greenbug)；麥長管蚜(Macrosiphumavenae)、英國禾穀蚜(Englishgrainaphid)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊種黑蝗，殊種蚱蜢；血黑蝗，遷徙蚱蜢；小麥癭蚊(Mayetioladestructor)、黑森癭蚊(hessianfly)；麥紅吸漿蟲(Sitodiplosismosellana)、麥蠓(wheatmidge)；美洲麥杆蠅(Meromyzaamericana，wheatstemmaggot)；冬作種蠅(Hylemyacoarctata，wheatbulbfly)；菸草薊馬(Frankliniellafusca)、煙薊馬(tobaccothrips)；莖鋸蜂(Cephuscinctus)、麥莖蜂(wheatstemsawfly)；鬱金香瘤癭蟎(Aceriatulipae)、麥癭蟎(wheatcurlmite)；向日葵：Suleimahelianthana，sunflowerbudmoth；向日葵斑螟(Homoeosomaelectellum)、美洲向日葵螟(sunflowermoth)；向日葵葉甲(zygogrammaexclamationis，sunflowerbeetle)；胡蘿蔔金龜(Bothyrusgibbosus，carrotbeetle)；向日葵籽癭蚊(Neolasiopteramurtfeldtiana，sunflowerseedmidge)；棉屬植物：煙蚜夜蛾(Heliothisvirescens)、棉捲葉蛾(cottonbudworm)；谷實夜蛾(Helicoverpazea)、美洲棉鈴蟲(cottonbollworm)；甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)、甜菜粘蟲(beetarmyworm)；紅鈴麥蛾(Pectinophoragossypiella)、棉紅鈴蟲(pinkbollworm)；墨西哥棉鈴象(Anthonomusgrandis)、棉鈴象甲(bollweevil)；棉蚜(Aphisgossypii，cottonaphid)；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelisseriatus，cottonfleahopper)；結翅粉蝨(Trialeurodesabutilonea，bandedwingedwhitefly)；牧草盲蝽(Lyguslineolaris，tarnishedplantbug)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊種黑蝗，殊種蚱蜢；棉薊馬(Thripstabaci)、洋蔥薊馬(onionthrips)；菸草薊馬，草薊馬；硃砂葉蟎，棉紅蜘蛛；二斑葉蟎，二點葉蟎；稻：小蔗螟，甘蔗鑽心蟲；草地夜蛾，秋夜蛾；谷實夜蛾，美洲棉鈴蟲；葡萄肖葉甲(Colaspisbrunnea，grapecolaspis)；稻水象甲(Lissorhoptrusoryzophilus，ricewaterweevil)；米象(Sitophilusoryzae，riceweevil)；黑尾葉蟬(Nephotettixnigropictus)、稻葉蟬(riceleafhopper)；美洲谷長蝽，麥蝨；喜綠蝽(Acrosternumhilare，greenstinkbug)；大豆：大豆夜蛾(Pseudoplusiaincludens)、大豆尺蠖(soybeanlooper)；梨豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)、梨豆毛蟲(velvetbeancaterpillar)；苜蓿綠夜蛾(Plathypenascabra，greencloverworm)；玉米螟，歐洲玉米鑽心蟲；小地老虎，黑地蠶；甜菜夜蛾，甜菜粘蟲；煙蚜夜蛾，棉捲葉蛾；谷實夜蛾，美洲棉鈴蟲；墨西哥豆瓢蟲(Epilachnavarivestis，Mexicanbeanbeetle)；桃蚜(Myzuspersicae，greenpeachaphid)；蠶豆微葉蟬(Empoascafabae)、馬鈴薯葉蟬(potatoleafhopper)；喜綠蝽(Acrosternumhilare)、綠臭蝽(greenstinkbug)；赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊種黑蝗，殊種蚱蜢；玉米種蠅，玉米種蛆；Sericothripsvariabilis、大豆薊馬(soybeanthrips)；棉薊馬，洋蔥薊馬；土耳其斯坦葉蟎(Tetranychusturkestani，strawberryspidermite)；二斑葉蟎，二點葉蟎；大麥：玉米螟，歐洲玉米鑽心蟲；小地老虎，黑地蠶；麥二叉蚜，綠蟲；美洲谷長蝽，麥蝨；喜綠蝽，綠臭蝽；褐臭椿(Euschistusservus，brownstinkbug)；玉米種蠅，玉米種蛆；小麥癭蚊，黑森癭蚊；麥巖蟎(Petrobialatens，brownwheatmite)；油菜(OilSeedRape)：甘藍短棒蚜(Brevicorynebrassicae)、甘藍蚜(cabbageaphid)；十字花科跳甲(Phyllotretacruciferae，Fleabeetle)；蓓帶夜蛾(Mamestraconfigurata、Berthaarmyworm)；小菜蛾(Plutellaxylostella，Diamond-backmoth)；地種蠅屬某些物種(Deliassp.)、根蛆(Rootmaggots)。線蟲包括寄生性線蟲如根結線蟲、胞囊線蟲和根腐線蟲，包括胞囊線蟲屬(Heterodera)某些物種、根結線蟲屬(Meloidogyne)某些物種和球胞囊屬(Globodera)某些物種；特別地是胞囊線蟲成員，包括但不限於Heteroderaglycines(大豆胞囊線蟲)；Heteroderaschachtii(甜菜胞囊線蟲)；Heteroderaavenae(穀類胞囊線蟲)；和馬鈴薯金線蟲(Globoderarostochiensis)和馬鈴薯白線蟲(Globoderapailida)(馬鈴薯胞囊線蟲)。根腐線蟲包括短體屬(Pratylenchus)某些物種。用於增加植物產量的方法提供了用於增加植物產量的方法。所述方法包括提供植物或植物細胞，其表達編碼本文中所公開的殺蟲多肽序列的多核苷酸，和在被害蟲侵襲的田間生長該植物或其種子，其中所述多肽對所述害蟲具有殺蟲活性。在一些實施方案中，所述多肽具有針對鱗翅目的、鞘翅目的、雙翅目的、半翅目的或線蟲類的害蟲的殺蟲活性並且所述的田地用鱗翅目的、半翅目的、鞘翅目的、雙翅目的或線蟲類的害蟲侵襲。如本文中定義，植物的「產量」指由植物產生的生物量的質量和/或數量。「生物量」意指任何所度量的植物產物。生物量產生的增加是所度量植物產物的產量方面的任意改善。增加植物產量具有幾項商業應用。例如，增加植物葉生物量可以增加用於人或動物消費的葉菜類的產量。另外，增加葉生物量可以用來增加植物衍生的藥用或工業產物的生產。產量的增加可以包含任何統計顯著的增加，包括但不限於與不表達殺蟲序列的植物相比，產量增加至少1％、增加至少3％、增加至少5％、增加至少10％、增加至少20％、增加至少30％、至少50％、至少70％、至少100％或更多。在具體的方法中，植物產量因表達本文中所公開殺蟲蛋白的植物的改善的害蟲抗性而增加。殺蟲蛋白的表達導致害蟲侵襲或採食植物的能力降低，因而，改善植物產量。以下實施例以說明方式且不以限制方式提供。實施例實施例1.從菌株ATX2024中鑑定對西方玉米根蟲有活性的蛋白質通過生物化學和基因組分析的組合從菌株ATX2024中鑑定了西方玉米根蟲活性蛋白AXMI-205。在西方玉米根蟲(Diabroticavirgifera或者WCRW)生物測定中，鑑定ATX2024為顯示熱敏感活性的活性菌株。在ATX2024培養物質上如下進行蛋白質的分級分離和純化：ATX2024細胞在合適的培養基中(如C2培養基或者補充有海藻糖的CYS培養基，培養基的選擇對於本發明不是關鍵的)在37℃下生長3天。也可以在30℃下進行培育。收集細胞沉澱並且在A緩衝液((20mM乙酸鈉/50mM氯化鈉，pH值5)中使用「弗氏壓碎器」的高壓力破碎細胞。通過離心澄清裂解物並且對pH值5.0的20mM的乙酸鈉，50mM的氯化鈉透析。然後將透析的樣品裝載到20mlSP瓊脂糖TM陽離子交換柱上(GEHealthcare)。通過A緩衝液中從50mM到1M氯化鈉的線性鹽梯度用超過20倍柱體積洗脫蛋白質。也可以用超過10倍柱體積進行洗脫。匯集活性級分並對緩衝液B(pH值7或者pH值8的20mMTris-HCl/50mM氯化鈉)透析。然後將透析的活性級分裝載到5ml瓊脂糖Q陰離子交換柱上。可以使用其他的陰離子交換柱如1.7mlSOURCETM陰離子交換柱。用緩衝液A中從50mM到1M氯化鈉的線性鹽梯度洗脫蛋白質。收集的級分在WCRW上測試活性並且觀察到對WCRW有活性的級分。鑑定約52kDa的蛋白質條帶與級分的活性相關。這種蛋白質在本文被稱作蛋白質條帶#10。然後匯集活性級分並且濃縮，並且進行SDS-PAGE。分離得到的相應於蛋白質條帶#10的凝膠部分並且通過本領域已知的N-末端測序和基質輔助雷射解析電離串聯飛行時間質譜(MALDI-TOF-TOF)分析進行分析。比較從蛋白質條帶#10得到的MALDI-TOF-TOF數據，顯示其與已知的蛋白質資料庫不匹配。當與已知的蛋白質序列資料庫比較時，蛋白質條帶#10的N末端的胺基酸測序得到的N末端肽序列顯示與已知的蛋白質序列不匹配。實施例2.ATX2024的基因組測序從如下選擇的菌株中鑑定出的完整的基因序列：總DNA含有以下的一些或者全部的混合物：基因組DNA、不同大小的質粒、噬菌體染色體、其他未表徵的染色體外分子。機械或者酶促剪切染色體外DNA來產生大小分布的片段。通過本領域已知的方法對片段化的DNA測序。實施例3.將N末端和MALDI-TOF-TOF數據與基因組序列數據匹配通過從產生自ATX2024的序列讀數提取所有可能的ORFs產生ATX2024的序列數據編碼的一組推斷的可讀框(ORFs)。使用BLAST算法比較蛋白質條帶#10(上文)的N-末端測序數據和這組ATX2024ORFs。發現兩種讀碼編碼與N-末端序列數據有高同源性的推測的蛋白質片段。相似地，使用Mascot程序(www.matrixscience.com；Perkins等人.(1999)Electrophoresis20(18)：3551-67)比較來自蛋白質條帶#10的MALDI-TOF-TOF數據和這組ATX2024ORFs。發現七個讀數編碼與MALDI-TOF-TOF數據集中存在的峰值具有明顯匹配的推測的蛋白質片段。將從N-末端和MALDI-TOF-TOF數據分析鑑定的DNA序列讀數彙編來提供初步的基因序列。使用TAIL-PCR策略得到與初步的基因序列數據相鄰的側翼序列。將得到的PCR產物的序列與來自ATX2024的原始的基因組序列彙編來提供編碼蛋白質條帶#10的可讀框的完成的基因序列。將這種可讀框命名為Axmi205(SEQIDNO：1)，並且將可讀框編碼的蛋白質命名為AXMI-205(SEQIDNO：2，3或者4)。然後從ATX2024基因組中擴增編碼AXMI-205的基因組區域，克隆並且得到這種克隆的DNA序列。在包含Axmi205的區域中這種克隆的DNA序列被提供為SEQIDNO：12。將AXMI-205與已知的蛋白質序列資料庫比較顯示AXMI-205是獨特的蛋白質，與已知的蛋白質顯示出非常低的同源性(20％或者更少)。有趣地，AXMI-205與通常被稱作MACPF蛋白(Rosado等人，CellularMicrobiology(2008)10(9)，1765-1774)的一大類鬆散相關的蛋白質顯示出低的但有可能顯著的同源性。已經建議這些蛋白質在如免疫反應和保護免於細菌攻擊的過程中起作用。AXMI-205與來自密執安棍狀桿菌的蛋白質(SEQIDNO：14；GENBANK登錄號YP_001223127，Gartemann等人，J.Bacteriol.190(6)，2138-2149(2008))具有20％的同一性，並且與發光光杆狀菌蛋白質(SEQIDNO：15；GENBANK登錄號2QP2_A；Rosado，C.J.，等人，Science317(5844)，1548-1551(2007))具有13％的同一性。儘管這些百分比同一性低，但是可以從附圖1的檢查中鑑定這些蛋白質之間胺基酸的保守區域。實施例3.AXMI-205的異源表達將Axmi205的可讀框克隆到基於(1)麥芽糖結合融合載體的大腸桿菌表達載體中來產生pAX6911，並且克隆到基於pRSF1b的(2)表達載體中來產生pAX7011。為在大腸桿菌中表達，用pAX6911，pAX7011或者對照質粒轉化BL21＊DE3。將載體轉化的單個菌落接種到補充有卡那黴素的LB中並且在37℃下生長過夜。第二天，將1％的過夜培養物一式兩份接種到新鮮的培養基中並且在37℃下生長到對數期。隨後，在37℃下用1mMIPTG誘導培養物3小時或者在20℃下過夜誘導。在補充有1mMDTT的pH10.5的50mM碳酸鈉緩衝液中懸浮每種細胞沉澱並且超聲處理。通過SDS-PAGE分析檢測相應於AXMI-205的推測大小的蛋白質的表達。在pMal融合載體pAX6911的情況下，通過PAGE觀察與pMAL-AXMI-205融合物的預測大小一致的蛋白質。實施例4.AXMI-205的殺蟲活性按照供應商(NewEnglandBiolabs)的推薦從大腸桿菌克隆的裂解物中純化融合蛋白，並且用Xa因子或者胰蛋白酶切割所述融合蛋白。用SDS-PAGE分析證實純化的融合蛋白的切割。在昆蟲測定中在由20mMTris，1mMDTT，50mMNaCl組成的緩衝液中用合適的對照測試來自含有AXMI-205的pAX6911的純化的蛋白質，和用Xa因子或胰蛋白酶切割的pAX6911，或者未被切割的蛋白質。也以這種方式測試表達AXMI-205的pAX7011的可溶提取物。兩天後，含有AXMI-205的樣品顯示強的生長遲緩活性並且賦予西方玉米根蟲致死性。表1顯示本文使用的得分分配的描述，並且表2匯總了從AXMI-205樣品中觀察到的活性。表1.得分系統的描述表2.AXMI-205樣品的殺蟲活性實施例5.殺蟲活性的額外測定可以測試本發明的核苷酸序列產生殺蟲蛋白的能力。常常以眾多方式評估殺蟲蛋白作為殺蟲劑對害蟲發揮作用的能力。本領域熟知的一種方式是進行飼餵測定法。在這種飼餵測定法中，使害蟲暴露於含有待測試化合物的樣品或對照樣品。這常常通過將待測試物質或該物質的合適稀釋物放置到害蟲會攝取的物質(如人工食物)上進行。待測試的物質可以由液體、固體或漿液組成。待測試的物質可以置於表面上並且隨後允許乾燥。備選地，待測試的物質可以與熔融的人工食物混合，隨後分配至測定箱中。測定箱可以是例如杯、碟或微量滴定板的孔。用於吸吮性害蟲(例如蚜蟲)的測定法可以涉及試驗材料與昆蟲通過隔離物(理想地是可以被吸吮昆蟲的吸口部分穿透的部分)分隔以允許攝取試驗材料。該試驗材料常常與飼餵刺激物如蔗糖混合以促進試驗化合物的攝取。其他類型的測定法可以包括微量注射試驗材料至害蟲的口或腸，以及產生轉基因植物，隨後測試害蟲以該轉基因植物為食的能力。植物測試法可以涉及分離通常消費的植物部分，例如，附著在葉子上的小籠狀物，或在含有昆蟲的小籠狀物中分離完整植株。在本領域已知並且可以例如在Robertson和Preisler，eds.(1992)Pesticidebioassayswitharthropods，CRC，BocaRaton，FL中發現測定害蟲的其他方法和途徑。備選地，通常在期刊ArthropodManagementTests和JournalofEconomicEntomology中或者通過與美國昆蟲學會(ESA)成員討論描述測定。實施例6.合成基因設計了編碼AXMI-205的合成基因。在SEQIDNO：9中給出了Axmi205v01.02。在SEQIDNO：10中給出了Axmi205v01.03。在SEQIDNO：11中給出了Axmi205v01.04。實施例7.AXMI-205的變體為鑑定AXMI-205C-末端部分中功能上重要的區域和位置，在相應於SEQIDNO：2的307-536胺基酸位置上測定了丙氨酸掃描突變體。丙氨酸突變體被合成產生(Geneart，Burlingame，CA)並且被組裝到來源於pAX3577的表達載體中用於在大腸桿菌中表達((pAX3577含有pRSF1b(Invitrogen)中的Axmi250v01.03)。從突變體S307A起始，每兩個殘基用丙氨酸取代。在此系列中最後的丙氨酸突變體是K535A。總共匯集了101種丙氨酸突變體。將匯集的丙氨酸突變體以及pAX3577轉化進BL21＊DE3細胞並且平板接種在LB+卡那黴素(100μg/ml)上。挑取新鮮的菌落到8mlLB+卡那黴素(100μg/ml)液體培養基中並且在37℃，300rpm下在24深孔板中生長直到OD600達到0.6。加入IPTG以達到0.5mM的終濃度，並且在20℃額外培養培養物18小時。測定OD600nm並且通過離心(在4℃，4000rpm，10分鐘)收集細胞。在pH7.4，20mMTris/HCl，150mMNaCl，1mMDTT中以20OD600/ml的密度重懸浮細胞沉澱。通過玻珠擊打破碎細胞並且在4℃，4500rpm離心15分鐘後得到可溶提取物。以每種變體四次重複測定提取物對WCRW的活性。在五和六天後，通過將四次重複的得分平均確定根蟲的毒性得分。在初步篩選中篩選了266種變體，提供了文庫的3倍覆蓋。對得分高於和低於Axmi205野生型序列得分的變體測序。發現以下的丙氨酸突變體(相對於SEQIDNO：2)對WCRW有活性：S307A，D315A，V317A，S349A，G351A，K353A，V355A，D395A，G399A，W407A,G419A,P355A,P435A,S443A,K465A,V467A,F483A,P487A,S495A,D497A,E499A,K509A和I513A.將丙氨酸突變體E499A命名為Axmi205(evo24)(SEQIDNO:5)並且將丙氨酸突變體V467A命名為Axmi205(evo25)(SEQIDNO:6)。實施例8.axmi-205截短物的活性構建了axmi-205的一些截短物並且測試了其對西方玉米根蟲的活性。構建了從AXMI-205蛋白(SEQIDNO:2)的C-末端除去了10,20,30,34或者71個胺基酸的C-末端截短物。表達MBP融合物的克隆pAX7106在用Xa因子切割後，產生蛋白AXMI-205(trunc10)(SEQIDNO:7)，所述AXMI-205(trunc10)蛋白相對於AXMI-205缺少來自C-末端的10個胺基酸。表達MBP融合蛋白的克隆pAX7106在用Xa因子切割後，產生蛋白AXMI-205(trunc20)(SEQIDNO:8)，所述AXMI-205(trunc20)蛋白相對於AXMI-205缺少來自C-末端的20個胺基酸。AXMI-205(trunc10)和AXMI-205(trunc20)都顯示對WCRW的活性，然而30個胺基酸的截短物不顯示活性。實施例9.用於植物表達的基因引導為在植物中表達，將本發明的編碼區與適合的啟動子和終止子序列連接。這種序列在本領域是眾所周知的，並且為在單子葉植物中表達，可以包括稻肌動蛋白啟動子或者玉米泛素啟動子，為在雙子葉植物中表達，可以包括擬南芥UBQ3啟動子或者CaMV35S啟動子，以及nos或者PinII終止子。產生和證實啟動子-基因-終止子構建體的技術在本領域也是眾所周知的。在本發明的一個方面，設計和產生了合成的DNA序列。這些合成序列已經相對於親本序列改變了核苷酸序列，但是編碼與親本AXMI-205蛋白基本上相同的蛋白質(例如SEQIDNO:9-12)。在本發明的另一個方面，設計合成基因的修飾形式以便得到的多肽被靶向植物細胞器，如內質網或者質外體。已知導致融合蛋白靶向植物細胞器的肽序列在本領域是已知的。例如，在本領域已知來自白羽扇豆(Lupinusalbus)的酸性磷酸酶基因的N-末端區域(IDGI：14276838，Miller等人(2001)PlantPhysiology127：594-606)導致異源蛋白質靶向內質網。如果得到的融合蛋白在C-末端也含有包含肽N-端-賴氨酸-天冬氨酸-穀氨酸-亮氨酸(即「KDEL」基序，SEQIDNO：13)的內質網滯留序列，那麼融合蛋白將被靶向至內質網。如果融合蛋白在C-末端缺少內質網靶向序列，蛋白質將被靶向至內質網，但最終將被隔離在質外體中。因此，這種基因編碼融合蛋白，所述融合蛋白含有與本發明的胺基酸序列的N-末端融合的來自白羽扇豆的酸性磷酸酶基因的N-末端三十一個胺基酸(IDGI：14276838，Miller等人，2001，上文)，以及在C-末端的KDEL序列。因此，推測在植物細胞中表達得到的蛋白質被靶向至植物內質網。上文描述的植物表達盒與合適的植物選擇標記組合來幫助在轉化的細胞和組織中的選擇，並且連接到植物轉化載體中。這些可以包括來自農桿菌介導的轉化的二元載體或者用於氣溶膠或者生物射彈轉化的簡單質粒載體。實施例10.用於植物表達的引導基因為在植物中表達，將本發明基因的編碼區DNA與適合的啟動子和終止子序列有效連接。這種序列在本領域是眾所周知的，並且為在單子葉植物中表達，可以包括稻肌動蛋白啟動子或者玉米泛素啟動子，為在雙子葉植物中表達，可以包括擬南芥UBQ3啟動子或者CaMV35S啟動子，以及nos或者PinII終止子。產生和證實啟動子-基因-終止子構建體的技術在本領域也是眾所周知的。上文描述的植物表達盒與合適的植物選擇標記組合來幫助在轉化的細胞和組織中的選擇，並且連接到與植物轉化載體中。這些可以包括來自農桿菌介導的轉化的二元載體或者用於氣溶膠或者生物射彈轉化的簡單質粒載體。實施例11.用本文描述的殺蟲蛋白基因轉化玉米細胞最好在授粉後8-12天後收集玉米穗。從穗中分離出胚，並且大小是0.8-1.5mm的那些胚優選用於轉化。通過盾片向上將胚接種於適合的培養基如DN62A5S培養基(3.98g/LN6鹽；1mL/L(1000x貯存液)N6維生素；800mg/LL-天冬醯胺；100mg/L肌醇；1.4g/LL-脯氨酸；100mg/L酪蛋白胺基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(1mg/mL貯存液)2，4-D)中。然而，除了DN62A5S之外的培養基和鹽是適合的並且在本領域已知。在25℃下在黑暗中過夜培養胚。然而，本身不必過夜培養胚。將所得的外植體轉移至篩板(meshsquares)(每個平板30-40個網孔)，轉移到滲透培養基上約30-45分鐘，隨後轉移至照射平板(beamingplate)(見，例如，PCT公開號WO/0138514和美國專利號5,240,842)。使用氣溶膠束加速器，使用基本上如PCT公開號WO/0138514中所述的條件，將設計旨在植物細胞中表達本發明基因的DNA構建體加速至植物組織中。在照射後，將胚在滲透培養基上孵育約30分鐘，隨後置於孵育培養基上在25℃黑暗中過夜。為避免過分損傷照射過的外植體，將它們在轉移至恢復培養基之前孵育至少24小時。胚隨後鋪展在恢復期培養基上，於25℃黑暗下約5日，隨後轉移至選擇培養基。取決於所用具體選擇的性質和特徵，在選擇培養基中孵育外植體持續直至8周。在選擇期之後，將所得的愈傷組織轉移至胚成熟培養基，直至觀察到成熟體細胞胚的形成。所得的成熟體細胞胚隨後置於低光照下，並且通過本領域已知的方法啟動再生的過程。允許所得的苗在生根培養基上生根，並且將所得的植物轉移至苗圃缽並作為轉基因植物繁殖。材料DN62A5S培養基用1NKOH/1NKCl將溶液的pH值調整到pH5.8，加入脫乙醯吉蘭糖膠(Sigma)以達到3g/L的濃度，然後將培養基高壓滅菌。在冷卻到50℃後，每升培養基中加入2ml5mg/ml的硝酸銀貯存液。實施例12.通過農桿菌介導的轉化在植物細胞中轉化本發明的基因最好在授粉後8-12天後收集穗。從穗中分離出胚，並且大小是0.8-1.5mm的那些胚優選用於轉化。通過盾片向上將胚接種於適合的培養基中，並且在25℃下在黑暗中過夜培養。然而，過夜培養胚本身不是必要的。將胚與含有適合的載體的農桿菌菌株接觸約5-10分鐘用於Ti質粒介導的轉化，然後平板接種到共培養培養基中約3天(25℃，黑暗中)。在共培養之後，將外植體轉移到恢復期培養基中培養約5天(25℃下，在黑暗中)。取決於使用的特定選擇的性質和特徵，外植體在選擇培養基中培養長達8周。在選擇期之後，將得到的愈傷組織轉移到胚成熟培養基，直到觀察了成熟的體細胞胚的形成。然後將得到的成熟的體細胞胚放置於弱光線下，並且按照本領域已知的啟動再生過程。實施例13.在西方玉米根蟲的侵襲時保護表達Axmi205的轉基因植物免於根損傷通過農桿菌介導的轉化得到了用兩種版本的Axmi205(Axmi205(SEQIDNO：1)或者Axmi205v01.03(SEQIDNO：10))轉化的轉基因玉米植物。選擇通過PCR分析顯示含有適合的Axmi205構建體的植物，並且將其轉移到根訓練容器中。將含有Axmi205或者Axmi205v01.03的T0植物移植到根訓練容器中並且繁殖約3周。然後用約125個非滯育的西方玉米根蟲的卵侵襲每種個體植物。在侵襲的24小時內，觀察到多於90％的卵已經孵化了。通過蛋白質印跡分析使用抗AXMI-205抗體分析植物中AXMI-205蛋白的表達。選擇表達可檢測量的AXMI-205的植物用於分析。十五天後，使用愛荷華州節損傷尺度1(Oleson，J.D.，Y.Park，T.M.Nowatzki，和J.J.Tollefson.2005.J.EconEntomol.98(1)：1-8)評估每種植物中根損傷的量。表3顯示與受相同方式侵襲的對照植物相比，AXMI-205的兩種形式都導致較低的根損傷。在相似的實驗中，與未轉化的對照(未顯示)相比，含有Axmi205v01.02或者Axmi-205v01.04的植物顯示改進的根評級。表3.表達Axmi-205的轉基因玉米的根損傷本說明書中提到的全部出版物及專利申請說明了本發明所屬領域的技術人員的水平。全部出版物及專利申請通過引用的方式以相同程度併入本文，如同專門且個別地說明通過引用方式併入每份單獨的出版物或專利申請。儘管出於理解明晰性目的，已經通過說明和實例方式相當詳細地描述了前述發明，不過顯而易見可以在所附帶權利要求書的範圍內進行某些變化和修改。