應用生物反應器工業化生產豬藍耳病疫苗的方法
2023-11-09 19:14:52 1
專利名稱:應用生物反應器工業化生產豬藍耳病疫苗的方法
技術領域：
本發明屬於獸用生物製品技術領域：
，具體涉及ー種應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法。
背景技術：
豬繁通與呼吸症候群(PorcineReproductive and RespiratorySyndrome,PRRS)，又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸症候群病毒(PRRSV)引起豬的ー種高度接觸性傳染病，對養豬業危害很大。目前PRRS在國內愈演愈烈，直接和間接地造成了 2006年流行我國大部分省份的所謂「豬無名高熱病」，即高致病性豬藍耳病，導致1000萬 3000萬頭生豬死亡。我國已將高致病性豬藍耳病列為ー類傳染病，疫苗免疫是目前防制該病的最根本有效措施。目前豬藍耳病疫苗的生產是採用傳統的轉瓶エ藝，即豬藍耳病病毒接種已形成單層的細胞，培養後一次性收穫病毒液。但是每個轉瓶均是獨立的細胞培養單元，每瓶細胞的質量、病毒產量和滴度都不同，導致疫苗批間差異大，而且操作勞動強度大，生產效率低，隱性汙染引起的高內毒素等缺點，已經越來越不適應當前疫苗大規模生產的要求。
專利公開號為CN101612395 A的專利申請，公開了ー種應用生物反應器培養敏感細胞生產豬藍耳病疫苗的方法，所用的生物反應器為攪拌式生物反應器、氣升式生物反應、Wave生物反應器和中空纖維反應器；培養的方式是通過向生物反應器內接種種子細胞，並培養到一定的密度後，接種病毒，收穫病毒液。但是利用Cell Lift型生物反應器，採用生物反應器間逐級放大的倒罐式操作技術，進行細胞的高密度培養以製備疫苗，未見報導。
發明內容
本發明的目的為了克服豬藍耳病疫苗現有生產エ藝的缺陷，提供了一種應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其優點是設備佔地面積小、生產規模大；培養速度快、生產效率高；生產機械化，易於自動控制；培養設備密閉，不易汙染；副產物少，疫苗的副反應小；生產的病毒液效價高，與傳統的轉瓶エ藝相比，收穫的病毒液滴度提高了 O. 5
I.5個LogTCID5ciAil，疫苗質量穩定。
本發明的技術方案為
一種應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其特徵在於包括如下步驟(1)用微載體培養制苗用細胞將微載體和生物反應器經滅菌後，接種制苗用細胞，進行培養，待微載體上的細胞形成緻密的單層，接種豬藍耳病病毒，並繼續培養，使病毒繁殖，所述的制苗用細胞為對豬藍耳病病毒毒株敏感的細胞，且為Marc-145細胞和MA104細胞；
(2)每天按時取樣觀察細胞病變情況，待細胞病變達到80%以上時，停止培養，收穫病毒液製得豬藍耳病活疫苗；或對收穫的病毒液進行超濾濃縮和病毒滅活，通過柱層析方法純化滅活的病毒，加入佐劑製備滅活疫苗。
所述的病毒的接種量為O. 0001 O. IMOI。[0009]所述的生物反應器設定參數為pH 6. 5 7. 8、溫度33 37°C、溶氧(DO) 30 80%、攪拌速度30 lOOrpm。考慮到細胞培養的最適條件，優選的pH6. 8 7. 2、細胞培養階段溫度設定37°C，病毒培養階段溫度設定35°C、溶氧50%、攪拌速度30 lOOrpm。
所述的微載體為Cytodex系列微載體,微載體的使用密度為2 25g/L。
所述的生物反應器為攪拌式生物反應器。
所述的生物反應器容積為14 150L。制苗用細胞可採用14L 40L或14L 40L 150L逐級放大的培養模式，即通過胰酶將14L生物反應器培養的細胞消化下來，作為種子細胞接種到40L的生物反應器，再將40L的反應器內培養的細胞消化下來作為種子細胞接種到150L生物反應器，如此形成生物反應器之間的逐級放大培養過程，從而避免了單純的用轉瓶培養種子細胞而容易造成汙染和增加勞動強度的缺陷；於40し或150L生物反應 器培養豬藍耳病病毒；或直接用14L、40L或150L的生物反應器培養病毒。
所述的生物反應器的培養採用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細胞的密度以每天O. 5 4個工作體積。
豬藍耳病病毒可以是制苗用的強毒株，用來製備滅活苗；也可以是制苗用弱毒株，製備弱毒活疫苗。
本發明採用生物反應器微載體培養技術進行細胞的高密度培養，生產豬藍耳病疫苗，與傳統的轉瓶生產エ藝相比，自動化控制程度高，生產可實時監控；節省人力，降低成本；生產用地少，規模易於擴大；生產的病毒滴度高，批間差異小，產品質量穩定，副反應小。
圖I為本發明的エ藝流程圖。
圖2a為細胞接種後6h的微載體細胞圖片。
圖2b為細胞接種後5d的微載體細胞圖片。
圖2c為接毒後細胞狀態的微載體細胞圖片。
圖3為細胞生長曲線。
具體實施方式
以下是本發明ー個具體的實施方案，以進ー步的闡述本發明，但不能解釋為限制本發明的範圍。
實施例一生物反應器美國NBS公司14L和40L生物反應器，生物反應器設定參數為pH 7. 2、溫度37°C、溶氧50%、攪拌速度30 IOOrpm ；
微載體Cytodex I (通用電氣醫療集團生命科學部)；
豬藍耳病病毒JXA1株；
細胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公司)；
病毒維持液含體積濃度為1%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公司)；
細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodex-I，水化後，用pH7. 4的磷酸鹽緩衝液PBS淘洗幾遍，滅菌，接種Marc-145細胞，進行培養；每天定時取樣觀察細胞生長情況，進行細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到IXlO6Ail吋，開始灌注，灌注的速度依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天O. 5 4個工作體積，以維持細胞的生長，培養4天，細胞的密度達到6 X 106/ml。
微載體培養的放大待14L生物反應器細胞的密度達到6X 106/ml，將長滿細胞的微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度O. 02% EDTA的pH7. 4的磷酸鹽緩衝液PBS緩衝液清洗細胞兩次，加入37°C預熱的含質量濃度O. 02% EDTA、質量濃度O. 25%胰酶的胰酶消化液，消化8min，排出多餘的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘餘胰酶的消化，啟動容器攪拌使其充分分散消化的細胞，然後將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反應器，按照上述的培養方法進行培養。
病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到7X106/ml，排出細胞生長液並更換成病毒維持液，按照O. 001M0I接種豬藍耳病病毒；接毒後6h開始灌注培養，以維持病毒 繁殖所必需的營養物質，待細胞病變達到80%以上時，同時收穫病毒液，測定病毒含量為
7.51ogTCID5Q/ml，將收穫的病毒液置於2 8°C中，或保存在_20°C。
製備疫苗將上述收穫的病毒液用100KD截留分子量的超濾膜包濃縮10倍，滅活劑與病毒液的體積比按I : 2000加入質量濃度為37%的甲醛溶液進行滅活後，再經過凝膠層析柱S印harose 4FF柱層析得到純化疫苗，按抗原和油佐劑I : I比例加入油佐劑，乳化配製成滅活疫苗，油佐劑的配製為94% (V/V)白油、6% (V/V)的Span-80，2% (g/V)硬脂Ife招。
實施例ニ 生物反應器美國NBS公司14L和40L生物反應器，生物反應器設定參數為pH 7. 2、溫度37°C、D050%、攪拌速度30 IOOrpm ；
微載體Cytodex I (通用電氣醫療集團生命科學部)；
豬藍耳病病毒JXAl-R株；
細胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公司)；
病毒維持液含體積濃度為1%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公司)；
細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodex-I，水化後，用pH7. 4的磷酸鹽緩衝液PBS淘洗幾遍，滅菌，接種Marc-145細胞，進行培養；每天定時取樣觀察細胞生長情況，進行細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到IXlO6Ail吋，開始灌注，灌注的速度依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天O. 5 4個工作體積，以維持細胞的生長，培養4d，細胞的密度達到6 X 106/ml。
微載體培養的放大待14L生物反應器細胞的密度達到6X 106/ml，將長滿細胞的微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度O. 02% EDTA的pH7. 4的磷酸鹽緩衝液PBS緩衝液清洗細胞兩次，加入37°C預熱的含質量濃度O. 02% EDTA、質量濃度O. 25%胰酶的胰酶消化液，消化8min，排出多餘的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘餘胰酶的消化，啟動容器攪拌使其充分分散消化的細胞，然後將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反應器，按照上述的培養方法進行培養。
病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到7X106/ml，排出細胞生長液並更換成病毒維持液，按照O. OOlMOI接種豬藍耳病病毒；接毒後6h開始灌注培養，以維持病毒繁殖所必需的營養物質，待細胞病變達到80%以上時，同時收穫病毒液，測定病毒含量為 8.01ogTCID5Q/ml，將收穫的病毒液置於2 8°C中，保存在_20°C。
製備疫苗將上述收穫的病毒液按病毒液與凍幹保護劑的體積比為I : I加入質量濃度為5%蔗糖脫脂乳凍幹保護劑，製成凍幹活疫苗。
權利要求
1、一種應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其特徵在於包括如下步驟(I)用微載體培養制苗用細胞將微載體和生物反應器經滅菌後，加入細胞生長液，接種制苗用細胞進行培養，待微載體上的細胞形成緻密的單層，接種豬藍耳病病毒，並繼續培養，使病毒繁殖，所述的制苗用細胞為對豬藍耳病病毒毒株敏感的細胞，且為Marc-145細胞和MA104細胞；(2)待細胞病變達到80%以上時，停止培養，收穫病毒液；(3)制苗用的弱毒株，對收穫的病毒液加入凍幹保護劑製備凍幹弱毒活疫苗，或制苗用的強毒株，對收穫的病毒液進行超濾濃縮和病毒滅活，通過柱層析方法純化滅活的病毒，加入佐劑製備滅活疫苗。
2、根據權利要求
I所述應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其特徵在於病毒的接種量為O. 0001 O. IMOI。
3、根據權利要求
I所述應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其特徵在於所述的生物反應器設定參數為pH 6. 5 7. 8、溫度33 37°C、溶氧30 80%和攪拌速度30 lOOrpm。
4、根據權利要求
I所述應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其特徵在於所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2 25g/L。
5、根據權利要求
I 4之一所述應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其特徵在於所述的生物反應器為攪拌式生物反應器。
6、根據權利要求
I 4之一所述的應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其特徵在於所述的生物反應器容積為14 150L ;制苗用細胞經過14L 40L或14L 40L 150L逐級放大培養後，於40L或150L生物反應器培養豬藍耳病病毒；或直接用14L、40L或150 L的生物反應器培養病毒。
7、根據權利要求
I 4之一所述應用生物反應器エ業化生產豬藍耳病疫苗的方法，其特徵在幹所述的生物反應器的培養採用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細胞的密度為每天O. 5 4個工作體積。
專利摘要
本發明涉及一種應用生物反應器工業化生產豬藍耳病疫苗的方法，包括如下步驟(1)將微載體和生物反應器經滅菌後，加入細胞生長液，接種制苗用細胞進行培養，待微載體上的細胞形成緻密的單層，接種豬藍耳病病毒，並繼續培養，使病毒繁殖；(2)待細胞病變達到80％以上時，停止培養並收穫病毒液；(3)對收穫的病毒液加入凍幹保護劑製備凍幹弱毒活疫苗，或對收穫的病毒液進行超濾濃縮和病毒滅活，通過柱層析方法純化滅活的病毒，加入佐劑製備滅活疫苗。本發明與傳統的轉瓶生產工藝相比，自動化控制程度高，生產可實時監控；節省人力，降低成本；生產用地少，規模易於擴大；生產的病毒滴度高，批間差異小，產品質量穩定，副反應小。
文檔編號A61K39/12GKCN102038942 B發布類型授權 專利申請號CN 201010282151
公開日2012年8月22日 申請日期2010年9月15日
發明者劉漢平, 張萍, 李偉, 溫文生, 漆世華, 王楨楨, 秦紅剛, 肖敏, 韓興 申請人:武漢中博生物股份有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan