培養基及山竹細胞次生代謝物的製備方法與流程
2023-11-11 18:40:42 2
本發明涉及細胞領域，特別涉及培養基及山竹細胞次生代謝物的製備方法。
背景技術：
：山竹又稱山竹子、莽吉柿、鳳果，是藤黃科(Guttiferae)藤黃屬(Garcinia)常綠喬木山竹的果實。近年來山竹的藥理作用成為研究熱點。山竹果殼含有多種氧雜蒽酮衍生物，主要包括α-倒捻子素、γ-倒捻子素等。這些氧雜蒽酮表現出多種生物活性，如抗炎、抗腫瘤、抗氧化及對多種細菌具有抗菌活性。在生物化學上氧雜蒽酮被認為是唯一的自然界找到的由三環芳香族被各種酚類、甲氧基類和異戊二烯所取代，從而產生一系列衍生物的家族。目前，研究人員已經鑑定和分離大約200種氧雜蒽酮，其中40種是在莽吉柿果實中發現的。許多重要的氧雜蒽酮如α－倒捻子酮、β－倒捻子酮、γ－倒捻子酮。目前山竹的氧雜蒽酮類化合物均用化學提取法或複合酶解法。主要存在如下問題：1.化學合成方法工藝複雜。2.安全性低，生產過程中使用大量有機溶劑，極易殘留在成品中。3.受限於山竹的生長季節，影響成品的產量。4.細胞大量培養具有濃縮有效物的功效。技術實現要素：有鑑於此，本發明提供一種培養基及山竹細胞次生代謝物總氧雜蒽酮類化合物的製備方法。本發明利用山竹細胞培養物中的次生代謝物(山竹細胞培養過程中合成並釋放至培養液中具生物活性物質的總稱)含有總氧雜蒽酮類化合物，將其次生代謝物收集進行凍幹保存。利用總氧雜蒽酮類化合物具抗氧化功效，達到抗衰老的目的，可將該凍乾粉運用到化妝品中。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種培養基，包括2,4-D、6-BA和基礎培養基；所述2,4-D在所述培養基中的濃度為0.2～2.0mg/L；所述6-BA在所述培養基中的濃度為0.5～3.0mg/L。在本發明的一些具體實施方案中，所述培養基還包括葡萄糖。在本發明的一些具體實施方案中，所述葡萄糖在所述培養基中的濃度為1.0～5.0g/L。在本發明的一些具體實施方案中，所述培養基中所述基礎培養基為MS培養基。本發明還提供了所述培養基在培養山竹細胞製備次生代謝物中的應用。在本發明的一些具體實施方案中，所述山竹細胞次生代謝物為總氧雜蒽酮類化合物。本發明還提供了一種山竹細胞次生代謝物的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟：步驟1：獲得山竹細胞；步驟2：取步驟1獲得的山竹細胞與本發明提供的培養基混合後初步培養，再與本發明提供的培養基混合後擴大培養，收集培養液。在本發明的一些具體實施方案中，所述製備方法步驟1中所述山竹細胞的製備方法為取山竹果皮與基礎培養基、纖維素酶和果膠酶混合後酶解，過濾，收集濾液。在本發明的一些具體實施方案中，所述製備方法中所述纖維素酶的加入量為所述山竹果皮質量的0.01～0.10％，所述果膠酶的加入量為所述山竹果皮質量的0.01～0.10％。在本發明的一些具體實施方案中，所述製備方法中所述纖維素酶的酶活為30000U/mg，所述果膠酶的酶活為50000U/mg。在本發明的一些具體實施方案中，纖維素酶和果膠酶的體積比1:1。在本發明的一些具體實施方案中，所述酶解的時間為3小時。在本發明的一些具體實施方案中，所述初步培養的條件為：取山竹細胞加入I號滅菌培養基將山竹細胞株配製成1-5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養14天。I號培養基的配方(1LMS培養基中)名稱含量名稱含量2,4-D0.2～1.0mg/L6-BA1.5～3.0mg/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素。在本發明的一些具體實施方案中，所述擴大培養的條件為：經過初步培養後，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養基將山竹細胞配製成1-3x106/ml密度的山竹細胞液置於發酵罐中進行懸浮培養，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養14天。Ⅱ號滅菌培養基的配方(1LMS培養基中)名稱含量名稱含量2,4-D1.0～2.0mg/L6-BA0.5～1.5mg/L葡萄糖1.0～5.0g/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素。在本發明的一些具體實施方案中，步驟2收集培養液之後，還包括過濾、濃縮，收集濃縮液後除菌，凍幹的步驟。在本發明的一些具體實施方案中，所述凍幹為於-20～-35℃，真空度為50～200Pa的條件下，凍幹24～36小時。本發明還提供了所述製備方法製得的山竹細胞次生代謝物。在本發明的一些具體實施方案中，所述山竹細胞次生代謝物為總氧雜蒽酮類化合物。本發明還提供了所述山竹細胞次生代謝物在製備抗脂質過氧化的藥物、食品和/或化妝品中的應用。本發明還提供了所述山竹細胞次生代謝物在製備抗衰老的藥物、食品和/或化妝品中的應用。本發明提供了一種培養基，包括2,4-D、6-BA和基礎培養基。通過該培養基以及本發明提供的方法製得的山竹細胞培養物中的次生代謝物(山竹細胞培養過程中合成並釋放至培養液中具生物活性物質的總稱)含有總氧雜蒽酮類化合物，將其次生代謝物收集進行凍幹保存。利用總氧雜蒽酮類化合物具抗氧化功效，達到抗衰老的目的，可將該凍乾粉運用到化妝品中。具體實施方式本發明公開了一種培養基及山竹細胞次生代謝物的製備方法，本領域技術人員可以借鑑本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
發明內容、精神和範圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。本發明提供了一種山竹細胞次生代謝物的製備方法，包括如下步驟：獲取山竹細胞株：取1kg新鮮山竹進行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸鈉中20分鐘。倒去次氯酸鈉溶液，在無菌條件下，每次使用2L無菌去離子水清洗，共三次，每次清洗過程中輕輕攪動。在無菌的條件下，取下消毒後的山竹果皮，用滅菌後的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。將山竹果皮碎片轉移至無菌乾淨的燒杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培養基，0.01-0.10％纖維素酶和0.01-0.10％果膠酶，消化3小時。優選的，纖維素酶和果膠酶體積比為1:1。用200目無菌網篩對消化液進行過濾，除去雜質，獲得山竹細胞株。山竹細胞大量培養：加入I號滅菌培養基將山竹細胞株配製成1～5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養14天。經過初步培養後，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養基將山竹細胞配製成1-3×106/ml密度的山竹細胞液置於發酵罐中進行懸浮培養，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養14天。I號培養基的配方(1LMS培養基中)：名稱含量名稱含量2,4-D0.2-1.0mg/L6-BA1.5-3.0mg/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素Ⅱ號滅菌培養基的配方(1LMS培養基中)：名稱含量名稱含量2,4-D1.0-2.0mg/L6-BA0.5-1.5mg/L葡萄糖1.0-5.0g/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素山竹細胞次生代謝物凍乾粉的製備：收集山竹細胞培養物，用0.45μM的濾膜對其進行過濾，濃縮，將得到的濃縮上清用0.22μM過濾除菌。除菌後進行凍幹處理，凍幹溫度為-20～-35℃，真空度為50～200Pa，凍幹時間為24～36小時，即得到山竹細胞的次生代謝物凍乾粉。將凍乾粉分裝成1ml/支。本發明採用植物細胞培養法提取山竹中的總氧雜蒽酮類化合物對提取出的總氧雜蒽酮類化合物進行凍幹處理，易於保存和應用，增大穩定性。有益效果包括：1.提取工藝穩定，有效成分濃度大，並能保存其活性。2.安全性高，不殘留有機溶劑。3.不受限於山竹的生長季節影響。本發明提供的培養基及山竹細胞次生代謝物的製備方法中所用原料及試劑均可由市場購得。下面結合實施例，進一步闡述本發明：實施例1獲取山竹細胞株：取1kg新鮮山竹進行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸鈉中20分鐘。倒去次氯酸鈉溶液，在無菌條件下，每次使用2L無菌去離子水清洗，共三次，每次清洗過程中輕輕攪動。在無菌的條件下，取下消毒後的山竹果皮，用滅菌後的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。將山竹果皮碎片轉移至無菌乾淨的燒杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培養基，0.01％纖維素酶和0.05％果膠酶，消化3小時。纖維素酶的酶活為30000U/mg，果膠酶的酶活為50000U/mg。用200目無菌網篩對消化液進行過濾，除去雜質，獲得山竹細胞株。山竹細胞大量培養：加入I號滅菌培養基將山竹細胞株配製成1～5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養14天。經過初步培養後，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養基將山竹細胞配製成1-3×106/ml密度的山竹細胞液置於發酵罐中進行懸浮培養，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養14天。表1I號培養基的配方(1LMS培養基中)名稱含量名稱含量2,4-D0.2mg/L6-BA3.0mg/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素表2Ⅱ號滅菌培養基的配方(1LMS培養基中)名稱含量名稱含量2,4-D1.0mg/L6-BA1.5mg/L葡萄糖3.0g/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素山竹細胞次生代謝物凍乾粉的製備：收集山竹細胞培養物，用0.45μM的濾膜對其進行過濾，濃縮，將得到的濃縮上清用0.22μM過濾除菌。除菌後進行凍幹處理，凍幹溫度為-28℃，真空度為50Pa，凍幹時間為30小時，即得到山竹細胞的次生代謝物凍乾粉。將凍乾粉分裝成1ml/支。實施例2獲取山竹細胞株：取1kg新鮮山竹進行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸鈉中20分鐘。倒去次氯酸鈉溶液，在無菌條件下，每次使用2L無菌去離子水清洗，共三次，每次清洗過程中輕輕攪動。在無菌的條件下，取下消毒後的山竹果皮，用滅菌後的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。將山竹果皮碎片轉移至無菌乾淨的燒杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培養基，0.10％纖維素酶和0.01％果膠酶，消化3小時。纖維素酶的酶活為30000U/mg，果膠酶的酶活為50000U/mg。用200目無菌網篩對消化液進行過濾，除去雜質，獲得山竹細胞株。山竹細胞大量培養：加入I號滅菌培養基將山竹細胞株配製成1～5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養14天。經過初步培養後，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養基將山竹細胞配製成1-3×106/ml密度的山竹細胞液置於發酵罐中進行懸浮培養，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養14天。表3I號培養基的配方(1LMS培養基中)名稱含量名稱含量2,4-D1.0mg/L6-BA1.5mg/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素表4Ⅱ號滅菌培養基的配方(1LMS培養基中)名稱含量名稱含量2,4-D1.5mg/L6-BA1.0mg/L葡萄糖1.0g/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素山竹細胞次生代謝物凍乾粉的製備：收集山竹細胞培養物，用0.45μM的濾膜對其進行過濾，濃縮，將得到的濃縮上清用0.22μM過濾除菌。除菌後進行凍幹處理，凍幹溫度為-35℃，真空度為200Pa，凍幹時間為36小時，即得到山竹細胞的次生代謝物凍乾粉。將凍乾粉分裝成1ml/支。實施例3獲取山竹細胞株：取1kg新鮮山竹進行清洗消毒，浸在10L15％-20％次氯酸鈉中20分鐘。倒去次氯酸鈉溶液，在無菌條件下，每次使用2L無菌去離子水清洗，共三次，每次清洗過程中輕輕攪動。在無菌的條件下，取下消毒後的山竹果皮，用滅菌後的剪刀剪碎，每片碎片大小≤1mm2。將山竹果皮碎片轉移至無菌乾淨的燒杯中，每1.0g碎片加入10mlMS(MurashigeandSkoog)培養基，0.05％纖維素酶和0.10％果膠酶，消化3小時。纖維素酶的酶活為30000U/mg，果膠酶的酶活為50000U/mg。用200目無菌網篩對消化液進行過濾，除去雜質，獲得山竹細胞株。山竹細胞大量培養：加入I號滅菌培養基將山竹細胞株配製成1～5×105/ml密度的山竹細胞液，取100ml山竹細胞液加入250ml無菌三角燒瓶中，在旋轉式搖床上，以100-200rpm/min，25-26℃，培養14天。經過初步培養後，250g離心10min去除上清液，加入Ⅱ號滅菌培養基將山竹細胞配製成1-3×106/ml密度的山竹細胞液置於發酵罐中進行懸浮培養，130-140rpm/min，25-26℃，通入過濾空氣，速率為0.01-0.05m3/s，培養14天。表5I號培養基的配方(1LMS培養基中)名稱含量名稱含量2,4-D0.6mg/L6-BA2.2mg/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素表6Ⅱ號滅菌培養基的配方(1LMS培養基中)名稱含量名稱含量2,4-D2.0mg/L6-BA0.5mg/L葡萄糖5.0g/L註：2,4-D為生長素，6-BA為細胞分裂素山竹細胞次生代謝物凍乾粉的製備：收集山竹細胞培養物，用0.45μM的濾膜對其進行過濾，濃縮，將得到的濃縮上清用0.22μM過濾除菌。除菌後進行凍幹處理，凍幹溫度為-20℃，真空度為120Pa，凍幹時間為24小時，即得到山竹細胞的次生代謝物凍乾粉。將凍乾粉分裝成1ml/支。實施例4次生代謝物凍乾粉中總氧雜蒽酮類含量的測定標準曲線的製備：精密量取α－倒捻子素對照品溶液0，5，10，15，20，25，30μl，總氧雜蒽酮類濃度分別為0，10，15，20，25，30μg/ml，分別置於10ml具塞試管中，加甲醇至1.0ml，搖勻，以甲醇為空白。分別加0.25ml5％亞硝酸鈉溶液，搖勻，室溫放置9min。再加入0.35ml10％硝酸鋁溶液，搖勻，室溫放置6min。再加入3.0ml4％氫氧化鈉溶液，加甲醇補足體積至5ml，搖勻，室溫放置15min，370nm波長處測定吸光度，以α－倒捻子素的量對吸光度作標準曲線。總氧雜蒽酮的提取及測定：樣品組1～樣品組3：採用實施例1～實施例3製備的凍乾粉溶解成液體。取樣品粉末0.25g，精密稱定，置於具塞試管中，加入5ml檸檬酸－檸檬酸鈉緩衝液和一定質量分數的酶，在一定溫度和pH下水浴一定時間，過濾，棄去酶液，再向藥渣中加入液固比為1∶17(g/ml)的90％乙醇，超聲提取74min後，過濾，並轉移至10ml量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。分別吸取對照品溶液與供試品溶液各20μl，同時顯色，測定吸光度。結果見表7。表7組別總氧雜蒽酮類含量(μg/ml)樣品組1(實施例1製備)31.2樣品組2(實施例2製備)30.7樣品組3(實施例3製備)30.4結論：本專利的植物細胞培養方法能成功提取出豐富的總氧雜蒽酮類物質，且不同批次間的含量無明顯差別(P<0.05)，證明方法穩定。實施例5山竹次生代謝物凍乾粉對大白鼠皮膚組織勻漿中MDA生成量的影響自由基形成後，其代謝產物丙二醛(MDA)含量明顯增高，MDA為極活潑的交聯劑，它能使真皮結構發生大分子交聯，使真皮纖維扭曲增粗紊亂，使人的皮膚在外觀上日見衰老，MDA含量的高低可間接表徵物質的抗脂質過氧化(即抗MDA生成)活性，MDA含量越小，表明物質的抗脂質過氧化能力越強；反之，則抗脂質過氧化能力越弱。將40隻大白鼠分成4組，每組10隻，去其背部被毛，暴露面積約6cm。，取同一批次的實施例1製備的山竹細胞次生代謝物凍乾粉，塗抹前將與其配對的2ml溶酶完全倒入凍乾粉中，充分混勻，將2ml混合物全部均勻地塗抹至小鼠暴露的背部，每兩天塗抹一次。第一組，連續塗抹實施例1製備的山竹細胞次生代謝物凍乾粉5次後處死，取背部皮膚組織勻漿，製作為10％的勻漿。第二組，連續塗抹實施例1製備的山竹細胞次生代謝物凍乾粉10次後處死，取背部皮膚組織勻漿，製作為10％的勻漿。第三組，連續塗抹實施例1製備的山竹細胞次生代謝物凍乾粉15次後處死，取背部皮膚組織勻漿，製作為10％的勻漿。第四組不塗抹實施例1製備的山竹細胞次生代謝物凍乾粉，30天後處死，取背部皮膚組織勻漿，製作為10％的勻漿。標準管取0.2ml10mol/ml標準品、標準空白管取0.2ml無水乙醇、測定管取0.2ml測試樣品，然後三管均加入0.2ml試劑一，混勻後，均加入3ml試劑二和1ml試劑三。旋渦混勻器混勻，試管口用保鮮薄膜紮緊，刺一小孔，95℃水浴40分鐘，取出後流水冷卻，然後3500轉/分，離心10分鐘。取上清，532mm處，1cm光徑，蒸餾水調零，比色測各管吸光度值。結果見表8。表8註：*表明與對照組之間數據有顯著差異(P<0.05)結論：證明本專利提取的總氧雜蒽酮類具有明顯抗氧化作用(P<0.05)，隨著使用天數的增加，效果有明顯提升。取實施例2、實施例3製備的山竹細胞次生代謝物凍乾粉進行上述實驗，實驗結果與實施例1製備的山竹細胞次生代謝物凍乾粉的實驗結果相近，與其無顯著差異(P＞0.05)。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。當前第1頁1 2 3