一種P4HB基因表達的抑制劑及其應用的製作方法

2023-11-11 17:32:42

本發明屬於生物醫藥
技術領域：
：，具體涉及一種P4HB基因表達的抑制劑及其應用。
背景技術：
：：傳統的醫藥領域，有機化合物和抗體是治療各類疾病的特效藥，而近年來，隨著分子生物學在醫藥領域的應用以及新的治療理念的提出，在生物體內控制特定的基因表達的功能性核酸作為一種新型醫藥或診斷藥備受關注。目前，作為新型醫藥或診斷藥的功能性核酸主要有RNAi(RNAinterference：RNA幹擾)，其藥物作用機理主要是RNAi的基因沉默，功能性RNA片段與轉錄因子等靶物質特異性結合來抑制其功能的核酸適體，或與靶mRNA結合而抑制其翻譯的反義核酸，從而特異性地阻礙靶基因的mRNA前體中的多聚腺苷酸化而使其不穩定化後，從而抑制靶基因的表達。具有轉錄後抑制靶基因的表達的功能性RNA片段的種類主要包括siRNA(smallinterferingRNA，小幹擾RNA)、shRNA(shorthairpinRNA，短髮夾RNA)及miRNA(microRNA，微小RNA)，從功能上，這些均被期待作為下一代的醫藥或診斷藥。但是肝癌的發生和發展是一個較為複雜的過程，異常表達的基因成千上萬，目前還沒有找到一種在肝癌組織中起關鍵作用的基因，並且通過抑制該基因能夠遏制肝癌的發生或惡化。技術實現要素：有鑑於此，本發明的目的在於一種抑制P4HB基因表達的抑制劑siRNA，可以有效沉悶P4HB的表達，進而抑制肝癌組織的增長。為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：本發明提供了一種P4HB基因表達的抑制劑，所述抑制劑為具有SEQIDNo1所示核苷酸序列的siRNA分子。本發明還提供了所述抑制劑在製備預防或治療肝癌的藥物中的應用。優選的，所述的藥物包括連接有所述的抑制劑的重組載體。優選的，所述重組載體的載體為聚乙烯亞胺。優選的，所述siRNA分子與聚乙烯亞胺的摩爾比為1:2～4。優選的，所述藥物的劑型為注射劑。優選的，所述的抑制劑通過下調P4HB基因表達，使細胞中GRP78表達量上調，以及抑制上皮間質轉化(EMT)，從而抑制肝細胞癌的發生發展。本發明提供了一種P4HB基因表達的抑制劑，所述抑制劑為具有SEQIDNo1所示核苷酸序列的siRNA分子。本發明提供的抑制劑，通過siRNA分子的核苷酸序列與P4HB基因表達產生的mRNA發生互補結合，從而阻止靶位點P4HB基因的表達成蛋白質，從而使P4HB基因沉默，達到抑制P4HB基因表達的目的。本發明還提供了所述抑制劑在製備預防或治療肝癌的藥物中的應用。本發明研究發現P4HB在肝癌組織和細胞系中過度表達的特點，另外腫瘤P4HB水平與疾病的進展和轉移呈正相關，並與病人的存活率負相關，P4HB基因過表達能夠促進肝癌細胞生長、遷移、侵襲。因此，本發明提供所述抑制劑與P4HB基因表達產生的mRNA發生互補結合，使P4HB基因沉默，從而使上皮細胞轉分化(EMT)能夠起到相反的作用。同時，P4HB沉默可以抑制肝癌細胞的體內成瘤。進一步的，本發明提供的應用，通過所述抑制劑抑制P4HB基因表達使細胞中GRP78表達量上調，GRP78具有抑制肝癌細胞的EMT、遷移和侵襲的作用，同時能夠拮抗由P4HB過表達引起的肝癌細胞EMT、遷移和侵襲。附圖說明圖1為實施例1中肝癌細胞系與正常組織細胞中P4HB蛋白的表達量；圖2為實施例2中肝癌細胞系與正常組織細胞中P4HBmRNA的表達量；圖3為實施例3中MTT檢測細胞增殖情況；圖4為實施例4中qRT-PCR檢測P4HBmRNA表達量；圖5為實施例4中qRT-PCR檢測GRP78mRNA表達量。圖6為實施例4中P4HB和GRP78mRNA在人肝細胞癌組織中的表達水平相關性分析；圖7為實施例5中Westernblot檢測P4HB蛋白表達量；圖8為實施例5中Westernblot檢測上皮標誌物E-cadherin、間質標誌物N-cadherin和波形蛋白的蛋白表達量；圖9為實施例5中Westernblot檢測上皮標誌物GRP78蛋白表達量；圖10為實施例6中Transwell技術檢測細胞遷移的情況圖片；圖11為實施例6中HepG2和Huh-7細胞經處理後細胞遷移數量柱狀圖；圖12為實施例6中Transwell技術檢測細胞侵襲的情況圖片；圖13為實施例6中HepG2和Huh-7細胞經處理後細胞侵襲數量柱狀圖；圖14為實施例7中免疫螢光分析E-cadherin的表達量圖片圖15為實施例7中免疫螢光分析波形蛋白的表達量圖片圖16為實施例8中不同處理的腫瘤圖片；圖17為實施例8中腫瘤體積的柱狀圖；圖18為實施例8中腫瘤重量的柱狀圖；圖19為實施例9中siRNA治療組腫瘤體積顯著低於載體PEI對照組和空白對照組；圖20為實施例9中siRNA組瘤體病理圖；圖21為實施例9中載體對照組瘤體病理圖；圖22為實施例9中空白對照組瘤體病理圖。具體實施方式本發明提供了一種P4HB基因表達的抑制劑，所述抑制劑為具有SEQIDNo1所示核苷酸序列的siRNA分子。本發明中，所述抑制劑的核苷酸序列優選利用siRNA靶點尋找工具「siRNAfinder」(http://www.ambion.com/techlib/misc/siRNA_finder)根據P4HB基因的mRNA(GeneBankaccessionno.AF015950)的開放可讀框內的靶向特定序列設計而成。所述的siRNA序列在合成前優選進行BLAST檢索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，侯選siRNA序列在美國NCBI(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的Unigene資料庫進行BLAST同源性比對。當siRNA序列只同源於靶基因時，才可以用於下一步的基因功能研究。本發明對所述siRNA分子的合成沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的siRNA分子合成方法即可。本發明實施例中所述siRNA分子是由上海吉瑪製藥技術有限公司根據本發明提供的序列合成得到。本發明還提供了所述抑制劑在製備預防或治療肝癌的藥物中的應用。本發明中，所述的藥物包括連接有所述的抑制劑的重組載體。本發明對所述重組載體的載體優選為聚乙烯亞胺(PEI)。所述聚乙烯亞胺的分子量優選為700～1000Da，更優選為800Da。本發明對聚乙烯亞胺的來源沒有特殊限制，採用本領域技術人員所熟知的聚乙烯亞胺即可。本發明中，所述siRNA分子與聚乙烯亞胺的摩爾比優選為1:2～4，更優選為1:3。本發明中，所述藥物的劑型為注射劑。所述注射劑中抑制劑的濃度優選為80～120mg/ml，更優選為100mg/ml。本發明中所述注射劑還包括注射劑可接受輔料。所述輔料優選包括緩衝液、分散劑、助懸劑、穩定劑、防腐劑和抗氧化劑中的一種或多種。所述注射劑的溶劑為注射用水。本發明中，所述緩衝液的用量優選以調節體系的pH值在5.0～8.0為準；所述的緩衝液優選為枸櫞酸鹽緩衝液、醋酸鹽緩衝液或磷酸鹽緩衝液。本發明中，所述防腐劑在注射劑中的質量濃度優選為：0.02％～0.2％(w/v)，更優選為0.1～0.15％，最優選為0.12％；所述的防腐劑為尼泊金甲酯鈉、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯和尼泊金丁酯中的一種。本發明中，所述分散劑在注射劑中的質量百分含量優選為0.5％～15％(w/v)，更優選為1％～10％，最優選為5％；所述的分散劑優選為聚乙烯吡咯烷酮；本發明中，所述助懸劑在注射劑中的質量百分含量優選為0.2％～20％(w/v)，更優選為0.5％～15％，最優選為10％；所述的助懸劑優選為羧甲基纖維素或羧甲基纖維素鈉；本發明中，所述穩定劑在注射劑中的質量百分含量優選為0.01％～0.2％(w/v)，更優選為0.08～0.15％，最優選為0.08％；所述穩定劑的種類為RNAstable(R)穩定劑。所述RNAstable(R)穩定劑購自Qiagen.德國。本發明中，所述抗氧化劑在注射劑中的質量百分含量優選為0.02％～0.5％(w/v)，更優選為0.08～0.3％，最優選為0.15％；所述的抗氧化劑優選為連二亞硫酸鈉。本發明中，所述的抑制劑通過下調P4HB基因表達，使細胞中GRP78表達量上調，抑制上皮細胞轉分化，從而抑制肝細胞癌的發生發展。本發明中，所述抑制劑抑制肝癌細胞發生增殖、遷移和侵襲，並且還能抑制腫瘤的形成。所述肝癌細胞包括Huh-7細胞、HepG2細胞、PLC5細胞、Hep3B細胞、SK-Hep-1細胞。本發明中，所述注射劑的使用方法優選1次/3日，每次注射0.1ml/Kg。下面結合實施例對本發明提供的一種P4HB基因表達的抑制劑及其應用進行詳細的說明，但是不能把它們理解為對本發明保護範圍的限定。實施例1將人肝癌細胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1細胞和正常肝細胞L02細胞系，用含100U/ml雙抗，10％胎牛血清的DMEM全培養基進行培養48h，培養環境為：37℃、5％CO2、100％溼度；約2d換液一次，每天採用顯微鏡觀察細胞的增殖數量，當細胞呈對數期增長時，採用Westernblot方法分別檢測各細胞系P4HB的表達量：具體步驟如下：①細胞準備細胞轉染24h後，Westernblot法檢測各組細胞蛋白量的表達情況；②相關液體配製A.2MTris-HCl(pH8.8)100m1稱取24.2gTris鹼；加50mlddH2O；緩慢加濃鹽酸至pH8.8(約4m1)；讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，加ddH2O至100ml。B.1MTris-HCl(pH6.8)100m1稱取12.1gTris鹼；加50mlddH2O至pH6.8(約8ml)，讓溶液冷卻至室溫，pH將會升高，加ddH2O至總量為100ml。C.50％甘油100ml取50m1100％甘油；加入50mlddH2O。D.1％溴酚藍10ml稱取100mg溴酚藍；加ddH2O至l0ml，攪拌直到完全溶解；過濾除去聚合的染料。E.lmol/LDTT儲存液用l0ml0.0lmol/L乙酸鈉溶液(pH5.2)溶解1.545gDTT，過濾除菌後-20℃保存。F.丙烯醯胺儲存液100ml30％(W/V)丙烯醯胺，0.8％(W/V)雙丙烯醯胺。29.2g丙烯醯胺；0.8g雙丙烯醯胺(戴手套通風櫃操作，加ddH2O至100ml，緩慢攪拌直至丙烯醯胺粉末完全溶解，石蠟膜封口，過濾後於4℃避光保存。G.10％SDS10gSDS於100ml純水中，緩緩攪拌使其完全溶解，室溫保存。H.電泳緩衝液稱取3.0gTris，甘氨酸14.4g，溶於900ml純水中，充分混勻，溶解後加入10％SDS10ml，定容至1000ml，混勻後室溫保存。轉移緩衝液稱取Tris2.4g，甘氨酸11.5g，溶於700ml純水中，充分溶解後，加入甲醇200ml，定容到1000ml，室溫保存。J.RIPA裂解液50mmol/LTris-HCl，150mmol/LNaCl，1％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，0.1％SDS，溶解混勻後於4℃保存備用，臨用前加入蛋白酶抑制劑(cocktail，1000×)至所需濃度。K.0.01％考馬斯亮藍染液10mg考馬斯亮藍R2500.25g，先加入10ml冰醋酸酸，45ml無水乙醇，攪拌至充分溶解後，定容至100ml，過濾後於4℃避光保存。L.TTBS洗滌液100ml10×TBS+900mlddH2O+1mlTween-20。M.麗春紅染液麗春紅0.025g冰醋酸50m1ddH2O5m1N.脫色液甲醇45m1冰醋酸l0mlddH2O45m1O.5×Samplebuffer(pH調為6.8，在調pH後再加溴酚藍、甘油)③蛋白樣品的製備A.將用於細胞裂解的所有物品及液體放入0℃冰盒預冷。B.按照碧雲天生產Western及IP細胞裂解液說明書配製細胞裂解液。取適當量的裂解液，在使用前數min內加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1mM。C.將24孔板中的培養基倒掉，用預冷的PBS洗滌細胞三遍，每孔加入裂解液100u1，用槍吹打數下，使細胞裂解液與細胞充分接觸，然後放於裝滿碎冰的大託盤中，冰育40min，並放在搖床上不停搖動。D.將細胞混合液轉移到1.5ml離心管，放入超低溫高速離心機離心，條件為：4℃、14000g，5min，吸取上清液至乾淨無菌1.5ml離心管中；E.用nanodrop1000測定蛋白濃度，單位為mg/ml值，標註好，-80℃低溫冰箱保存。F.將上清轉移至另-EP管中，-20℃保存。④SDS-聚丙烯醯胺電泳(SDS-polyacrylamidegeleletrophoresis，SDS-PAGE)SDS-PAGE凝膠配製根據碧雲天生產的SDS-PAGE凝膠配製說明書配製10％分離膠(下層膠)，5％濃縮膠(上層膠)。a.10％分離膠配製：按表1進行配製。表1SDS-PAGE凝膠分離膠加樣表按上述表格所列加入15ml離心管後，振蕩器充分混勻，用1000ul加樣槍沿兩層玻璃板間隙內緩慢注入5ml，用雙蒸水封膠，室溫下聚合60min，當膠凝固後，吸取上層雙蒸水，並儘可能用濾紙吸乾。b.5％濃縮膠配製：按表2進行配製。表2SDS-PAGE凝膠濃縮膠加樣表振蕩器充分混勻，用1000ul加樣槍注入兩側玻璃板間隙，並迅速插入梳子，室溫下聚合約30min，拔出梳子，以備電泳。樣品處理分別取各組同等質量蛋白樣本，稀釋至等體積，98℃水浴鍋中5min，使蛋白變性，冷卻後加入碧雲天生產的SDS-PAGE蛋白上樣緩衝液3ul。上樣與電泳上樣：冷卻到室溫後，用10ul微量加樣器把蛋白樣品緩慢加入加樣孔，每孔約10ul。並加彩色預染蛋白質分子量標準約5ul。電泳：上層濃縮膠條件為：100V，30min；下層分離膠為：200V，30min，待樣品中的溴酚藍遷移至膠的底端附近即可停止電泳，或者可以根據預染蛋白質分子量標準的電泳情況，預計目的蛋白已經被適當分離後即可停止電泳，本實驗觀察到綠色蛋白條帶出現並拉開距離即可停止電泳。⑤轉膜(Transfer)本實驗選用PVDF膜，通過電轉移法將蛋白從聚丙烯醯胺凝膠轉移至PVDF膜上。具體步驟如下：A.戴上乾淨手套，切割以目的蛋白所在為中心區域大小約4cm×2.5cm矩形PVDF膜，分離凝膠與PVDF膜，並在PVDF膜右上角剪一小三角，標示為膜的蛋白面，並浸泡事先準備好的預冷轉膜液中。B.剪6張濾紙及一張PVDF膜，其大小與凝膠大小一致，泡入轉膜液中10min，注意PVDF膜事先需甲醇浸溼，且不能超過15s，再移至轉膜液中。C.在轉膜板中按照從陰極到陽極順序依次放：三層濾紙，凝膠，PVDF膜，三層濾紙，並保證各層之間無氣泡。D.轉模板放入轉膜電泳槽中電泳，恆定電流300mA，60min。注意，轉膜電泳槽裝置需放入冰浴中進行，對抗轉移時產熱。⑥染色(Staining)轉膜後的凝膠用考馬斯亮藍染色，觀察蛋白的殘留情況。或者用麗春紅染色液對PVDF膜進行染色觀察轉膜的效果。TTBS溶液漂洗2-3次，每次3-5min，去除麗春紅或考馬斯亮藍，進行後續的Western檢測。⑦封閉(Blocking)把蛋白膜放置到預先準備好的Western洗滌液中，洗滌3遍，每遍5min，以洗去膜上的轉膜液。加入封閉液，並放入4℃冰箱封閉過夜。注意整個過程PVDF膜不能幹燥，並使液體完全覆蓋蛋白膜。⑧孵育(Incubation)一抗孵育(Primaryantibodyincubation)次日下午用TBST洗滌三次，每次5min，加入兔抗人β-Actin單克隆抗體(工作濃度為1：5000)，封閉放入4℃冰箱過夜。二抗孵育(Secondaryantibodyincubation)隔夜回收一抗，用TTBS洗滌3次，每次5min，吸盡洗滌液，加入Western二抗稀釋液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(工作濃度為1：1000)，室溫下在側擺搖床上搖動孵育60min。回收二抗。用TTBS洗滌4次，每次5min。如果結果背景較高可以適當延長洗滌時間並增加洗滌次數。⑨目的蛋白檢測(Detectionofproteins)A.BeyoECLPlus工作液的配製：等體積混合50ulBeyoECLPlusA液和B液，室溫放置備用。工作液宜在臨檢測前配製。B.Western二抗孵育後，並進行數次洗滌後，用平頭鑷將膜取出，用吸水紙略吸去過多的液體(切勿接觸膜的蛋白面)，然後置於一潔淨保鮮膜上。C.根據膜的大小，按每10平方釐米膜加1mlBeyoECLPlus工作液的比例，滴加BeyoECLPlus工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上，放置1-2min。D.取膜，棄BeyoECLPlus工作液，用吸水紙吸去過多的液體。將膜放在兩片保鮮膜中間，隨後進行壓片檢測或螢光成像儀檢測。E.壓片檢測：將膜固定於片夾內。暗室內壓片1min，立即顯影定影，根據結果再調整壓片時間。或直接分別壓片30s，1，3，5min，然後一起顯影定影觀察結果。F.螢光成像儀檢測：將膜放置到KodakImagestation2000MM螢光成像儀內，參考儀器說明書進行檢測。採用儀器自帶軟體KodakMolecularImagingSoftwareStandardEditionV5.0.1.30分析結合的抗體，並採用光密度分析進行量化。各細胞系的P4HB的表達量如圖1所示。圖1為Westernblot檢測P4HB蛋白在肝癌細胞系包括Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B，和SK-Hep-1與正常組織中的表達量；由圖1可以看出，人肝癌細胞Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B和SK-Hep-1中P4HB的表達量明顯高於正常幹細胞L02細胞系中P4HB的表達量，P4HB在肝癌細胞中呈上調表達，說明P4HB的表達與肝癌的發生有直接聯繫。實施例2將人肝癌細胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1細胞和正常肝細胞L02細胞系進行細胞收集，試劑盒法提取RNA，提取的RNA調整濃度後進行PCR檢測。P4HB基因的PCR正向引物為：5』-GGAATGGAGACACGGCTTC-3』；P4HB的PCR反向引物：5』-TTCAGCCAGTTCACGATGTC-3』。所述PCR的反應程序如表3所示。表3PCR的反應程序qRT-PCR後得到人肝癌細胞Huh-7、HepG2、PLC5、Hep3B、SK-Hep-1細胞和正常肝細胞L02細胞系的P4HB基因的表達情況如圖2所示。由圖2可以看出，以正常組織中P4HB基因的表達量為基準，肝癌細胞Huh-7，HepG2，PLC5，Hep3B和SK-Hep-1細胞的P4HB的mRNA的表達量明顯高於正常組織中P4HB基因的表達量。實施例3將P4HBsiRNA與載體lipofectamineTM2000的連接是物理連接，通過lipofectameTM2000帶有的正電荷將帶有負電荷的siRNA物理包封在lipofectamnie內的。siRNA與lipofectamine混勻後，即實現了物理接連。用P4HB抑制劑siRNA分子、對照siRNA、P4HB載體和空載體分別轉染HepG2和Huh-7細胞24小時。得到處理後的HepG2和Huh-7細胞。具體採用商品化的載體lipofectaminTM2000進行轉染，步驟如下：先將裝有1OD(3.0nmol)siRNA的乾粉的Ep管在臺式離心機上瞬時離心4s，然後緩慢打開管蓋，溶解時加入150ulDEPC處理水後蓋上蓋子，震蕩溶解，使其siRNA終濃度為20uM。為避免多次凍溶，將其分裝入0.1mlEP管，每管約15ul，標註種類、日期，放入-80℃冰箱備用。準備工作：首先向準備好的Ep管內分別加入150ul左右的opti-MEM培養基；接著分別加入6ul的siRNA和對照組siRNA；然後將36ulLipofectamineTM2000和900ulopti-MEM混勻後的混合液，將混合液靜置5min，分別取出150ul混合液加入到含siRNA和對照組siRNA管內，然後混勻，靜置20min；轉染：分別在製備的lipofectamine-saRNA溶液中取100ul加入到對應的Huh-7、HepG2細胞孔中，例如從siRNA管分別取出100ul(共三次)加入到siRNA組各孔細胞中，以此類推到對照組的管，最終每孔中siRNA的濃度約為80nM。換液：轉染後培養6h，棄細胞培養基，用PBS緩衝液洗滌2次，每孔加入500μl的DMEM全培養基，繼續培養48h。轉染後，將細胞接種於24孔板，每孔2×104個細胞，細胞培養箱培養72小時。在不同時間點(12h、24h、48h和72h)，去除培養基，採用MTT試劑盒分析細胞相對活性，加樣後，用分光光度計在550nm波長下測量每孔細胞的OD值。MTT檢測細胞增殖情況如圖3所示。由圖3可以看出，P4HBsiRNA組細胞相對系對細胞數顯著低於兩個對照組(對照siRNA組、對照載體組)，說明通過siRNA下調P4HB表達水平，可抑制細胞增殖。P4HB組細胞相對數量最高，說明，通過向細胞內轉染P4HB基因，上調P4HB表達水平，可促進腫瘤細胞增殖。實施例4對實施例3處理得到的HepG2和Huh-7細胞檢測P4HB和GRP78基因進行qRT-PCR檢測。分別提取肝癌細胞的總RNA，分別取1ugRNA採用Moloneymurineleukemiavirus(M-MLV)逆轉錄，合成cDNA，然後根據SYBRGreenreactionmix(AppliedBiosystems,USA)操作指南進行加樣，在型號為anABIPrism7900HT螢光定量PCR儀進行實時螢光定量PCR。P4HB的PCR正向引物為：5』-GGAATGGAGACACGGCTTC-3』；P4HB的PCR反向引物：5』-TTCAGCCAGTTCACGATGTC-3』。GRP78的PCR正向引物為：5』-GCCTGTATTTCTAGACCTGCC-3』；GRP78的PCR反向引物5』-TTCATCTTGCCAGCCAGTTG-3』；以β-actin基因作為內參基因；所述β-actin基因的PCR正向引物為：5』-AGCGCGGCTACAGCTTCA-3』；所述β-actin基因的PCR反向引物為5』-GGCCATCTCTTGCTCGAAGT-3』。PCR體系擴增的程序如表4所示。表4PCR體系擴增的程序qRT-PCR檢測P4HBmRNA表達量如圖4所示；qRT-PCR檢測GRP78mRNA表達量如圖5所示。圖6為P4HB和GRP78mRNA在人肝細胞癌組織中的表達水平相關性分析。由圖4可知，P4HBsiRNA可顯著下調P4HB基因表達水平，P4HBsiRNA組P4HBmRNA相對表達水平顯著高於對照siRNA組(controlsiRNA)，P4HB載體組(向細胞內轉染P4HB基因)的P4HBmRNA表達水平顯著高於載體對照組(controlvector組)。說明可通過轉染siRNA下調P4HB表達水平，轉染P4HB上調P4HB表達水平。由圖5和圖6可知，P4HB基因表達水平與GRP78基因表達水平呈負相關。下調P4HB基因表達水平，GRP78基因表達水平升高，上調P4HB基因表達水平，GRP78基因表達水平下降。實施例5針對實施例3處理得到的肝癌組織HepG2和Huh-7細胞，分別提取P4HB蛋白、GRP78、E-鈣粘素、N-鈣粘素、波形蛋白和β-actin蛋白進行Westernblot分析。將HepG2和Huh-7細胞樣本放入在RIPA裂解液，存於-80℃，待用。HepG2和Huh-7細胞經PBS洗去培養基後，採用含有全蛋白酶抑制劑的裂解液。然後每個樣本分別取20ug總蛋白，進行加樣，分析採用SDS-PAGE膠進行電泳，PVDF膜進行轉膜。轉膜後分別與抗P4HB、抗GRP78、抗E-鈣粘素、抗N-鈣粘素、抗波形蛋白、抗β-actin蛋白在4℃過夜孵育，之後，PBS洗去液體，採用辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下孵育1小時。採用VersaDoc5000密度儀測量PVDF膜上蛋白條帶的密度，進一步量化分析。圖7為Westernblot檢測P4HB蛋白表達量，圖8為Westernblot檢測上皮標誌物E-cadherin、間質標誌物N-cadherin和波形蛋白的蛋白表達量，圖9為Westernblot檢測上皮標誌物GRP78蛋白表達量。由圖7可知，P4HBsiRNA可顯著下調P4HB蛋白表達水平，P4HBsiRNA組P4HB蛋白相對表達水平顯著高於對照siRNA組(controlsiRNA)，P4HB載體組(向細胞內轉染P4HB基因)的P4HB蛋白表達水平顯著高於載體對照組(controlvector組)。說明可通過轉染siRNA下調P4HB蛋白表達水平，轉染P4HB上調P4HB蛋白表達水平。由圖9可知，P4HB蛋白表達水平與GRP78蛋白表達水平呈負相關。下調P4HB蛋白表達水平，GRP78蛋白表達水平升高，上調P4HB蛋白表達水平，GRP78蛋白表達水平下降。由圖8可知，下調P4HB表達水平(P4HBsiRNA組)，E-cadherin蛋白表達水平相對對照組(controlsiRNA組)升高，N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平相對對照組(controlsiRNA組)下降；上調P4HB表達水平(P4HBvector組)，E-cadherin蛋白表達水平相對對照組(controlsiRNA組)下降，N-cadherin和Vimentin蛋白表達水平相對對照組(controlsiRNA組)升高。E-cadherin蛋白表達降低、N-cadherin和Vimentin蛋白升高是腫瘤細胞EMT過程的表現，EMT是促進腫瘤細胞轉移、侵襲力、耐藥、輻射抵抗的重要因素。因此，說明可通過下調P4HB表達水平，降低腫瘤EMT，從而降低腫瘤的惡性表現。實施例6細胞遷移和侵襲力分析採用8um膜的Transwell室分析細胞遷移和侵襲能力。遷移能力：將1×105個細胞加到不含胎牛血清的DMEM培養基中，然後加到Transwell室上部，Transwell室下部加滿生長培養基。24小時，刮去室上部的細胞，遷移到室下部的細胞進行固定，用0.1％濃度的結晶紫染色，成像。分析侵襲能力：Transwell室的膜上覆蓋一層基質膠(Matrigel)，餘方法同遷移能力方法。圖10為Transwell技術檢測細胞遷移的情況圖片；圖11為HepG2和Huh-7細胞經處理後細胞遷移數量柱狀圖。圖12為Transwell技術檢測細胞侵襲的情況圖片；圖13為HepG2和Huh-7細胞經處理後細胞侵襲數量柱狀圖。由圖10～13的結果說明通過P4HBsiRNA下調P4HB表達水平，可降低腫瘤細胞遷移和侵襲能力。實施例7轉染後的各組(P4HBsiRNA組、controlsiRNA組、P4HBvector組和controlvector組)細胞接種於2-井室的細胞培養玻片上，24h後，各組細胞內分別加入抗-E-candherin或抗-vimentin抗體，在4℃孵育12h後，用PBS洗去抗體，然後加入FITC連接的二抗，室溫孵育1h，去培養液，用DAPI染色，然後用SP2MP共聚焦顯微鏡觀察、拍照、分析。圖14和圖15分別為免疫螢光分析E-cadherin和波形蛋白的表達量圖片。實施例8將裸鼠分成兩組，其中一組在裸鼠的右側皮下種植含有抑制劑siRNA重組載體轉染後的HepG2細胞，種植5×106個細胞/只；另一組小鼠在相同部位注射相同劑量的對照siRNA轉染的HepG2細胞。將兩組裸鼠在相同的環境條件下飼養37天，分別從兩組裸鼠體內取出腫瘤組織。測量腫瘤體積，稱量腫瘤重量，並做記錄。圖16為腫瘤圖片；對不同處理得到的裸鼠體內產生的腫瘤體積情況如圖17所示；不同處理得到的裸鼠體內產生的腫瘤重量如圖18所示。由圖16～17可知，通過siRNA下調P4HB表達水平的瘤細胞植入裸鼠體內後，發展為瘤組織的體積、重量均顯著低於對照組。說明該siRNA可以抑制腫瘤的發生發展。實施例9將P4HB抑制劑與PEI、聚乙烯吡咯烷酮、磷酸鹽緩衝液、羧甲基纖維素鈉、連二亞硫酸鈉和注射用水配置成注射劑，注射劑中P4HB抑制劑的終濃度為100mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮的質量濃度為5％，連二亞硫酸鈉0.15％，注射劑的pH值為6.8。移植瘤長徑大小約0.5cm的肝細胞癌移植瘤裸鼠作為研究對象，進行靜脈注射小鼠，按照每千克小鼠注射10ml的注射液，每三天注射一次。實驗組為5隻，對照組分為PEI載體對照組和空白對照組(生理鹽水注射)，均為同批移植瘤裸鼠，載體對照組注射同等體積的載體PEI溶液，空白對照組注射同等體積的生理鹽水。結果如圖19和圖20所示。圖19顯示siRNA治療組腫瘤體積顯著低於載體PEI對照組和空白對照組(生理鹽水組)。說明以PEI為載體的siRNA通過靜脈注射，可以顯著抑制腫瘤的增長。圖20為siRNA組瘤體病理圖。由圖20可知，圖片中有可見片狀壞死紅染(如黑色箭頭所示處)，其他部分瘤細胞結構模糊、核固縮、核染色變深、核仁邊界不清。載體對照組和空白對照組病理圖如圖21和圖22所示。由圖21和22中可知，圖片中可見瘤細胞呈增殖狀態(如灰色箭頭所示處)，壞死較少。圖20～圖22經過比較，說明siRNA可促使腫瘤組織內細胞壞死，抑制腫瘤組織發生發展。由以上實施例可知，本發明設計合成的靶向P4HB的siRNA，採用Lipofectamine2000轉染肝癌HepG2細胞系，然後通過RT-PCR和westernblot分別檢測HepG2細胞內靶基因mRNA和蛋白表達水平，結果說明本研究設計的siRNA可以有效沉默P4HB的表達，進一步負向調控肝癌的EMT過程，及抑制肝癌組織的增長。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本
技術領域：
：的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。SEQUENCELISTING上海市第七人民醫院一種P4HB基因表達的抑制劑及其應用20161PatentInversion3.3121RNA人工序列1aagatgaactgtaatacgcaa21當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp