檢測化合物或試劑降低微粒體前列腺素e合酶或造血前列腺素d合酶活性的能力的方法
2023-11-11 21:51:22 2
專利名稱：檢測化合物或試劑降低微粒體前列腺素e合酶或造血前列腺素d合酶活性的能力的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測化合物或試劑降低前列腺素合酶活性的能力的新穎和有用的方法。更具體地說，本發明涉及一種檢測化合物或試劑降低微粒體前列腺素E合酶(mPGES)活性或造血前列腺素D合酶(hPGDS)活性的能力的方法。
背景技術：
前列腺素是一類在疼痛、發燒和炎症過程中起重要作用的類花生酸(eicosanoids)。它們在體內從花生四烯酸合成，具有一個構成花生四烯酸碳鏈一部分的五元碳環。前列腺素不是激素，僅在被合成部位附近起局部作用。
PGE2和PGD2這兩種前列腺素在發燒、疼痛和炎症中均起著特別重要的作用。尤其是，在抗原刺激下肥大細胞產生的PGD2水平升高，而PGD2是呼吸道過敏性疾病的一種主要介質。尤其是，除了其它症狀之外，它可引起支氣管收縮、支氣管機能亢進、鼻塞、以及嗜曙紅細胞和TH2細胞浸潤。PGE2是一種疼痛介質，已被證明在誘導痛覺過敏、發燒、血管舒張和水腫中起著一定的作用。
在體內合成過程中，磷脂酶A2將磷脂轉化為花生四烯酸(在體內以酯的形式存在)。隨後，前列腺素內過氧化物合成酶再將花生四烯酸轉化為前列腺素G2(PGG2)。前列腺素內過氧化物合成酶還可催化PGG2中過氧化物基團的還原反應，而形成前列腺素H2(PGH2)，其中PGH2是PGE2和PGD2的前體。在產生PGE2的情況下，前列腺素E合酶(PGES)在輔因子穀胱甘肽(GSH)存在時將PGH2轉化為PGE2。至少存在兩種PGE2合成酶，即細胞質PGES(cPGES)和微粒體PGES(mPGES)。這兩種PGES被廣泛地表達在許多組織中並重疊分布。mPGES可被炎性刺激物例如脂多糖(LPS)、IL-1和TNF-α誘導，而cPGES的表達則是組成性的。此外，已經證明mPGES與COX-2活性有關聯[Murakami等，J.Biol.Chem.27532783(2000)]。
PGD2的產生是前列腺素D合成酶(PGDS)將PGH2轉化為PGD2的結果。已知有兩種類型的PGD2合酶。第一種是載脂型(lipocalin-type)PGDS(L-PGDS)，主要見於中樞神經系統內；第二種是造血型PGDS(hPGDS)，主要見於外周組織。L-PGDS不依賴於穀胱甘肽(GSH)，而hPGDS則依賴於GSH，並具有GST活性。此外，L-PGDS和hPGDS兩者之間幾乎沒有結構同源性。
由於PGD2和PGE2在發燒、疼痛和炎症過程中起著重要作用，人們已經作出許多努力來建立各種檢測方法，以檢測那些可能降低甚至抑制其產生的化合物。尤其是，為了測定某種化合物或試劑降低或抑制前列腺素合酶活性的能力，許多技術例如HPLC、ELISA或RIA等已被用於定量分析PGD2和PGE2的產生。然而，這些技術都具有一定固有的局限性。例如，它們需要多個洗滌步驟、純化步驟和/或使用放射性物質。還有，這些方法比較費時，日通量只有幾十(HPLC)到幾百(ELISA和RIA)個數據點。因此，它們不能用於高通量篩選。
螢光偏振技術是一種用於研究分子間相互作用的技術。這項技術的原理取決於被鑑定分子的大小。尤其是，當用平面偏振光照射螢光分子的時候，被測分子中處於基態的電子躍遷到激發態。在大約4-5納秒之後，這些激發態電子又躍遷回到基態。正是在此衰變過程中，該待測分子發射出螢光信號。在螢光偏振過程中，只有在被測分子在整個激發態始終保持靜止的情況下，才能在同一平面上檢測到這種螢光發射。如果該分子在激發態期間發生運動或旋轉，則所發射的螢光將處於與激發該電子的偏振光不同的平面上。結果，將檢測不到螢光發射。已經普遍接受的是，分子越小則其運動性和旋轉性越大。因此，小分子產生的信號將比大分子小得多，因為大分子在激發態期間將保持相對的靜止。螢光偏振利用的正是分子的這種性質。尤其是，在螢光偏振法分析某種配體的過程中，該配體、示蹤劑(即以螢光標記物標記的配體)和與該配體結合的受體被置於溶液中。於是，該配體和示蹤劑為了結合到受體上而互相競爭。然後，用平面偏振光照射該溶液，再進行信號檢測。如果溶液中沒有多少配體，則所存在的大多數受體將結合示蹤劑。由於受體是一種大分子(相對於配體而言)，故可獲得一種來自標記物螢光的信號，而且可獲得很強的螢光偏振信號。相反，如果存在大量的配體，則大部分受體將與該配體結合。結果，如果有信號產生的話，由示蹤劑單獨產生的螢光偏振信號將明顯小於前述由結合受體的示蹤劑所產生的信號。正是這些信號之間的差異，使得本技術領域中一位普通的技術人員即能確定該配體是否存在並能測定其濃度。螢光偏振按毫螢光偏振度，或mP為單位測量。
因此，螢光偏振比ELISA、HPLC和RIA等檢測方法用起來更為簡便有效。而且，它可容易地用於在很短的時間內高通量篩選大量的化合物或試劑。
所以，所需要的正是一種螢光偏振方法，用於評價化合物或試劑降低或甚至抑制前列腺素合酶活性的能力，尤其是評價某種試劑或化合物是否能夠降低或抑制mPGES產生PGE2的能力，以及評價某種試劑或化合物是否能夠降低或抑制hPGDS產生PGD2的能力。
所需要的還有一種高通量系統，用於評價化合物或試劑降低或抑制前列腺素合酶的活性尤其是mPGES或hPGDS的活性的能力。降低或甚至抑制造血前列腺素D2合酶(hPGDS)或可誘導的微粒體前列腺素E2合酶(mPGES)活性的化合物也許可用於治療炎症和過敏症狀，如關節炎、哮喘以及鼻炎等，此處只舉幾個例子。此外，疼痛和/或發燒可能也能用這樣的化合物或試劑來治療。
本文對任何參考文獻的引用不應被解釋為是承認這類參考文獻是本申請的「現有技術」。
發明概述按照本發明，我們提供一個新的有效方法，用於評價化合物或試劑降低或甚至抑制mPGES或hPGDS產生各自的前列腺素產物之活性的能力，該方法不使用放射性同位素，不需要繁多的洗滌步驟，而且可以體外操作後輸回體內的方式，以體外操作的方式，或以細胞為基礎的方式實施，也可以分離的方式實施。此外，本發明的方法可很容易地以高通量的方式實施。
廣義地，本發明可引申為一種方法，用於確定一種化合物或試劑是否能夠降低前列腺素合酶與其底物反應形成前列腺素產物的活性。其中該前列腺素合酶選自微粒體前列腺素E合酶(mPGES)和造血前列腺素D合酶(hPGDS)。本發明的這種方法包括以下步驟將前列腺素合酶與其底物、輔因子和待測化合物或試劑混合，使得酶促反應能夠發生；然後將該混合物與終止液一起孵育，該終止液含有阻止未反應的底物自發轉化為前列腺素產物的試劑；然後再將該混合物與一種這樣的檢測試劑一起孵育，該檢測試劑含有螢光標記物(即一種示蹤劑)標記的前列腺素產物，以及以前列腺素產物作為免疫原所產生的抗體；隨後，用平面偏振光照射該混合物和以同一方式處理但不含待測化合物或試劑的對照混合物，該平面偏振光的波長為螢光標記物所發出螢光的波長。測定並比較待測混合物與對照混合物的螢光偏振值。如果待測混合物的偏振值大於對照混合物的偏振值，則表明所測化合物或試劑可以降低前列腺素合酶活性。因此，這樣的化合物或試劑可以容易地用於治療患有炎症、過敏、疼痛和發燒或這些病症的任意組合的受試者，此處僅為幾個例子而已。
此外，本發明可延伸至如上所述的一種方法，其中前列腺素合酶是可誘導的微粒體前列腺素E合酶(mPGES)，底物是前列腺素H2(PGH2)，輔因子是穀胱甘肽(GSH)，前列腺素產物是前列腺素E2(PGE2)。本發明之方法所用的mPGES可以來源於牛、羊、嚙齒類動物、馬、狗、人、貓等等。在一具體實施方案中，mPGES來源於人，其胺基酸序列如圖9B和SEQ ID NO2所示。此外，應用於本發明方法的mPGES不必為純化形式。
本發明可進一步延伸為這樣的方法，如本申請書所述，用於確定一種化合物或試劑是否能夠降低前列腺素合酶與其底物反應而形成一種前列腺素產物的活性。其中前列腺素合酶是造血前列腺素D合酶(hPGDS)，底物是PGH2，輔因子是GSH，前列腺素產物是前列腺素D2(PGD2)。正如mPGES一樣，應用於本發明方法的hPGDS可以有眾多的來源。在一具體實施方案中，hPGDS是人hPGDS，其胺基酸序列如
圖10B和SEQ IDNO4所示。而且，hPGDS不必為純化形式。
正如上文所述，在本發明方法中，終止液含有阻止未反應的底物自發轉化為前列腺素產物的試劑。尤其是，如上所述的兩種前列腺素合酶的底物PGH2含有過氧化物基團。雖然無義務解釋其機制，當然也不想受任何解釋的限制，但據認為mPGES和hPGDS可催化PGH2的過氧化物基團的氧鍵斷裂，並將PGH2分別轉化為PGE2和PGD2。然而，PGH2也會自發轉化為PGE2或PGD2。這種自發轉化可以幹擾並改變對化合物或試劑降低mPGES或hPGDS活性之能力的分析結果。因此在本發明方法中，將待測混合物與終止液一起孵育，該終止液含有阻止PGH2自發轉化為PGD2或PGE2的試劑。這種試劑的一個具體例子是濃度約為20mM的FeCl2。然而，本技術領域中一位普通的技術人員就可以容易地熟悉可阻止這種同步轉化的其它試劑，而這類試劑也包括在本發明方法中。而且，這種孵育的持續時間可以改變，但必須長得足以阻止任何剩餘的未反應PGH2轉化為前列腺素產物。
此外，本發明可延伸至這樣的方法，用於確定一種化合物或試劑是否能夠降低前列腺素合酶，尤其是mPGES或hPGDS，與其底物反應形成一種前列腺素產物的活性。其中該待測混合物與終止液一起孵育之後，再與檢測試劑一起孵育，該檢測試劑含有用螢光標記物標記的前列腺素產物和以前列腺素產物作為免疫原的抗體。本技術領域中那些普通技術人員都知道的眾多螢光標記物均可應用於本發明之方法。這些螢光標記物的例子包括螢光素、藻紅蛋白(PE)、德克薩斯紅(Texas red，TR)、羅丹明、游離的鑭系元素鹽、螯合的鑭系元素鹽、CyDye(Amersham Biotech公司產品)、BODIPY(Molecular Probes公司產品)和ALEXA(Molecular Probes公司產品)等，此處僅為幾個例子而已。在一具體實施方案中，螢光標記物是德克薩斯紅。此外，螢光標記物可以直接結合前列腺素產物上，或者備選地先結合到一個接頭分子上，通過該接頭分子再結合到前列腺素產物上。本發明所用的具體的接頭分子包括，但當然不限於，氨基丁酸、氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、Fmoc-氨基己酸、一個或多個β-丙氨酸、異硫氰酸酯基團、琥珀醯亞胺酯、滷代二乙眠碸或碳二亞胺等，此處僅為幾個例子而已。在本發明的一具體實施方案中，該前列腺素產物先結合到一個碳二亞胺接頭上，通過該接頭再結合到螢光標記物如德克薩斯紅上。
此外，本發明可延伸至這樣的方法，用於確定一種化合物或試劑是否能夠降低或抑制可誘導的微粒體前列腺素E合酶(mPGES)與其底物前列腺素H2(PGH2)反應生成前列腺素E2(PGE2)，此方法包括以下步驟(a)將mPGES與PGH2、穀胱甘肽(GSH)和待測化合物或試劑混合至少30秒；(b)步驟(a)之混合物與含有FeCl2的終止液一起孵育；(c)將步驟(b)之混合物與一種檢測試劑一起孵育，該檢測試劑含有用德克薩斯紅標記的PGE2和以PGE2作為免疫原的抗體；(d)用波長為580±20nm的平面偏振光照射步驟(c)之混合物和對照混合物，並測定步驟(c)之混合物和對照混合物的螢光偏振值；(e)比較步驟(d)的測定結果。
如果含有被測化合物或試劑的混合物的螢光偏振測定值大於對照混合物的螢光偏振測定值，則表明該化合物或試劑可降低mPGES的活性。在一具體實施方案中，mPGES是人mPGES，其胺基酸序列如圖9B和SEQID NO2所示，PGE2和德克薩斯紅通過碳二亞胺接頭連接。德克薩斯紅的激發波長是580nm。然而，此波長可以在580nm±20nm範圍內。類似地，德克薩斯紅的螢光發射波長通常被認為是620nm。然而，這個波長可以在620nm±20nm的範圍內變化。激發波長和發射波長的這種變化被包括在本發明中。而且，正如前面所說明的，mPGES不必為純化形式。
此外，本發明可延伸至這樣的方法，用於確定一種化合物或試劑是否能夠降低造血前列腺素D合酶(hPGDS)與其底物前列腺素H2(PGH2)反應形成前列腺素D2(PGD2)，此方法包括以下步驟(a)將hPGDS與PGH2、GSH和待測化合物或試劑混合至少30秒；(b)將步驟(a)之混合物與含有FeCl2的終止液一起孵育；(c)將步驟(b)之混合物與一種檢測試劑一起孵育，該檢測試劑含有用德克薩斯紅標記的PGD2和以PGD2作為免疫原的抗體；(d)用波長為580±20nm的平面偏振光照射步驟(c)之混合物和對照混合物，並測定步驟(c)之混合物和對照混合物的螢光偏振值；(e)比較步驟(d)的測定結果。
如果含有被測化合物或試劑的混合物的螢光偏振測定值大於對照混合物的螢光偏振測定值，則表明該化合物或試劑可降低hPGDS的活性。在一具體實施方案中，hPGDS是人hPGDS，其胺基酸序列如圖10B和SEQID NO4所示，德克薩斯紅和PGD2通過碳二亞胺接頭以化學鍵連接。
此外，本發明可延伸至這樣的方法，用於確定一種化合物或試劑是否能夠降低前列腺素合酶如mPGES或hPGDS，產生前列腺素產物的活性，而且這種方法是以高通量方式進行的。
因此，本發明的一個方面是提供一種方法，用於評價化合物或試劑降低或甚至抑制前列腺素合酶，如mPGES或hPGDS的活性的能力。所以，本發明的方法使得本技術領域中一位普通的技術人員能夠鑑定可應用於治療受試者疼痛、炎症、發燒、或這些病症的某種組合的化合物或試劑。
本發明的另一個方面是提供一種方法，用於評價化合物或試劑降低或抑制mPGES或hPGDS的活性的能力，而且這種方法不需要洗滌步驟或利用放射性同位素。
本發明還有一個方面是提供一種方法，用於評價化合物或試劑降低或抑制前列腺素合酶如mPGES或hPGDS的活性的能力，而且這種方法可以體外操作後輸回體內的方式，以體外操作的方式，或以細胞為基礎的方式實現，也可以分離的方式實施。
本發明還有另一個方面是提供一種方法，用於評價化合物或試劑降低或抑制前列腺素合酶的活性的能力，而且這種方法可以高通量方式進行。
通過參考以下附圖和本發明之詳細說明，將能更好地理解本發明的這些方面及其它方面。
附圖簡述圖1是底物PGH2轉化為PGE2的酶促轉化反應與PGH2轉化為前列腺素產物PGD2或PGE2的自發轉化反應之間的競爭示意圖，其中所用的酶是mPGES，防止該自發轉化反應的試劑是FeCl2。
圖2是本發明之一種方法的示意圖，其中前列腺素合酶是mPGES，前列腺素產物是PGE2。
圖3是底物PGH2轉化為PGD2的酶促轉化反應與PGH2轉化為前列腺素產物PGD2或PGE2的自發轉化反應之間的競爭示意圖，其中所用的酶是hPGDS，防止該自發轉化反應的試劑是FeCl2。
圖4是本發明之一種方法的示意圖，其中前列腺素合酶是hPGDS，前列腺素產物是PGD2。
圖5顯示了MK-886的化學結構。MK-886是一種已知的mPGES抑制劑，用於證明本發明的方法使我們能夠確定一種化合物或試劑是否能夠降低或抑制前列腺素合酶的活性。
圖6是利用前列腺素合酶mPGES和已知的抑制劑MK-886而繪製的本發明之方法的濃度反應曲線示意圖。IC50＝27.5μM。這些結果表明，本發明的方法使本技術領域中一位普通的技術人員能夠確定一種化合物或試劑是否能夠降低前列腺素合酶的活性。此例中的前列腺素合酶是mPGES。
圖7顯示了HQL 79的化學結構。
圖8是一個柱形圖，顯示了由HQL 79所引起的hPGDS活性下降可以通過本發明的方法來檢測。
圖9A和9B顯示了用於下文實施例I中的人mPGES的核苷酸序列和胺基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。
圖10A和10B顯示了人H-PGDS的核苷酸序列和胺基酸序列(SEQ IDNO分別為3和4)。
發明詳述本發明基於這樣一個出乎意料的驚人發現螢光偏振可用於鑑定那些可降低前列腺素合酶(如mPGES或hPGDS)產生前列腺素(如PGD2或PGE2)的活性的化合物或試劑。因此廣義地說，本發明可延伸至這樣的方法，用於確定一種化合物或試劑是否能夠降低前列腺素合酶與其底物反應生成前列腺素產物的活性，其中所述前列腺素合酶選自mPGES或hPGDS，此方法包括以下步驟(a)前列腺素合酶與其底物、輔因子和待測化合物或試劑混合；(b)將步驟(a)之混合物與終止液一起孵育，該終止液含有阻止該底物自發轉化為前列腺素產物的試劑；(c)將步驟(b)之混合物與檢測試劑一起孵育，該檢測試劑含有以螢光標記物標記的前列腺素產物，以及以該前列腺素產物作為免疫原的抗體；(d)用線性偏振光照射步驟(c)之混合物和對照混合物，該偏振光的波長為螢光標記物所發出螢光的波長，並測定步驟(c)之混合物和對照混合物的螢光偏振值；以及(e)比較步驟(d)的測定結果，上述步驟中如果步驟(d)之混合物的螢光偏振測定值大於對照混合物的螢光偏振測定值，則表明該化合物或試劑可降低前列腺素合酶的活性。
貫穿本說明書和所附權利要求書的眾多術語與短語之定義如下，即本文中所用的術語「化合物」或「試劑」指的是目前已知的或以後發現的任何化學成份。本發明所用的化合物或試劑的例子包括有機化合物(例如人造的或天然存在的)、肽(人造的或天然存在的)、糖類、核酸分子等等。
本文中所用的術語「酶」指的是這樣的生物分子，例如可催化特定化學反應的蛋白質或RNA。酶不影響催化反應的平衡，而是通過降低活化能的方式來提高反應速度。
本文中所用的術語「前列腺素合酶」指的是可催化前列腺素H2(PGH2)轉化為前列腺素產物的酶。應用於本發明的前列腺素合酶的具體例子包括可誘導的微粒體前列腺素E合酶(mPGES)，該酶在輔因子穀胱甘肽(GSH)存在的情況下將前列腺素H2轉化為前列腺素E2(PGE2)。另一個例子是造血前列腺素D合酶(hPGDS)，該酶在輔因子GSH存在的情況下將前列腺素H2轉化為前列腺素D2(PGD2)。
本文中所用的術語「底物」指的是在酶的作用下以產生反應產物的化合物。本發明所用底物的例子是PGH2。
本文中所用的術語「輔因子」指的是對酶活性所需的有機分子、無機分子、肽或蛋白質。在本發明的一具體實施方案中，前列腺素合酶是mPGES或hPGDS，輔因子是穀胱甘肽(GSH)。
本文中所用的術語「前列腺素產物」指的是由於前列腺素合酶作用於前列腺素合酶的底物而生成的反應產物。因此，對於mPGES，該前列腺素產物是PGE2；對於hPGDS，該前列腺素產物是PGD2。
本文中所用的術語「螢光標記物」指的是當用特定波長的光照射時可發出螢光的物質，該物質可直接結合到目的化合物上或者先結合到一個接頭分子上，通過該接頭再結合到目的化合物上。應用於本發明方法的螢光標記物的例子包括，但當然不限於，螢光素、藻紅蛋白(PE)、德克薩斯紅(TR)、羅丹明、游離的鑭系元素鹽、螯合的鑭系元素鹽、BODIPY、ALEXA、CyDye等。應用於本發明之方法的一種特定的螢光標記物是德克薩斯紅。
本文中所用的術語「接頭」和「接頭分子」可互換使用，指的是與螢光標記物和前列腺素產物結合的化學部分。應用於本發明的接頭的具體例子包括氨基丁酸、氨基己酸、7-氨基庚酸、8-氨基辛酸、Fmoc-氨基己酸、一個或多個β-丙氨酸、異硫氰酸酯基團、琥珀醯亞胺酯、滷代二乙眠碸或碳二亞胺等，此處僅為幾個例子而已。應用於本發明的接頭的一個具體例子是碳二亞胺基團。
本文中所用的術語「對照混合物」指的是與含有被測化合物或試劑的混合物相比，含有同樣數量的同樣試劑、化合物、細胞等物質的混合物，並且以與含有被測化合物或試劑的混合物一樣的方式處理，所不同的是，該對照混合物不含被測化合物或試劑。
抗體正如上文所解釋，本發明的方法使用了具有以前列腺素產物例如PGD2或PGE2作為免疫原的抗體。這種抗體可以是單克隆抗體、多克隆抗體、乃至嵌合抗體。本技術領域中已知的許多方法都可用於製備PGE2或PGD2的多克隆抗體。為了製備抗體，可通過注射前列腺素產物使多種宿主動物免疫，這些宿主動物包括但不限於兔、小鼠、大鼠、綿羊、山羊等。在一具體實施方案中，PGE2或PGD2可以連接至免疫原性載體上，例如牛血清白蛋白(BSA)或匙孔血藍蛋白(KLH)。可使用多種佐劑以提高免疫應答，根據宿主的物種，可用的佐劑包括但不限於弗氏佐劑(完全和不完全)、氫氧化鋁等礦物凝膠、溶血卵磷脂等表面活性物質、複合多元醇(Pluronicpolyols)、多聚陰離子、肽、油乳劑、匙孔血藍蛋白、二硝基酚、卡介苗(bacille Calmette-Guerin，BCG)或小棒桿菌(Corynebacterium parvum)。
對於製備針對前列腺素產物的單克隆抗體，任何通過培養的傳代細胞系製備抗體分子的技術都可以使用。這些技術包括但不限於最初由Kohler和Milstein開發的雜交瘤細胞技術[Nature 256495-497(1975)]、trioma技術、人類B細胞雜交瘤細胞技術[Kozbor等，Immunology Today 472(1983)；Cote等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030(1983)]，以及製備人源單克隆抗體的EBV-雜交瘤技術[Cole等，在MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.一書中的77-96頁(1985)]。此外，單克隆抗體還可以利用專利PCT/US90/02545中所述的技術在無菌動物體內製備。為製備「嵌合抗體」而開發的技術也可以利用[Morrison等，J.Bacteriol.159870(1984)；Neuberger等，Nature312604-608(1984)；Takeda等，Nature 314452-454(1985)]，該技術將前列腺素產物特異的小鼠抗體分子基因剪接到具有適當生物學活性的人源抗體分子基因上。
條件正如上文所解釋，本發明的方法可以體外操作後輸回體內的方式，以體外操作的方式實施；或以分離的方式實施，其中所有的試劑、酶、底物等先分離出來並保存於TRIS、TRIS鹽酸、HEPEs、或磷酸鹽這樣的緩衝液中；也可以細胞為基礎的方式實施。此外，在本發明的方法中，前列腺素合酶不必經過純化。
在以細胞為基礎的分析中，本發明的方法用於確定被測化合物或試劑是否能夠防止或減少細胞分泌前列腺素產物，而在體外方法中，細胞可以在使用本發明的方法之前裂解，使得可以在胞內介質中待測化合物或試劑。
搜索化合物庫尋找可降低或抑制前列腺素合酶活性的候選化合物或試劑按照慣例，產生具有有用性質的新化合物實體要經過以下步驟鑑定具有某些所需性質或活性的化合物(稱為先導化合物(lead compound))，製備該先導化合物的變體，以及評價這些化合物變體的性質和活性。然而，目前的趨勢是縮短藥物開發所有階段所需的時間。由於高通量篩選(HTS)法能夠快速有效地進行大批量試驗，所以這種方法取代了傳統的先導化合物鑑定法。
在一具體實施方案中，高通量篩選法涉及提供一批含有大量潛在治療性化合物(候選化合物)的化合物。然後，利用本發明的方法篩選這種「歷史性(historic)化合物群」，以鑑定這批化合物中顯示了所需特徵活性的那些化合物(特定的化合物類別或亞類)。如此鑑定的化合物可以用作為傳統的「先導化合物」或其本身即可用作為潛在的或實際的治療劑。
組合化合物庫組合化合物庫是一種幫助產生新的先導化合物的首選方法。組合化合物庫是通過組合許多化學「結構單元」例如試劑而以化學或生物學方式合成的各種各樣化合物的集合。例如，線性組合化合物庫如多肽庫，是由一組被稱為胺基酸的化學結構單元按照預定的化合物長度(即多肽化合物中胺基酸的數量)以多種可能的方式組合而成的。幾百萬種化合物可以通過這種化學結構單元組合性混合而合成。例如，一位評論員注意到系統性地組合混合100個可互換的化學結構單元，在理論上可合成一億種四聚體化合物或100億種五聚體化合物(Gallop等，應用組合技術進行藥物發現2.組合的有機合成，文庫篩選策略和未來方向，J.Med.Chem.(1994)37(9)1233-1251)。
組合化合物庫的製備對於本技術領域中那些普通技術人員來說是眾所周知的。這種組合化合物庫包括但不限於肽庫(參閱，如美國專利5,010,175，Furka(1991)Int.J.Pept.Prot.Res.，37487-493，Houghton等(1991)Nature，35484-88)。肽的合成決不是所預見和計劃用於本發明的唯一方法。其它產生化學多元庫的化學物質也可以使用。這樣的化學物質包括但不限於類肽(peptoids)(PCT
發明者李竹吟, 熊俊傑, J·S·薩伯爾, Y·H·馬 申請人:安萬特藥物公司