微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備的製作方法
2023-11-11 22:02:52
專利名稱：微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，屬於酶學領域。
近年來，酶學在臨床診斷與治療中的應用發展非常迅速，現已分別發展為醫學中的兩個新領域，即診斷酶學和治療酶學。目前已有上百種酶試驗可用於臨床診斷。臨床酶學的這一發展，部分是由於測定技術的發展，使許多酶的測定已日益精確和簡便，可用於常規測定。部分是由於認識到某些疾病發展過程中酶活力必然發生改變這一客觀事實，特別是在疾病的早期，用X光片、CT還未能發現病灶時，而體內的酶活性已開始發生變化。如果能定期查體，可做到對疾病的早期發現。值得一提的是，目前臨床上診斷酶學的應用多數是對酶的總活性的測定，並且市場上已有相應試劑盒銷售，其缺點是缺乏器官特異性，但由於許多酶在組織的含量遠高於血清，即使少量組織壞死所釋放的酶也足以引起血清中酶活性的變化，因而仍具有較高的靈敏性。目前有關酶活性測定的試劑盒約有20～30種，同工酶檢測試劑盒約有3～5種，但多數用的是免疫化學法和化學抑制法。而同工酶是指酶蛋白結構不同具有相似的催化特性的一類酶，不同的同工酶來自不同的臟器。當某一組織或器官發生病變時，由於組織受損或細胞膜通透性的變化，引起細胞內酶大量釋入血液而引起血清酶活性的改變。通過同工酶的檢測可確定患病部位，從而提高酶學診斷的特異性和敏感性，還可判斷預後。目前由於自行配製酶顯示液，所用試劑品種繁多，規格不一，致使酶顯示結果不穩定，結果判定不統一等等，特別是大型生化分析儀的應用，使臨床生化檢測的操作更簡便，省時、省力，但其是對總酶活性測定缺乏組織特異性。而同工酶的檢測使病變的定性和定位就精確多了。
本發明的目的在於提供一種質量優良、性能穩定、重複性能好，同時大大簡化了檢測的操作過程且使用該試劑盒可使同工酶的檢測操作規範化，從而使酶活性的檢測及質量控制達到統一標準的微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備及檢測方法。
本發明的目的由如下技術方案實施做醋纖膜電泳，其包括有(1)、配製濃度為0.03～0.1mol/L電極液，PH為7.5-9.0；(2)、配製濃度為0.05～0.2mol/L泡醋纖膜緩衝液，分裝安瓿A；(3)、將冰乙酸做為固定液，分裝安瓿F；(4)、配製顯色液
(a)、將底物裝入安瓿B，(b)、將濃度為0.05～0.5mol/L的緩衝液分裝安瓿C，pH為6.2～7.5，(c)、內裝重氮鹽染料分裝安瓿D，(d)、將濃度為0.05～0.2mol/L緩衝液分裝安瓿E，按重量百分比，其中安瓿B中的底物與安瓿D中的重氮鹽染料，其比例分別為9.1％～80％，20.0％～90.9％，用時將安瓿B中的底物和安瓿C中的1～3ml緩衝液混合；將安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的0.5～2ml緩衝液混合溶解。
做瓊脂糖凝膠電泳，其包括有(1)、配製濃度為0.03～0.1mol/L電極液，PH為7.5-9.0；(2)、以冰乙酸做為固定液分裝安瓿F；(3)、配製瓊脂糖凝膠將0.5～1.2g瓊脂糖或瓊脂加入濃度為0.05～0.2mol/L泡醋纖膜緩衝液80～120ml，加熱溶解，趁熱分裝安瓿A；瓊脂糖凝膠的配製也可以是將瓊脂糖或瓊脂、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮，濃度為0.05～0.2mol/L泡醋纖膜緩衝液80～120ml，加熱溶解，趁熱分裝安瓿A，其中瓊脂糖或瓊脂、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮按重量百分比其分別為7.0％～36.4％，52.6％～91.0％，1.4％～19.4％。(4)、配製顯色液(a)、將底物裝入安瓿B，(b)、將濃度為0.05～0.3mol/L的緩衝液分裝安瓿C，pH為6.2～8.0，(c)、內裝重氮鹽染料分裝安瓿D，(d)、將濃度為0.05～0.2mol/L緩衝液分裝安瓿E，按重量百分比，其中安瓿B中的底物與安瓿D中的重氮鹽染料，其比例分別為9.1％～80％，20.0％～90.9％，用時將安瓿B中的底物和安瓿C中的1～3ml緩衝液混合；將安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的0.5～2ml緩衝液混合溶解。
顯色液也可以製備為凍幹試劑，凍幹試劑製備方法如下安瓿G將底物、濃度為0.05～0.5mol/L的緩衝液1～3ml分裝於安瓿內，經冰凍乾燥後，封口，為安瓿G，用時加水溶解即可使用；安瓿H將重氮鹽染料與濃度為0.05～0.2mol/L緩衝液0.5～2ml分裝於安瓿內，經冰凍乾燥後封口，為安瓿H，用時加水溶解即可使用；按重量百分比，其中安瓿G中的底物與安瓿H中的重氮鹽染料，比例分別為9.1％～80％，20.0％～90.9％。
所述安瓿B或安瓿G中的底物可以用下列化合物顯示微粒體氨基肽酶，底物可以用L-丙氨醯-β-萘胺鹽酸鹽、L-亮氨醯-β-萘胺鹽酸鹽、L-亮氨醯-3-羧基苯胺、L-亮氨醯甘氨酸、亮氨醯對硝基苯胺、丙氨醯對硝基苯胺、蛋氨醯-β-萘胺鹽酸鹽、苯丙氨醯-β-萘胺鹽酸鹽等多種化合物。顯示亮氨酸氨基肽酶(LAP EC3.4.11.1)底物可用亮氨醯胺、L-亮氨醯-對-氨基-二丙磺胺苯胺；顯示胱氨酸氨基肽酶(CAP EC 3.4.11.3)；底物可用胱氨醯-β-萘胺、L-半胱氨酸-雙-P-硝基苯胺、S-苄基-L-半胱氨酸-P-硝基苯胺硝基苯胺等。
所述安瓿C或安瓿G中的緩衝液可用磷酸鹽類緩衝液，也可用Tris系列緩衝液。
所述安瓿D或安瓿H中的重氮鹽染料可以有多種，如固藍B或固藍BB、固藍R或固藍RR、固紫B、柘石榴紅GBC、固紅RC、固紅TR、六偶氮付品紅等。
所述安瓿E中的緩衝液可以是磷酸緩衝液，醋酸緩衝液或可用Tris緩衝液；微粒體氨基肽酶同工酶(mAP EC 3.4.11.2)是水解一些胺基酸與芳香醯胺所形成的醯胺類化合物的酶。廣布於肝、腎、胰、腦等組織及胃液等，可用於肝臟疾病及胰腺癌的診斷與鑑別診斷。檢查胃液的mAP有助於胃癌的診斷和鑑別診斷。
本發明的優點是將試劑分裝於安瓿內，便於保存，性能穩定，重複性好，減輕了勞動強度，改變了傳統的人工配製試劑的繁瑣。並由此而引起的操作過程中個體間存在的差異，從而使操作規範化，使酶的檢測及質量控制達到統一的標準，同時使用試劑盒簡化了操作過程，省時、快速、便於推廣。尤其是當做大量樣品檢測時試劑盒更方便適用，為臨床疾病的診斷和鑑別診斷提供依據。
實施例實施例1、做酸纖膜電泳(1)、配製濃度為0.1mol/L巴比妥緩衝液做為電極液，PH為8.0；(2)、配製濃度為0.05mol/L二氨基二甲基1.3丙二醇緩衝液做為泡醋纖膜緩衝液，分裝安瓿A(3)、將冰乙酸做為固定液，取2ml分裝安瓿F；(4)、配製顯色液(a)、將底物L-亮氨醯-β-萘胺鹽酸鹽1mg，裝入安瓿B，(b)、將1ml濃度為0.05mol/L的磷酸緩衝液分裝安瓿C，pH為6.2，(c)、內裝重氮鹽染料固藍BB7mg分裝安瓿D，(d)、將0.5ml濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液分裝安瓿E，用時將安瓿B中的底物和安瓿C中的緩衝液混合；將安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的緩衝液混合溶解。
應用首先泡膜打開安瓿A加水至25ml，將醋纖膜泡在該液內20分鐘。然後將醋纖膜取出，夾在濾紙中間吸去多餘水份，膜條無光澤面朝上。用點樣片醮血清點在距膜一端2cm處。將配製好的電極緩衝液倒入電泳槽內，使槽內電極緩衝液處於同一水平。在電泳槽的陰、陽極槽內分別用合適尺寸的濾紙摺疊4層搭在槽的兩側，做為鹽橋。將點樣的膜條點樣面朝下，點樣處朝向陰極端搭在鹽橋上，膜條需與鹽橋貼緊，繃展。接通電源，調節電壓100～260v，10～30分鐘後，關閉電源。然後進行同工酶顯色將安瓿C內液體加入安瓿B，加熱溶解，取一個玻璃板上面放一張濾紙，將泡在安瓿A液內的醋纖膜取出，用濾紙吸去多餘液體，放在玻璃板上面的濾紙上，將溶解好的安瓿C與安瓿B的混和液倒在醋纖膜上，即為染色膜。將電泳後的膜條貼在染色膜上，在37℃溫育40分鐘，然後將安瓿E內液體與安瓿D內容物混合溶解，將該液均勻倒在在37℃溫育後的醋纖膜上，在室溫下放置5～10分鐘，即可見同工酶譜。
結果微粒體氨基肽酶同工酶(mAP)正常人微粒體氨基肽酶同工酶只顯示1條酶活性適中的區帶。肝癌和胰頭癌病人中多數在與正常人同一電泳位置酶活性區帶加寬、加深，並在向陽極方向多一條細帶。實施例2、做酸纖膜電泳(1)、配製濃度為0.07mol/Ltris-HCL緩衝液做為電極液，PH為8.6；(2)、配製濃度為0.1mol/Ltris緩衝液做為泡醋纖膜緩衝液，分裝安瓿A；(3)、將冰乙酸2ml做為固定液，分裝安瓿F；(4)、配製顯色液(a)、將底物L-丙氨醯-β-萘胺鹽酸鹽8mg，裝入安瓿B，(b)、將2ml濃度為0.1mol/L的磷酸緩衝液分裝安瓿C，pH為7.0，(c)、內裝重氮鹽染料固藍RR3mg分裝安瓿D，(d)、將1ml濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液分裝安瓿E，用時將安瓿B中的底物和安瓿C中的緩衝液混合；將安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的緩衝液混合溶解。
應用如實施例1所述，結果也相同。實施例3、做酸纖膜電泳(1)、配製濃度為0.04mol/Ltris-甘氨酸緩衝液做為電極液，PH為8.6；(2)、配製濃度為0.15mol/Ltris緩衝液做為泡醋纖膜緩衝液，分裝安瓿A；(3)、將冰乙酸做為固定液，取2ml分裝安瓿F；(4)、配製顯色液顯色液可以製備為凍幹試劑，製備如下安瓿G將底物L-亮氨醯-β-萘胺鹽酸鹽5mg，加緩衝液1.5ml濃度為0.1mol/L的Tris緩衝液，分裝於安瓿內，經冰凍乾燥後，封口，為安瓿G，用時加水溶解即可使用；安瓿H將重氮鹽染料固藍RR3mg與1ml濃度為0.05mol/L磷酸緩衝液分裝於安瓿，冰凍乾燥後封口，為安瓿H，用時加水溶解即可使用。
應用首先泡膜打開安瓿A加水至25ml，將醋纖膜泡在該液內20分鐘。然後將醋纖膜取出，夾在濾紙中間吸去多餘水份，膜條無光澤面朝上。用點樣片醮血清點在距膜一端2cm處。將配製好的電極緩衝液倒入電泳槽內，使槽內電極緩衝液處於同一水平。在電泳槽的陰、陽極槽內分別用合適尺寸的濾紙摺疊4層搭在槽的兩側，做為鹽橋。將點樣的膜條點樣面朝下，點樣處朝向陰極端搭在鹽橋上，膜條需與鹽橋貼緊，繃展。接通電源，調節電壓100～260v，10～30分鐘後，關閉電源。然後進行同工酶顯色打開安瓿G加1.5ml蒸餾水溶解，取一個玻璃板上面放一張濾紙，將泡在安瓿A液內的醋纖膜取出，用濾紙吸去多餘液體，放在玻璃板上面的濾紙上，將溶解好的安瓿G內的液體倒在醋纖膜上，即為染色膜。將電泳後的膜條貼在染色膜上，在37℃溫育40分鐘，然後將安瓿H內加入1ml蒸餾水溶解，將該液均勻倒在在37℃溫育後的醋纖膜上，在室溫下放置5～10分鐘，即可見同工酶譜。
結果微粒體氨基肽酶同工酶(mAP)正常人微粒體氨基肽酶同工酶只顯示1條酶活性適中的區帶。肝癌和胰頭癌病人中多數在與正常人同一電泳位置酶活性區帶加寬、加深，並在向陽極方向多一條細帶。
實施例4、做瓊脂糖凝膠電泳試劑的製備，其包括有(1)、配製濃度為0.07mol/L電極液，PH為8.4；(2)、以冰乙酸做為固定液，取2ml分裝安瓿F；(3)、配製瓊脂糖凝膠將瓊脂糖0.6g加入濃度為0.05mol/L Tris緩衝液100ml，加熱溶解，趁熱分裝安瓿A；(4)、配製顯色液(a)、將底物L-丙氨醯-β-萘胺鹽酸鹽8mg，裝入安瓿B，(b)、將濃度為0.2mol/L的緩衝液2ml分裝安瓿C，pH為7.0，(c)、內裝重氮鹽染料固紅TR6mg分裝安瓿D，(d)、將濃度為0.1mol/L緩衝液1ml分裝安瓿E，用時將安瓿B中的底物和安瓿C中的緩衝液混合；將安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的緩衝液混合溶解。然後將安瓿B中的底物和安瓿C中的緩衝液的混合液與安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的緩衝液的混合液混合，即為顯色液。
應用將安瓿A隔水加熱溶解，趁熱澆在一玻璃板上，冷卻後在距膜一端約2cm處放0.3×1cm的濾紙。約10分鐘後取下濾紙，在該處加樣8微升，放置5分鐘。然後將凝膠板放在加好電極液的電泳槽架上，兩端用4層紗布搭橋，電壓100v，電泳30分鐘，關閉電源。將膠板取出加入上述已混合好的顯色液，放在37℃溫箱裡溫育20-30分鐘，即可見同工酶顯色帶。
結果如實施例1所述。
實施例5、做瓊脂糖凝膠電泳試劑的製備，其包括有(1)、配製濃度為0.03mol/L電極液，PH為8.6；(2)、以冰乙酸做為固定液，取2ml分裝安瓿F；(3)、配製瓊脂糖凝膠將瓊脂1g，蔗糖2g和聚乙烯吡咯烷酮0.3g，加入濃度為0.08mol/L泡醋纖膜緩衝液100ml，加熱溶解，趁熱分裝安瓿A；(4)、配製顯色液(a)、將底物L-胱氨醯-β-萘胺鹽酸鹽6mg，裝入安瓿B，(b)、將濃度為0.1mol/L的緩衝液1.5ml分裝安瓿C，pH為6.0，(c)、內裝重氮鹽染料固紅RC7mg分裝安瓿D，(d)、將濃度為0.2mol/L緩衝液1ml分裝安瓿E，用時將安瓿B中的底物和安瓿C中的緩衝液混合；將安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的緩衝液混合溶解。將安瓿B中的底物和安瓿C中的緩衝液的混合液與安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的緩衝液的混合液混合，即為顯色液。
應用如實施例4所述，結果顯示胱氨酸氨基肽酶(CAP)，孕婦血清有二條酶活性帶，正常人不含此酶，若孕婦此酶活性下降或消失，表明胎盤發育不良，此外肝癌患者血清中也可出現此酶活性。
權利要求
1.一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，做醋纖膜電脈，其包括有(1)、配製濃度為0.03～0.1mol/L電極液，PH為7.5-9.0；(2)、配製濃度為0.05～0.2mol/L泡醋纖膜緩衝液，分裝安瓿A；(3)、將冰乙酸做為固定液，分裝安瓿F；(4)、配製顯色液(a)、將底物裝入安瓿B，(b)、將濃度為0.05～0.5mol/L的緩衝液分裝安瓿C，pH為6.2～7.5，(c)、將重氮鹽染料分裝安瓿D，(d)、將濃度為0.05～0.2mol/L緩衝液分裝安瓿E，按重量百分比，其中安瓿B中的底物與安瓿D中的重氮鹽染料，其比例分別為9.1％～80％，20.0％～90.9％，用時將安瓿B中的底物和安瓿C中的1～3ml緩衝液混合；將安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的0.5～2ml緩衝液混合溶解。
2.一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，做瓊脂糖凝膠電泳，其包括有(1)、配製濃度為0.03～0.1mol/L電極液，PH為7.5-9.0；(2)、以冰乙酸做為固定液分裝安瓿F；(3)、配製瓊脂糖凝膠將0.5～1.2g瓊脂糖或瓊脂加入濃度為0.05～0.2mol/L泡醋纖膜緩衝液80～120ml，加熱溶解，趁熱分裝安瓿A；(4)、配製顯色液(a)、將底物裝入安瓿B，(b)、將濃度為0.05～0.5mol/L的緩衝液分裝安瓿C，pH為6.2～7.5，(c)、內裝重氮鹽染料分裝安瓿D，(d)、將濃度為0.05～0.2mol/L緩衝液分裝安瓿E，按重量百分比，其中安瓿B中的底物與安瓿D中的重氮鹽染料，其比例分別為9.1％～80％，20.0％～90.9％，用時將安瓿B中的底物和安瓿C中的1～3ml緩衝液混合；將安瓿D中的重氮鹽染料和安瓿E中的0.5～2ml緩衝液混合溶解。
3.根據權利要求1、2所述的一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於顯色液也可以製備為凍幹試劑，凍幹試劑製備方法如下安瓿G將底物、濃度為0.05～0.5mol/L的緩衝液1～3ml分裝於安瓿內，經冰凍乾燥後，封口，為安瓿G，用時加水溶解即可使用；安瓿H將重氮鹽染料與濃度為0.05～0.2mol/L緩衝液0.5～2ml分裝於安瓿內，經冰凍乾燥後封口，為安瓿H，用時加水溶解即可使用；按重量百分比，其中安瓿G中的底物與安瓿H中的重氮鹽染料，比例分別為9.1％～80％，20.0％～90.9％。
4.根據權利要求1、2所述的一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述安瓿B或安瓿G中的底物可以用下列化合物顯示微粒體氨基肽酶，底物可以用L-丙氨醯-β-萘胺鹽酸鹽、L-亮氨醯-β-萘胺鹽酸鹽、L-亮氨醯-3-羧基苯胺、L-亮氨醯甘氨酸、亮氨醯對硝基苯胺、丙氨醯對硝基苯胺、蛋氨醯-β-萘胺鹽酸鹽、苯丙氨醯-β-萘胺鹽酸鹽等多種化合物。顯示亮氨酸氨基肽酶(LAP EC3.4.11.1)底物可用亮氨醯胺、L-亮氨醯-對-氨基-二丙磺胺苯胺；顯示胱氨酸氨基肽酶(CAPEC 3.4.11.3)；底物可用胱氨醯-β-萘胺、L-半胱氨酸-雙-P-硝基苯胺、S-苄基-L-半胱氨酸-P-硝基苯胺硝基苯胺等。
5.根據權利要求1、2所述的一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述安瓿C或安瓿G中的緩衝液可用磷酸鹽類緩衝液，也可用Tris系列緩衝液。
6.根據權利要求1、2所述的一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述安瓿D或安瓿H中的重氮鹽染料可以有多種，如固藍B或固藍BB、固藍R或固藍RR、固紫B、柘石榴紅GBC、固紅RC、固紅TR、六偶氮付品紅等。
7.根據權利要求1所述的一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述安瓿E中的緩衝液可以是磷酸緩衝液，醋酸緩衝液或可用Tris緩衝液。
8.根據權利要求2所述的一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備，其特徵在於所述瓊脂糖凝膠的配製也可以是將瓊脂糖或瓊脂、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮，濃度為0.05～0.2mol/L泡醋纖膜緩衝液80～120ml，加熱溶解，趁熱分裝安瓿A，其中瓊脂糖或瓊脂、蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮按重量百分比其分別為7.0％～36.4％，52.6％～91.0％，1.4％～19.4％。
全文摘要
本發明公開了一種微粒體氨基肽酶同工酶診斷試劑盒的製備,屬於酶學領域。其是將試劑分裝於安瓿內,便於保存,性能穩定,重複性好,減輕了勞動強度,改變了傳統的人工配製試劑的繁瑣。並由此而引起的操作過程中個體間存在的差異,從而使操作規範化,使酶的檢測及質量控制達到統一的標準,同時使用試劑盒簡化了操作過程,省時、快速、便於推廣。尤其是當做大量樣品檢測時試劑盒更方便適用,為臨床疾病的診斷和鑑別診斷提供依據。
文檔編號G01N33/531GK1381726SQ0111075
公開日2002年11月27日 申請日期2001年4月20日 優先權日2001年4月20日
發明者陳必珍, 舍英, 閻美容, 侯金鳳 申請人:呼和浩特同日試劑有限公司