一種葡萄糖異構酶的247位單突變體酶和138位,247位雙突變體酶及其構建方法
2023-11-02 12:20:22 1
專利名稱：一種葡萄糖異構酶的247位單突變體酶和138位,247位雙突變體酶及其構建方法
技術領域：
本發明涉及利用蛋白質工程的定點突變方法改良葡萄糖異構酶的技術領域。
中國專利申請號95112782.9「SM33 GI的突變酶GI G138P及一種提高GI熱穩定性的突變方案」給出了有關7號澱粉酶鏈黴菌M1033葡萄糖異構酶(SM33 GI)的來源、特性及蛋白質工程對該酶改造的一般情況。但現有技術未能提高該酶的活力。
本發明的目的是提出一種使SM33 GI酶活力提高的突變體酶SM33 GI G247D，熱穩定性和酶活力同時得以提高的雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)，及其構建方法。
本發明SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D，其特徵在於所述SM33 GI的Gly247或某些GI中在同源性比較上相當於SM33 GI的Gly247位的甘氨酸(Gly)變成了天門冬氨酸(Asp)。
本發明SM33 GI G247D的製備方法，其特徵在於根據SM33 GI的基因序列，設計併合成引入Asp247密碼子的定點突變引物，對SM33 G1基因進行定點突變，測定DNA序列，鑑別出Gly247密碼子變成Asp247密碼子的突變體，並進行表達。
本發明SM33 GI的雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)，其特徵在於將帶有Asp247密碼子的SM33 GI基因片段，或某些GI中在同源性比較上相當於SM33 GI的G247D，替代了SM33 GI G138P上的相應的DNA片段或相應位點。
本發明5M33 GI雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)的製備方法，先按中國專利申請號95112782.9技術獲得SM33 GI的突變體酶SM33 GI G138P，其特徵在於根據SM33 GI的基因序列，設計併合成引入Asp247密碼子的定點突變引物，對SM33 GI基因進行定點突變，測定DNA序列，鑑別出Gly247密碼子變成Asp247密碼子的突變體，並進行表達，獲得SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D；再將SM33 GI G138P及SM33 GI G247D分別用XhoI酶解，將帶有G138P的SM33 GI基因5』端DNA片段與帶有G247D的SM33 GI基因3』端DNA片段經T4連接酶連接而成為帶有G138P、G247D雙突變位點的SM33 GI基因，並進行表達。
比較由上述突變體進行表達獲得的突變體粗酶的性質，可以發現單突變體酶SM33 GIG247D與野生型粗酶GI相比，酶比活有較明顯的提高，但熱穩定性下降；而雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)在熱穩定性和酶比活上均優於野生型GI、單突變體酶GI G138P及GI G247D；進一步比較雙突變體酶GI(G138P,G247D)及單突變體酶GI G138P的純酶，前者比活及其熱穩定性均優於後者。
由此可知，本發明SM33 GI的單突變體酶SM33 GI G247D具有提高酶活的優點；而將帶有此Asp247位的片段替換了SM33 GI G138P相應片段所構成的SM33 GI雙突變體酶GI(G138P,G247D)，比這兩種單突變體酶中任一種具有更高的酶活及熱穩定性。
依據分子的空間結構，當247位引入Asp後，局部構象發生細微調整，但不會產生大的空間障礙。因為247位接近不對稱單位二體的結合面，且此結合面主要由G260、A261、G262的主鏈構成，而Gly殘基主鏈構象允許有較大的變化，允許247D的引入。儘管如此，247D位的引入對分子中的二體形成仍有一定的影響，可影響分子的熱穩定性。
247位引入Asp產生的效應是在分子中引入電荷，從而改變分子的靜電場分布。根據枯草桿菌蛋白酶的相應研究結果，這種遠離活性中心的電荷引入會影響酶的催化活力。
專利申請號95112782.9已分析表明，138位引入Pro會增加酶的熱穩定性，原因可能是引入Pro會限制酶的柔性，使其對溫度變得不十分敏感。
空間結構表明，138位和247位相距甚遠，彼此構象改變不會相互影響，故而上述138位和247位分別引入Pro和Asp，其對酶的影響效應同時存在。
因此，採用本發明構建方法，可使SM33 GI的酶活提高，以及酶活和熱穩定性同時獲得提高；尤其是雙突變體可構建工程菌株，具有廣泛的應用前景。
實施例1．SM33 GI G247D的製備1)、合成寡核苷酸點突變引物根據SM33 GI的基因序列，設計將Gly247(GGC)的密碼子改成Asp247(GAC)的密碼子的寡核苷酸突變引物，例如5′-ACC TCA ACG ACC AGT CCG-3′；採用DNA合成法進行合成。
2)、構建重組M13DNA將重組表達質粒pTKD-GI和M13mp19RF用EcoRⅠ+SphⅠ雙酶解，經瓊脂糖凝膠電泳，分別從膠中抽提0.9kb和7.2kb片段，以T4DNA連接酶連接後，轉染大腸桿菌XL1-blue。
3)、定點誘變採用雙引物法，步驟簡述如下a、製備重組M13DNA的參U單鏈模板，於大腸桿菌CJ236中完成；b、磷酸化寡核苷酸點突變引物；c、將磷酸化點突變引物、通用引物與參U單鏈模板退火，進行體外延伸與連接；d、轉染突變反應液於XL1-blue感受態細胞。
具體過程可參見中國《(生物化學與生物物理學報》1995年27(5)470頁。
然後挑取噬菌斑，小規模抽提單鏈，測定DNA序列，鑑定出Gly247的密碼子變成Asp247的密碼子的突變體。
4)、表達突變體基因將突變體基因克隆回原重組表達質粒pTKD-GI，轉化大腸桿菌K38/pGP1-2。可採用中國《(高技術通訊)》1993年3(7)10頁所述的方法，培養表達出SM33 GI G247D。
實施例2.SM33 GI(G138P,G247D)的構建及雙突變體酶的製備1)、pTKD-GI(G138P,G247D)的構建附
圖1是pTKD-GI(G138P,G247D)的構建圖，圖中A-Ⅰ是pTKD-GI G138P，其DNA大小為4.3Kb；A-Ⅱ是A-Ⅰ經XhoⅠ酶解後，經電泳分離獲得的大片段，其DNA大小為3.6Kb，它由pTKD載體大片段以及帶有G138P突變位點的GI基因5』端DNA片段構成。圖中B-Ⅰ是pTKD-GI G247D，其DNA大小為4.3Kb,B-Ⅱ是B-Ⅰ經XhoⅠ酶解後，經電泳分離得到的小片段，其DNA大小為700bp，它是由pTKD載體小片段以及帶有G247D突變位點的GI基因3』端DNA片段構成。
AB是指pTKD-GI(G138P,G247D)，是將A-ⅡDNA片段和B-ⅡDNA片段經T4連接酶(T4Ligase)連接而構成的帶有G138P、G247D雙突變位點的完整SM33 GI基因的pTKD表達質粒，其DNA大小為4.3Kb。
2)、表達SM33 GI(G138P,G247D)雙突變體酶按實施例1所述方法將pTKD-GI(G138P,G247D)轉化大腸桿菌K38/pGP1-2，培養表達可得到SM33 GI(G138P,G247D)雙突變體酶。
實施例3.SM33 GI,SM33 GI G138P,SM33 GI G247D及SM33 GI(G138P,G247D)粗酶性質比較1)、比活測定採用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖為底物。具體按《中國科學技術大學學報》1992年22(2),232-235頁所述方法測定，結果列於表1表1
2)、熱穩定性的測定70℃，加熱2小時，採用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖為底物，測定其加熱前後的相對活力，結果列於表2表2
由上述對粗酶性質的測定結果可以得出雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)的酶活及熱穩定性為最佳。
由中國專利申請號95112782.9提出的「SM33 GI的突變酶GI G138P及一種提高GI熱穩定性的突變方法」，突變體酶GI G138P的熱穩定性較野生型有明顯提高，酶活無明顯下降；而雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)實質上也就是在SM33 GI G138P突變體酶的247位GIy又引入Asp的突變；故有必要進一步純化及比較雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)與單突變體酶SM33 GI G138P的性質變化。
實施例4．雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)與單突變體酶SM33 GI G138P的分離純化及酶學性質比較1)、純化ⅰ)、加熱變性除去雜蛋白70℃加熱15』後酶蛋白及酶活的變化分別將SM33 GI(G138P,G247D)和SM33 GI G138P兩種粗酶液於70℃加熱15′後取出，立即冷卻至4℃,10000rmp離心20分鐘，去沉澱，由上清測得單突變體酶SM33 GI G138P和雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)加熱前後的總蛋白和總活力(以加熱前為100％)，結果列於表3表3
可見採用加熱變性的方法除去了大部分雜蛋白。
ⅱ)、純化按「生物化學與生物物理學報」1995年27(5)470頁所述方法，將上清經DEAE-sepharose FF一次柱層析，即獲得SDS-PAGE電泳純酶。
2)、雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)與單突變體酶SM33 GIG138P的性質比較ⅰ)、熱穩定性的測定選用10mM MgCl2/50mM Tris-HCl(PH7.0)緩衝液作為熱穩定性實驗的緩衝液。酶液在80℃水浴中保溫，每20分鐘取樣100ul，分別以木糖和葡萄糖為底物，將酶液與底物分別混合後，在35℃水浴中反應15分鐘，用半胱氨酸-咔唑法測活，數據分別列於表4和表5表4是以木糖為底物時不同保溫時間後酶的相對活力；表5是以葡萄糖為底物時不同保溫時間後酶的相對活力。表4
表5
取橫坐標為時間(單位分鐘)，縱坐標為相對活力，以保溫時間-相對活力的對數作圖。圖2為SM33 GI G138P和SM33 GI(G138P,G247D)在80℃，以木糖為底物時的熱穩定性曲線；圖3為SM33 GI G138P和SM33 GI(G138P,G247D)在80℃，以葡萄糖為底物時的熱穩定性曲線。圖中黑圓點是SM33 GI(G138P,G247D)的活力數據，黑方塊是SM33 GI G138P的活力數據；實線表示SM33 GI(G138P,G247D)的時間-相對活力曲線，虛線表示SM33 GI G138P的時間-相對活力曲線。
根據附圖2和3，從縱坐標上1g50所對應的橫坐標，即可求得突變體葡萄糖異構酶的半衰期列於表6
表6
可以看出，雙突變體酶8M33 GI(G138P,G247D)的熱穩定性優於單突變體酶SM33 GIG138P，其熱失活半衰期在以葡萄糖為底物時提高到1.24倍；在以木糖為底物時提高到4.06倍。
ⅱ)、比活測定經上述先加熱變性，再經DEAE-sepharose FF柱層析獲得的雙突變體酶，採用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖為底物，測得SM33 GI G138P的比活為113.3U/mg，而SM33 GI(G138P,G247D)為179.2 U/mg，即SM33 GI(G138P,G247D)的比活是SM33 GI G138P的1.58倍。
由上述結果可知，本發明製備的SM33 GI(G138P,G247D)是較單突變體酶SM33 GI G138P的熱穩定性及酶活力同時得以提高的有意義的雙突變體酶，其酶活較GI G138P提高到1.58倍，其熱失活半衰期在以葡萄糖為底物時提高到1.24倍，在以木糖為底物時提高到4.06倍。
權利要求
1.一種SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D，其特徵在於所述SM33 GI的Gly247或某些GI中在同源性比較上相當於SM33 GI的Gly247位的甘氨酸(Gly)變成了天門冬氨酸(Asp)。
2.一種SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D的製備方法，其特徵在於根據SM33 GI的基因序列，設計併合成引入Asp247密碼子的定點突變引物，對SM33 GI基因進行定點突變，測定DNA序列，鑑別出Gly247密碼子變成Asp24 7密碼子的突變體，並進行表達。
3.一種SM33 GI的雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)，其特徵在於將帶有Asp247密碼子的SM33 GI基因片段，或某些GI中在同源性比較上相當於SM33 GI的G2 47D，替代了SM33 GI G1 38P上的相應片段或位點。
4.一種SM33 GI的雙突變體酶SM33 GI(G138P,G247D)的製備方法，先按中國專利申請號95112782.9技術獲得SM33 GI的突變體酶SM33 GI G138P，其特徵在於根據SM33 GI的基因序列，設計併合成引入Asp247密碼子的定點突變引物，對SM33GI基因進行定點突變，測定DNA序列，鑑別出Gly247密碼子變成Asp247密碼子的突變體，並進行表達，獲得SM33 GI的突變體酶SM33 GI G247D；再將SM33 GIG138P及SM33 GI G247D分別用XhoI酶解，將帶有G138P的SM33GI基因5』端DNA片段與帶有G247D的SM33 GI基因3』端DNA片段經T4連接酶連接而成為帶有G138P、G247D雙突變位點的SM33 GI基因，並進行表達。
全文摘要
本發明提供一種蛋白質工程的定點突變方案及其SM33 GI的突變體酶和雙突變體酶,其特徵在於將SM33 GI的247位或在同源性比較相當於247位的Gly替換為Asp,獲得的突變體酶SM33 GI G247D,其酶活較野生型粗酶GI有明顯的提高;再將帶有Asp247的SM 33 GI基因片段替代SM33 GI GI38P基因的相應片段,可獲得雙突變體酶SM33GI(GI38P,G247D),其酶活和熱穩定性同時獲得提高。
文檔編號C12N9/92GK1213003SQ9711971
公開日1999年4月7日 申請日期1997年9月30日 優先權日1997年9月30日
發明者王玉珍, 徐衝, 牛立文, 王淳, 伍傳金, 滕脈坤, 崔濤, 陶莉梅, 朱國萍, 杭俊, 朱學勇, 羅昭鋒, 廖軍 申請人:中國科學技術大學