在植物中降低Bowman－Birk蛋白酶抑制劑的水平的製作方法

2023-11-03 13:49:07 1

專利名稱：在植物中降低Bowman－Birk蛋白酶抑制劑的水平的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用共抑制或反義技術降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制劑水平的方法。
背景技術：
植物的種子含有貯存或稱預留蛋白，這些蛋白在種子的發育過程中形成。在發芽及早期幼苗生長過程中，這些貯存物水解產生代謝中間體供生長的幼苗使用。在收穫的種子中，貯存蛋白代表很重要的營養來源。通過改變貯存蛋白的組成以降低種子內不需要蛋白的量可以提高種子的營養價值。
在豆科植物種子中發現的一類主要的蛋白就是蛋白酶抑制劑，它們作為內源蛋白酶的調節因子並且保護植物免受昆蟲及致病原的侵害。
植物蛋白酶抑制劑通常都是小分子量蛋白，其特點是具備和特定的動物蛋白酶偶爾也有植物蛋白酶結合的能力，因此使這些酶失去活力。研究表明有活性的蛋白酶抑制劑可能對人或其它動物有毒，給植物食品的營養價值帶來負面影響，儘管在某些情況下它們是有益的。因此，有必要降低食物中的蛋白酶抑制劑的水平。
在豆科家族中蛋白酶抑制劑含量豐富，約佔大豆蛋白的6％。當粗大豆飼料餵給單胃動物如雞，大鼠和鵪鶉時，它們的抗營養本質導致脾增生，腺泡腺瘤及整體的生長減退。
大豆(Glycine max)種子蛋白是貯存蛋白的一個例子，它廣泛應用於人類食物中。如嬰兒食品豆腐，大豆蛋白分離物，大豆粉，紋理化的大豆纖維，以及醬油。大豆蛋白產物是人類需求中極好的價廉，高質量的蛋白來源。大豆也廣泛應用於動物飼料成分。然而，這些必須進行適當加工，以去除或滅活蛋白酶抑制劑。
大豆蛋白酶抑制劑分為三類Kunitz胰酶抑制劑(KTi)，Bowman-Birk抑制劑(BBi)，及富含甘氨酸的胰酶抑制劑(GRSTi)。這些抑制劑的胺基酸序列中含大量的含硫胺基酸(甲硫氨酸和半胱氨酸)。
KTi的主要及大量表達形式是21.5 kDa的蛋白質，它對胰酶有特定的抑制活性。BBi是一種低分子量蛋白(8000kDa)，可以在不同的位點同時抑制胰酶及胰凝乳蛋白酶。至少有10種不同的同功型BBi已被報導。GRSTi是大豆種子中胰酶的次要抑制劑。
為了提高糧食的營養價值，採取了各種方法以降低大豆中蛋白酶抑制劑的含量及活性。這些包括物理的(熱)和化學的方法對大豆產品進行處理，還包括通過常規育種技術對大豆進行遺傳改造。
在任何熱處理中必須小心，因為即使是需要熱來破壞胰酶抑制劑，不適當的加熱也會降低大豆蛋白本身的營養價值。進一步而言，儘管通過常規應用的熱處理對大豆粉處理後可以通過變性使蛋白酶抑制劑大量失活，但仍有10-15％的殘留活性。BBi的異常結構是導致殘留活性的最可能的原因。BBi通過二硫鍵緊密交聯在一起，使得單獨的分子對熱有很強的抗性。這樣對種子或大豆製品進行熱處理以降低抑制劑的表達是不完全成功的，而且從能量上講是昂貴的，而且，大豆粗蛋白製品通常含有原大豆5％-20％的活性，(Rackis,J.J；Gumbmann,M.R.in Antinutrients and natrual toxicants in food；Ory,R.L；ED.；Food and Nutrition Press；Westport,CT,1981,P203)因此存在一點顧慮，由於這些未變性的BBi導致的殘留活性可能是一種嚴重的健康問題(Liener,I.E.(1986)J.Nutr.166:920-923)。
另一種從原大豆中去除蛋白酶抑制劑的方法是溶劑抽提法。這種化學抽提方法在去掉各種各樣抑制物質的同時也導致了種子中相當數量的油脂的喪失，這樣，降低了它的食物價值。同時，還存在清除及處置溶劑的問題。
對大豆植株進行遺傳改造以發展低抑制劑活性的品種這種思路也已被提出。然而這種思路有許多缺陷。在失去抑制劑的同時，相當數量的營養價時也丟失了。遺傳變種與另一個品種之間的交叉授粉會導致蛋白酶抑制劑基因的重新表達。進一步而言，改變一個抑制劑的表達並不會影響另一個的表達。至今常規育種技術和組織培養技術不能產生一個低水平蛋白酶抑制劑的植株，儘管存在對這種植株的需要。
對降低蛋白酶抑制劑活性的需求以及熱滅活的高昂費用導致了對大豆種質增加的研究以尋找缺乏蛋白酶抑制劑的種系。缺乏KTi的同等株系已經培育出來(Hymowitz,T.(1986),Nutritional andToxicological Significance of Enzyme lnhibitors in Foods,M.Friedman ed.Plenum Press,New Pork)。但是至今為止篩選的另外12,690個大豆品種中沒有發現BBi的無效株。(Domagalski,J.M.etal(1992)Crop Sci 32:1502-1505)。BBi無效株曾經在野生多年生豆科植物中找到，但這些品種在常規大豆育種規程中並不常用，因為它們雜交有問題，同時存在早期莢果脫落現象。
採取的另一個措施以降低大豆中的蛋白酶抑制的水平就是有目的地表達Brazil Nut貯存蛋白。這個蛋白富含含硫胺基酸，這樣，就抑制了同樣富含含硫胺基酸的蛋白酶抑制劑的表達(WO95/27068)。這種方法被認為是有用的，因為兩種蛋白共用的含硫胺基酸的貯備量在種子發育過程中是一定的。新蛋白的表達有效地競爭了這有限的含硫胺基酸的貯備，導致了蛋白酶抑制劑表達的減少。儘管有效，仍存在一些固有的限制。適於增加硫還原以及合成含硫胺基酸的環境條件含使抑制劑水平上升。因為生長條件不能預測，在商業上取得成功所必需的對抑制劑表達抑制的強有力控制並不能被保證。而且大豆培育者也努力提高種子中甲硫氨酸和半胱氨酸的含量以提高其營養價植。這樣做他們就會選擇那些可以提高合成甲硫氨酸和半胱氨酸能力的株系。這樣會再次打破對蛋白酶抑制劑的抑制。而且，表達含硫新蛋白，其水平足以導致對蛋白酶抑制劑的抑制，這會導致大豆種子中引入一種新的可能的致敏蛋白，這需要在處理中有特別的考慮及在產品上的特別說明。
由於KTi無效株系的可用性，人們就希望獲得對大豆植株進行遺傳修飾以獲得低水平表達BBi的植株。這不僅會降低熱滅活蛋白酶抑制劑所需的熱量，以及在產品中較低的殘留活性，而且通過與已知的KTi無效株的雜交，可以產生整體蛋白酶活性都很低的株系。
BBi含有獨立的胰酶和胰凝乳蛋白酶的結合位點(Liener,I.E.in R.J.Summerfield和A.H.Bunting(eds)Advances in LegumeScience,Royal Bot.Gardens,Kew England)。從大豆種子中至少純化了10種BBi的同型物。然而，一些同型物都因蛋白裂解修飾而相互關聯，據估計有三種由三個獨立基因位點編碼的抑制劑亞型。(Tan-Wilson et al.(1987)J.Agric.Food.Chem.35:974-981)。對GenBank進行大豆(Glycine.Max)BBi序列進行檢索，結果顯示了由Bowman確定的經典的BBi序列及兩個同型物，命名為CⅡ和DⅡ。與Bowman同型物相比這些序列有73％和83％的同源性，蛋白序列有57％和75％的同源性。
這樣就存在一種需要即通過共抑制或反義技術來提供一種消除大豆種子中BBi和其同型物的新方法。
發明概述本發明涉及一種降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制劑的方法，它包括(a)用嵌合基團轉染植物細胞，該基因包括編碼Bowman-Birk蛋白酶抑制劑的核酸中斷，或者它的亞片段或者它的互補序列。它們都可操縱地和一個啟動子相連。
(b)由從(a)獲得的轉染的植物細胞培育可育的成熟植株並獲得種子。
(c)從由(b)獲得的種子中進行篩選，選擇那些與不含嵌合基因的植株相比Bowman-Birk蛋白酶抑制水平降低的種子。
另外對用此方法產生的植株和由此植株獲得的種子也很感興趣，這種植物Bowman-Birk蛋白酶抑制劑水平降低。
在另一方面，這個發明還涉及將用這種方法獲得的植株與Kunitz胰酶抑制劑無效的植株進行雜交以及由此植株獲得的種子。
在更進一步的方面，本發明還涉及雜種植株，該植株通過將用本(發明)方法製得的植株與任一親本植株進行雜交獲得，由此獲得的後代在其基因組中包括一個嵌合基因，該基因包括編碼Bowman-Birk蛋白酶抑制劑的核酸片段或者一個亞片段或者其互補序列，它們都可操作地和一個啟動子相連。
附圖及序列的簡要說明通過下面詳細的描述及圖表，序列說明本發明可以被更全面地理解，這些附圖和序列說明構成本申請的一部分。
這個序列描述概要說明了下文附帶的序列。這個序列表包含核苷酸的單字符和胺基酸的三字符，正如在Nueleic Acid Research13:3021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(No.2):345-373(1984)所描述的IUPAC-IUB標準所規定的，在所有核苷酸和胺基酸序列數據中所用的符號和格式均符合專利申請中核酸和/或胺基酸序列公開時的規則正如在37 C.F.R.§1.821-1.825和WIPO StandardSt.25所規定的。


圖1為pDD1的質粒圖，它包括BBi同型物CⅡ的有義(共抑制)構建物以便用於降低蛋白酶抑制劑水平。
圖2顯示了野生植株胚胎，載體對照轉化植株組織以及pDD1轉化胚胎體細胞的BBi表達的Western分析結果。
圖3顯示了野生植株及pDD1轉化植株種子中BBi表達的Western分析結果。
SEQ ID NOS:1和2展示了用於從大豆mRNA中擴增BBi的同型物CⅡ正義和反義寡核苷酸引物序列。
SEQ ID NO:3示PCR產物的序列，該序列從大豆mRNA中獲得，其中以SEQ ID NOS:1和2的寡核苷酸作為引物。
SEQ ID NO:4示由SEQ ID NO.3而來的BBi前體蛋白的胺基酸序列。
發明詳述在本公開的上下文中，將用到了許多術語。
正如這裡所用的，一個「分離的核酸片段」是指DNA或RNA的聚合物，它是單鏈的或雙鏈的，視需要而定還可以包括合成的，非自然的或突變的核苷酸鹼基。以DNA聚合物形式存在的分離的核酸片段可由一個或幾個DNA，基因組DNA或合成DNA的片段組成。
正如這裡所用的，一個「分離的核酸片段」是指DNA或RNA的聚合物，它是單鏈的或雙鏈的，選擇地包括合成的，非自然的或改變了的核苷酸鹼基。以DNA聚合物形式存在的分離的核酸片段可由一個或幾個eDNA，基因組DNA或合成DNA片段組成。
術語「其功能等價的亞片段」是指分離核酸片段的一部分或亞序列，它不影響這段核酸片段編碼的蛋白的功能屬性或者不影響該核酸片段通過反義或共抑制技術介導的基因表達改變的能力。
術語「基本相似」在這裡用來指核酸片段，其中一個或幾個核苷酸鹼基的變化導致一個或多個胺基酸的替換，但不影響DNA編碼的蛋白質的功能屬性。它們也指這樣的核酸片段，一個或多個核苷酸鹼基的改變並不影響核酸片段通過反義或共抑制技術介導的基因表達改變的能力。
「基本相關」(corresponding substantially)也指對本發明核酸片段進行修飾如缺失或插入一個或幾個核苷酸，而就該轉錄產物通過反義或共抑制技術介導的基因表達的改變或最終蛋白分子功能屬性的改變的能力而言，不會顯著影響最終轉錄產物的功能屬性。因此可以理解本領域的技術人員將會明白本發明所包括的不止那些具體的代表性序列。
例如，在本領域中已知的，基因表達的反義抑制和共抑制通過小於完整編碼序列的核酸片段來實現，以及通過與被抑制的基因同源性不足100％的片段來實現。而且，改變一個基因從而導致在一個位點上產生化學上等同的胺基酸但並不影響編碼蛋白的功能屬性，這也是本領域中熟知的。例如，一個編碼疏水胺基酸丙氨酸的密碼子，可以替代為另一個編碼疏水性稍弱的疏水殘基，如甘氨酸或編碼一個更疏水的殘基如纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸的密碼子。類似的，導致一個帶負電的胺基酸替換成另一個帶負電胺基酸的變化，例如天冬氨酸變成穀氨酸或者一個帶正電的胺基酸替換成另一個帶正電的胺基酸，如賴氨酸變成精氨酸，這些都可以期待產生一個功能上等價的產物。核苷酸的變化導致蛋白分子N-端或C-端部分的變化也期待著不改變蛋白的活力。每一項提出的修飾均是本領域的常規技術，正如確定編碼產物生物活性保留程度一樣。而且，本領域的技術人員認為在本發明中包括的基本相似的核酸序列也可以通過與這裡的示範序列在中度嚴謹條件下(1×SSC,0.1％SDC,55℃)能夠雜交的能力而確定。
一個胺基酸或核酸序列的「主要部分」(substantial portion)包括多肽鏈上足夠的胺基酸序列或基因上的核苷酸序列以提供該多肽鏈或基因的有力的鑑定，可以通過本領域的技術人員進行的手工評價或藉助算法如BLAST(Altschul S.F.et al(1993)J.Mol.Biol.215:403-410)和Gapped Blast(Altschul S.F.etal.(1997)Nucleic Acids Res.,25:3389-3402)進行計算機自動序列比較及鑑定。
「基因」是指一段可表達為一個特定蛋白核酸片段，該蛋白質包括位於編碼序列之前(5』非編碼序列)及之後(3』-非編碼序列)的調控序列。「天然基因」是指從天然分離出來的有其調控序列的基因，「嵌合基因」是指任何非天然基因，包括天然狀態時不在一起的調控及編碼序列。因此嵌合基因包括從不同來源所獲得的調控和編碼序列或同一來源來的調控及編碼序列但與自然狀態安排的狀態不同。「內源性基因」是指在一個有機體的基因組中位於其天然位置的天然基因。一個「外源基因」是指在一個宿主有機體中通常找不到的基因，但通過基因轉移導入宿主中的基因。外源基因包括插入非天然有機體的天然基因或嵌合基因。一個「轉基因」是指通過轉化程序轉入基因組的基因。
「編碼序列」是指編碼特定胺基酸序列的DNA序列，「調控序列」是指位於編碼序列上遊(5』-非編碼序列)，其中或下遊(3』-非編碼序列)的核苷酸序列，它可以影響轉錄，RNA加工或穩定性，或其所偶聯的編碼序列的翻譯。調控序列包括，但並不限制於，啟動子，翻譯引導序列，內含子以及多聚腺苷酸識別序列。
「啟動子」是指一段DNA序列，它可以控制編碼序列及功能RNA的表達。啟動子序列包括近端和許多遠端上遊序列，後者常指增強子。因此，啟動子就是一段DNA序列，它可以激活啟動子活性，它可以是啟動子的內源性序列一個插入的異源成分，以提高啟動子的水平或組織特異性。啟動子可以整體從一個天然基因獲得，或者由自然界存在的來源於不同啟動子的不同因素組成，或者由合成DNA片段組成。本領域的技術人員都明白不同的啟動子可以指導基因在不同組織或不同類型細胞中表達，或在不同發育階段或對不同環境條件的反應條件下表達。可以使基因在大部分細胞類型大部分時間表達的啟動子通常被稱為「組成型啟動子」。在植物細胞中各種可以使用的新啟動子常被發現，在OKamuro J.K和Goldberg R.B.(1989)編纂的Biochemistry of plants 15:1-82中可以找到許多的例子。而且更進一步認識到在大多數情況下調控序列的精確邊界並未完全確定，有些差異的DNA片段也許可以有相同的啟動子活性。
一個「內含子」是一個基因內部的插入序列，它並不編碼蛋白序列的一部分。這樣，這種序列轉錄成RNA但它們被切除並不翻譯。這個術語也指切出的RNA序列。一個「外顯子」是指基因序列的一部分，它轉錄出來並可在該基因來源成熟的信使RNA中找到，但它不必是編碼最終產物的一部分序列。
「翻譯引導序列」是指中啟動子序列和編碼序列之間的一段DNA序列。翻譯引導序列在完全加工的mRNA中存在位於mRNA中翻譯引導序列的上遊。翻譯引導序列可以影響mRNA初級轉錄本的加工，mRNA的穩定性或翻譯效率。翻譯引導序列已經被描述(Turner,R.和Foster,G.D.(1995)Molecular Biotechnology 3:225)。
「3』-非編碼序列」是指一個編碼序列下遊的DNA序列，包括聚腺苷酸識別序列和其他可以編碼影響mRNA加工或基因表達的調節信號的序列。聚腺苷酸信號通常通過影響向mRNA前體3』末端增加聚腺苷酸信號而被確定。應用不同的3』-非編碼序列示例於Ingelbrecht I.L.等(1986)Plant cell 1:671-680。
「RNA轉錄本」是指RNA聚合酶催化的DNA序列的轉錄產物。當RNA轉錄本與DNA序列完全互補時它被稱為初級轉錄本，或者它可以是初級轉錄本轉錄後加工而來的RNA序列，被稱為成熟RNA。「信使RNA(mRNA)」是指無內含子的RNA，也可以在細胞內翻譯成蛋白。「cDNA」是指雙鏈DNA，它和mRNA互補並且來源於mRNA。「有義」RNA指RNA轉錄本，包括mRNA，因此可以在細胞內翻譯成蛋白質。「反義RNA」是指RNA轉錄本，它可以和全部或部分靶初級轉錄本或mRNA互補，並阻礙靶基因的表達(U.S.Patent No.5,107,065)。反義RNA的互補性可以針對基因轉錄本的任一部分，即5』-非編碼區，3』-非編碼區內含子或編碼序列。「功能RNA」是指反義RNA，核酶RNA或其他不被翻譯的RNA但在細胞加工中有效應。
術語「操作相連」是指單核苷酸片段上的核酸序列的相連，因此一個的功能影響另一個。例如，當一個啟動子能夠影響編碼序列的表達時它與編碼序列操作相連(即編碼序列在啟動子的轉錄控制之下)。編碼序列可以和調控序列正向或反向操作相連。
術語「表達」，正如此處所用，是指功能終產物的產生。基因的表達或過表達包括基因的轉錄和mRNA翻譯成前體或成熟蛋白質。「反義抑制」是指產生可以抑制靶蛋白表達的反義RNA轉錄本。「過表達」是指在轉基因有機體中基因產物的產量超過正常或非轉化有機體的產量水平。「共抑制」是指可以抑制相同或基本相似的外源或內源基因的有義RNA轉錄本的產生。(U.S.Patent No.5,231,020)。
「改變的表達」是指在轉基因有機體中基因產物的產生在數量或比例上與野生有機體中相關組織(器官和發育類型)的活性差異十分顯著。
「成熟」蛋白是指翻譯後修飾的蛋白；即初始翻譯產物中的前導肽已經被去除的形式。「前體」蛋白是指mRNA的最初翻譯產物，即前導肽仍然存在。前導肽可以但不必局限於細胞內定位信號。
「葉綠體轉移肽」是一段胺基酸序列，它和一個蛋白質一起翻譯並帶領該蛋白進入葉綠體或其它細胞內可合成蛋白的質體。「葉綠體轉移序列」是編碼葉綠體轉移肽的核酸序列。一個「信號肽」是一段胺基酸序列，它和一個蛋白質一起翻譯並帶領該蛋白進入分泌系統(Chrispeels M.J.(1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42:21-53)。如果該蛋白定位於液泡，可以進一步加入一個液泡定向信號(上文)。如果該蛋白定位於核，現有的所有的信號肽都去掉取而代之的是一個核定位信號。(Raikhel N.V.(1992)Plant Phys.100:1627-1632)。
「轉化」是指將核酸片段轉入宿主基因組導致遺傳上穩定的遺傳。包含轉化核酸的宿主有機體稱為轉基因有機體。穀類細胞優選的轉化方法是粒子-加速或基因槍轉化技術。(Klein et al(1987)Nature(London)327:70-73；U.S.Patent No.4,945,050)。
這裡所用的標準重組DNA和分子克隆技術都是本領域中所熟知的並且在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.分子克隆中有詳細描述(Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Coldspring Harbor Laboratory Press:Cold Spring Harbor,1989(以下為Sambrook))。
「PCR」或「聚合酶鏈式反應」是一個合成大量特定DNA片段的技術，包括一系列重複的循環(Perkin Elmer.Cetus lnstruments,Norwalk,CT)。代表性地，雙鏈DNA熱變性，與靶序列3』端互補的兩個引物在低溫退火，然而在一個中等溫度延伸。這樣一套三個連續的步驟稱為一個循環。
「表達構建物」是一個包含本發明的嵌合基因的質粒載體，可以被構建。質粒載體的選擇依賴於轉化植物宿主植株所用的方法。本領域的技術人員很清楚質粒載體上必須有那些元件以便成功轉化，選擇及擴增帶嵌合基因的宿主細胞。熟練的技術人員也會認識到不同的獨立地轉化事件會導致不同水平和方式的表達(Jones.etal(1985)EMBOJ 4:2411-2418；De Almeida et al.(1989)Mol.Gen.Genetics 218:78-86)，這樣，必須對多重事件進行篩選以獲得預期表達水平和方式的株系。這樣的篩選可通過DNA的Southern分析，mRNA表達的Northern分析，蛋白表達的Wertern分析及表型分析進行)。
如這裡所用，「大豆」是指物種Glycine max,Glycine soja，或任何其它可與Glycine max生殖相容的物種。一個「株系」是指一群親本相似的植株。在個體之間極少或基本沒有遺傳上的變異，即使在一個性狀上也是如此。這樣的株系通過一代或多代的自花授粉和選擇獲得，或者通過一個親本進行營養繁殖包括組織或細胞培養的技術。「種質」是指任何植株，種系或植株群，它們具備在植物培育計劃中作為親本的潛能。術語「雜種」是指兩個遺傳上不同的兩個個體雜交任何後代(見Rieger R.et al.(1968)A Glossary of Genetics andCytogenetics；Springer-Verlag:New York) 。
本發明涉及降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制劑水平的方法，它包括(a)用包含編碼Bowman-Birk蛋白酶抑制劑的核酸片段或它的亞片段或它的互補片段並與一個啟動子相連的嵌合基因轉化植物細胞；(b)從由步驟(a)獲得的轉化植物細胞培育可育的成熟植株並獲得種子；(c)從由步驟(b)獲得的種子進行篩選，篩選出的種子與不含嵌合基因的植物相比Bowman-Birk蛋白酶抑制劑水平降低。
本發明還涉及由本方法產生的轉基因植株，這些植株包含降低水平的Bowman-Birk蛋白酶抑制劑以及由這些植株獲得的種子。正如這裡所用的，「植株」指的是一個完整植株，或植株的一部分或一個植物細胞或一群植物細胞。可用本發明方法的這類植株的範圍通常和可轉化的可產生種子的高等植物的範圍一樣大，包括含Bowman-Birk蛋白酶抑制劑或類Bowman-Birk蛋白酶抑制劑，即一種在功能上與Bowman-Birk蛋白酶抑制劑相當或相等的蛋白酶抑制劑的單子葉或雙子葉植物。這類植物的例子包括但並不限制於大豆，小麥，玉米，蠶豆，苜蓿，豇豆，水稻，花生，大麥，和土豆。附加的信息可在下列參考文獻中找到。普通豆類，Wilson,K.A.and Laskowski,M.Sr.((1975)J.Biol.Chem.250:4261-4267)；小麥，Odani,S.et.al.((1986)J.Biochem.100:975-983)；穀類Rohr meier,T.and Lehle,L.((1993)Plant Mol.Biol.22:783-792)；蠶豆，Asao.T.et al.((1991)J.Biochem.110:951-955)；苜蓿，Brown,W.E.etal((1985)Biochemistry 24:2105-2108)；豇豆，Morhy,L.andVentura,M.M.((1987)An.Acad.Bras.Cienc.59:71-81)，水稻Tashiro,M.et al.((1987)J.Biochem.102:297-306)花生Norioka,S.and Ikenaka,T.((1983)J.Biochem,94:589-599)；大麥Nagasue,A.et al.((1988)Agric.Biol.Chem.52:1505-1514)；土豆，Mitsumori,C.et al(1994)Plant Mol.Biol.26:961-969)。
轉化技術對那些非常熟悉植物分子生物學的技術人員而言是很熟識的。植物細胞的轉化方法包括但不止於顆粒轟擊，微注時，電穿孔以及農桿菌-介導的DNA轉移。
本發明的方法應用了嵌合基因，包括編碼Bowman-Birk蛋白酶抑制劑的核酸片段或其亞片段或其互補片段，它們與啟動子操作相連，因此嵌合基因表達導致轉化宿主細胞Bowman-Birk蛋白酶抑制劑的抑制。
在嵌合基因構建中所用的核酸片段大部分與SEQ ID NO:3的序列相關，或與其亞片段或其互補片段或其亞片段相關。
在另一方面，本發明還涉及用本方法製得的植株與Kunitz胰酶抑制劑(KTi)缺陷植株雜交所獲植株及由它所獲的種子。
BBi水平下降的大豆植株的培育方便了去除大豆中所有的蛋白酶抑制劑，這可通過與現存的Kunitz胰酶缺陷種質系即Kunitztrypsin缺陷植株進行常規植物的雜交育種獲得。這種雙缺陷株的獲得不僅節省了加工的花費，而且打開了新的種子市場，例如「全脂豆」用於飼養動物一樣。全脂豆不用加工去除油料部分，因此飼料中含增加的熱量價值。而且不經過熱或化學變性BBi和KTi對蛋白產品進行變性，組成大豆分離物或濃縮物的貯存蛋白會保持天然構象，導致到現在為止的各種加工方法不可能保持的功能活性。
在另一方面，這個發明也關於雜種植株，該植株通過將用本發明方法獲得的植株與任一親本進行雜交獲得，由此獲得的後代在其基因組中包含含有與操縱子操作相連的編碼Bowman-Birk蛋白酶抑制劑或其亞片段或其互補片段的核酸片段。由此植物獲得的種子也令人感興趣。
實施例本發明在下列實施例中進一步被說明，其中若非特別說明所有的部分及百分比均為重量，度數為攝氏度。應該理解這個實施例儘管顯示了本發明的優選的實施方案，這個實施例僅僅是通過展示的方法給出的。通過上述討論及這個實施例，一個本領域的技術人員可以確定本發明的核心特性，並且不會偏離其宗旨和範圍，對本發明做出改變和修飾以適用不同的用途和條件。
實施例種子中Bowman-Bitk抑制劑水平下降的大豆植株根據從EMBL/GenBank/DDBJ database(登錄號NO.KO1967)獲得的Bowman-Birk蛋白酶抑制劑C-Ⅱ基因的cDNA序列，設計一對引物(SEQ ID NOS:2和3)用於RT-PCR(GeneampTMRNA PCR Kit；Perkin-Elmer Cetus,Norwalk,CT)反應從由大豆子葉中獲得的總RNA中得到C-ⅡcDNA的全基團。
5』-GCGGCCGCATGGTGGTGTTAAAGCTGTG-3』SEQ ID NO:15』-GCGGCCGCTAGTCATCATCTTCATC-3』 SEQ ID NO:2所獲DNA片段用凝膠電泳進行分離，獨立，克隆於pGem-T載體系統(Promega,Madison,WI)的pGem-T的EcoR V位點，產生pGem-T/BBi。在確定了方便下一步克隆的插入片段的正確方向後，BBicDNA用適用於二種DNA的SphⅠ和SacⅠ位點從pGem-T/BBi質粒切出，定向克隆入pZErO-1.1(Invitrogen,San Diego,CA)產生pZErO-1.1/BBi。為了產生活躍轉錄的基因。BBi cDNA利用限制位點XbaⅠ和kpnⅠ從pZErO-1.1/BBi質粒中切出，然後利用同樣位點，定向克隆於質粒pML70(WO 94/11516和WO 97/47731)。這樣產生了質粒pML70/BBi，它包括一個活躍的轉錄單位，包括(ⅰ)Kunitz胰酶抑制劑啟動子(ⅱ)BBiC-Ⅱ cDNA處於有義方向(ⅲ)Kunitz胰酶抑制劑3』序列。這個轉錄單位通過用限制酶BamHⅠ消化從pML 70/BBi釋放出來。該DNA片段用電泳分離，克隆入pKS18HH的BamHⅠ位點。產生pDD1。質粒pKS18HH包含下列遺傳成分，(1)T7啟動子/潮黴素B磷酸轉移酶(HPT)/T7終止子序列(ⅰ)菸草花葉病毒的35S啟動子(CaMV)/潮黴素B磷酸轉移酶/胭酯鹼合成酶(NOS)(ⅲ)去除了β-內醯胺酶編碼基因的質粒載體pSP72(Promega)。這樣，pKS 18HH質粒載體就可以使用潮黴素B作為大腸桿菌和我們的大豆轉化及重生系統的選擇劑。質粒pDD1(示於圖1)用來轟擊從大豆種子獲得的體胚組織。
體胚培養的轉化轉化及繁殖大豆的體細胞胚的貯存液及培養基於WO 94/11516中描述。
大豆胚懸液培養在下述條件進行，35ml液體培養基(SB172)。旋轉培養(150 rpm)28℃，光照為螢光混和物，16h白天8h黑夜。每兩周進行一次亞培養，接種約35mg組織於35ml液體培養基中。
大豆胚懸液培養用pDD1通過顆粒槍轟擊方法進行轉化(見Kleinet al(1987)Nature 327:70)。轉化使用Dupont BiolisticTMPDS1000/He裝置。
5μl pDD1質粒DNA(1μg/μl),50μl CaCl2(2.5M)和20μl精胺(0.1 M)加入50μl 60mg/ml 1.0μm或0.6μm金顆粒懸液之中。該顆粒製備液攪動3分鐘，在微量離心機中離心10秒鐘去除上清。DNA包裹的顆粒用400μl 100％乙醇洗一次然後重懸於40μl無水醇中。DNA/顆粒懸液超聲3次，每次1秒鐘。然後在每個大載物盤上加入5μl DNA-包裹的全顆粒。
在一個空的60mm×15mm塑料盤中加入約200至600mg二周齡懸液培養物，用移液管吸去組織中的殘留液體。這些組織離保留屏(retaining screen)3.5英寸遠，轟擊二次。膜爆發壓力定於1100PSi。這個空腔抽至一28英寸汞柱的壓力。每個實驗中每個構建物轟擊兩個盤子。轟擊之後，該組織分為兩半、放回液體培養基中，按上述條件進行培養。
轟擊四至六天後，液體培養基換為含50mg/ml Hygromycin的新鮮培養基。選擇培養基每周都換新鮮的。轟擊後六周，綠色的1轉化的組織被分離出來，接種於三角瓶中，產生新的轉化的胚懸液培養。
轉化的胚塊從液體培養培養液中取出，放在固體瓊脂培養基上，SB 103，加入0.5％炭開始成熟。1周後，胚轉入無炭的SB 103培養基，在SB 103培養基上3周後，正在成熟的胚分離出來，放在SB 148培養基上。胚成熟的條件是26℃，螢光和白熾光混合光照，168h白天8h黑夜輪流。SB 148培養基上6周後，胚用於分析β-conglycinin亞基蛋白的表達。每個胚塊產生5至20個體胚。可育植株可從這些胚胎中產生，正如WO 94/11516所述。
BBi的檢測BBi的檢測通過常規的免疫印跡(Western)方法進行。對於體胚和種子的分析，8μl(2x)加樣緩衝液加入8μl樣品提取液。這種(2x)加樣緩衝液包含100 mM Tris-HCl(pH7.5),4％SDS,0.2％溴酚蘭，15％甘油和200 mMβ-巰基乙醇。該混合物95℃加熱4分鐘。然後將樣品混合物進行微量離心(1200 rpm,20秒)然後上樣於10％預製Ready GelTM(Bio-Rad,Richmond,CA)，該膠置於mini-Protein ⅡElectrophoresis Cell(Bio-Rad)。Bio-Rad Tris/甘氨酸/SDS緩衝液作為電泳緩衝液，電壓為恆壓125V。除了樣品抽取液，每個膠都包含泳道分子量標準(Bio-Rad SDS-PAGE標準，低分子量範圍)和一泳道從商用去脂大豆粉提取的大豆種子蛋白或從Sigma化學公司獲得的BBi標準蛋白。電泳後，蛋白用Mini Trans-Blot ElectrophoreticTransfer Cell(Bio-Rad)從脈支持物(SPS-PAGE)上電轉到硝酸纖維素膜上。轉移在下述緩衝液中進行25 mM Tris,192 mM甘氨酸，20％v/v甲醇、pH8.3。轉移25伏過夜。轉移後硝酸纖維素印跡在TBS緩衝液(TBS:20 mM Tris,500 mM NaCl,pH 7.5)中漂洗10分鐘。該膜然後在封閉液(5％脫脂奶粉溶於TBS緩衝液中)中浸泡，該溶液放於旋轉搖床平臺上輕微晃動，室溫放置30分鐘至1小時。然後倒掉封閉液，加入TTBS(0.05％Tween-20配於TBS中)，室溫轉搖，洗5分鐘。這一步驟重複二次，漂洗之後，向膜中加入BBi抗體，室溫輕搖孵育1至2小時。抗體按1∶5000稀釋於抗體緩衝液中(1％牛奶溶於TTBS)。抗血清由Covance Research Products Inc.製備P.O.Bo×7200,Dewver,PA 17517，通過向Elite兔中注射BBi蛋白(1.0mg/ml)以產生Bowman Birk抑制劑蛋白特異的抗體。未結合的BBi抗體通過3次在TTBS室溫5洗滌去除。該膜然後於室溫孵育1-2小時於含有1∶2000稀釋的辣根過氧化物酶連接的驢抗兔Ig的緩衝液中。(Amersham life Science)。為了去除多餘的二抗，膜在TTBS中洗三次，每次5分鐘。使用ECL Western blotting程度(AmorshamLife Science)使用檢測試劑1,2進行檢測。等體積的試劑1和試劑2混合，以便產生由以覆蓋膜的溶液。該膜輕微振動使之在檢測液中孵育1分鐘。多餘的液體吸乾後，膜的蛋白側向上放於膠片盒中進行膠中自顯影1分鐘。(Kodak Scientific Imaging Film X-OMAT AR)。
轉化體胚的分析預實驗已經做過以確定體胚發育中BBi可以被最初檢測到的時間。未轉化的胚的子葉(如上所示產生，只是未經轟擊)被解剖，這些胚胎是啟動成熟後5、7、9周胚胎，-80°凍存直至分析。子葉組織稱重，抽提液按照10μl/mg組織加入，用Pellet PestleDisposable Mixer(Kimble/Kontes)進行組織研磨。抽提液由50 mMTris-HCl(pH7.5)。10 mM β-巰基乙醇(BME),0.1％SDS組成。這些樣品在12000 rpm離心10分鐘，上清用加樣器轉至一個新的微量離心管中。提取物-20℃保存至用。從這些預實驗可知，BBi最早在啟動成熟後5周表達。
從潮黴素選擇獲得了27個克隆。轉化後的胚胎的分析在成熟啟始後的5至7周用上述方法進行。5個克隆具有明顯降低的或檢測不到的BBi水平(表1)。這些胚胎特別標明。
表1轉基因體胚的分析
圖2顯示了一個具代表性的轉基因體胚的Western分析。從野生型對照和來源於事例2048-2-3胚胎中的組織中檢測到一條對應於BBi很強的帶，而樣品2048-2-2所得胚胎中只檢測到很少或幾乎沒有BBi。抑制了BBi表達的體胚克隆用於發芽產生植株。
轉基因種子的分析種子切片，約重10mg，取材於RO:1種子，該種子來源於事例2048-5-4產生的轉基因植株，該切片用上述方法分析BBi的存在。在分析的64個種子中，發現18個的BBi水平低於檢測水平。另有12個種子發現有顯示降低的水平。圖3顯示了具代表性的轉基因種子的Western分析(按上述方法進行)，在泳道3和6的樣品有明顯降低的BBi水平，而其餘泳道的樣品均在檢測限下。
這些數據清楚表明pDD1介導的由這種質粒轉化的組織產生的胚胎和種子中BBi水平共抑制的有效性。
序列表110杜邦公司120在植物中降低BOW MAN-BIRK蛋白酶抑制劑的水平130BB-1143-A14014115060/097,4501511998年，8月21日1604170Microsoft Office 97210121128212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的寡核苷酸4001gcggccgcat ggtggtgtta aagctgtg 28210221125212DNA213人工序列220223人工序列的描述合成的寡核苷酸4002gcggccgcta gtcatcatct tcatc 252103211350212DNA213大豆220221CDS222(9)..(320)220221成熟肽222(90)..(317)4003gcggccgc atg gtg gtg tta aag gtg gtt tct tgg ttc ttt tcc ttg tgg50Met Val Val Leu Lys Val Val Ser Trp Phe Phe Ser Leu Trp-25 -20 -15ggg tta cta atg cgc gca tgg gaa ctg aac ctc ttc aaa agt gat cac 98Gly Leu Leu Met Arg Ala Trp Glu Leu Asn Leu Phe Lys Ser Asp His-10 -5 -1 1tca tca agt gat gat gag tct rca aaa cca tgc tgt gat crc tgc atg146Ser Ser Ser Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Leu Cys Met5 10 15tgc aca gcc tca atg cca cct caa tgc cat tgt gca gat att agg ttg194Cys Thr Ala Ser Met Pro Pro Gln Cys His Cys Ala Asp Ile Arg Leu20 25 30 35aat tca tgt cac tca gct tgt gat cgc tgt gcg tgc aca cgc tcg atg242Asn Ser Cys His Ser Ala Cys Asp Arg Cys Ala Cys Thr Arg Ser Met40 45 50cca ggc cag tgt cgt tgc ctt gac acc acc gac ttt tgc tac aaa cct290Pro Gly Gln Cys Arg Cys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Cys Tyr Lys Pro55 60 65tgc aag tcc agt gat gaa gat gat gac tag cggccgctgt tagtatatct 340Cys Lys Ser Ser Asp Glu Asp Asp Asp70 75taaattcttt 3502104211103212蛋白質213大豆4004Met Val Val Leu Lys Val Val Ser Trp Phe Phe Ser Leu Trp Gly Leu1 5 10 15Leu Met Arg Ala Trp Glu Leu Asn Leu Phe Lys Ser Asp His Ser Ser20 25 30Ser Asp Asp Glu Ser Ser Lys Pro Cys Cys Asp Leu Cys Met Cys Thr35 40 45Ala Ser Met Pro Pro Gln Cys His Cys Ala Asp Ile Arg Leu Asn Ser50 55 60Cys His Ser Ala Cys Asp Arg Cys Ala Cys Thr Arg Ser Met Pro Gly65 70 75 80Gln Cys Arg Cys Leu Asp Thr Thr Asp Phe Cys Tyr Lys Pro Cys Lys85 90 95Ser Ser Asp Glu Asp Asp Asp100
權利要求
1．一種降低植物中Bowman-Birk蛋白酶抑制劑水平的方法，包括(a)用包含與啟動子可操作地相連的編碼Dowman-Birk蛋白酶抑制劑的核酸片段或其亞片段或其互補片段的嵌合基因轉化植物細胞；(b)由(a)步所獲的轉化植物細胞培育出可育成熟植株以獲得種子；(c)從(b)步所獲的種子中進行篩選，選擇與不含嵌合基因植株相比，Bowman-Birk蛋白酶的水平降低的種子。
2．權利要求1的方法，其中所述核酸片段包括由SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或其功能上等價的亞片段。
3．權利要求1的方法，其中植物細胞選自大豆，小麥，玉米，蠶豆，苜蓿，豇豆，水稻、花生，大麥或土豆。
4．由權利要求1的方法所獲植株，它含有降低水平的Bowman-Birk蛋白酶抑制劑。
5．由權利要求4的植株所獲的種子。
6．通過將權利要求4的植株與缺陷Kunitz胰酶抑制劑的植株進行雜交所獲植株。
7．由權利要求6植株所獲種子。
8．將權利要求4的植株與任一親本雜交所獲的雜交植株，所獲後代在其基因組中含與啟動子操作相連的編碼Bowman-Birk蛋白酶抑制劑的核酸片段或其亞片段或其互補片段的嵌合基因。
9．由權利要求8植株所獲的種子。
全文摘要
本發明公開了用共抑制或反義技術降低植物中Bowman－Birk蛋白酶抑制劑水平的方法。
文檔編號C07K14/81GK1313904SQ9980991
公開日2001年9月19日 申請日期1999年8月10日 優先權日1998年8月21日
發明者G·M·法德爾 申請人:納幕爾杜邦公司