一種微生物穀氨醯胺轉胺酶及其製備的日常用止血產品的製作方法
2023-12-04 01:08:36
一種微生物穀氨醯胺轉胺酶及其製備的日常用止血產品的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種微生物穀氨醯胺轉胺酶及其用於日常生活創傷失血的快速止血產品，其中該產品中包含突變的微生物穀氨醯胺轉胺酶為主活性基質或有效成分。本發明使用的原料微生物穀氨醯胺轉胺酶，是在不改變傳統微生物穀氨醯胺轉胺酶的功能和原有的低毒性的情況下，通過基因突變，獲得與野生型酶相比發生了四個位點的胺基酸突變的突變酶。該酶具有優異的耐熱性，在常溫下具有較好穩定性。通過該突變酶所製備的日常生活創傷失血的快速止血產品，包括貼劑、膏劑(軟膏劑、硬膏劑)、糊劑、搽劑。試驗證明，本發明產品具有快速止血、鎮痛、防傷口黏連、阻菌等作用，且低毒副作用、使用方便。
【專利說明】—種微生物穀氨醯胺轉胺酶及其製備的日常用止血產品
【技術領域】
[0001]本發明屬於醫藥領域，具體涉及一種含有微生物穀氨醯胺轉胺酶的創可貼及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002]日常生活中，人們常會遭受小創傷而引起出血，如果不及時止血，可能會引起感染和創傷加劇。目前，理想的止血材料應具備以下特徵:止血迅速、持久；無毒副作用，不誘導血栓形成；不增加感染機會，不影響組織癒合；簡便實用等。
[0003]日常創傷類止血產品主要包括貼劑、敷劑、藥用紗帶或綁帶、凝膠狀或塊狀，其中貼劑類止血產品(如創可貼等)是人們生活中最常用的一種外科用藥，俗稱「止血膏藥」，具有止血，護創作用。
[0004]以創可貼為例，其適合創傷較為表淺，傷口整齊乾淨、出血不多而又不需要縫合的小傷口使用。如果皮膚的傷口相對較深，而又無條件處理，用創可貼進行簡單包紮。但目前市售的創可貼包紮時間不能太長，最好不超過兩天。因創可貼具有壓迫止血，保護創面，預防感染，促進癒合，攜帶方便，使用簡單等優點，其已經成為人們日常生活中必備止血衛生用品。
[0005]目前市售創可貼大致有兩類:不含藥創可貼、含藥創可貼。不含藥創可貼雖然具備消炎和防護感染的作用，但對於傷口快速止血、防止傷口粘連等方面作用效果欠佳，容易造成傷口與創可貼粘連和二次出血；含藥創可貼比不含藥創可貼止血效果強，但傷口與創可貼易粘連的問題仍然存在，且往往有一定的毒副作用。總體而言，調查表明超過50%的民眾認為市售創可貼無法達到理想的止血效果，因此，很有必要研發新一代止血效果好、防傷口粘連且低副作用的創可貼。
[0006]穀氨醯胺轉胺酶(蛋白質-穀氨酸-Y -穀氨醯胺轉胺酶，Transglutaminase,簡稱TGase)，又稱轉穀氨醯胺酶或Y -穀氨醯胺醯基轉移酶，由331個氨基組成，催化醯基轉移反應，能催化蛋白質分子內或分子間的交聯、蛋白質和胺基酸之間的連接以及蛋白質分子內穀氨醯胺基的水解，從而改善蛋白質的結構和功能特性。由於其卓越的交聯特性，被譽為「21世紀超級粘合劑」。在食品、醫藥、紡織、化妝品等領域展現出廣泛前景(崔豔華等《生物技術通報》，2009年第一期)
[0007]TGase廣泛存在於動、植物和微生物機體組織。最近的研究發現，不同來源的TGase在胺基酸序列、分子量大小、酶的理化性質具有差異。動物來源的TGase分子量不等，需要鈣離子激活，酶活性中心為半胱氨酸殘基位點。動物來源的TGase以豚鼠肝臟的TGase (GTG)研究最為深入，該酶的分子量為90kD，其酶促反應需要鈣離子激活。對底物特異性強，同時由於該酶含有17個半胱氨酸殘基致使其熱穩定性差。在50°C下，10分鐘後，酶活性僅為殘留40%。鈣離子對植物來源的TGase活性影響因物種而異。從動物組織中提取的TGase來源少，成本高，分離程序複雜，不易推廣應用。
[0008]TGase在植物組織中扮演何種角色仍不十分清楚，Kang等從大豆葉片中提取TGase進行了研究。但是分離純化工藝複雜，酶的得率較低。目前，尚未有植物來源TGase用於商業化生產。
[0009]但是，微生物來源的TGase (mTG)與動物來源的TGase具有不同的酶特性，mTG分子量在23~45kD之間，多數為40kD左右，為動物來源TGase分子量的一半左右。重要的是，mTG具有較強的熱穩定性，且在相對較寬的pH範圍內均具有較高活性。同時，mTG的酶活性完全不依賴於鈣離子，所以有廣泛的底物特異性的醯基供體，這一點與動植物來源的TGase完全不同。同時，mTG較GTG相比，在高壓條件下具有更為顯著的穩定性。上述特性使mTG有更為廣闊的應用範圍。
[0010]微生物來源的TGase屬於胞外酶，可直接分泌到培養基中.分離純化較動植物來源的TGase容易，並且微生物發酵原料廉價、產酶周期短，最適合進行大規模工業化生產，因此備受研究者的青睞。
[0011]研究發現TGase可以催化相鄰纖維蛋白分子之間的谷醯胺和賴氨酸形成ε -(Y穀氨醯胺)_賴氨酸共價鍵，從而形成相鄰纖維蛋白分子之間的交聯。穀氨醯胺轉胺酶和凝血因子XlIIa(FXIIIa)同屬於穀氨醯胺轉胺酶超家族，功能與後者極為相似，能夠催化醯基轉移反應，使得蛋白質分子內或分子間形成交聯，從而改變蛋白質的結構和功能，該反應存在於很多生物學過程，包括血凝過程、傷口癒合、表皮角質化、紅細胞膜的硬化。中國專利「穀氨醯胺轉胺酶的用途」 (CN2008100475880)報導了穀氨醯胺轉胺酶可作為皮膚創傷癒合促進劑或其活性成分，其中包含0.1-100U / ml或0.1-100%乾重的穀氨醯胺轉胺酶作為皮膚創傷癒合促進劑的活性成分。然而，該研究僅僅在於將穀氨醯胺轉胺酶作為輔劑(即促進劑)用於傷口癒合，其既沒有涉及快速止血的用途，也沒有研究該酶如何實現傷口不黏連的效果，同時所述的0.1- 100U / ml或0.1-100%乾重的方案過於寬泛，缺乏具體有效的數據而最終沒有被授權。因此，其相關研究仍然停留在TG酶如何減少創傷癒合時間的方面(談丹，微生物穀氨醯胺轉胺酶對大鼠創傷癒合作用研究，《中國生物工程雜誌》，2007年第27卷第9期；張念榮，穀氨醯氨轉氨酶的特性及其應用研究進展，《西部皮革》，2012年第34卷第14期)。
[0012]中國專利申請CN2007800512154及其同族專利申請W02008076407公開了一種明
膠-轉谷醯胺酶止血輔料和密封材料，其包含明膠和無毒性轉谷醯胺酶的交聯材料，可用於治療創傷組織。然而，該發明使用是常規的微生物源轉穀氨醯胺酶(USA，CHICAGO，批號L-04207),該酶不但價格昂貴，且最佳反應溫度一般在50°C-55°C左右，在常溫(25°C )時酶活只有最佳反應溫度的20%左右，從而嚴重影響了涉及穀氨醯胺轉胺酶的活性(參見其實施例1)。
[0013]對於這種現象，國內研究者崔豔華等(穀氨醯胺轉胺酶研究進展，《生物技術通報》，2009年第I期)的研究表明，「來源於不同微生物的mTG在酶學上存在差異(表1)。即使是來自不同的菌種甚至來自同一菌種不同菌株的TG酶之間在等電點、最適PH、最適溫度、熱穩定性等方面存在或大或小的差別，這些差別會直接影響酶的應用。例如，芽孢桿菌屬TG酶與鏈黴菌屬的TG酶基因同源性較低，並且酶學活性也存在差異。S.mobaraensismTG的酶活最適溫度為50度，而來自B.subtilis的mTG最適溫度為60度。」
[0014]由於對於止血類產品來說，酶的穩定性十分重要，特別是對於常溫保存的產品來說更是如此。但上述研究的mTG的最佳反應溫度一般在50°C _55°C左右，在常溫(25°C )時酶活只有最佳反應溫度的20%左右，即使是在體溫(37°C)左右，酶活也只有最佳酶活的一半左右(Buettner K, Hertel TC, Pietzsch M, Amino Acids.2012Feb ;42(2_3):987-96.；Marx CK, Hertel TC, Pietzsch M，J Biotechnol.2008S印 10 ;136 (3-4):156-62.)。此外這些酶的熱穩定性比較差，60°C 10分鐘可以導致mTG酶活損失80%左右(Marx CK, HertelTC,Pietzsch M, J Biotechnol.2008S印 10 ; 136 (3-4):156-62.) ? 針對上述特點，德國的科學家對此進行了研究，並取得了一定的成果，發現了高溫下熱穩定性好的酶(如上述文獻，以及歐洲專利 W02008020075A1、W02010101256A1 ;美國專利 US20120021459A1)，但是這些酶的最佳酶反應溫度依然在50°C左右。這制約了穀氨醯胺轉胺酶作為醫用產品的應用。
[0015]為解決這一問題，本發明人的在先中國專利申請CN2012101922407首次提出利用不具有酶活的微生物穀氨醯胺轉氨酶酶原，並結合適量激活酶以及明膠，取得良好的傷口止血效果。然而，該研究所使用的激活酶為分散酶，這是一種非特異性的金屬蛋白酶，雖然其能夠分散組織、分類細胞，但部分分散酶會傷害細胞，並且在培養時不穩定，甚至可能引入支原體汙染，且其價格昂貴，同時在使用前需要將分散酶和穀氨醯胺轉氨酶酶原進行水溶液混合，不能將二者預先混合併與製成相關醫用產品，這極大地影響了穀氨醯胺轉氨酶酶原的醫療用途。
[0016]另外，本發明人另一在先中國專利申請CN2012102021709提出利用提出改造現有野生酶獲得高活性突變酶，其涉及了 3個位點突變得到的重組酶(以下簡稱3突變酶)。儘管該突變酶具有良好的止血效果，但由於其需要與明膠配合使用，且自身止血效果和防粘連效果有待改進，因此一定程度上影響了穀氨醯胺轉氨酶酶原的醫療用途。
[0017]因此，目前需要提供一種快速止血、避免止血產品和傷口粘連、不易傳播疾病、成本低廉的醫用創傷材料，以滿足國內對於快速止血產品的需要。
【發明內容】
[0018]綜上所述，現有技術問題在於如何提供一種含有新的微生物穀氨醯胺轉胺酶的日常止血產品，其中該酶應當具有不同於現有技術結構且性能更加優異，同時所述日常止血產品也應當具有不同於現有技術的產品結構。
[0019]因此，本發明思路是提出了一種新的微生物穀氨醯胺轉胺酶，其結構不同於已經報導的任何一種具有新性能的突變體，同時能滿足在最佳活性溫度向較低溫度偏離以及具有較好的熱穩定性。高溫處理顯示，該mTG在70°C處理後仍然體現了很高的殘餘酶活。反應溫度顯示，該酶的最佳活性溫度為40°C，比野生型mTG低，同時常溫和37°C時的比酶活比野生型mTG高。
[0020]包括前面所述的文獻報導的具有熱穩定性的mTG主要突變位點是2位的絲氨酸突變為酪氨酸，或者23位的絲氨酸突變為纈氨酸或酪氨酸，或者24位的酪氨酸突變為天冬醯胺，或者294位的賴氨酸突變為亮氨酸或異亮氨酸；或者101位的絲氨酸突變為脯氨酸，或者250位的甘氨酸突變為精氨酸，或者157位的甘氨酸突變為絲氨酸。這些突變的穀氨醯胺轉胺酶沒有3個以上胺基酸突變組合，並且不具有較好的熱穩定性。
[0021]因此，本發明第一個目的是提供一種新的微生物穀氨醯胺轉胺酶mTG，該mTG與野生型mTG相比發生了四個位點的胺基酸突變，突變分別為第23位絲氨酸變為丙氨酸、73位甘氨酸變為酪氨酸、317位賴氨酸變為穀氨醯胺以及325位賴氨酸變為穀氨醯胺(即S23A、G73Y、K317Q、K325Q)，這四個突變位點(以下簡稱四突變)均不同於現有文獻報導的突變位點。在一個實施方案中，所述穀氨醯胺轉胺酶mTG具有如SEQ ID NO:4所述的序列。在另一實施方案中，所述穀氨醯胺轉胺酶mTG具有如SEQ IDNO:3所述的基因編碼的蛋白序列。
[0022]在一個具體實施方案中，所述的穀氨醯胺轉胺酶mTG，其中該酶電泳純度為至少90%以上，比活性大於25U /毫克,優選地,純度為95%以上，且比活性大於25U /毫克；其中該酶的最適反應溫度在25-45攝氏度之間。在一個最優選的實施方案中，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶活優選為150U / ml。
[0023]本發明第二個目的在於提供一種編碼上述突變酶的基因序列。在一個實施方案中，所述序列選自如SEQ ID NO:3所述的基因。
[0024]本發明第三個目的在於克服現有穀氨醯胺轉氨酶常溫下活性不足，或是需要輔助劑激活(即激活酶)的缺點，提供一種包含該穀氨醯胺轉氨酶為主要活性基質的日常生活創傷失血的快速止血材料。
[0025]在一個實施方案中，所述止血產品包括貼劑、膏劑(軟膏劑、硬膏劑)、糊劑、搽劑。
[0026]在另一實施方案中，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶的電泳純度為至少90%以上，比活性大於25U /毫克。優選地,純度為95%以上，且比活性大於25U /毫克。在一個最優選的實施方案中，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶活優選為150U / ml。
[0027]在另一實施方案中所述穀氨醯胺轉胺酶的最適反應溫度在25-45攝氏度之間。
[0028]在另一實施方案中，所述貼劑的基質包括含有活性穀氨醯胺轉胺酶成分的藥芯(即儲藥層)、將藥芯固定在傷口上的粘附層。在一個具體的實施方案中，所述貼劑包括創可貼、ok繃、止血綁帶等。在更具體的實施方案中，所述創可貼、ok繃、止血綁帶包括固定透氣膠帶，並且其所用粘附層`、固定透氣膠帶等均為市場上通用品。更優選的，所述藥芯包括或不包括具有止血和促進傷口癒合功能的明膠。所述創可貼、Ok繃、止血綁帶的透氣膠帶包括現有任何膠帶，例如PVP膠帶、彈力布、I3U膠帶、氧化鋅膠布，以及任何對皮膚無傷害的彈性膠帶。
[0029]在另一實施方案中，所述膏劑(軟膏劑、硬膏劑)、糊劑、搽劑的基質選自不具有止血和促進傷口癒合功能的藥學上可接受的輔料。其中，所述膏劑(軟膏劑、硬膏劑)、糊劑的藥學上可接受的輔料包括易被皮膚吸收的軟性基質(凡士林、液狀石蠟、羊毛脂、蜂蠟、動物油、植物油、單硬質酸甘油酯、十八醇等及其混合物)，以橡膠為主要基質並與樹脂、月旨肪或類脂性物質形成的硬性基質；所述搽劑的藥學上可接受的輔料包括乙醇、油(動物油、植物油或礦物油)或適當的溶劑(口生理鹽水、或與生理鹽水等滲的緩衝液)形成的基質。更優選的，以上所述基質包括或不包括明膠。
[0030]本發明第四個目的是提供一種製備上述用於日常生活創傷的止血產品的方法，步驟包括:
[0031](I)製備能表達所述微生物穀氨醯胺轉胺酶的重組微生物，並進行重組表達；
[0032](2)收集並純化具有所述活性的穀氨醯胺轉胺酶，並配置成活性溶液；
[0033](3)通過常規方法，將所述穀氨醯胺轉胺酶的活性溶液添加在不具有止血和促進傷口癒合功能的基質上；
[0034](4)將所述基質進行常規處理，即得到上述用於日常生活創傷的止血產品。
[0035]在一個實施方案中，所述止血產品包括貼劑、膏劑(軟膏劑、硬膏劑)、糊劑、搽劑。[0036]在一個具體實施方案中，所述止血產品為貼劑，其中通過噴灑、塗布或浸泡方法將所述微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液添加在所述藥芯上，並將藥芯附加在粘附層上，經擠壓、乾燥、分割，得到貼劑。在更具體的實施方案中，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液為25U /ml~300U / ml。在一個最優選的實施方案中，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶酶活優選為150U / ml。其中，所述乾燥溫度不超過50°C。在另外更具體的實施方案中，所述基質不包括明膠。
[0037]在另一具體實施方案中，所述止血產品為膏劑或糊劑、搽劑，其中通過將所述微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液與不具有止血和促進傷口癒合功能的藥學上可接受的輔料進行混勻，直至製備成膏劑或糊劑、搽劑，所述混勻方法包括機械混勻、加熱混勻、乳化混勻等方法。
[0038]技術效果
[0039]本發明含有微生物穀氨醯胺轉胺酶的創可貼可增強傷口恢復效果，止血效果明顯，傷口乾燥不黏連；
[0040]本發明使用原料微生物穀氨醯胺轉胺酶，是在不改變傳統微生物穀氨醯胺轉胺酶的功能和原有的低毒性的情況下，通過一定的技術改良微生物穀氨醯胺轉胺酶的耐熱性，獲得了在常溫下具有較好穩定性的微生物穀氨醯胺轉胺酶；
[0041]本創可貼具有快速止血，鎮痛，防傷口黏連等作用，低副作用，對傷口有良好的治癒作用，作用起效快，使用方便，而且可以針對不同的傷口類型，如碰傷，劃傷等。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0042]圖1表示實施例3中突變體mTG基因的凝膠電泳檢測圖。
[0043]圖2表示實施例5中mTG蛋白的質譜分析結果。
[0044]圖3表示實施例6中本發明突變mTG蛋白的精細純化後的電泳圖，其中4泳道為純化的蛋白。
[0045]圖4表示實施例7中在不同溫度下野生型mTG蛋白、三位點突變mTG蛋白以及本發明突變mTG蛋白的比活性測定。
[0046]圖5表示實施例10中空白對照組分別對傷口的止血3天效果示意圖。
[0047]圖6表示實施例10中本發明含有微生物穀氨醯胺轉胺酶的創可貼對傷口的止血3天效果；
[0048]圖7表示實施例11中空白對照組對傷口處理3天後防止黏連的效果示意圖，其中第2-3天紗布粘連，第3天去除紗布後，傷口出血非常明顯。
[0049]圖8表示實施例11中市售某品牌含藥創可貼對傷口處理3天後防止黏連的效果示意圖，其中第2天紗布粘連，第3天去除紗布後，傷口少量出血。
[0050]圖9表示實施例11中本發明創可貼(含有微生物穀氨醯胺轉胺酶)對傷口處理3天後防止黏連的效果示意圖。其中，第2天紗布不粘連，即可除去紗布。第三天去除紗布後，傷口乾燥無滲血。 【具體實施方式】
[0051]結合以下具體實施例和附圖，對本發明作進一步的詳細說明，本發明的保護內容不局限於以下實施例。在不背離發明構思的精神和範圍下，本領域技術人員能夠想到的變化和優點都被包括在本發明中，並且以所附的權利要求書為保護範圍。實施本發明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內容之外，均為本領域的普遍知識和公知常識，本發明沒有特別限制內容。
[0052]實施例1酶活測定
[0053]I)測酶活試劑配製
[0054]A 液(0.5L):將 0.015mol (5.06g)底物 Na-CBZ-Gln-Gly,0.05mol (3.475g)鹽酸羥胺、0.005mol (1.536g)還原型穀胱甘肽加入400ml蒸懼水於燒杯中，用磁力攪拌器攪拌20分鐘後，加入 0.111101(12.118))1^8，用611101 / L(或 lmol / L)鹽酸調 pH 至 6.0，將溶液移至500ml容量瓶中，用蒸餾水洗滌燒杯3次倒入容量瓶中，定容至500ml。
[0055]B 液:3mol / L HC1、12%三氯乙酸(W / V)、5%三氯化鐵(W / V，溶於 0.1mol /L鹽酸，再過濾)按1:1:1的體積比混合。
[0056]2)酶活測定
[0057]放線菌發酵液過濾，取濾液稀釋5倍。實驗組:取0.2ml稀釋液，加2ml A液37V溫育10分鐘，再加2ml B液。對照組:取0.2ml稀釋液，加2ml B液37°C溫育10分鐘，再加2mlA液。於525nm測定吸光值。
[0058]實施例2野生菌株的誘變
[0059]野生型mTG菌株為茂源鏈黴菌(Streptomyces mobaraensis)(如美國ATCC的菌株ATCC編號29032或者美國ATCC的菌株ATCC編號27441，或者中國微生物保存中心的菌株入 CGMCC 編號 4.1719 及 CGMCC 編號 4.5591).[0060]培養基配置:高氏一號培養基(g / L):可溶性澱粉20，KNO3I，毫克804.7H200.5，K2HPO4.3Η200.5，NaCl0.5，FeS`O4.7Η200.01，瓊脂 20，ρΗ7.2-7.4。發酵培養基(g / L):甘油 20，酵母膏 6，魚粉蛋白腖 25，毫克 804.IW2O2, K2HPO4.3Η202, ρΗ7.4。
[0061]向高氏一號培養基中加入IOml冷無菌水，用接種針充分刮取表面菌絲，打散孢子，無菌濾紙過濾。
[0062]操作在紅燈或避光條件下進行，提前0.5h開紫外燈，使光源穩定。取濃度約為107個孢子/ mL的孢子懸浮液3mL置於直徑為6cm滅菌平皿中，利用磁力攪拌子攪拌，在紫外燈功率15W條件下，不同輻照距離，紫外輻照不同的時間進行誘變。避光Ih後，暗環境中將不同稀釋度的孢子懸液塗布於高氏培養基上。30°C培養7天。
[0063]挑取單菌落，在發酵培養基中培養24小時，分別測定37°C時候選菌株和野生菌株的酶活。
[0064]實施例3突變體mTG基因的獲取
[0065]基因組抽提:將實施例2中液體培養的酶活性最高的突變菌株的新鮮菌絲體接種於新鮮培養基，培養24小時左右；離心收集IOml菌體；新鮮菌體於研缽(一 20°C預冷)中，反覆液氮研磨至細粉狀，迅速平均分裝至2個1.5mL離心管中；加TE緩衝液550 μ L，加65°C預熱的20% SDS溶液30 μ L，漩渦振蕩5S，加20毫克/ mL蛋白酶K20 μ L，輕輕混勻，37°C保溫Ih;加等體積Tris飽和酚/氯仿/異戊醇(25: 24: I)抽提，輕微顛倒混勻，1000Or / min離心IOmin ;小心吸取上清至新離心管中，加等體積氯仿/異戊醇(24: I)抽提，1000Or / min，離心5min ;吸取上清液與等體積異丙醇(4°C預冷)混勻，然後1000Or /min離心5min,棄上清。沉澱用lmL70%乙醇(4°C預冷)洗漆(顛倒、離心Imin),自然風乾，加入40uL TE溶解，-20°C保存備用。
[0066]引物設計:設計了一對引物可以通過聚合酶鏈式反應獲取mTG基因的全序列，該序列選自:SEQ NO:1:ctcaacgaaa gcgctccggc cgcttc
[0067]SEQ NO:2:cgctcacatc acggccagcc ctgc
[0068]PCR反應體系及反應條件:將上述獲得的基因組DNA和引物混合，按如下條件進行PCR 反應:Taq 酶反應液(2 倍濃度)25 μ L、引物 Pf (2.5mmol / mL) 2 μ L、引物 Pr (2.5mmol /mL) 2 μ L、DNA2 μ L及無菌水。94°C變性I分鐘、55°C退火30秒、72°C 2分鐘，一共40個循環。
[0069]電泳檢測PCR純度，結果如圖1所示，左邊泳道是分子量標準DNA，右邊泳道為PCR片段電泳結果。PCR片段大小在1000bp與2000bp之間，與理論值1058bp —致。
[0070]實施例4突變mTG基因的測序
[0071]向實施例3中的PCR產物中加入2倍體積的無水乙醇，混勻，室溫放置5分鐘。12000rmp離心10分鐘，棄盡上清；用70%的乙醇洗沉澱一次。乾燥，用50 μ L無菌水溶解沉澱。按如下體系反應:無菌水溶解的PCR產物I μ L、pUC19-T載體(Takara公司)0.5μ L、連接酶0.5 μ L、緩衝液(10倍濃度)5 μ L及無菌水43 μ L，混勻，16°C反應20分鐘。將上述反應後的產物取5 μ L，加入到100 μ L大腸桿菌DH5a感受態細胞(Takara公司)，4°C反應30分鐘，42°C反應90秒，加入LB培養基，37°C培養I小時，將菌液塗布與LB平板上。待菌落形成後，送測序公司測序。與野生型mTG基因相比較，檢測突變位點。
[0072]經過常規方法進行測序，發現該突變基因的序列如SEQ ID NO:3所示，由此推測其對應的蛋白質胺基酸序列如SEQ ID N04所示。
[0073]實施例5mTG蛋白的一般純化
[0074]發酵培養基和菌株同實施例2，將茂源鏈黴菌孢子接種到裝有30mL發酵培養基的，培養28小時。在4°C離心機中12000rmp離心30分鐘，去除菌體和固體雜質，獲得20mL培養基上清。加入40mL無水乙醇，4°C放置I小時。4°C離心機中12000rmp離心30分鐘，棄盡上清，收集沉澱。將沉澱置於安倍瓶，冷凍乾燥機中凍幹36小時，即得到初步提純的野生型mTG蛋白。
[0075]將突變的茂源鏈黴菌孢子接種到裝有30mL發酵培養基的，培養24小時。其他操作步驟同上，純化得到突變mTG蛋白。
[0076]純化的蛋白質利用質譜分析其結構是否與理論推斷一致。最終質譜分析結果顯示:其質譜分子量顯示為37713u(圖2)，與基因測序的推斷的分子結構符合。說明蛋白質序列確為SEQ N04。經過比對，相對於野生型序列，該SEQ ID NO:4有4個位點發生突變，分別為第23位絲氨酸變為丙氨酸、73位甘氨酸變為酪氨酸、317位賴氨酸變為穀氨醯胺以及325位賴氨酸變為穀氨醯胺(即S23A、G73Y、K317Q、K325Q)。
[0077]實施例6本發明突變mTG蛋白的精細純化
[0078]將實施例5中得到的蛋白利用離子交換柱進行蛋白精細純化。填料為DEAE-825，平衡液為0.05M的tris緩衝液，ρΗ7.4。流動相為ρΗ6.0的0.lmol / L磷酸二氫鈉緩衝液。收集各個組分，電泳檢測，得到純度較好的mTG蛋白。將該組分脫鹽後凍幹。實驗結果顯示該蛋白大小與預期37.9kDa的分子量大小一致，而且純度很高，電泳只有單一的條帶，純度大於99% (如圖3所示)。第4泳道為純化的蛋白。由此，實施例6的結果也進一步印證了實施例5中所分析的蛋白質序列確為SEQ N04。
[0079]實施例7不同溫度下突變mTG蛋白的比活性測定
[0080]將純化得到的野生型mTG蛋白和本發明突變mTG蛋白分別在25 °C、37 °C、45 V、55°C、75°C下測定酶活。測定酶活所用方法同實施例1所述。測活使用的溶液在反應前分別在對應的溫度下預熱2分鐘。實驗結果顯示(如圖4所示)，在不同反應溫度下，本發明突變mTG的比酶活表現出了與野生型mTG完全不同的走勢。本發明突變mTG最佳反應溫度在45°C左右，而野生型mTG最佳反應溫度在55°C左右，本發明mTG最佳反應溫度明顯低於野生型mTG。而且，在25°C _75°C下，本發明mTG比酶活均顯著高於野生型。在37°C時本發明mTG比酶活達到了 80U /毫克，比野生型mTG酶活高了 100%以上，比在先專利CN2012102021709的3位點突變也提高了 50%。此外，在55°C以上的高溫條件下野生型mTG活性急劇下降而本發明mTG仍保留較高酶活。650C _75°C時本發明mTG仍保留較高酶活，而此時野生型mTG幾乎已經失活。可見，比野生型mTG相比較，本發明突變mTG具有顯著良好的酶活力以及耐熱穩定性。[0081]實施例8基因工程方法製備本發明mTG
[0082]為了保證在沒有茂源鏈黴菌突變菌株的前提下也可以獲得突變基因，本實施例利用人工合成的方法獲得MTG突變體。
[0083]將上述突變的基因序列在商業化的生物公司(如上海生物工程公司、英駿生物技術公司等)合成全基因序列，並將其克隆到商業化大腸桿菌表達載體pET_32a (如默克生物公司或者其它生物公司；任何其它表達載體如pET-32b或其它的合適載體均可)的EcoRV位點中，形成一個可以表達目的基因的表達載體。按照常規的技術轉化到大腸桿菌BL21中，得到可以表達該蛋白的基因工程菌。將該基因工程菌接種到20ml LB培養基中，在37攝氏度200轉每分鐘培養16個小時後按照培養基體積的I / 1000加入溶度為lmol / L乳糖溶液，繼續培養4個小時，收集菌體。
[0084]在200w的功率下用超聲破碎儀破碎菌體；1000Ormp離心5分鐘棄去上清，將沉澱重懸於含8M尿素的溶液中，吹打3次；1000Ormp離心5分鐘，收集上清按如下所述純化。
[0085]利用QIAGEN公司的N1-NTA Spin KU，按照其中所述的方法進行純化。具體方法完全按照其說明書進行，最終獲得了含有突變的mTG的融合蛋白。
[0086]向融合蛋白溶液中按照融合蛋白的質量加入I / 10質量的分散酶。37攝氏度作用30分鐘後，按照實施例6的方法純化，獲得本發明mTG蛋白。
[0087]實施例9使用本發明的mTG蛋白製備創口貼
[0088]稱l-6g微生物穀氨醯胺轉胺酶溶於240ml50mM HEPES緩衝液(PH = 7)，配製成酶活為50-300u / ml的mTG酶溶液。另外，也可選擇有助於保持穀氨醯胺轉胺酶活性且有利於發揮止血效果的常規輔料，如明膠等。
[0089]創口貼的製備步驟如下:
[0090]將上述酶溶液噴灑在具有吸水效果的基質藥芯上，噴塗完後採取冷凍乾燥；
[0091]或者將基質藥芯緩緩通過上述溶液中，擠壓，在適當溫度下轉動乾燥；
[0092]或者利用輥子將酶溶液均勻塗布在基質藥芯上，然後通過分條儀將藥芯轉移至乾燥機中；[0093]在創可貼基體兩端塗有醫用膠粘劑，粘附在可貼基體材料，其中可貼基體是聚氨酯薄膜或醫用布；
[0094]利用切割機將創可貼本體切割成合適大小，如8釐米X 2.3釐米；
[0095]在本體正反兩面設置保護膜/紙，製成創可貼。其中防護膜是離型紙或塑料薄。
[0096]實施例10本發明的創可貼防止傷口滲血以及止血實驗
[0097]本發明創可貼原料微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液的配製:實驗使用微生物穀氨醯胺轉胺酶比活為:l-50u /毫克
[0098]稱3g微生物穀氨醯胺轉胺酶溶於240ml50mM HEPES緩衝液(PH = 7)，配製成酶活為150u / ml的mTG酶溶液。作為實驗組所用溶液。另外配製50mM HEPES緩衝液(pH =7)作為對照組所用溶液。所有試驗試劑均經過除菌程序。
[0099]準備15周的雄鼠14隻，隨機平均分配成2組，分別為第一組空白對照組，第二組微生物穀氨醯胺轉胺酶實驗組。將大鼠用氣麻機全身麻醉以後在大鼠背部剃毛7cmX7cm大小，剃毛部位消毒。在剃毛的部位用手術刀和手術剪將表皮和真皮剪出直徑4釐米大小的圓形切口。將浸泡過50mM HEPES緩衝液(pH = 7)的紗布覆蓋在第一組大鼠傷口上面。將浸泡過上述微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液的紗布覆蓋在第二組大鼠的傷口上面。完成以後每一組的大鼠都用紗布將傷口包紮好。
[0100]每天拍照，記錄傷口的恢復各項指標。每天用前面同樣的方法為每組動物換上相應的試驗試劑(第一組=HEPES緩衝液；第二組:微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液)。每一次觀察完和第一次的傷口比較，觀察實驗結果，見表1。
[0101]表1第三天實驗結果
[0102]
【權利要求】
1.一種新的微生物穀氨醯胺轉胺酶mTG，其特徵在於，該mTG與野生型mTG相比發生了四個位點的胺基酸突變，即S23A、G73Y、K317Q、K325Q。
2.如權利要求1所述的穀氨醯胺轉胺酶mTG，其特徵在於，該酶具有如SEQID N0:3所述的基因編碼的蛋白序列；或者，具有如SEQ ID NO:4所述的蛋白序列。
3.如權利要求1所述的穀氨醯胺轉胺酶mTG，其特徵在於，該酶電泳純度為至少90%以上，比活性大於25U /毫克,優選地,純度為95%以上，且比活性大於25U /毫克；其中該酶的最適反應溫度在25-45攝氏度之間。
4.用於編碼權利要求1-3之任一項所述酶的基因序列。
5.一種日常生活創傷失血的快速止血產品，其特徵在於，該產品中包含權利要求1-3之任一項所述的酶為主活性基質，或者包含權利要求4的基因所編碼的酶為主要活性基質。
6.如權利要求5所述的止血產品，其特徵在於，包括貼劑、膏劑(軟膏劑、硬膏劑)、糊劑、搽劑。
7.如權利要求6所述的止血產品，其特徵在於，所述貼劑的基質包括含有活性穀氨醯胺轉胺酶成分的藥芯(即儲藥層)、將藥芯固定在傷口上的粘附層。
8.如權利要求7所述的止血產品，其特徵在於，所述貼劑包括創可貼、ok繃、止血綁帶。
9.如權利要求8所述的止血產品，其特徵在於，所述創可貼、ok繃、止血綁帶包括固定透氣膠帶，並且其所用粘附層、固定透氣膠帶均為市場上通用品；其中所述創可貼、ok繃、止血綁帶的透氣膠帶包括現有任何膠帶,例如PVP膠帶、彈力布、PU膠帶、氧化鋅膠布，以及任何對皮膚無傷害的彈性膠帶。
10.如權利要求9所述的止血產品，其特徵在於，所述藥芯包括或不包括具有止血和促進傷口癒合功能的明膠。
11.如權利要求6所述的止血產品，其特徵在於，所述膏劑、糊劑、搽劑的基質選自不具有止血和促進傷口癒合功能的藥學上可接受的輔料；所述膏劑包括軟膏劑、硬膏劑。
12.如權利要求11所述的止血產品，其特徵在於，其中膏劑的藥學上可接受的輔料包括易被皮膚吸收的軟性基質，以橡膠為主要基質並與樹脂、脂肪或類脂性物質形成的硬性基質；其中，軟性基質包括凡士林、液狀石蠟、羊毛脂、蜂蠟、動物油、植物油、單硬質酸甘油酯、十八醇之任一種或其任意混合物。
13.如權利要求11所述的止血產品，其特徵在於，其中所述搽劑的藥學上可接受的輔料包括乙醇、油或適當的溶劑形成的基質；其中，所述油包括動物油、植物油或礦物油，所述溶劑包括生理鹽水、或與生理鹽水等滲的緩衝液。
14.如權利要求5-13之任一項所述的止血產品，其中以上所述基質包括或不包括明膠。
15.製備上述任一項權利要求中所述日常生活創傷失血的止血產品的方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)製備能表達所述 微生物穀氨醯胺轉胺酶的重組微生物，並進行重組表達； (2)收集並純化具有所述活性的穀氨醯胺轉胺酶，並配置成活性溶液； (3)通過常規方法，將所述穀氨醯胺轉胺酶的活性溶液添加在不具有止血和促進傷口癒合功能的基質上；(4)將所述基質進行常規處理，即得到所述日常生活創傷失血的止血產品。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述止血產品包括貼劑、膏劑、糊劑、搽劑；其中膏劑包括軟膏劑、硬膏劑。
17.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，所述止血產品為貼劑，其中通過噴灑、塗布或浸泡方法將所述微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液添加在所述藥芯上，並將藥芯附加在粘附層上，經擠壓、乾燥、分割，得到貼劑。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液為25U/ml~300U / ml ;其中，所述乾燥溫度不超過50°C。
19.如權利要求16所述的方法，其特徵在於，通過將所述微生物穀氨醯胺轉胺酶溶液與不具有止血和促進傷口癒合功能的藥學上可接受的輔料進行混勻，直至製備成膏劑或糊劑、搽劑，所述混勻 方法包括機械混勻、加熱混勻、乳化混勻。
20.如權利要求15-19之任一項所述的方法，其特徵在於，所述基質包括或不包括明膠。
【文檔編號】A61K38/45GK103820411SQ201410035709
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月24日 優先權日:2013年12月2日
【發明者】易正芳, 呂方, 裴正培, 劉明耀 申請人:華東師範大學