Lspr傳感裝置及其製備方法和dna檢測方法
2023-12-02 19:08:16 1
Lspr傳感裝置及其製備方法和dna檢測方法
【專利摘要】本發明提供一種LSPR傳感裝置，包括基底，基底上設有金屬層，金屬層呈XI形狀，且XI尺寸為納米級。本發明方法製備出的LSPR傳感裝置構建出了非對稱性XI型納米金結構，X與I結構單獨情況下會有LSPR現象中產生特有的峰；在結合形成XI結構時，兩個結構的光譜會一同雜合，產生多峰現象；同時XI結構會產生耦合作用，從而使得其雜合而成的峰產生偏移；大大提升了DNA檢測精確度和靈敏度；避免了傳統方法帶來的不均勻結構產生的噪聲，避免了無序結構造成波峰變寬的情況，通過兩個結構的特有光譜的雜交與不對稱結構產生的法諾共振使得LSPR傳感器使檢測更加準確。
【專利說明】LSPR傳感裝置及其製備方法和DNA檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於生化檢測【技術領域】，具體涉及一種基於局域表面等離子體共振技術的LSPR傳感裝置及其製備方法和DNA檢測方法。
【背景技術】
[0002]目前對於細菌進行檢測通常較為準確可行採用分子生物學方法進行。比如通常採用的PCR法和基因晶片，都是通過提取待測細菌的DNA，然後對DNA進行檢測驗證，從而便可以得知待測細菌的結果。
[0003]其中通常採用的PCR法和基因晶片；PCR法將從細菌提取的DNA用PCR對細菌基因進行大量擴增，在PCR過程中通過基於細菌的靶基因特異性設計的基因探針檢測擴增產物，從而實現細菌檢測；這一方法在實施時需要進行DNA提取、擴增、引物設計等繁多的步驟，細菌前處理複雜，而且難以高通量化。基因晶片採用將多個特定的寡核昔酸片段或基因片段作為探針，有規律地排列固定於支持物(如矽片、玻片、塑料片)上，然後與待測的標記樣品提取的基因按鹼基配對原理進行雜交，通過雷射共聚焦螢光檢測系統等對晶片進行掃描，並配以計算機系統對每一探針上的螢光信號作出比較和檢測，從而迅速得出細菌的待測信息。基因晶片檢測相對比較準確，但是技術成本高昂，操作複雜，難以高通量化。
[0004]因此基於上述現有方法中DNA檢測的缺陷，利用基於LSPR(Localized SurfacePlasmon Resonance,局域表面等離子體共振)原理的生物傳感器由於出於本身在DNA檢測方面具有高靈敏度， 速度快的有點因此被廣泛採用。但是傳統的LSPR傳感器使用的是比較一致的對稱結構，從而對入射光產生單一的吸收峰，儘管這些對稱結構已經滿足了對大部分生物大分子的檢測，但是對於細菌DNA這類的生物小分子仍然缺乏足夠的靈敏度。
【發明內容】
[0005]本發明實施例的目的在於克服現有技術的上述不足，提供一種可以實現精確DNA檢測的非對稱性納米結構的LSPR傳感裝置製作方法、傳感裝置及DNA檢測方法。
[0006]為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下:
[0007]—種LSPR傳感裝置，包括基底，所述基底上設有納米級金屬鍍層，且所述金屬鍍層呈XI形狀。
[0008]本發明方法製備出的LSPR傳感裝置構建出了非對稱性XI型納米金結構，X與I結構單獨情況下會有LSPR現象中產生特有的峰；在結合形成XI結構時，兩個結構的光譜會一同雜合，產生多峰現象；同時XI結構會產生耦合作用，從而使得其雜合而成的峰產生偏移；大大提升了 DNA檢測精確度和靈敏度；避免了傳統方法帶來的不均勻結構產生的噪聲，避免了無序結構造成波峰變寬的情況，通過兩個結構的特有光譜的雜交與不對稱結構產生的法諾共振使得LSPR傳感器使檢測更加準確。
[0009]本發明進一步好提出一種上述LSPR傳感裝置的製備方法，包括獲取基底，並在所述基底上設置抗蝕層；
[0010]獲取有序排列有納米級XI形狀的壓印用模板；
[0011]將模板與設有抗蝕層的基底壓合，使抗蝕層表面形成具有與壓印面適配的納米級XI形狀的凹槽；
[0012]在抗蝕層表面添加保護層；
[0013]將具有保護層和抗蝕層的基底進行等離子刻蝕處理使位於凹槽部分的抗蝕層被刻蝕去除,使位於凹槽部的基底表面裸露；
[0014]將等離子刻蝕後具有抗蝕層的基底進行電子束蒸鍍處理，使基底位於凹槽部的裸露表面生成金屬鍍層；
[0015]除去基底上的抗蝕層，即得到LSPR傳感裝置。
[0016]針對現有技術中的不足，本發明進一步還提出一種基於LSPR傳感裝置的DNA檢測方法，包括如下步驟:
[0017]獲取待測DNA樣品；
[0018]在LSPR傳感裝置上固定DNA捕獲探針，並於800nm~1800nm光波長內測量吸收光譜；
[0019]在固定有DNA捕獲探針的LSPR傳感裝置上添加待測DNA樣品，再於800nm~1800nm光波長內測量吸收光譜；
[0020]根據添加待測DNA後吸收光譜的變化獲取待測DNA信息。
[0021]本發明的基於非對稱性的LSPR傳感裝置的DNA檢測方法，基於LSPR技術，X與I結構單獨情況下會有LSPR現象，產生特有的峰；在結合形成XI結構時，兩個結構的光譜會一同雜合，產生多峰現象；同時XI結構會產生耦合作用，從而使得其雜合而成的峰產生偏移；大大提升了 DNA檢測精確度和靈敏度。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中:
[0023]圖1為本發明實施例LSPR傳感裝置製備過程中XI形狀壓印板的結構示意圖；
[0024]圖2為本發明實施例LSPR傳感裝置製備過程中壓印板與基底壓合後的在抗蝕層表面形成的凹槽結構示意圖；
[0025]圖3為圖2所示壓印模板與基底壓合後A-A向的截面示意圖；
[0026]圖4為圖3中沉積保護層後的結構示意圖；
[0027]圖5為將圖4中進行等離子蝕刻後的結構示意圖；
[0028]圖6為將圖4中具有抗蝕層的基底上生成金屬膜後的結構示意圖；
[0029]圖7為將去除圖5中抗蝕層後所得的LSPR傳感裝置結構示意圖；
[0030]圖8為本發明非對稱納米結構LSPR傳感裝置在不同折射率溶液中的光譜圖；
[0031]圖9為本發明非對稱納米結構LSPR傳感裝置檢測光譜中X部分和I部分光譜疊加形成多峰光譜的示意圖；
[0032]圖10為本發明實施例非對稱納米結構LSPR傳感裝置進行革蘭氏陽性細菌DNA檢測的光譜圖。
【具體實施方式】
[0033]為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
[0034]本發明實例提供了一種基於局域表面等離子體共振技術的非對稱性的LSPR傳感裝置的DNA檢測方法，包括如下步驟:
[0035]S10，提取待測 DNA;
[0036]S20，對提取的待測DNA進行PCR擴增；
[0037]S30，製作具有非對稱性納米金結構的LSPR傳感裝置；
[0038]S40，在LSPR傳感裝置上固定DNA捕獲探針；
[0039]S50，檢測待測 DNA。
[0040]本發明中採用非對稱的納米金顆粒基於紫外分光光度計上800~1800nm波長下表面等離子共振產生的DNA的光譜變化，進行待測細菌的DNA的檢測從而對待測細菌類型進行判斷。
[0041]在步驟SlO中出於本發明中對細菌DNA的序列的識別特異性進行考量，採用下述步驟提取待測細菌的16srRNA基因；
[0042]步驟如下:
[0043]S11，待測細菌的菌液樣品，進行高速離心從沉降物中獲取菌體；當然，為了使獲取的菌體潔淨，可以重複進行EP管中加緩衝液RB洗滌後再離心；最後再將搜集到的菌體重懸於RB緩衝液，備用；
[0044]S12，向SlO中搜集到的菌體進行裂解，使菌體內含物釋放，得到內含物混合液；
[0045]如果考量待測的細菌為革蘭氏陽性菌，可以向獲取的菌體適量溶菌酶，確保細菌的有效裂解；加入溶菌酶37°C溫浴30-60min ;高速離心後棄上清後將細胞振蕩或者吹打再次重懸於緩衝液RB中；
[0046]S13，向S12步驟得到的內含物混合液中加RNaseA溶液，振蕩混勻，室溫放置5-10min ;得到除去RNA後的混合液；
[0047]S14，向S13步驟得到的混合液中加結合液CB，再加入異丙醇後，充分混勻得到渾濁液；
[0048]S15，將步驟S14所得渾濁液加入吸附柱AC中，高速離心棄掉廢液；離心操作中可以將吸附柱AC放入收集管中，方便離心過程的進行；
[0049]S16，向離心後吸附柱AC中加抑制物去除液IR，再次高速離心棄廢液；得到除去DNA擴增抑制物的吸附柱AC ；
[0050]S17，向吸附柱AC中加入漂洗液WB，高速離心後棄掉廢液，加入漂洗液WB，高速離心後棄掉廢液；並將漂洗液WB清洗之後的吸附柱AC放回空收集管中，高速離心後除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下遊反應；
[0051]S18，將吸附柱AC置入離心管中，在柱中吸附膜上加洗脫緩衝液EB，室溫放置3-5min, 12000rpm離心Imin ;搜集洗脫後得到的洗脫溶液；
[0052]S19，將得到的洗脫溶液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心Imin後便可以得到待測DNA樣品，並可以置于于_20°C中保存備用。
[0053]在這一步驟SlO中所得到的16srRNA基因，是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在於所有細菌的基因組中，具有高度的保守性和特異性，相比隨意性的其它基因片段具有更高的準確性，因此本發明中優選採用這一基因進行。
[0054]進一步在步驟S20中對SlO中所得的待測DNA進行PCR擴增，基於上述16srRNA基因，根據引物設計合成待測細菌16S rRNA和促旋酶(gyrB)基因的引物，用ddH20稀釋至工作濃度。
[0055]步驟S20中將獲取的DNA利用設計的引物進行PCR擴增，以足待測量的需求，當然在PCR擴增中需要提供DNA聚合酶、鹼基原料等，以使PCR能進行。PCR反應程序為:95°C預變性5min ;95°C變性30s，依各引物退火溫度退火30s，72°C延伸2min(依擴增產物長度1000bp/min)，設定32個循環，最後72°C延伸1min ;當然，在反應進行中可以採用標準的PCR反應體系進行PCR擴增，體系中控制20 μ I標準擴增體系進行，具體包括:1μ I提取的待測DNA的標樣、0.5μ I上遊引物、0.5μ I下遊引物、0.2μ I Easy Taq、2yl dNTPs、
2μ IlOXEasy Taq Buffer、14 μ I ddH20。
[0056]當然上述步驟S20之後進行PCR擴增的產物使用含Gelred核酸染料的I %瓊脂糖凝膠在含TAE緩衝液電泳槽中進行電泳，電壓120伏，對產物中存在的長度不一的DNA鏈進行分離純化，並對電泳後的膠存在條帶較好的DNA取點，重新溶解作為待測DNA樣品備用。
[0057]前期待測DNA樣品製備完成之後，需要製備本發明中檢測所需要的非對稱性納米金顆粒的LSPR傳感裝置；在步驟S30中進行製備的細節過程包括如下步驟:
[0058]S31，選取潔淨的石英玻璃片作為基底1，並對其進行清洗乾燥；在這一步驟中基底I是作為承載非對稱性納米金顆粒的基材，除了上述優選的石英玻璃之外，在保證其光譜效果中還可以選擇塑料片、亞克力片等；石英玻璃片本身光學性質最佳，而且其產品的硬度可以
[0059]S32，在基底I上設置一層抗蝕層2，該抗蝕層2材料一般選為樹脂；
[0060]S33，獲取一壓印模板3，該壓印模板3為納米級，且形狀為XI形狀，包括X結構31和I結構32兩部分，這一形狀可以參見圖1所示；X結構31包括相互交叉組成X形狀的四個分枝部311 ;分枝部311的長度為150~230nm、寬度為35~40nm，且相鄰兩分枝部311之間的夾角為50~70度或110~130度；1結構區32長度為250~350nm，寬度為35~40nmo
[0061]製備過程中將該壓印模板3置於抗蝕層2表面與基底I進行壓合，參見圖2-3 ;那麼在壓合之後抗蝕層2的表面便形成與壓印模板3的形狀像相適配的凹槽結構21 ；
[0062]當然，需要指出的是，在本發明中的基底I上可以形成多個非對稱XI結構，並不僅僅限於只形成一個XI納米結構；且多個XI納米結構時規則進行排列，若干個XI納米結構規則排列有助於之後產品性質的重複與產品良性率的提升。
[0063]S34，將上述壓合成型後的抗蝕層2上進行保護層4沉積處理，由於其表面具有壓合後的XI形狀凹槽結構21，那麼沉積處理中抗蝕層2表面的凹槽結構21中上不沉積保護層4 ;而非凹槽結構21的表面上會沉積上保護層4，且沉積後的結構示意圖參見圖4 ；
[0064]S35，再將沉積保護層4後帶有基底I的抗蝕層2進行等離子刻蝕處理；由於非凹槽結構21表面有保護層4保護，因此不會被刻蝕；而凹槽結構21由於不存在保護層4保護，因此對應於凹槽結構21內的抗蝕層2會被蝕刻去除，使得與凹槽結構21位置對應的基底I表面裸露出來；刻蝕處理之後的結構示意圖參見圖5 ；
[0065]S36，將上一步除去凹槽結構21內抗蝕層2的基底I用電子束蒸鍍，使得抗蝕層2的表面和對應於凹槽結構21的基底I表面上均勻的鍍上一層金屬膜5，其結構參見圖6所示；最後將蝕刻之後餘留的抗蝕層2全部去掉，則使得基底I表面具有一層X形狀與I形狀組合的非對稱的Ti/Au納米結構，參見圖7 ;其中XI形狀的形成是由於壓印模板3的而形成的，本身壓印模板3為XI形狀，那麼在蝕刻去除之後生成的非對稱的Ti/Au膜的納米結構，其形狀也是XI形狀型形狀。採用Ti/Au形成非對稱的納米金顆粒結構，相比其他的材質其在上述波長範圍下光譜更加精確。
[0066]在本發明中上述電子束蒸鍍的方式中，先蒸鍍Inm的鈦，再蒸鍍20nm的金，是基底I表面形成兩個金屬單層疊加的金屬復層；lnm的Ti膜是為了增加基底I與Au的粘附性，從而使整體納米級金屬層5的結構穩定，提升產品的性質和性能。當然，在本發明中這裡的金屬層5也可以採用與現有的LSPR中通常採用的貴金屬Ag、Pt等也可以，只是無法達到上述Ti/Au膜結構所取得的性能效果。並且，在上述實施方式中採用電子束蒸鍍的方式形成Ti/Au膜結構，在本領域普通技術人員實施時，也可以根據同樣的目的採用離子濺射、熱蒸鍍的方式生成，均可；其中電子束蒸鍍形成的金屬層5的納米層級好一些。
[0067]採用印製的方式進行進行非對稱納米金顆粒的製作，其步驟相對較為簡單，而且採用抗蝕層2輔助非對稱性壓印成型，相對其他的加工方式，形狀比較規則穩定。
[0068]得到上述非對稱的納米金結構之後，步驟S40用該非對稱的納米金結構固定DNA捕獲探針，用於進行待測DNA檢測，具體在步驟S40中包括:
[0069]S41，取步驟S36中得到的具有非對稱的Ti/Au納米結構的基底1，使用超純水衝洗乾淨，並使用氮氣將其烘乾，備用；
[0070]S42，將對DNA捕獲探針進行激活處理；在這一步驟中DNA捕獲探針為本身採用根據已知確定的細菌菌種的靶基因設計的反向互補的寡聚核苷酸序列，因此當待測DNA的細菌類型與該DNA捕獲探針所屬於的細菌類型相匹配時，那麼DNA捕獲探針邊可以結合待測DNA ;該DNA捕獲探針可以針對待測病毒或者細菌的特異性序列進行設計。
[0071]比如HIV病毒中含有的已知的DNA序列中含有特異性的序列為「GACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGACCATCAATGAGGAAG CTGCAGAATGGGATAGAGTGCATCCAGT 」，那麼便可以選取其中部分特異、用於識別HIV片段製作反向互補序列作為DNA捕獲探針，如寡聚核苷酸序列 「TCATTGATGGTCTCTTTTAACA」。
[0072]在DNA捕獲探針製備完成之後，為了保證其穩定性防止鹼基、結構發生變化，因此會在製備之後對DNA捕獲探針進行巰基修飾，本發明在使用前去掉其修飾巰基，對其進行激活；可以向DNA捕獲探針中加入TCEP,減少其中的疏基基團從而激活DNA捕獲探針。
[0073]S43,將上述激活後的DNA捕獲探針加入至緩衝液中形成DNA捕獲探針緩衝溶液；再將DNA捕獲探針緩衝溶液滴加至基底I上，室溫下靜置I小時；並使用超純水衝洗基底I後用氮氣流乾燥。
[0074]在這一步驟中緩衝液在本發明中採用1mM Tris-HCl+lmM EDTA+0.1M NaCl+lOmMTCEP配製成的pH7.4緩衝系，更加絡合官能團更加利於保持DNA捕獲探針的性質。
[0075]S44，將上述加有DNA捕獲探針的基底I置於MCH溶液中處理，再使用超純水衝洗基底1，並使用氮氣流乾燥，即完成固定。
[0076]S45，使用紫外分光光度計對固定DNA捕獲探針的基底I在800nm~1800nm光波長內測量其吸收光譜。
[0077]其中上述氮氣作為乾燥過程中的保護氣體，對DNA捕獲探針進行保護，防止其被氧化、分解等等，出於這一目的，氮氣的氣體還可以用滿足保護目的的其它氣體進行。
[0078]進一步在上述步驟完成之後，進行待測DNA的檢測，具體步驟S50包括:
[0079]S51，取上述PCR擴增之後待測DNA樣品，選好用量之後，滴加至上述固定有DNA捕獲探針的基底I上，靜置約I小時；再使用超純水衝洗基底1，並使用氮氣流乾燥；
[0080]在這一過程中如果所檢測的待測DNA所述的細菌類型與DNA捕獲探針所述的類型符合，那麼待測DNA與DNA捕獲探針會結合。
[0081]S52，使用紫外分光光度計對步驟S51處理後的基底I在800nm~1800nm光波長內測量其吸收光譜。
[0082]通過對比步驟S52所獲取的吸收光譜與步驟S45所獲取的吸收光譜的圖譜變化，便可以獲得待測DNA的檢測結果。
[0083]本發明中採用上述步驟進行DNA的特異性檢測，基於LSPR技術，當光線入射到由貴金屬構成的納米顆粒上時，如果入射光子頻率與金屬納米顆粒或金屬島傳導電子的整體振動頻率相匹配時，納米顆粒或金屬島會對光子能量產生很強的吸收作用，就會發生局域表面等離子體共振現象，其結果可以從吸收光譜中分析獲得。
[0084]而現有的L SPR傳感裝置進行DNA檢測中，需要從兩個方面來提升側鏈的準確精度；第一個是保證光譜的偏移幅度，即當傳感裝置檢測區域產生變化時，LSPR產生的光譜應儘可能大的偏移，這個指標常常用「偏移距離/折射率變化δ λ uPK/δη」來衡量，即為當LSPR傳感器接觸表面的液體的折射率產生單位變化時其波峰的偏移距離，該參數越大則傳感器的靈敏度越高；第二個指標為產生光譜中的波峰的寬度，當波峰越窄的時候，其檢測的特異性越高，產生的噪音信號越小。現有LSPR傳感檢測中，檢測中由於不均勻結構產生的噪聲，導致無序結構造成波峰變寬；檢測小分子DNA中，吸收峰的便宜幅度缺乏足夠的靈敏度。
[0085]本發明中使用納米壓印技術，構建出了規則的、有序的、均勻的非對稱性XI型納米金結構，避免了傳統方法帶來的不均勻結構產生的噪聲，避免了無序結構造成波峰變寬的情況。項目設計的獨有的XI型金納米結構，通過兩個結構的特有光譜的雜交與不對稱結構產生的法諾共振使得LSPR傳感器對傳感界面的變化更為敏感。傳統的LSPR的的靈敏度一般在100~500nm/RIU,極少數結構如Au branches等特殊結構可以達到800~900nm/RIU0而本結構通過多方面提高了其靈敏度，最高可達1000nm/RIU，超出了傳統方法所能達到的最好結果。相比現有的對稱性的LSPR傳感器，不會產生光譜疊加，且也不會有法諾共振。
[0086]而在本發明的基於非對稱性納米結構的LSPR傳感裝置中產生的法諾共振是量子數虧損的多通道是多種波函數，波函數疊加可以出現相長或相消，也就是各種量子虧損的通道可以相互疊加，發生共振從而會出現某種波函數幅值最大的情況，對應著某種量子虧損最明顯。因此在個納米顆粒之間的耦合作用，使得光譜會出現非對稱的峰型。在本發明中針對這一情形，設計的非對稱型的納米金結構，其中X與I結構單獨情況下會有自己的LSPR現象，產生自己特有的峰；在結合形成XI結構時，兩個結構的光譜會一同雜合，產生多峰現象；同時XI結構會產生耦合作用，從而使得其雜合而成的峰產生偏移；這一光譜產生的結果可以參見圖8-圖9所示。
[0087]為了使本發明上述方法更加清楚，也更加易於理解，以下通過實施例對本發明的方法步驟進行說明:
[0088]實施例1
[0089]本發明中選擇革蘭氏陽性細菌作為細菌標樣進行本發明操作:
[0090]S11，取0.5_2ml培養菌液於EP管後，高速離心30s，棄上清；於EP管中加緩衝液RB重懸，高速離心後棄上清；該步驟重複2~3次；
[0091]S12，加入適量溶菌酶，顛倒混勻，37°C溫浴30_60min ;高速離心後棄上清後將細胞振蕩或者吹打重懸於緩衝液RB中；
[0092]S13，向步驟S13得到的溶液中加RNase A(25mg/ml)溶液20 μ 1，振蕩混勻，室溫放置 5-10min ；
[0093]S14，加入結合液CB，再加入少量異丙醇，此時會出現絮狀的沉降物，立刻渦旋振蕩充分混勻，得到混合物；
[0094]S15，將混合物加入吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，高速離心30-60s，棄掉廢液；
[0095]S16，再向吸附柱AC中加抑制物去除液IR，高速離心30s，棄廢液；
[0096]S17，加入漂洗液WB，高速離心後棄掉廢液，加入500 μ I漂洗液WB，高速離心後棄掉廢液；並將吸附柱AC放回空收集管中，高速離心後除去漂洗液，以免漂洗液中殘留乙醇抑制下遊反應；
[0097]S18，取出吸附柱AC，放入一個乾淨的離心管中，在吸附柱AC的吸附膜的中間部位加100 μ I洗脫緩衝液EB進行洗脫，室溫放置3-5min，12000rpm離心lmin，搜集洗脫液；
[0098]S19，將得到的洗脫液重新加入離心吸附柱中，室溫放置2min，12000rpm離心lmin，便得到待測DNA樣品為提取的革蘭氏陽性細菌16srRNA基因；
[0099]得到革蘭氏陽性細菌的16srRNA基因後可以不置于于-20°C中保存，直接進入下述步驟使用；
[0100]S20，將上述S19得到的待測DNA進行PCR擴增；仍然採用20 μ I標準擴增體系進行;步驟319得到的待測0嫩14 1、0.5「1上遊引物、0.5μ I下遊引物、0.2μ I Easy Taq、2μ I dNTPs、2 μ IlOXEasy Taq BufferU4y I ddH20。
[0101]其中上遊引物和下遊引物根據革蘭氏陽性細菌的16srRNA基因設計合成對，用ddH20稀釋至工作濃度。
[0102]進行95 V預變性5min ;95 °C變性30s，依各引物退火溫度退火30s，72 °C延伸2min (依擴增產物長度1000bp/min)，設定32個循環，最後72°C延伸1min。
[0103]在上述PCR過程結束之後，將PCR擴增產物使用含Gelred核酸染料的1%瓊脂糖凝膠在含TAE緩衝液電泳槽中進行電泳，電壓120伏，電泳完成後使用凝膠成像系統拍照。
[0104]S30，製作非對稱的XI形納米金顆粒，按照如下步驟進行:
[0105]S31，選用2*2cm乾淨的石英玻璃片作為基底1，並對其進行清洗乾燥；獲取以納米級的非對稱結構的XI形凸型模板；其中該XI型凸型模板可以參見上述壓印模板3的描述。
[0106]S32，在基底I上設置一層樹脂層作為抗蝕層2 ;將凸型模板的納米級非對稱結構面對著樹脂層表面與石英玻璃片I壓合；在樹脂層2的表面上形成與凸型模板形狀適配的XI形狀的凹槽，壓合之後拿掉凸型模板。
[0107]S33，在室溫下，將上述壓合之後的帶有樹脂層的石英玻璃片斜置45度，然後進行沉積一層20nm的鉻(Cr)在樹脂層上作為保護層4 ;沉積之後樹脂層表面非凹槽位置會被被鉻層覆蓋，其凹槽表面凹陷因此沒有鉻沉積。
[0108]S34，在室溫下，將S33所得的沉積完鉻後的帶有樹脂層的石英玻璃片，平置與洗膠機中，使用氧氣等離子體進行衝洗、刻蝕；使得與凹槽位置對應的樹脂被刻蝕掉，從而位於這一位置的石英玻璃片表面裸露出來；
[0109]S35，在室溫下，將S34處理後的帶有樹脂層的石英玻璃片水平的放置，使用電子束蒸鍍，將Inm的鈦與20nm的金按順序分別均勻的蒸鍍在樣品上，使得樹脂層的表面和上述石英玻璃片裸露的表面上鍍上一層Ti/Au膜。
[0110]最後將石英玻璃片上的樹脂層全部除去，則在石英玻璃片表面得到一層X結構與I結構組合的非對稱的Ti/Au納米結構。
[0111]S40，在非對稱的Ti/Au納米結構的石英玻璃片上固定DNA捕獲探針，在這裡採用「NH2-T12-AAGGGGCATGATGATTTGACGTC」作為革蘭氏陽性細菌的16srRNA基因的捕獲探針序列，然後進行捕獲探針固定:
[0112]S41，將Iml的ImM TCEP加入99ml的0.2mM的DNA捕獲探針進行探針激活；
[0113]S42，再將4ml的捕獲探針加入1-buffer緩衝液形成緩衝溶液，再滴在石英玻璃片上，室溫下靜置I小時 ；使用超純水衝洗電極，並使用氮氣流乾燥；
[0114]其中1-buffer 緩衝液為 1mM Tris-HCl+lmM EDTA+0.1M NaCl+lOmM TCEP 配製成的ρΗ7.4緩衝系；
[0115]S43，將石英玻璃片浸潤在10ml的MCH溶液中室溫靜置2小時，再使用超純水衝洗電極，並使用氮氣流乾燥；
[0116]S44，使用紫外分光光度計對處理好的石英玻璃片在800nm~1800nm光波長內測量其吸收光譜。
[0117]S51，取IuM濃度的待測DNA溶液4uL滴加至上述固定有DNA捕獲探針的石英玻璃片上，並靜置I小時；之後再使用超純水衝洗石英玻璃片，並使用氮氣流乾燥；
[0118]S52，使用紫外分光光度計對處理好的石英玻璃片在800nm~1800nm光波長內測量其吸收光譜。
[0119]從上述S44中和S52兩個步驟中獲取的光譜吸收峰的變化，便可得出待測的DNA的結果。
[0120]參見圖10所示，圖10為本發明實施例非對稱納米結構LSPR傳感器進行革蘭氏陽性細菌DNA檢測的光譜圖；結果中發現步驟S52中的其吸收峰相比S44中的吸收峰向右偏移，所以表明DNA與LSPR傳感器(即上述非對稱性XI納米金屬結構的石英玻璃片)表面固定的探針相結合，即表明所檢測病菌是該探針所對應的病菌；
[0121]實施例2
[0122]基於上述對比，在實施例2中採用從金黃色葡糖球菌中提取DNA作為待測的DNA進行實施例1中的步驟，DNA捕獲探針仍然採用實施例1中的革蘭氏陽性細菌的16srRNA基因的捕獲探針序列；進行檢測步驟按照與實施例1相同的步驟進行。
[0123]在最後的吸收光譜中，所獲得的其吸收峰未出現移動，則是因為待測DNA與LSPR傳感器(即上述非對稱性XI納米金屬結構的石英玻璃片)表面固定的探針不能相結合，即表明所檢測病菌不是該探針所對應的病菌。
[0124]當然在上述實施例進行多次重複實施中，有可能存在其吸收峰向左移動的結果，是因為則表明在固定好的探針脫落，造成吸收峰向左移動；那麼重新重複捕獲探針固定步驟後再檢測即可。
[0125]並且，本發明的上述傳感裝置還可以對待測DNA進行定量檢測，因為局域表面等離子體共振是金屬納米顆粒或者不連續的金屬納米結構被入射光激發後，其內部自由電子的協同震蕩產生局域表面等離子體共振，金屬納米結構表面的局域電磁場被極大增強，展現強烈的表面等離子體共振吸收。當納米顆粒表面修飾特定捕獲探針，待測DNA與捕獲探針的雜交/親和結合會改變傳感器的檢測平面上納米顆粒本身的震動頻率，從而使得傳感器對入射光產生的吸收峰發生改變，變化的大小程度與檢測物質的濃度呈正相關。因此，基於光譜中的峰值的大小，便可以計算得出檢測物質的濃度，對待測DNA定量。
[0126]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包括在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種LSPR傳感裝置，包括基底，其特徵在於，所述基底上設有金屬層，所述金屬層呈XI形狀，且所述XI形狀尺寸為納米級。
2.如權利要求1所述的LSPR傳感裝置，其特徵在於，所述金屬層的X結構區包括四個分枝部；所述分枝部的長度為150~230nm、寬度為35~40nm，且相鄰兩分枝部之間的夾角為50~70度或110~130度； 所述金屬層的I結構區長度為250~350nm,寬度為35~40nm。 和/或所述金屬層包括位於基底上的Ti層、及位於所述Ti層上的Au層。 和/或所述基底為石英玻璃片、亞克力片或塑料片。
3.如權利要求1或2所述的LSPR傳感裝置，其特徵在於，所述金屬層上固定有DNA捕獲探針。
4.一種LSPR傳感裝置的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟: 獲取基底，並在所述基底上設置抗蝕層； 獲取模板，所述模板具有XI形狀的模型，且所述XI形狀尺寸為納米級； 將所述模板與設有抗蝕層的基底壓合，使抗蝕層表面形成與所述XI形狀的模型適配的凹槽； 在所述抗蝕層的非凹槽表面上形成保護層； 將具有所述保護層和抗蝕層的所述基底進行等離子刻蝕處理，使位於凹槽部分的抗蝕層刻蝕去除,使位於凹槽部的基底表面裸露； 在所述位於凹槽部的基底表面上生成金屬層； 除去所述基底上的所述抗蝕層。
5.如權利要求4所述的LSPR傳感裝置製作方法，其特徵在於，在所述位於凹槽部的基底表面上生成金屬層步驟中，採用電子束蒸鍍的方式生成所述金屬層。
6.如權利要求5所述的LSPR傳感裝置製作方法，其特徵在於，所述除去所述基底上的所述抗蝕層步驟之後，還包括在所述金屬層上固定DNA捕獲探針。
7.如權利要求6所述的LSPR傳感裝置製作方法，其特徵在於，所述在所述金屬層上固定DNA捕獲探針步驟包括: 將DNA捕獲探針加入緩衝液中形成DNA捕獲探針緩衝溶液； 將DNA捕獲探針緩衝溶液滴加至LSPR傳感裝置上，水洗後並在保護氣氛下乾燥； 將加有DNA捕獲探針的LSPR傳感裝置用MCH溶液處理後，再次水洗後於保護氣氛下乾燥。
8.一種基於權利要求1或2所述的LSPR傳感裝置的DNA檢測方法，其特徵在於，包括如下步驟: 獲取待測DNA樣品； 在LSPR傳感裝置上固定DNA捕獲探針，並於800nm~1800nm光波長內測量吸收光譜；在固定有DNA捕獲探針的LSPR傳感裝置上添加待測DNA樣品，再於800nm~1800nm光波長內測量吸收光譜； 根據添加待測DNA後吸收光譜的變化獲取待測DNA信息。
9.如權利要求8所述的基於LSPR傳感裝置的DNA檢測方法，其特徵在於，在所述LSPR傳感裝置上固定DNA捕獲探針步驟包括:將DNA捕獲探針加入緩衝液中形成DNA捕獲探針緩衝溶液； 將DNA捕獲探針緩衝溶液滴加至LSPR傳感裝置上，水洗後並在保護氣氛下乾燥； 將加有DNA捕獲探針的LSPR傳感裝置用MCH溶液處理後，再次水洗後於保護氣氛下乾燥。
10.如權利要求8或9所述的基於LSPR傳感裝置的DNA檢測方法，其特徵在於，所述將DNA捕獲探針加入緩衝液中形成DNA捕獲探針緩衝溶液步驟之前，還包括將DNA捕獲探針進行激活處理； 和/或所述將DNA捕獲探針進行激活處 理步驟包括將DNA捕獲探針用TCEP處理。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073425SQ201410271298
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月17日 優先權日:2014年6月17日
【發明者】李科錚, 吳宇亮, 於洪宇 申請人:深圳威芯華創科技有限公司