一種轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法

2023-11-11 04:40:42 2

專利名稱：一種轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法
技術領域：
本發明涉及一種水稻的轉基因技術，尤其是一種轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法。
背景技術：
培育抗病品種是農作物育種的主要目標之一。轉基因技術作為傳統育種方法的重要補充，可以避開雜交及多代選擇等繁瑣過程，將已經從植物基因組克隆的抗病基因轉化感病品種，利用較短的時間改良受體品種的抗病性。在水稻抗病基因的育種應用方面，隨著水稻基因組學和圖位克隆技術的完善，一系列水稻抗病基因被陸續分離和研究，為轉基因水稻研究提供了豐富的基因資源。
通過轉基因技術培育抗病品種還依賴於高效的無選擇標記轉化體系。雙菌株(雙載體)共轉化作為一種常用的無選擇標記轉化方法，具有載體簡單和易於構建等優點。與「雙T-DNA載體」共轉化方法相比較，後者雖然只用單個轉化載體，但是單個載體同時含有2個T-DNA區，使得載體構建相對困難一些。如果轉化的目的基因為序列較長的水稻NBS-LRR類抗病基因(例如水稻抗稻瘟病基因Pi9)，構建雙T-DNA載體的難度會更大。另一方面，現有關於雙菌株共轉化的研究表明，標記基因載體和目的基因載體發生共轉化的頻率變化較大，主要受植物材料生理狀態和農桿菌轉化條件等影響。在轉基因分離世代(Tl或T2)，需要分別從大量水稻植株提取DNA和進行標記基因及目的基因的PCR檢測。此外，在大約50%共轉化植株的基因組中，標記基因和目的基因的T-DNA發生連鎖，難於從其後代群體篩選獲得分離的無選擇標記轉基因個體。所以，雙菌株共轉化後代群體的分析工作非常繁重，亟需提高其無選擇標記轉基因個體的篩選效率，以便在高效、安全的轉基因技術基礎上，培育合乎育種目標的農作物新種質。2004年，Kolesnik等在水稻中進行轉座因子標籤研究，把綠色螢光蛋白(GFP)用作負選擇標記，篩除帶T-DNA (同時含GFP、HPT標記基因和Ac/Ds轉座元件)的水稻分離個體。2005年，Chen等利用一個雙T-DNA載體轉化菸草，其中標記基因的T-DNA帶有GFP和卡那黴素抗性選擇標記(NPTII)，目的基因的T-DNA僅含⑶S報告基因。通過GFP螢光檢測篩除GFP陽性的Tl植株，再從GFP陰性植株篩選GUS陽性個體，獲得了不含NPTII標記的轉GUS基因菸草。本發明向雙菌株共轉化載體系統引入了 GFP螢光標記。將GFP與潮黴素磷酸轉移酶(HPT)克隆於標記基因載體，目的基因(即水稻抗稻瘟病基因Pi9)置於另一 T-DNA載體，通過雙菌株方法獲得共轉化植株。在分離世代(Tl或T2)篩除GFP陽性的標記基因植株，然後對GFP陰性植株進行Pi9基因的PCR檢測，從而獲得轉Pi9的無選擇標記個體。並藉助於檯燈式螢光檢測器，大量、快速地篩除GFP陽性個體，減少後續鑑定Pi9基因的工作量，以提高無選擇標記植株的篩選效率。

發明內容
本發明要解決上述現有技術的缺點，提供一種篩選效率高的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法。本發明解決其技術問題採用的技術方案首先，將綠色螢光蛋白(GFP)與潮黴素磷酸轉移酶(HPT)克隆於標記基因載體，目的基因置於另一 T-DNA載體，攜帶標記基因載體的農桿菌菌株與攜帶目的基因載體的農桿菌菌株混合併轉化水稻愈傷組織，利用特異引物對目的基因載體的抗病基因進行PCR檢測，篩選獲得共轉化植株(TO)。然後，在共轉化植株的分離世代(Tl或T2)，藉助於檯燈式螢光檢測器，大量、快速地篩除GFP陽性的標記基因植株，並對GFP陰性植株進行抗病基因的PCR檢測，從而獲得轉抗病基因的無選擇標記個體。由於受體水稻的基因組存在與被轉化抗病基因同源的序列，所以根據目的基因載體的抗病基因序列及其兩側T-DNA序列，設計了多套PCR引物，分別在T-DNA邊界序列與抗病基因上遊或下遊序列之間進行擴增，對目的基因進行有效檢測。發明有益的效果是本發明向雙菌株共轉化載體系統引入了 GFP螢光標記將GFP 與潮黴素磷酸轉移酶(HPT)克隆於標記基因載體，並藉助於檯燈式螢光檢測器，大量、快速地篩除GFP陽性個體，減少後續鑑定Pi9基因的工作量，以提高無選擇標記植株的篩選效率，可以應用於水稻抗稻瘟病基因或其它功能基因的無選擇標記轉基因育種，提高水稻抗病能力或改良其它農藝性狀。


圖I:雙菌株共轉化的載體系統及共轉化水稻植株的篩選策略Pi9，水稻Pi9抗稻瘟病基因；GFP，綠色螢光蛋白；HPT，潮黴素磷酸轉移酶；LB和RB，T-DNA左邊界和右邊界序列；圖2:從共培養的水稻愈傷組織產生的綠色螢光轉化細胞團A :經過3d農桿菌共培養和l(Tl5d潮黴素培養基上的選擇培養，在燈式螢光檢測器下多個愈傷組織產生GPT+轉化細胞團；B :從單個愈傷組織產生的GFP+轉化細胞團；圖3 :共轉化水稻植株中Pi9抗稻瘟病基因的PCR檢測A pLJ42載體T-DNA區的DNA序列以及Pi9基因的PCR引物。RB和LB序列用黑體字母表示，RB和LB附近序列的特異引物(RB-1、RB-2、LB-1和LB-2)的同源序列用下劃線表示，Pi9兩側的SalI酶切位點用斜體字母表示。Pi9-l、Pi9-2和Pi9-3，Pi9基因的特異引物。引物的擴增方向用箭頭表示。B和C :分別為RB-I和Pi9-1引物的PCR(Pi9/RB-PCR)、以及LB-I和Pi9-2弓丨物的PCR(Pi9/LB-PCR)。M，DNA分子量標準；1，負對照(水);2，正對照(pLJ42質粒);3，負對照(未轉化水稻);4-11，日本晴的8個獨立轉化植株(TO)。D :空育131、浙11B、粵泰B和浙恢414的TO植株的Pi9/RB-PCR和Pi9/LB_PCR分析。MjDNA分子量標準；1-2 (空育 131) ;3-6(浙 11B) ;7(粵泰 B) ;8_12(浙恢 414)；圖4浙粳22T1代植株Pi9、HPT和GFP基因的PCR分析浙粳22 :水稻轉化受體；WX207和WX208 :獨立轉化的共轉化水稻株系；Pi9+HPT-GFP-:轉Pi9的無選擇標記Tl代植株；圖5浙恢414和浙粳22的共轉化Tl代植株稻瘟菌接種鑑定A :菲律賓稻瘟病菌系P06-6的接種結果，無選擇標記的Pi9基因植株表現抗病，而轉化受體浙恢414和不含Pi9的Tl植株均表現感病；B :浙江省12個稻瘟病菌系(B1、B15、C13、D1-1、D1-2、D3-1、D3-2、D3-3、D7-1、D7-2、E1 和 E3)混合孢子的接種結果，轉 Pi9 基因的無選擇標記植株表現抗病，而浙粳22和不含Pi9的Tl植株表現感病。原豐早、Co39和麗江黑谷感病品種；浙恢414和浙粳22 :水稻轉化受體；75-1-127 :含Pi9抗稻瘟病基因的水稻品系；WX409 :浙恢414的I個共轉化株系；WX207 :浙粳22的I個共轉化株系。
具體實施例方式下面結合附圖對本發明作進一步說明實施例以轉化水稻廣譜抗稻瘟病基因Pi9為例，通過改進的雙菌株(雙載體)共轉化系統，創製轉抗病基因的無選擇標記水稻種質材料。載體構建共轉化載體系統包括標記基因載體(pRBOl)和目的基因載體(pLJ42)，如圖I。將玉米泛素啟動子Ubi控制的綠色螢光蛋白(GFP)基因克隆到農桿菌轉化載體pCAMBIAl300 (Genbank AF234296)的HindIII和EcoRI酶切位點，產生標記基因載體 pRBOl, pRBOl還攜帶由花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子控制的潮黴素磷酸轉移酶基因(HPT)。HPT作為潮黴素抗性選擇標記，用於篩選水稻轉化細胞，GFP基因作為可視遺傳標記，用於跟蹤攜帶pRBOlT-DNA的水稻轉化細胞、組織和植株，以提高篩選效率。與此同時，將 pCAMBIA0380 載體(Genbank AF234290) T-DNA 區的 Nos-polyA序列去除，獲得 T-DNA 區不含任何基因的衍生載體PZJ06，然後將水稻廣譜抗稻瘟病基因Pi9的基因組片段(13. 5kb)克隆到PZJ06載體(其T-DNA區不含任何基因)的SalI位點，產生目的基因載體pLJ42。通過電激法將PBR01和pLJ42分別轉化農桿菌EHA105菌系。每個載體隨機取I個農桿菌轉化子，提取質粒DNA並轉化大腸桿菌DH5 a菌株，在轉化平板上隨機選取8_10個轉化菌落，擴大培養，提取質粒並進行酶切鑑定，酶切結果與原PBR01或pLJ42載體的酶切帶型一致的農桿菌轉化子用於水稻轉化。水稻愈傷組織的誘導培養水稻受體品種(系)6個，其中浙恢414、浙粳22、浙11B、日本晴和空育 131 為粳稻(Oryza sativa L. subsp. japonica)，粵泰 B 為秈稻(Oryzasativa L. subsp. indica)。取水稻成熟種子去殼,70%酒精浸泡2min,次氯酸鈉溶液(有效氯5%以上)浸泡2次，每次20min，無菌水衝洗5次。然後在NB培養基(N6大量元素，B5微量元素和維生素，2mg/L2，4-D)上培養4_5周。培養室光溫條件為26°C，光照12h，黑暗12h。將誘導的胚性愈傷組織轉移到新鮮NB培養基，繼代培養10d。農桿菌培養取轉化載體pRBOl和pLJ42的農桿菌單菌落，在含50mg/L卡那黴素的YEP液體培養基中單獨培養(280C，200r/min, l_2d)。在菌液0D600值達到I. 4 1. 8時，向OD值較高的菌液加YEP，直到被稀釋菌液與另一菌液的的OD值相等。然後將上述相同細胞濃度的PRBOl菌液和pLJ42菌液按I :4體積混合。離心收集菌體，並懸浮於含有200mM乙醯丁香酮(acetosyringone, Sigma)的AAM培養液。用AAM將混合菌液的0D600值調到0. 7左右，用於侵染水稻愈傷組織。水稻轉化如上所述，從各個水稻品種(系)的種子成熟胚誘導愈傷組織。攜帶目的基因載體PLJ42的農桿菌與攜帶標記基因載體pRBOl的農桿菌按4:1比例混合，每個水稻品種(系)取IOOlOO塊愈傷組織，在IOml農桿菌混合液中浸泡lOmin。吸去菌液，將愈傷組織轉移到滅菌濾紙上，超淨工作檯上乾燥15min。再將愈傷組織轉移到表面覆蓋有無菌濾紙的共培養培養基，20°C黑暗條件下培養3d。經過共培養的愈傷組織，先用無菌水洗4-5次,再用含300mg/L羧節青黴素的無菌水溶液洗1_2次,30min。用無菌濾紙吸乾愈傷組織表面水份，將愈傷組織轉移到選擇培養基(NB，50mg/L潮黴素，300mg/L頭孢黴素)。經過15 20d的第一次選擇培養，在燈式螢光檢測器下，愈傷組織的表面長出綠色螢光轉化細胞團(圖2)。然後篩選表達GFP綠色螢光的轉化愈傷組織，並轉移到新鮮的選擇培養基，進行第二次選擇培養(持續15-20d)。GFP陽性愈傷組織在分化培養基(NB，3mg/L 6-BA，0. 5mg/LNAA)上培養25 30d，待分化苗長到4cm左右時轉移到生根培養基(1/2NB，無激素)誘導生根。轉化水稻愈傷組織及植株(TO)的GFP螢光檢測對於體積較大的轉化愈傷組織，在檯燈式突光檢測器(modular fluorescence desk lamp detector,匈牙利BLS公司)下直接觀察培養皿中轉化愈傷組織表達的綠色螢光。GFP激發光源為raS/LS-lB(460-495nm)，濾光片為FHS/EF-2G2 (505_515nm)。對於體積較小的轉化細胞團，在徠卡螢光體視顯微鏡(LeicaM165FC)下觀察GFP螢光。轉化植株GFP螢光通過檯燈式檢測器進行檢測。
目的基因的PCR檢測及共轉化水稻植株的篩選轉化植株(TO)表達HPT酶和GFP螢光蛋白，表現潮黴素抗性，並且通過綠色螢光檢測獲得確認。再從GFP陽性的TO植株取葉組織，提取水稻基因組DNA，利用目的基因(水稻抗稻瘟病基因Pi9)的特異引物進行PCR分析，篩選含Pi9的共轉化水稻植株(Pi9+HPT+GFP+)，如圖I。由於受體水稻的基因組存在與Pi9抗稻瘟病基因同源的序列，所以根據目的基因載體抗病基因序列及其兩側的T-DNA序列，設計了多套PCR引物(圖3A ;表I)，分別在T-DNA邊界序列與抗病基因上遊或下遊序列之間進行擴增(圖3B、3C和3D)，從而對目的基因進行有效檢測Pi9上遊序列的擴增，採用T-DNA右邊界(RB)附近載體序列的同源引物RB-l(5』-CGCTCTTTTCTTAGGTTTACC-3』)和 Pi9 基因 5』 序列的同源引物 Pi9-1 (5』 -AACCGTAAGTAGTATAGCATAGCT-3』)，或採用 RB-2 (5』 -ATATCCTGTCAAACACTGATAGT-3』)和 Pi9_l。Pi9 下遊序列的擴增，採用 Pi9 基因 3』 序列的同源引物Pi9_2(5』-TCTTTGGACATATGCATGGACC-3』)和T-DNA左邊界(LB)附近載體序列的同源引物 LB-I (5，-GTAAACAAAITGACGCTTAGACAAC-3』)，或採用 Pi9_3(5』 -TGTATATTCTGGCCTTGTTTAGTT-3')和 LB-2 (5，-ATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGA-3')。檢測 Pi9 的 PCR 反應條件94°C，3min ；94°C，30s ；62°C，30s ；72°C, Imin ；32 個循環；72°C, 5min。對於高 GC 含量的Pi9下遊序列，使用2 X GC PCR緩衝液(TAKARA公司)。PCR反應使用rTaq DNA聚合酶(TAKARA 公司)。轉Pi9抗病基因無選擇標記後代植株的篩選從共轉化植株(TO)收穫Tl代種子，發芽後在檯燈式螢光檢測器下檢測綠色螢光，區分GFP陽性(GFP+)和陰性(GFP-)植株，然後棄除GFP陽性的標記基因植株。再按照以上關於目的基因(Pi9)的PCR檢測方法，從GFP-植株群體篩選帶目的基因的無選擇標記植株(表2)。同時利用HPT和GFP的特異引物，對無選擇標記後代以及其它Tl植株進行檢測，進一步確認無選擇標記植株(Pi9+HPT-GFP-)(圖4) ；T2代無選擇標記轉基因植株的篩選方法與Tl代相似從Tl代P19+GFP+植株收穫T2種子，對T2植株進行綠色螢光檢測，進而對GFP-植株進行Pi9基因的PCR檢測，篩選無選擇標記的Pi9基因植株(表3)。Tl代水稻植株的稻瘟病抗性鑑定採用孢子懸浮液噴霧法向轉Pi9基因無選擇標記水稻植株接種稻瘟病菌系P06-6 (圖5A)。對於轉化受體為浙粳22的WX207株系(Tl)，利用 12 個稻瘟病菌系(BI、B15、C13、Dl-1、Dl-2、D3-1、D3-2、D3-3、D7-1、D7-2、El 和 E3)的混合孢子接種(圖5B)。稻瘟病接種方法水稻種子去殼，表面滅菌，在1/2MS無激素培養基上發芽和生長3-5d，移栽到滅菌的水稻土。水稻幼苗在人工氣候箱內生長12-14d。生長條件為光照培養12h(溫度28°C，相對溼度80% )，黑暗培養12h(溫度20°C，相對溼度60% )。同時在種子發芽的當天開始培養稻瘟菌，將_20°C保存的帶稻瘟菌孢子的濾紙片接種到燕麥培養基(24g/L燕麥片，12g/L瓊脂，100mg/L羧苄青黴素)，27°C暗培養5d，然後相同溫度下連續光照培養5-7d。稻瘟菌培養物用含0. 02%TWeen 20的滅菌水衝洗，收集孢子懸浮液，並經過Miracloth微孔濾膜過濾。接種前將孢子濃度調節到5 X 105spores/ml。採用噴霧法向水稻幼苗接種稻瘟菌孢子，接種水稻苗在25-26°C暗培養24h，然後轉移至人工氣候箱中培養6-7d，考察稻瘟病發病情況。表I利用Pi9和T-DNA特異引物檢測共轉化Ttl水稻植株
權利要求
1.一種轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，包含以下步驟1)將綠色螢光蛋白(GFP)與潮黴素磷酸轉移酶(HPT)克隆於標記基因載體，目的基因置於另一T-DNA載體；2)攜帶標記基因載體的農桿菌菌株與攜帶目的基因載體的農桿菌菌株混合併轉化水稻愈傷組織；3)利用特異引物對目的基因載體的抗病基因進行PCR檢測，篩選獲得共轉化植株(TO) ;4)在共轉化植株的分離世代(Tl或T2)，藉助於檯燈式螢光檢測器，篩除GFP陽性的標記基因植株，並對GFP陰性植株進行抗病基因的PCR檢測，從而獲得轉抗病基因的無選擇標記個體。
2.根據權利要求I所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是所述步驟I)具體地說，將玉米泛素啟動子Ubi控制的綠色螢光蛋白(GFP)基因克隆到農桿菌轉化載體PCAMBIA1300 (Genbank AF234296)的HindIII和EcoRI酶切位點，產生標記基因載體pRB01，pRB01還攜帶由花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子控制的潮黴素磷酸轉移酶基因(HPT);將 pCAMBIA0380 載體(Genbank AF234290) T-DNA 區的 Nos-polyA 序列去除，獲得T-DNA區不含任何基因的衍生載體pZJ06，然後將水稻廣譜抗稻瘟病基因Pi9的基因組片段(13. 5kb)克隆到pZJ06載體的SalI位點，產生目的基因載體pLJ42。
3.根據權利要求I所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是所述步驟2)具體地說，攜帶目的基因載體PLJ42的農桿菌與攜帶標記基因載體PRBOl的農桿菌菌液混合，每個水稻品種(系)取IOOlOO塊愈傷組織，在IOml農桿菌混合液中浸泡IOmin ;吸去菌液，將愈傷組織轉移到滅菌濾紙上，超淨工作檯上乾燥15min ;再將愈傷組織轉移到表面覆蓋有無菌濾紙的共培養培養基，20°C黑暗條件下培養3d ;經過共培養的愈傷組織，先用無菌水洗4-5次，再用含300mg/L羧苄青黴素的無菌水溶液洗1_2次，30min ;用無菌濾紙吸乾愈傷組織表面水份，將愈傷組織轉移到選擇培養基(NB，50mg/L潮黴素，300mg/L頭孢黴素)，經過15 20d的第一次選擇培養，篩選表達GFP綠色螢光的轉化愈傷組織，並轉移到新鮮的選擇培養基，進行第二次選擇培養，持續15-20d ；GFP陽性愈傷組織在分化培養基(NB，3mg/L 6-BA,0. 5mg/L NAA)上培養25 30d，待分化苗長到4cm左右時轉移到生根培養基(1/2NB，無激素)誘導生根。
4.根據權利要求3所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是所述水稻品種(系)包括浙恢414、浙粳22、浙11B、日本晴、空育131和粵泰B。
5.根據權利要求3所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是所述農桿菌混合液的培養具體地說，取轉化載體PRBOl和pLJ42的農桿菌單菌落，在含50mg/L卡那黴素的YEP液體培養基中單獨培養(28°C，200r/min, l_2d)，在菌液0D600值達到I. ri. 8時，向OD值較高的菌液加YEP，直到被稀釋菌液與另一菌液的的OD值相等。然後將上述相同細胞濃度的PRBOl菌液和pLJ42菌液按I :4體積混合，離心收集菌體，並懸浮於含有200mM乙醯丁香酮(acetosyringone, Sigma)的AAM培養液,用AAM將混合菌液的0D600值調到0. 7左右。
6.根據權利要求3所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是所述水稻愈傷組織的誘導培養具體地說，取水稻成熟種子去殼，70%酒精浸泡2min,次氯酸鈉溶液(有效氯5%以上)浸泡2次，每次20min，無菌水衝洗5次，然後在NB培養基(N6大量元素，B5微量元素和維生素，2mg/L 2，4_D)上培養4_5周，培養室光溫條件為26°C，光照12h，黑暗12h，將誘導的胚性愈傷組織轉移到新鮮NB培養基，繼代培養10d。
7.根據權利要求I所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是所述步驟3)具體地說，通過綠色螢光檢測確認，從GFP陽性的TO植株取葉組織，提取水稻基因組DNA，利用目的基因(水稻抗稻瘟病基因Pi9)的特異引物進行PCR分析，篩選含Pi9的共轉化水稻植株(Pi9+HPT+GFP+)。
8.根據權利要求7所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是所述PCR分析具體地說，根據目的基因載體抗病基因序列及其兩側的TDNA序列，設計了多套PCR引物，分別在T-DNA邊界序列與抗病基因上遊或下遊序列之間進行擴增，從而對目的基因進行有效檢測，其中Pi9上遊序列的擴增，採用T-DNA右邊界(RB)附近載體序列的同源引物RB-I和Pi9基因5』序列的同源引物Pi9-1，或採用RB-2和Pi9-1 ;Pi9下遊序列的擴增，採用Pi9基因3』序列的同源引物Pi9-2和T-DNA左邊界(LB)附近載體序列的同源引物LB-I，或採用Pi9-3和LB-2。
9.根據權利要求8所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是檢測 Pi9 的 PCR 反應條件94°C,3min ；94°C,30s ；62°C,30s ;72°C，lmin ;32 個循環；72°C，5min，對於高GC含量的Pi9下遊序列，使用2 XGC PCR緩衝液(TAKARA公司)，PCR反應使用rTaq DNA聚合酶(TAKARA公司)。
10.根據權利要求I所述的轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，其特徵是所述步驟4)具體地說，從共轉化植株TO收穫Tl代種子，發芽後在檯燈式螢光檢測器下檢測綠色螢光，區分GFP陽性(GFP+)和陰性(GFP-)植株，然後棄除GFP陽性的標記基因植株，再按照目的基因(Pi9)的PCR檢測方法，從GFP-植株群體篩選帶目的基因的無選擇標記植株，同時利用HPT和GFP的特異引物，對無選擇標記後代以及其它Tl植株進行檢測，進一步確認無選擇標記植株(Pi9+HPT-GFP_) ;T2代無選擇標記轉基因植株的篩選方法與Tl代相似，從Tl代Pi9+GFP+植株收穫T2種子，對T2植株進行綠色螢光檢測，進而對GFP-植株進行目的基因(Pi9)的PCR檢測，篩選無選擇標記的Pi9基因植株。
全文摘要
本發明涉及一種轉化水稻抗病基因並獲得無選擇標記轉基因後代的方法，首先，將綠色螢光蛋白(GFP)與潮黴素磷酸轉移酶(HPT)克隆於標記基因載體，目的基因置於另一T-DNA載體，攜帶標記基因載體的農桿菌菌株與攜帶目的基因載體的農桿菌菌株混合併轉化水稻愈傷組織，利用特異引物對目的基因載體的抗病基因進行PCR檢測，篩選獲得共轉化植株(T0)。然後，在共轉化植株的分離世代(T1或T2)，藉助於檯燈式螢光檢測器，大量、快速地篩除GFP陽性的標記基因植株，並對GFP陰性植株進行抗病基因的PCR檢測，從而獲得轉抗病基因的無選擇標記個體。本發明可以應用於水稻抗稻瘟病基因或其它功能基因的無選擇標記轉基因育種，提高水稻抗病能力或改良其它農藝性狀。
文檔編號A01H5/00GK102703499SQ201210223328
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月27日 優先權日2012年6月27日
發明者何海燕, 劉中來, 李軍, 王歆, 瞿紹洪, 趙建華 申請人:浙江省農業科學院