黃病毒疫苗輸送系統的製作方法

2023-11-11 05:29:42 2

專利名稱：：黃病毒疫苗輸送系統的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種改良的(improved)黃病毒複製子、包含該黃病毒複製子的表達載體、構建體和系統。更具體地，本發明涉及一種可用作疫苗輸送系統的黃病毒表達系統，該表達系統編碼異源性的免疫原性蛋白和肽，所述的蛋白和肽能夠誘導抗病毒感染和抗癌症的保護性T細胞免疫。疫苗可通過DNA、RNA或病毒樣顆粒的形式而施用，其經過在細胞內自我複製而產生高水平表達的RNA和所編碼的蛋白。
背景技術：
：基於複製子的正鏈RNA病毒載體已經被研發用於抗病毒疫苗和抗癌症的疫苗(綜述見參考文獻25)。這些載體所具有的一些特徵使其成為研發高效而安全的疫苗的一種合適的選擇。這些特徵包括(i)由於複製子RNA具有自我擴增的能力，因而可高水平表達所編碼的異源性基因(HG)，(ii)其僅在細胞質內進行複製，因此不會引起與細胞核內剪切和/或染色體整合相關的問題，(iii)複製子RNA不會脫離轉染的(或感染的)細胞，因此限制了疫苗載體在被免疫的對象內的播散，這使得這些載體具有生物學安全性，以及(iv)其基因組(7-9kb)相對較小，因此易於對其cDNA進行處理並產生重組體。基於複製子的表達載體已經被研發用於大多數典型的正鏈RNA病毒家族成員，包括α病毒、微小核糖核酸病毒(picomavirus)以及黃病毒(綜述見參考文獻25)。不過，絕大部分有關實驗動物的複製子載體的免疫原特性的數據來源於α病毒的複製子，例如新培斯病毒(Sindbisvirus，SIN)、塞姆利基森林病毒(SemlikiForestvirus，SFV)和委內瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelanequineencephalitisvirus，VEE)(綜述見參考文獻47，更新的研究結果見參考文獻8，10，11，39)。總體而言，這些研究顯示，α病毒複製子載體可誘導針對其所編碼的免疫原的強烈的抗體和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的應答，且在大多數情況下，在適當的病毒或腫瘤攻擊實驗中可保護被免疫的動物。三種輸送方式均是有效的，不過，VLP具有最高的輸送功效。將常規(非複製型)質粒DNA載體與基於α病毒DNA的複製子載體進行比較研究發現，後者通常會誘導更強的免疫應答且所用的DNA濃度明顯更低(4，17)。但是，一些研究發現，由基於DNA的α病毒複製子所誘導的免疫應答的功效似乎取決於所編碼的免疫原的性質，且針對免疫原的免疫與等量的常規質粒DNA載體所誘導免疫效果相似或更低(10，23)。衍生自黃病毒Kunjin(KUN)的複製子載體在一些出版物中已經有描述(26，28，52，53；國際申請WO99/28487)。KUN複製子表達系統，例如α病毒複製子系統，可以三種方式輸送複製子RNA，即以裸RNA、VLP和質粒DNA(圖1A)(25，52，53)的方式。不同於同源性α病毒複製子包裝系統(6，33，41)，KUN複製子包裝系統利用了衍生自無關的SFV病毒的複製子表達載體來產生KUN結構蛋白(28，52)。這樣可以消除可能存在與感染性重組材料汙染VLP有關的問題。此外，與通常用於免疫接種研究的、對細胞具有高致病性的α病毒複製子載體不同，KUN複製子似乎不具有細胞致病性，因此能夠在體外和體內長期表達HG(53)。儘管目前已經存在非細胞致病性的α病毒複製子載體(1，12，40)，但還沒有有關其免疫原性特性的研究結果。已往的研究中，用包含非細胞致病性的、基於DNA的、表達β-半乳糖苷酶基因的KUN複製子載體的VLP免疫小鼠，可誘導產生抗β-半乳糖苷酶的抗體應答(53；國際申請WO99/28487)。但是，尚未證明KUN複製子載體系統可以輸送能夠誘導保護性免疫應答的免疫原。發明目的本發明人在此首次描述了基於黃病毒複製子的疫苗的疫苗輸送系統，該疫苗輸送系統能夠通過抗體和T細胞介導的應答而提供長期的保護性免疫。此外，本發明人對用於產生VLP的黃病毒複製子和包裝系統進行了修飾和改良。因此，本發明的一個目的是提供一種用於輸送疫苗的、經過改良的黃病毒複製子載體系統。
發明內容因此本發明廣泛涉及一種黃病毒表達系統以及其中所用的黃病毒複製子、表達載體和表達構建體。在一個具體實施方案中，本發明涉及一種黃病毒疫苗輸送系統。在一個方面，本發明提供了一種表達載體，其包含(i)一種編碼不能產生感染性病毒的黃病毒複製子的核苷酸序列，其中所述的黃病毒複製子編碼一或多種突變的黃病毒非結構蛋白；(ii)一個異源性核酸的插入位點；(iii)可操縱地連接於編碼所述的黃病毒複製子的核苷酸序列的啟動子；以及(iv)至少一種編碼自身蛋白酶(autoprotease)的核苷酸序列。在適當條件下，相對於編碼相應的野生型蛋白的黃病毒複製子而言，編碼突變的黃病毒非結構蛋白的黃病毒複製子能夠更有效地在動物細胞中實現持久的複製。優選地，(i)中所述的突變的黃病毒非結構蛋白選自(a)突變的非結構蛋白NS1；(b)突變的非結構蛋白NS2A；以及(c)突變的非結構蛋白NS5。更優選地，(i)中所述的突變的黃病毒非結構蛋白選自(i)脯氨酸250突變為亮氨酸的非結構蛋白NS1；(ii)丙氨酸30突變為脯氨酸的非結構蛋白NS2A；(iii)天冬醯胺101突變為天冬氨酸的非結構蛋白NS2A；以及(iv)脯氨酸270突變為絲氨酸的非結構蛋白NS5。在一個優選的實施方案中，該種或每一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列編碼一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。在一個具體的實施方案中，該表達載體包含一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列。該實施方案的實例被命名為SP6KUNrep5和pKUNrep5。在另一個具體實施方案中，該表達載體包含兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一種位於所述的插入位點的5′，而所述的至少兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二種位於所述的插入位點的3′。該實施方案的實例被命名為SP6KUNrep6和pKUNrep6。在另一方面，本發明提供了一種表達構建體，其包含(i)一種編碼不能產生感染性病毒的黃病毒複製子的核苷酸序列，其中所述的黃病毒複製子編碼一或多種突變的黃病毒非結構蛋白；(ii)一種異源性核酸；(iii)可操縱地連接於編碼所述的黃病毒複製子的核苷酸序列的啟動子；以及(iv)至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列。在適當條件下，相對於編碼相應的野生型蛋白的黃病毒複製子而言，編碼突變的黃病毒非結構蛋白的黃病毒複製子能夠更有效地在動物細胞中實現持久的複製。優選地，(i)中所述的突變的黃病毒非結構蛋白選自(a)突變的非結構蛋白NS1；(b)突變的非結構蛋白NS2A；以及(c)突變的非結構蛋白NS5。更優選地，(i)中所述的突變的黃病毒非結構蛋白選自(i)脯氨酸250突變為亮氨酸的非結構蛋白NS1；(ii)丙氨酸30突變為脯氨酸的非結構蛋白NS2A；(iii)天冬醯胺101突變為天冬氨酸的非結構蛋白NS2A；以及(iv)脯氨酸270突變為絲氨酸的非結構蛋白NS5。在一個優選的實施方案中，該種或每一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列編碼一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。在一個實施方案中，所述的表達構建體包含至少兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一種位於所述的異源性核酸的5′，而所述的至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二種位於所述的異源性核酸的3′。在一個具體實施方案中，該方面提供了可自一種DNA表達構建體轉錄而來的一種RNA，其中所述的RNA包含(i)其中所述的黃病毒複製子編碼一或多種突變的黃病毒非結構蛋白；以及(ii)一種編碼一種異源性蛋白的異源性RNA序列。在一個實施方案中，所述的啟動子能以可操縱的方式在體內啟動RNA轉錄。更優選地，所述的啟動子能以可操縱的方式在哺乳動物細胞中啟動RNA轉錄。一種優選的在哺乳動物細胞中可操縱的啟動子的實例是CMV啟動子。在另一個實施方案中，所述的啟動子能以可操縱的方式在體外啟動RNA轉錄。一種優選的能以可操縱的方式在體外啟動RNA轉錄的啟動子的實例是SP6啟動子。在具體的實施方案中，本發明的表達構建體的非限制性實例包括用於體外RNA表達的包含SP6啟動子的RNALeuMpt、RNAProMpt、KUNRNAgag或用於細胞內RNA表達的包含CMV啟動子的DNALeuMpt、DNAProMpt、KUNDNAgag。在另一方面，本發明提供了一種表達系統，其包含(i)上述第一方面的表達載體或上述第二方面的表達構建體；和(ii)至少另一種能夠表達一或多種蛋白的表達構建體，所述的蛋白有助於將所述的表達載體或構建體包裝入黃病毒病毒樣顆粒(VLP)。在具體的實施方案中，所述的另一種表達構建體是一種包裝構建體，其選自SFVMEC/L713P、SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PlacZNeo。這些構建體在SFVnsP2基因中將亮氨酸713以脯氨酸進行取代以降低細胞致病性。SFVMEC/L713P/Neo和pSFV3L713PlacZNeo特別適合用於產生穩定的細胞系。在另一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含可自一種黃病毒DNA表達構建體轉錄而來的一種RNA，其中所述的RNA編碼(i)一種不能產生感染性病毒的黃病毒複製子；和(ii)一種免疫原性蛋白質。在另一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含一種可在動物細胞中自其轉錄得到RNA的黃病毒DNA表達構建體，其中所述的轉錄得到的RNA編碼(i)一種不能產生感染性病毒的黃病毒複製子；和(ii)一種免疫原性蛋白質。優選地，根據上述的核酸組合物，所述的DNA和RNA表達構建體包括一種編碼至少一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的核苷酸序列。更優選地，所述的DNA和RNA構建體包括一種位於所述的編碼第一種所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的異源性核酸的5′的核苷酸序列以及一種位於所述的編碼第二種所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶的異源性DNA的3′的核苷酸序列。在另一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含由上述第三方面的表達系統產生的一或多種VLP。優選地，本發明的藥物組合物是免疫治療性組合物，或更優選地，是疫苗。在另一方面，本發明提供了對動物進行免疫的方法，其包括將上述任一方面所述的藥物組合物施用於所述的動物以便在所述的動物中誘導免疫。動物包括人、家畜、寵物、家禽和其他具有商業價值的動物，儘管並不限於這些。優選地，所述的動物是哺乳動物。更優選地，所述的動物是人。免疫可以是抗體介導的和/或細胞介導的免疫，例如T細胞介導的免疫。在一個實施方案中，T細胞免疫的特徵在於是CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。優選地，T細胞免疫的特徵在於誘導一種長期的效應細胞CD8+CTL應答。在另一個實施方案中，T細胞免疫的特徵在於是一種CD4+T細胞應答。在一個具體的實施方案中，所述的免疫方法誘導針對病毒的免疫。在另一個具體實施方案中，所述的免疫方法誘導針對癌症例如黑色素瘤的免疫。在本文中，除非另有說明，「包含」取其包括而非排他的含義，因此所述及的整數或整數的組可以包括一或多個未被述及的其他的整數或整數的組。附圖和表格說明表1.貫序轉染Kunjin和SFV複製子RNA。表2.同時轉染Kunjin和非細胞致病性的SFV複製子RNA。表3.在以Kunjin複製子RNA轉染的SFVMECA12細胞系中產生分泌的VPL。表4.孵育溫度對以KUN-GAG複製子RNA轉染的SFVMECA12細胞系產生VLP的影響。表5.VLP在表達非細胞致病性的SFV複製子並以pSFVHelperCprME和KUN-GAGRNA轉染的細胞系中的產生。表6.以KUNgagVLP進行免疫後對rVVgag攻擊實驗(challenge)的保護作用。表7.嘌呤黴素抗性BHK-KUN複製子細胞克隆No11和No20中的適應性突變(adaptivemutations)。圖1.基於KUN複製子的複製子基因表達和輸送系統(A)和編碼鼠多表位(murinepolyepitope，Mpt)的KUN複製子構建體(B)的示意圖。(A)可自摻入了噬菌體SP6啟動子的質粒DNA進行體外轉錄得到KUN複製子RNA並將其作為裸RNA通過轉染或注射進行輸送(26，52)。還可以藉助於細胞的RNA聚合酶II，自轉染的或注射的摻入了巨細胞病毒(CMV)啟動子的質粒DNA進行體內合成得到KUN複製子RNA(53)。此外，可使用如前所述的包裝系統首先將KUN複製子RNA包裝入病毒樣顆粒(virus-likeparticles，VLP)中(28)，然後通過轉染而輸送(52)。無論輸送方式如何，一旦進入細胞質，KUN複製子RNA即開始自我複製產生多個RNA拷貝，再由其進行翻譯，引起所編碼的異源性基因(HG)產物的產生增加。CAP代表在體外轉錄過程中通過合成方法或在體內轉錄或KUNRNA複製過程中天然添加到複製子RNA分子5′端的帽結構，其可確保有效起始翻譯過程。(B)KUN複製子構建體含有KUNRNA複製所需的序列，即5′和3′非翻譯區(UTR)，編碼KUNC蛋白(C20)的前20個胺基酸和KUNE蛋白(E22)的最後22個胺基酸的序列，以及編碼KUN非結構蛋白NS1(以NS1表示)、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、和NS5(以NS2-NS5表示)的完整的非結構區。此外，構建體還含有位於KUN5′UTR上遊的SP6或CMV啟動子，以便在體外或體內分別驅動RNA轉錄，以及插入到3′UTR下遊的含有丁型肝炎病毒核酶(HDVr)的反基因組序列(antigenomicsequence)和來自猿猴病毒40的聚腺苷酸化信號(pA)，以確保產生具有有效起始複製所需的精確3′端的KUN複製子RNA分子。為了使Mpt肽能夠自KUNC20和E22肽釋放到細胞質，所述構建體含有2個拷貝的口蹄疫病毒2A自身蛋白酶(FMDV2A)，其分別位於該Mpt序列的上遊和下遊。Pro和Leu變體分別在KUNNS1基因的250位含有胺基酸Pro或Leu。圖2.編碼鼠多表位(polytope)的KUN複製子構建體在轉染的BHK21細胞中複製的證據。(A)對以基於DNA或基於RNA的編碼Mpt的KUN複製子轉染的BHK21細胞進行IF分析。以KUN複製子多表位DNA(DNALeuMpt和DNAProMpt)或RNA(RNALeuMpt和RNAProMpt)轉染位於蓋玻片上的細胞，在轉染後48小時通過IF分析KUNNS3蛋白的表達。(B)對來自以KUN複製子多表位DNA和RNA轉染的BHK21細胞的總RNA進行Northern印跡分析。按照材料和方法中所述進行細胞轉染、RNA分離和Northern印跡分析。左圖所示為以代表KUN3′非翻譯區的KUN-特異性探針進行Northern印跡分析的結果，右圖所示為以代表Mpt序列的探針對同一張膜進行再次雜交的Northern印跡分析的結果。來自DNA轉染的細胞的樣品含有6μg總RNA，而來自RNA轉染的細胞的樣品含有12μg總RNA。pKUNβRep2(dGDD)條帶顯示的是分離自以產生編碼β-半乳糖苷酶基因的非複製型KUN複製子RNA的pKUNβRep2(dGDD)DNA(53)轉染的BHK細胞的RNA樣品。在左圖中該RNA的位置以星號示出。對照RNA為10ng體外轉錄的RNALeuMptRNA。圖3.以各種編碼Mpt免疫原的基於KUN複製子的載體進行免疫所誘導的特異於YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALV(TYQ)和SYIPSAEKI(SYI)表位的CTL應答。(A)在以指定疫苗進行免疫後對Balb/c小鼠(n＝4/組)的脾細胞進行ELISPOT分析。(B)對經過再次刺激的、來自以VLPProMpt進行免疫的Balb/c小鼠(n＝3/組)的脾細胞群進行51鉻(Cr)釋放分析。使用經過指定的肽致敏(實心方塊)或未經指定的肽致敏(空心方塊)的標記的靶細胞進行標準的6hCr釋放分析。圖4.以不同劑量的基於DNA的編碼Mpt的KUN複製子進行免疫誘導的特異於SYIPSAEKI表位的CD8+CTL應答。將DNALeuMpt和DNAProMpt以PBS進行連續稀釋，並以指定劑量注射到Balb/c小鼠(n＝4/組)的四頭肌。2周後處死小鼠並以ELISPOT分析測定CD8+CTL應答。圖5.A和B。接種RNALeuMpt疫苗後以重組痘苗病毒(vacciniavirus)和B16-OVA腫瘤進行攻擊實驗.(A)重組牛痘(vaccinia)攻擊實驗。以RNALeuMptRNA或RNALeuControlRNA接種Balb/c小鼠(n＝6/組)一次，然後以rVVMpt攻擊。在感染後第4天測定卵巢內的痘苗病毒滴度。(B)B16-OVA攻擊實驗。Balb/c小鼠(n＝6/組)以RNALeuControlRNA或RNALeuMptRNA免疫兩次或者以編碼鼠多表位(rVVMpt)的重組牛痘免疫一次，然後以B16-OVA細胞進行攻擊實驗。上圖顯示的是三組小鼠中每組12個腫瘤部位的平均腫瘤面積。當某一組中的第一個腫瘤的大小達到15×15mm時需要對動物處以安樂死(euthanisation)，腫瘤生長曲線隨即終止。下圖為三組小鼠的Kaplin-Meier存活曲線。當腫瘤的大小達到15×15mm時對小鼠處以安樂死。圖5C.接種VLPLeuMpt疫苗後的B16-OVA腫瘤攻擊實驗的Kaplan-Meier存活曲線。當腫瘤的大小達到15×15mm時將小鼠處死。VLPLeuMpt與rVV相比，Logrank統計p＜0.01。圖6.含有1拷貝FMDV2A蛋白酶的表達載體pKUNrep4(已經發表於參考文獻53)、pKUNrep5和SP6KUNrep5以及含有2拷貝FMDV2A蛋白酶的表達載體EMCVIRES、SP6KUNrep6和pKUNrep6的例子。通過自pKUNrep4缺失PAC基因而得到pKUNrep5。通過在pKUNrep5質粒中以SP6啟動子取代CMV啟動子而製備SP6KUNrep5。pKUNrep5和SP6KUNrep5載體僅具有一個FMDV2A序列可供裂解釋放出具有一個鄰近真實N端(authenticN-terminus)的異源性基因產物。插入的異源性基因下遊的EMCVIRES序列使得KUN非結構基因可獨立起始轉錄，因此該異源性基因可具有一個終止密碼子因此也就具有一個真實C端。pKUNrep6載體是DNALeuMpt和DNAProMpt表達構建體的基礎，而SP6KUNrep6是RNALeuMpt和RNAProMpt表達構建體的基礎，如圖1B所示。圖7.構建pSFVMECL713P。首先，將來自pSFV1載體(LifeTechnologies)的、含有塞姆利基森林病毒nsP2基因的SacI-XhoI片段連接到pBluescriptIIKS中，以誘導第713位胺基酸突變。這通過採用重疊PCR而進行，重疊PCR在nsP2基因中產生了一個AvrI1位點，將第713位胺基酸由亮氨酸改變為脯氨酸。該突變L713P可產生一種非細胞致病性的SFV株(59)。隨後將得到的質粒命名為pBSKS/SFVSac-Xhofrt。然後，將此構建體的RsrII-Bsu36I片段轉染到pSFVMEC105內遺產生所述構建體，pSFVMECL713P。圖8.構建pSFVMECL713Pneo。用MluI和XbaI將EMCV內部的核酶進入位點(IRES)的序列和新黴素基因自pBS-CIN4IN切下。然後將IRES/Neo基因插入位於插入的Kunjin核心序列下遊的pSFVMECL713P的BamHI位點。然後將此構建體用於建立表達KUN結構基因的穩定細胞系。圖9.構建pSFV3L713PlacZNeo。首先，使用來自pBS-CIN4IN的MluI-XhaI末端補平片段將IRES/Neo基因插入pSFV3LacZ，所述的來自pBS-CIN4IN的MluI-XhaI末端補平片段與將IRES/Neo克隆入pSFVMECL713Pneo所用的片段相同，該MluI-XhaI片段插入pSFV3LacZ的SmaI位點。隨後，以相同的限制性位點，將來自pSFVMECL713P的含有SFV非結構蛋白1-4的SpeI-NotI片段轉移至pSFV3LacZNeo，以便引入產生SFV複製子非細胞致病性表型的L713P突變。圖10.構建pSFVHelperprMEC。為了構建用於在pSFV3L713PlacZNeo穩定細胞系中表達Kunjin結構基因的輔助質粒，用MscI-SpeI位點將KUNprMEC基因盒自pSFVMEC105中切下，然後將該片段以相同的限制性位點插入pSFVHelper2(LifeTechnologies)並取代SFV結構蛋白。應當注意的是，該構建體中，prME和C被置於兩個單獨的26S啟動子的控制下。圖11.構建pSFVHelperCprME。使用Pfu聚合酶和適當的引物，並以含有全長KunjincDNA(27)的FLSDX質粒DNA作為模板，通過PCR產生兩端具有BglII位點的KunjinCprMEcDNA片段。然後將該CprME片段與含有同樣由PCR產生的並在兩端含有BamHI位點的pSFVHelper2載體的片段相連接。圖12.以KUNgagVLP(n＝6/組)和rVVgag(n＝3/組)免疫接種後引起小鼠產生的抗HIVgag抗體。以106PFU的KUNgagVLP或對照KUNVLP(KUN對照)免疫接種小鼠2次，或以106PFU的rVVgag免疫接種小鼠1次。末次免疫接種後2-3周，用針對純化重組gag蛋白的ELISA分析小鼠血清的抗gag抗體。圖13.對來自以KUNgagVLP免疫接種的小鼠的脾細胞進行T細胞增殖分析。HIV-1gag蛋白脈衝處理的脾細胞用於刺激脾細胞。SE＝標準誤。經過和未經過免疫接種的小鼠的刺激指數分別按照以HIV-1gag抗原刺激的計數(黑色條形)/無抗原刺激的計數(白色條形)計算出。圖14.KUN複製子VLP疫苗引起的長期免疫應答(A)以KUNgagVLP單次免疫接種2周和6個月後，Balb/c小鼠(n＝4/組)中針對AMQ表位的ELISPOT應答。(B)以編碼鼠多表位免疫原(mpt)的KUN複製子VLP2次免疫接種Balb/c小鼠(n＝8/組)(間隔4周)，6個月後對來自該小鼠的脾細胞進行ELISPOT分析。顯示了針對由Mpt編碼的各個表位，即YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALV(TYQ)和SYIPSAEKI(SYI)的CD8+T細胞應答。(C)以KUNmptVLP間隔4周免疫接種Balb/c小鼠(n＝6/組)共2次，第二次免疫接種10個月後，以編碼mpt(rVVmpt)的重組痘苗病毒對小鼠進行攻擊實驗。感染後第4天，測定卵巢中痘苗病毒的滴度。圖15.來自KUN複製子RNA的β-半乳糖苷酶在不同的抗嘌呤黴素的BHK細胞克隆的第4代中的表達。圖16.適應性突變對KUN複製子RNA在BHK21細胞中實現持久複製的能力的影響。從左至右，培養盤為repPACβ-gal、repPACβ-galNS2A(A-P)、repPACβ-galNS2A(N-D)和repPACβ-galNS5(P-S).具體實施例方式本發明人描述了以表達鼠CTL多表位(polyepitope或polytope)(Mpt)和HIV-1gag的KUN複製子作為免疫原，並以裸RNA、VLP、或質粒DNA的形式輸送從而對小鼠進行免疫接種。所有這些免疫接種的方式均誘導了針對所編碼的表位的特異性CD8+CTL應答，且在裸RNA和VLP的情況下，保護小鼠抵抗病毒和腫瘤攻擊實驗。此外，將表達完整HIV-1gag基因的KUN複製子以VLP形式輸送從而對小鼠進行免疫接種，誘導了特異於gag的抗體和CD4+T細胞應答，並保護小鼠抵抗以表達所述gag基因的重組痘苗病毒進行的攻擊實驗。此外，KUN複製子經過修飾(與WO99/28487相比)，在編碼異源性免疫原的序列的5′和3′插入了FMDV2A自身蛋白酶序列。這種修飾可引起所表達的融合蛋白發生自身蛋白裂解而釋放基本上無外來胺基酸序列的蛋白質免疫原。進一步的修飾包括使用編碼本發明的黃病毒複製子的NS1、NS2A和NS5蛋白成分中的一或多種的突變的核苷酸序列，該突變可更加有效地建立持久的複製。本發明還提供了一種新的、基於SFV的病毒包裝系統，其較國際申請WO99/28487所述的基於SFV的系統具有更低的細胞治病性。KUN複製子表達載體和構建體術語「核酸」在此是指單鏈或雙鏈的mRNA、RNA、cRNA和DNA包括cDNA和基因組DNA。在此，「黃病毒」是指屬於黃病毒屬(genusFlavivirus)的黃病毒科(familyFlaviviridae)成員，其含有65或更多種相關的病毒。典型地，黃病毒是小的、有包膜RNA病毒(直徑大約45nm)，具有包含單一糖蛋白E的包膜突起。其他結構蛋白稱為C(核心)和M(膜樣)。單鏈RNA具有感染性，典型地，其分子量為大約4×106，5′末端具有m7G帽，但在3′末端無poly(A)；其僅僅起到信使(messenger)的作用。黃病毒可感染很多種脊椎動物，其中多為節肢動物如蜱和蚊子所轉播，不過個別黃病毒群(group)通過未知載體(NKV)傳播。具體而言，黃病毒的非限制性實例為西尼羅河病毒(WestNilevirus)、Kunjin病毒、黃熱病毒(YellowFevervirus)、日本腦炎病毒(JapaneseEncephalitisvirus)、登革熱病毒(Denguevirus)、MontanaMyotis白質腦炎病毒(MontanaMyotisleukoencephalitisvirus)、烏蘇土病毒(Usutuvirus)、和Alkhurma病毒(Alkhurmavirus)。儘管本發明的優選的黃病毒複製子來自Kunjin病毒，但本領域技術人員能夠理解本發明的表達載體、表達構建體和表達系統可以採用任何黃病毒複製子。研究較為深入的黃病毒複製子的例子包括西尼羅河病毒I系(參考文獻61)和II系病毒株(參考文獻62)複製子。本發明所預期的黃病毒複製子包括任何來自黃病毒RNA的自我複製型成分，例如見國際申請WO99/28487所述。在此一般而言，黃病毒複製子衍生自黃病毒或者是黃病毒起源的。因此，在本說明書中，「編碼黃病毒複製子的核苷酸序列」是指一種DNA或RNA序列，其包含的來自黃病毒複製子或至少其一部分的序列信息足以進行複製但不能產生感染性病毒。例如，本領域人員能夠明了，在此所指的本發明的基於DNA的構建體包含複製子RNA的一個DNA拷貝，其互補於所述的複製子RNA或者是衍生於所述的複製子RNA。適當地，所述的黃病毒複製子能夠複製但是「不能產生感染性病毒」。這意味著所述黃病毒複製子無法表達病毒包裝所需的一或多種結構蛋白的完整分子或部分。國際申請WO99/28487詳細說明了如何修飾Kunjin黃病毒複製子以使其無法進行病毒包裝。在一個優選的實施方案中，所述黃病毒複製子包含(i)5′和3′非翻譯(UTR)序列以及分別編碼C蛋白的前20個胺基酸(C20)和E蛋白的最後22個胺基酸(E22)的序列；和(ii)編碼非結構蛋白NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5的核苷酸序列。在一個具體方面，所述的非結構蛋白中的一或多種是突變的。在一個具體的實施方案中，NS1蛋白的脯氨酸殘基250被亮氨酸取代。在另一個具體實施方案中，非結構蛋白NS2A中的丙氨酸30被脯氨酸取代。在另一個具體實施方案中，非結構蛋白NS2A中的天冬醯胺101被天冬氨酸取代。在另一個具體實施方案中，非結構蛋白NS5中的脯氨酸270被絲氨酸取代。還應該理解，上述各種突變或取代可單獨出現或以組合形式出現於本發明的黃病毒複製子中。根據本發明，「表達載體」包含上述黃病毒複製子連同一或多種其他調節核苷酸序列。此類調節序列包括但不限於啟動子、內部核糖體進入位點(IRES)、用於插入一或多種異源性核酸的限制性酶切位點、聚腺苷酸化序列以及其他序列如丁型肝炎病毒核酶(HDVr)的反基因組序列以分別確保轉錄的終止和精確裂解3′端。應該理解，本發明的表達載體和表達構建體包括編碼至少一種自身蛋白酶的核苷酸序列。優選地，所述的核苷酸序列編碼至少一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶，或更優選地，所述的核苷酸序列中的每種各自編碼一種相應的口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。優選地，使用一種表達的融合蛋白，其包含一種兩翼分別為一種N-埠蹄疫病毒2A自身蛋白酶和一種C-埠蹄疫病毒2A自身蛋白酶的異源性蛋白。這種排列引起所述口蹄疫病毒2A自身蛋白酶裂解該融合蛋白以釋放出基本上不含其他胺基酸序列的該異源性蛋白。本發明的特定的KUN複製子載體的例子為編碼一種FMDV2A蛋白酶和EMCVIRES的pKUNrep5和SP6KUNrep5以及編碼兩種FMDV2A蛋白酶的SP6KUNrep6和pKUNrep6，如圖6所示。根據本發明，「表達構建體」是一種表達載體，其中插入了一種異源性核酸以使得其能夠以RNA的形式和/或作為一種被編碼的蛋白而表達。所述的異源性核酸可編碼一或多種肽或多肽，或編碼一種基本上與靶序列相同或基本上與其互補的核苷酸序列。「蛋白質」是指一種胺基酸聚合物。胺基酸可包括天然的(即遺傳學編碼的)、非天然的、D-胺基酸和L-胺基酸，皆為本領域所熟知。「肽」是指具有少於50個胺基酸的蛋白質。「多肽」是指具有50個或更多個胺基酸的蛋白質。異源性核酸可編碼由致病生物體例如病毒、真菌、細菌、原蟲、無脊椎動物如寄生蟲和節肢動物所產生的或得到的蛋白質，或者可編碼由包括動物和人在內的動物所產生的或得到的突變的、致癌的或腫瘤性蛋白質如腫瘤抗原。異源性核酸也可編碼合成的或人工蛋白質如構建的用來誘導免疫的免疫原性表位。在一個實施方案中，所述的異源性核酸編碼一或多種免疫原性肽或多肽，但不限於此。優選地，所述一或多種免疫原性肽或多肽包含一或多種T細胞表位。在一個具體的實施方案中，所述的異源性核酸編碼多種肽表位(多表位)如一種鼠多表位(Mpt)，後者將在下文中做詳細說明。表位序列的例子包括YPHFMPTNL、RPQASGVYM、TYQRTRALOV、SYIPSAEKI和SIINFEKL，但不限於此。在另一個特定實施方案中，所述的異源性核酸編碼HIV-1gag基因或其片段。在本發明的表達構建體中，啟動子可操縱地連接於所述的黃病毒複製子。「可操縱地連接於」是指所述的啟動子的位置可以在體外或體內起始、調控或控制編碼所述的黃病毒複製子、所述的異源性核酸和促進RNA剪切和蛋白質表達的其他調控序列的RNA的轉錄。優選地，所述啟動子位於所述黃病毒複製子的5′。用於在體外自所述的DNA表達構建體轉錄RNA的優選的啟動子是SP6啟動子。用於在體內自哺乳動物細胞中的所述的DNA表達構建體轉錄RNA的優選的啟動子是巨細胞病毒(CMV)啟動子。不過，應該理解的是本發明也預期了其他在哺乳動物細胞內具有活性的熟知的啟動子，包括SV40啟動子(一種人類延長因子α啟動子)和α晶體蛋白啟動子，但不限於此。在用本發明的表達構建體產生穩定轉化的宿主細胞的實施方案中，表達載體進一步包含一種選擇標記基因以便對轉化的宿主細胞進行篩選。選擇標記基因是本領域熟知的，包括新黴素轉移酶和嘌呤黴素N-乙醯轉移酶，但不限於此。可將選擇標記基因插入以取代缺失的結構基因或插入至3′UTR區域。用於蛋白質表達的合適的宿主細胞可以是任何能夠實現轉錄、翻譯以及蛋白質表達所需的任何轉錄後和/或翻譯後處理或修飾的真核細胞系。可用於核酸轉染和蛋白質表達的哺乳動物細胞的典型的例子為COS、Vero、CV-1、BHK21、HEK293、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NIH3T3、Jurkat、WEHI231、HeLa和B16黑色素瘤細胞，但不限於此。可通過本領域已知的方法實施轉染，如磷酸鈣沉澱、電穿孔、脂質轉染胺試劑(lipofectamine)、脂質轉染試劑(lipofectin)和其他親脂試劑、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖、微粒子轟擊法(microparticlebombardment)、微注射和原生質體融合。本發明的表達構建體的例子包RNALeuMpt、RNAProMpt、KUNRNAgag、DNALeuMpt、DNAProMpt和UNDNAgag，將在下文中進一步詳述。病毒包裝根據本發明的第三方面，提供了一種黃病毒表達系統，其包含(i)上文中所述的黃病毒表達構建體；和(ii)至少另一種能夠表達一或多種蛋白的表達構建體，所述的蛋白有助於將第二方面所述的表達構建體包裝入黃病毒病毒樣顆粒(VLP)。可使用任何非黃病毒衍生的載體來表達用於病毒包裝並產生VLP所需的一或多種結構蛋白。例如，所述的另一種構建體可衍生自另一種α病毒如塞姆利基森林病毒(SFV)或新培斯病毒(SIN)或衍生自DNA病毒如腺病毒、禽痘病毒(fowlpoxvirus)或痘苗病毒。下文將詳細描述可用於產生VLP以及製備並純化VLP的所述另一種構建體(一種SFV衍生的構建體)的一個例子。在其他實施方案中，本發明提供了新的包裝系統，其提高了國際申請WO99/28487所述的系統的包裝功效並使之簡化。應該理解的是，在一些寬泛的實施方案中，黃病毒包裝可通過以下方式實現(a)用一種黃病毒表達構建體和能夠提供病毒包裝所需的結構蛋白的所述另一種表達構建體瞬時轉染宿主細胞(如上文中所述的)；(b)用一種黃病毒表達構建體瞬時轉染宿主細胞，其中所述的宿主細胞已經穩定轉染了一種能夠提供病毒包裝所需的結構蛋白的包裝構建體。就(a)來說，這些表達構建體可以進行共轉染或在一個時間框架內分別轉染以實現的VLP最佳產生。上文中，「轉染」是為了方便起見所使用的一個通用術語，其涵蓋了將外源性遺傳物質瞬時引入或穩定引入到宿主細胞內部。在一個具體的實施方案中，通過在nsP2基因中引入突變使得第713位的亮氨酸突變為脯氨酸(SFVMEC/L713P；圖7)，從而達到對衍生自SFV的包裝構建體SFV-MEC105進行修飾以降低其細胞致病性的目的。在另一個具體實施方案中，SFV-MEC/L713P構建體含有一個IRES-Neo盒(SFVMEC/L713P/Neo；圖8)以便通過抗生素G418進行選擇從而建立穩定表達的細胞系。轉染入該細胞系的Kunjin複製子RNA可進行複製並產生KunjinVLP。在另一個具體實施方案中，提供了一種非細胞致病性的SFV複製子RNA構建體pSFV3L713PLacZNeo(圖9)，以擴增轉染進去的SFV輔助RNApSFVHelperprMEC(圖10)和pSFVHelperCprME(圖11)，由此可表達Kunjin結構蛋白。所述的另一種構建體(衍生自SFV的構建體)、表達所述的衍生自SFV的構建體的細胞系以及各種用於產生VLP的包裝方案和VLP的製備並純化將在下文中詳細闡述。藥物和免疫治療性組合物和疫苗本發明的一個具體方面涉及黃病毒表達構建體和表達系統作為疫苗輸送系統的用途。不過，本發明更廣泛地提供了一種藥物組合物，其不限於用於疫苗輸送，而是包括免疫治療性組合物和疫苗，可包含(i)由本發明的表達系統產生的VLP；(ii)自本發明的DNA表達構建體轉錄得到的RNA；或(iii)在體內指導複製型RNA轉錄的本發明的質粒DNA表達構建體。該藥物組合物可進一步包含藥物學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。可通過輸送此類組合物以產生針對病原體的免疫力，優選為保護性免疫，所述的病原體例如為病毒、細菌、原蟲寄生蟲和無脊椎寄生蟲，但不限於此。在另一個替代性實施方案中，本發明意欲對癌症例如黑色素瘤進行免疫治療性治療。「藥物學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑」是指能夠安全地用於全身施用的固體或液體的填充物、稀釋劑或包囊化物質(encapsulatingsubstance)。根據特定的施用途徑，可以使用本領域熟知的多種載體。這些載體可以選自糖、澱粉、纖維素及其衍生物、麥芽、明膠、滑石粉、硫酸鈣、植物油、人造脂肪、多元醇、褐藻酸、磷酸緩衝液、乳化劑、等張鹽水和鹽類例如包括氯化物、溴化物和硫酸鹽在內的無機酸鹽、有機酸例如乙酸鹽、丙酸鹽和丙二酸鹽以及無致熱原的水。介紹藥理學可接受的載體、稀釋劑和賦形劑的參考文獻Remington′sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCo.N.J.USA，1991)，本文將其併入作為參考。可採用任何安全的施用途徑將本發明的組合物施用於患者。例如可採用經口服、直腸、胃腸外、舌下、口腔、靜脈、關節內、肌肉、皮內、皮下、吸入、眼內、腹腔內、腦室內、經皮等等。例如，肌肉注射和皮下注射是施用免疫治療性組合物、蛋白質疫苗和核酸疫苗的合適的方式。劑型包括片劑、分散劑(dispersion)、混懸劑、注射液、溶液、糖漿、錠劑、膠囊、栓劑、氣霧劑、經皮貼劑等等。這些劑型可包括專門為此目的而設計的注入式或植入式控釋裝置、或其他經過改良後可用於此目的的植入體。通過對治療劑進行包被可實現治療劑的控釋，例如使用疏水性聚合物，包括丙烯酸樹脂、石蠟、高級脂族醇(higheraliphaticalcohols)、聚乳酸和聚乙二醇酸以及某些纖維素衍生物如羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethylcellulose)。此外，也可採用其他聚合物基質、脂質體和/或微球體以實現控釋。適於口服或胃腸外施用的本發明的藥物組合物可以是分散的單位如膠囊、小藥囊(sachets)或片劑，分別含有一個預先確定的量的本發明的一或多種治療劑，所述治療劑為粉劑或顆粒或為水性液、非水性液、水包油乳劑或油包水液體乳劑質的溶液或混懸劑。可通過任何製藥方法製備此類組合物，但所有的方法均包括將一或多種上述製劑與構成一或多種必要成分的載體相結合的步驟。通常，所述組合物通過將本發明的製劑與液體載體或細分的固體載體進行均勻地和密切地混合而製備，然後，如有必要，將產品製成所需的形狀。上述的組合物可以按照與劑量配方相適應的方式施用，施用的量是藥物學有效劑量。根據本發明，施用於患者的劑量應該足以在一段適當的時間後對患者產生有益的反應。所施用的製劑的量取決於治療對象的情況，包括其年齡、性別、體重和一般健康狀況，這些因素由從業者進行判定。本發明的免疫治療性組合物可用於對動物例如人進行預防性或治療性免疫。不過，其他動物也適用，優選地為脊椎動物，包括家畜如牲畜和寵物。如下文中將要詳細說明的，本發明的疫苗的形式可以是VLP、RNA或DNA。通過採用本發明的疫苗適當地表達免疫原性蛋白質和肽表位包括多表位，可誘導針對病毒、腫瘤、細菌、原蟲以及其他無脊椎動物寄生蟲的免疫應答。優選地，所述免疫應答涉及誘導抗體、CD8+CTL和/或CD4+T細胞。更優選地，所述免疫應答涉及誘導長期效應細胞CD8+CTL。在一個具體的實施方案中，本發明人證實了以編碼衍生自卵清蛋白的CTL表位的RNA和VLP疫苗進行免疫，能夠在以表達卵清蛋白的B16黑色素瘤細胞進行的攻擊實驗中保護小鼠。在另一個具體實施方案中，本發明人以編碼完整HIV-1gag基因的VLP疫苗進行免疫，能夠在以表達HIV-1gag基因的重組痘苗病毒進行的攻擊實驗中保護小鼠。還應理解的是，本發明的免疫治療性組合物和疫苗可以在某些實施方案中包括一種佐劑。本領域可以理解，「佐劑」是指一或多種物質，所述物質可增強疫苗組合物的免疫原性和/或效力。合適的佐劑的非限制性實例包括異三十烷(squalane)和鯊烯(squalene)(或其他的動物來源油脂)；阻斷共聚物(blockcopolymers)；去垢劑如Tween-80；QuilA，礦物油如Drakeol或Marcol，植物油如花生油；衍生自棒桿菌屬(Corynebacterium)的佐劑如小棒桿菌(Corynebacteriumparvum)；衍生自丙酸桿菌屬(Propionibacterium)的佐劑如瘡皰丙酸桿菌(Propionibacteriumacne)；牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)(卡介苗或BCG)；白介素如白介素2和白介素12；單核因子如白介素1；腫瘤壞死因子；幹擾素如γ-幹擾素；一些組合形式如皂角苷-氫氧化鋁(saponin-aluminiumhydroxide)或Quil-A氫氧化鋁；脂質體；ISCOM和ISCOMATRIX佐劑；分枝桿菌細胞壁提取物；合成的糖肽如胞壁酸二肽(muramyldipeptide)或其他衍生物；Avridine；脂質A衍生物；硫酸葡聚糖；DEAE-葡聚糖或加上磷酸鋁；羧基聚亞甲基(carboxypolymethylene)如Carbopol′EMA；丙烯酸共聚物乳劑如NeocrylA640(如U.S.專利No.5,047,238)；牛痘或動物痘病毒蛋白；亞病毒顆粒佐劑如霍亂毒素，或其混合物。為了使得本發明能夠容易地被理解和付諸實踐，本領域人員可參照以下非限制性實施例。實施例1材料與方法質粒。基於RNA(RNALeu)的和基於DNA(DNALeu)的KUN複製子載體具有2個拷貝的口蹄疫病毒(FMDV2A)的2A自身蛋白酶，一個位於克隆位點上遊，另一個位於克隆位點下遊，並在KUNNS1基因的第250位胺基酸處具有亮氨酸(Leu)(圖1B)。RNAPro和DNAPro載體在第250位胺基酸具有脯氨酸(Pro)而不是Leu，它們是通過將RNALeu和DNALeu載體中跨過完整NS1基因的SphI-SphI片段，以來自KUN全長cDNA質粒250pro(16)的相應的SphI-SphI進行取代而構建的。用引物Mpt-F(5′GCGACGCGTCTAGAGCCAGCAACGAGAA-3′)和Mpt-R(5′-GTAACGCGTCTAAGTCCTCGGGGCCGG-3′)，自質粒pSTMPDV(50)中PCR擴增鼠多表位(Mpt)序列。PCR產物經MM消化後克隆入上述4種載體中的每一種的MluI位點，以分別產生質粒RNALeuMpt、RNAProMpt、DNALeuMpt和DNAProMpt(圖1B)。DNA和RNA轉染，IF和Northern印跡分析。為進行DNA轉染，使用LipofectaminePlus轉染試劑(LifeTechnologies，Melbourne，Australia)，按照製造商的說明，分別以2或0.4μg質粒DNA轉染6孔板中或蓋玻片上的BHK21細胞。如前所述(26)，以SP6RNA聚合酶，自XhoI線性化的基於RNA的質粒DNA中體外轉錄RNA，並將其電穿孔至BHK21細胞中。轉染後48小時，將載有轉染細胞的蓋玻片固定於冷丙酮中，並如前所述(56)，用抗NS3抗體，通過間接免疫螢光法(IF)分析KUNNS3蛋白的表達。如前所述(26)，使用代表KUN3′UTR區域或Mpt序列的、32P標記的cDNA探針，對來自轉染細胞的總RNA進行Northern印跡分析。製備VLP。如前所述(28，52)製備VLP(VLPProMpt和VLPLeuMPT)。簡言之，2×106BHK21細胞以大約10-20μg體外轉錄的RNAProMpt或RNALeuMPtRNA進行電穿孔，1.5kV，25μF，∝電阻，2次脈衝，中間間隔10秒。電穿孔後，將細胞稀釋於8mlDMEM/10％FCS中，並培養於60mm培養皿中，置於37℃，CO2培養箱內。32小時後，將細胞胰蛋白酶化，用於以體外轉錄的表達KUN結構蛋白(SFV-MEC105)(28)的SFV複製子RNA，在相同條件下進行第二次電穿孔。第二次電穿孔後18小時，將培養基更換為3ml的DMEM/2％FCS，將細胞進一步孵育22小時。收集培養基並在8000xg離心，然後按1ml進行分裝，儲存於-70℃。以10倍系列稀釋的VLP感染BHK21細胞，並在感染後30-40小時進行IF分析，計數NS3陽性細胞數，由此確定感染性VLP的滴度。對小鼠進行免疫接種。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)由AnimalResourcesCentre(Perth，WesternAustralia)提供。用以下配方對小鼠進行免疫(i)KUN複製子多表位DNA質粒，編碼DNALeuMpt和DNAProMpt的、表達MptKUN複製子並注射至股四頭肌(100μg於100μlPBS中，i.m.，每處腿部各50μl)；(ii)將體外轉錄的編碼Mpt的KUN複製子RNA、RNALeuMpt和RNAProMpt溶於經DEPC處理的PBS並按上述進行注射(約30μg於100μl，i.m.，每處腿部50μl)；(iii)包裝於VLP的複製子RNA、RNAProMPt或RNALeuMPT(分別為VLPProMpt和VLPLeuMpt)以溶於DMEM/2％FCS的形式輸送，並i.p.注射(1ml中～5×105至106VLP)；(iv)常規質粒DNA疫苗、編碼Mpt的pSTMPDV(100μg溶於100μl的PBS中，i.m.，每處股四頭肌50μl)(50)；和(v)一種編碼Mpt的重組痘苗病毒(107pfu，200μlRPMI1640，i.p.)，如前所述(51)。CTL分析。通過酶聯免疫斑點法(enzymelinkedimmuno-spot(ELISPOT))，使用前述的最小CTL肽表位(31)計數分泌表位特異性IFN-γ的細胞。簡言之，以5μg/mL的大鼠抗小鼠IFN-γ抗體(克隆RA-6A2，BDPharMingen，SanDiego，USA)過夜包被平底96孔MultiScreen-HA纖維素酯膜微滴定板(MilliporeAustraliaLtd.，NorthRyde，Australia)。然後將經過包被的平板以1％牛血清白蛋白(溶於PBS)在室溫下封閉1小時，並以含有0.05％Tween20(Sigma)的PBS洗滌3次。將脾細胞(1×106/孔)鋪於ELISPOT平板的第一排孔中，並按2倍進行系列稀釋。加入重組人IL-2(由CetusCorp.，Emeryville，California，USA惠贈)(100IU/ml)和肽(Mimotopes，Clayton，Victoria，Australia)(1μg/ml)，將平板孵育18小時。裂解細胞，洗滌平板，並先以生物素化的抗小鼠IFN-γ抗體(克隆XMG1.2)(BDPharMingen)孵育，然後以streptavidin-鹼性磷酸酶(BDPharMingen)和SigmaFastBCIP/NBT底物(Sigma)孵育，以檢測IFN-γ斑點。以KSELISPOT讀數器(CarlZeissVisionGmbH，Hallbergmoos，Germany)計數斑點。按照先前的方法(9)進行51Cr釋放分析。簡言之，以VLPProMpt對小鼠進行免疫，2-3周後處死小鼠，加入1μg/ml的肽(Mimotopes)對脾細胞在體外進行再次刺激6天。將得到的效應細胞群平分，並將等量的細胞以雙份的形式與肽致敏的和非致敏的51Cr標記的P815靶細胞作用，效應細胞與靶細胞的比例是指定的。痘苗病毒保護分析。各組(n＝6)6-8周齡的雌性Balb/c小鼠以大約30μgRNALeuMpt或對照(RNALeuControl)RNA免疫接種一次，3周後，給每隻小鼠腹腔注射107pfu的編碼鼠多表位(rVVMpt)(51)的重組痘苗病毒進行攻擊實驗。感染後第4天，取出雙側卵巢，洗滌並在1ml的PBS中以自動勻漿器進行勻漿。將100μl的卵巢懸液與含有1mg/ml的胰蛋白酶(Sigma)的900μl的PBS混合，在37℃孵育30分鐘。將溶液簡單離心，10,000xg，以去除雜質，將100μl上清液與900μl的RPMI/10％FCS培養基混合。然後通過在匯合的CV1細胞上進行斑點分析以測定卵巢中的痘苗病毒的滴度。以Wilcoxanrank-sum檢驗(7)計算實驗組和對照組病毒滴度之間的差異的顯著性。腫瘤保護分析。表達卵清蛋白(B16-OVA)的B16黑色素瘤細胞(3)由DrK.Rock(Dana-FarberCancerInstitute，Boston，USA)惠贈。給各組C57BL/6小鼠(n＝6)肌注兩次～30μg的RNALeuMptRNA或對照RNALeuControlRNA(間隔4周)或一次rVVMpt，進行免疫接種，末次接種2周後，在小鼠背部兩處不同位置皮下注射B16-OVA細胞(每隻小鼠105細胞)。注射前用電動剃刀去除注射部位周圍的毛髮，以便觀察腫瘤的出現。監測腫瘤的生長，當腫瘤大小達到15mm×15mm時處死動物。在腫瘤攻擊實驗後的指定天數計算每組的平均腫瘤面積。以方差分析(45)計算各組之間的平均腫瘤生長的差異。記錄動物被處死的時間並以Kaplan-Meier存活曲線(20)表示。以log-rank統計(20)計算存活曲線的差異。在以VLPLeuMpt進行的腫瘤保護研究中，給雌性C57BL6(H-2b)小鼠(6-8周齡；n＝6)腹腔注射(i.p)這些VLP一次(VLPLeuMptx1)或兩次(VLPLeuMptx2，間隔兩周)；對照VLP(VLPLeucontrol)；或(iv)編碼Mpt的重組痘苗病毒(rVVMpt)，以進行免疫接種。末次接種後2周，以5×105B16-OVA黑色素瘤腫瘤細胞皮下注射於2個不同部位對小鼠進行攻擊實驗。結果編碼鼠多表位的KUN複製子在轉染細胞內的有效複製。將編碼表達鼠多表位(Mpt)的KUN複製子cDNA的質粒DNADNALeuMpt和DNAProMpt轉染至BHK21細胞，通過Northern印跡和IF分析測定相應的複製子RNA在細胞內的複製及其通過RNA聚合酶II的轉錄表達。通過電穿孔將體外合成的編碼Mpt的KUN複製子RNARNALeuMpt和RNAProMpt轉染至BHK21細胞，並分析其複製和表達。用KUN抗NS3抗體對轉染細胞進行IF分析顯示，在以基於DNA的複製子轉染後，～50％的細胞為陽性，而在以基於RNA的複製子進行電穿孔後，～80％的細胞為陽性(圖2A)。在以前的用KUN複製子RNA進行的電穿孔中，僅在這些RNA能夠複製的情況下(26，27)IF才能檢測到KUNNS3的表達。不過，轉染編碼KUNcDNA的質粒DNA的確導致可通過IF檢測到KUN蛋白的表達，即使是在KUNRNA無法複製的情況下(30)。為確保細胞產生的來自轉染的質粒DNADNALeuMpt和DNAProMpt的複製子RNA是複製型的，我們通過用KUN特異性放射性標記的cDNA探針進行Northern印跡，對細胞總RNA進行分析(圖2A)。將這些樣品中的放射性信號的強度與分離自以相同量的產生複製缺陷型KUN複製子RNA的對照質粒DNApKUNβrep2(dGDD)(53)轉染的細胞的RNA樣品進行比較，發現以DNALeuMpt和DNAProMpt轉染的細胞所產生的KUN特異性RNA的量較以pKUNβrep2(dGDD)轉染的細胞高大約5-10倍。以往對能夠複製的和複製缺陷型的基於DNA的KUN複製子構建體的研究發現積聚的RNA的量存在相似的差異(53)。這些結果證實，細胞產生的來自轉染的質粒DNADNALeuMpt和DNAProMpt的複製子RNA是能夠複製的。以KUN特異性cDNA探針對分離自以體外合成的RNARNALeuMpt和RNAProMpt電穿孔的細胞的總RNA進行Northern印跡分析(圖2B)證實了IF的結果(圖2A)，它們共同證實KUN複製子RNA在轉染細胞內進行有效的複製和積聚。請注意，RNA轉染的樣品的細胞總RNA在凝膠中的上樣量是DNA轉染的樣品的細胞總RNA上樣量的2倍以上(圖2B)，此外溴化乙啶凝膠染色發現相應(RNA轉染的或DNA轉染的)樣品中核糖體RNA的濃度相似(數據未顯示)。為檢查複製子RNA在細胞內複製過程中Mpt序列是否保留，以放射性標記的特異於Mpt序列的cDNA探針對含有相同RNA樣品的膜(圖2B左側)進行再次分析。結果(圖2B右側)與用KUN特異性探針得到的結果一致(圖2B左側)，並明確證實，在複製子RNA在細胞內複製的過程中，Mpt序列確實保留。產生含有Leu和Pro的構建體的目的是評價KUNNS1基因的第250位胺基酸的此種突變對KUN複製子RNA的複製和積聚所可能產生的影響，且因此產生的對被編碼的HG在體外和體內的表達水平的影響。以往發現，KUNNS1基因第250位胺基酸由Pro(野生型)突變為Leu導致NS1蛋白不能發生二聚化。這引起病毒在Vero細胞中的複製延遲並減弱病毒在小鼠中的複製(16)。以等量的含有Leu和含有Pro的病毒感染Vero細胞，在第一個24小時內產生的含有Leu的病毒低於含有Pro的病毒大約100倍，但感染後48小時，含有Leu和含有Pro的病毒具有相似的產量。在體內實驗中，需要大約100倍以上的含有Leu的病毒才能在小鼠中產生類似的疾病的臨床症狀(16)。在以KUN-Mpt複製子構建體進行的本研究中，以基於DNA的、含有Leu和含有Pro的複製子構建體轉染的BHK21細胞中積聚的KUNRNA的量相似(比較圖2B中的DNALeuMpt和DNAProMpt)，而以體外轉錄的RNA進行轉染髮現，以含有Leu的RNA轉染的細胞中RNA積聚的水平略微高於以含有Pro的RNA轉染的細胞(比較圖2B中的RNALeuMpt和RNAProMpt)。如上所述，由溴化乙啶染色判斷，核糖體RNA在相應的樣品中是相似的。IF分析發現，轉染RNALeuMptRNA同樣引起NS3陽性細胞比例輕度升高(圖2A)。引人注目的是，RNAProMptRNA轉染後可見圓形(死亡的)NS3陽性細胞的數量明顯高於RNALeuMptRNA轉染(圖2A)，提示前者RNA具有更高的細胞致病性。以相應的KUN複製子載體RNARNAPro和RNALeu進行轉染後，含有Pro的變體和含有Leu的變體之間在細胞致病性方面也存在類似的差異(數據未顯示)。以基於DNA、基於RNA以及基於VLP的、表達多表位免疫原的KUN複製子免疫接種誘導CTL應答。鼠多表位免疫原(Mpt)含有4種結合的H-2d限制性CTL表位；其包括YPHFMPTNL(一種來自鼠巨細胞病毒pp89的H-2Ld限制性表位)、RPQASGVYM(來自LCMV核蛋白的H-2Ld限制性表位)、TYQRTRALV(來自流感病毒核蛋白的H-2Kd表位)以及SYIPSAEKI(來自伯氏瘧原蟲(P.Berghei)環子孢子蛋白的H-2Kd表位)。以編碼該Mpt免疫原的KUN複製子DNA、RNA和VLP免疫接種Balb/c小鼠一次，2-3周後，用IFN-γELISPOT測定針對該4種CTL肽表位中的每種的CTL應答(圖3A)。由DNA、RNA或VLPKUN疫苗產生的應答ELISPOT與由編碼相同多表位免疫原(rVVMpt)的重組痘苗病毒誘導的應答相當(圖3A)，而顯著高於由編碼相同免疫原的常規DNA疫苗(31)所誘導的應答(見圖4)。以往已經觀察到表位應答具有層次(hierarchy)，RPQ特異性應答較YPH應答更有優勢，而SYI應答較TYQ應答更有優勢，據認為這反映了亞優勢表位的較低的MHC結合親和力(31)。儘管在轉染的BHK21細胞中含有Pro的複製子似乎較含有Leu的複製子具有更強的細胞致病性(見前文)，但在誘導CTL應答方面這些變體之間沒有明顯差異(圖3A和圖4)。小鼠經VLPProMpt免疫接種一次，通過51C釋放分析對誘導CTL應答進行分析。觀察到特異於每種表位的顯著的CTL活性(圖3B)。這些應答同樣與以往用rVVMpt免疫接種一次的小鼠的應答(51)相當，並高於以常規的編碼多表位免疫原的DNA疫苗(50)免疫接種2次的小鼠的應答。以十倍系列稀釋的基於DNA的KUN多表位複製子DNALeuMpt和DNAProMpt對小鼠進行免疫接種說明，僅用0.1μg的KUN複製子DNA單次免疫接種仍然能檢測到CTL應答(圖4)。由0.1μgKUN疫苗誘導的CTL應答的幅度與用100μg的常規質粒DNA多表位疫苗免疫接種所誘導的應答相當(圖4)。本節的數據說明，以三種不同方式(DNA、RNA和VLP)之任一種方式輸送的KUN基於複製子的疫苗均能有效誘導CTL，其產生的應答的幅度與基於重組痘苗病毒的載體相當，而顯著高於常規的DNA疫苗。免疫接種編碼多表位的裸RNA或VLP保護小鼠對抗病毒和攻擊實驗。為了確定免疫接種KUN複製子載體所誘導的CTL應答是否能夠產生抗病毒攻擊實驗的保護作用，給小鼠免疫接種一次RNALeuMptRNA或RNALeuControlRNA(由RNALeu載體DNA製備得到)，然後以rVVMpt進行攻擊實驗。rVVMpt攻擊實驗分析測定了由KUN疫苗呈遞的所有4種H-2d限制性表位介導的保護作用。單次RNALeuMptRNA免疫接種後，觀察到卵巢rVV滴度顯著下降(～70％)(圖5A；p＝0.03)。採用常規的DNA多表位疫苗，只有進行2次免疫接種後才能得到與此相當的保護作用(50)。Mpt序列還編碼來自卵清蛋白的CTL表位，SIINFEKL(50，51)，因此可以用表達卵清蛋白的B16腫瘤細胞(B16-OVA)進行攻擊實驗以檢測KUN免疫接種的腫瘤保護作用。小鼠以RNALeuMpt和RNALeuControl免疫接種2次或以rVVMpt免疫接種一次，然後以B16-OVA進行攻擊實驗。與RNALeuControl免疫接種的動物相比，在RNALeuMpt免疫接種的小鼠中腫瘤生長的速度明顯較慢(p＜0.001)(圖5B，上圖)。此外，RNALeuMpt免疫接種的小鼠中腫瘤生長的平均速度也低於rVVMpt免疫接種的小鼠(p＝0.001)。同一實驗還表示為Kaplan-Meier曲線(圖5B，下圖)，其顯示的是在指定時間點小鼠存活的百分數。同樣，RNALeuMpt免疫接種的小鼠明顯優於RNALeuControl免疫接種的動物(p＝0.015)以及rVVMpt免疫接種的動物(p＝0.016)。參照圖5C，數據顯示，與接種裸RNA相比，免疫接種VLPLeuMpt極大地提高了接受免疫的小鼠在B16-OVA腫瘤攻擊實驗中的存活。還注意到，2次免疫接種VLP(VLPLeuMptx2)較1次免疫接種VLP(VLPLeuMptx1)可改善存活率。改良的病毒包裝系統的產生和評價採用三種不同方法以改良先前在國際申請WO99/28487中開發的Kunjin複製子RNA包裝系統，以便提高包裝效率並簡化包裝方案。(i)第一種方法涉及改良衍生自SFV的包裝構建體SFV-MEC105，通過在第713位引入亮氨酸至脯氨酸的胺基酸突變以降低其致病性(SFVMEC/L713P；圖7)。這使得Kunjin結構基因的表達延長而對SFVRNA複製無不良影響，並通過同時轉染Kunjin和SFVMEC/L713PRNA而簡化了包裝方案。這些結果在表1和2中給出。以往試圖採用同時轉染Kunjin和SFV-MEC105RNA，結果完全抑制了KunjinRNA複製。(ii)第二種方法涉及產生一種穩定的細胞系，其持續產生來自改良的非細胞致病性的SFV複製子RNA的Kunjin結構蛋白。為此，本發明人將一種IRES-Neo盒插入至SFVMEC/L713P構建體(SFVMEC/L713P/Neo；圖8)中，並通過抗生素G418篩選建立了一種穩定表達細胞克隆。以Kunjin複製子RNA轉染該細胞系使其能夠複製並產生相對高滴度的KunjinVLP(表3和4)。(iii)第三種方法是產生一種穩定表達非細胞致病性的SFV複製子RNApSFV3L713PLacZNeo(圖9)的細胞系，以便用其擴增轉染的SFV輔助RNApSFVHelperprMEC(圖10)和pSFVHelperCprME(圖11)以表達Kunjin結構蛋白。當這兩種輔助RNA之一與Kunjin複製子RNA一同轉染至pSFVL713PlacZNeo細胞系時，SFV輔助RNA和KUN複製子RNA均可被擴增，這導致產生分泌型KunjinVLP，儘管滴度相對較低(表5)。細胞致病性和非細胞致病性的衍生自SFV的包裝構建體之間產生KunjinVLP的相對效率。首先，以轉錄自構建體如RNALeuMpt的Kunjin複製子RNA(含有異源性基因)對BHK21細胞進行電穿孔。然後，在32小時，用分別轉錄自pSFVMEC105或pSFVMECL713P的細胞致病性(cyto)或非細胞致病性的(noncyto)塞姆利基森林病毒RNA對這些KunjinRNA轉染的細胞進行電穿孔。然後如表1所示，在第二次轉染後的不同時間收集此含有分泌型VLP的組織培養液。或者，將Kunjin複製子RNA和非細胞致病性的SFVRNA同時轉染至BHK21細胞內，並如表2所示，以不同的時間間隔收集此組織培養液。還應該主要的是，如表1和2所示，選取KunjinRNA與SFVRNA的不同比例以便使得VLP表達水平達到最佳。Kunjin複製子RNA轉染後KunjinVLP在表達來自改良的非細胞致病性的衍生自SFV的包裝構建體的Kunjin結構蛋白的穩定細胞系中的產生。穩定細胞系SFVMECA12表達用於產生VLP的來自非細胞致病性的SFV複製子的Kunjin結構蛋白。該細胞系表達編碼Kunjin結構蛋白的非細胞致病性的SFV複製。為了建立該細胞系，以SFVMECL713PNeoRNA(圖8)轉染BHK21細胞，並通過在含有1mg/mlG418的培養基中孵育而選出一個克隆，A12。然後以編碼異源性基因如HIVGAG或鼠多表位(Mpt)的Kunjin複製子RNA進行電穿孔以評價該細胞克隆。以Kunjin複製子RNA電穿孔後，在不同時間點收集組織培養液，並通過感染分析和免疫螢光法測算VLP的滴度(表3)。在進一步的實驗中評價了不同孵育溫度對產生VLP的影響。也就是說，以Kunjin複製子RNA對SFVMECA12細胞進行電穿孔後，將細胞孵育在37℃、33℃或37C/33℃(37℃過夜然後33℃)直至轉染後50小時(表4)。共轉染表達Kunjin結構蛋白的SFVHelperRNA和Kunjin複製子RNA後，表達非細胞致病性的SFV複製子的穩定細胞系產生KunjinVLP。使用構建體pSFV3L713PlacZNeo建立表達非細胞致病性的SFV複製子和LacZ基因的穩定細胞系。該細胞系表達具有L713P突變的非細胞致病性的SFV複製子、所編碼的Neo和LacZ基因。根據LacZ的表達監測這些細胞中的表達水平和均一性。選擇不同的克隆進一步分析VLP的產生，即克隆C5、C6和C11。同時以Kunjin複製子RNA和兩種SFV-Kunjin輔助RNA之一電穿孔每種細胞克隆。所述Kunjin複製子RNA編碼異源性基因如HIVGAG或鼠多表位(Mpt)。所述SFV-Kunjin輔助RNA編碼置於一種26S啟動子控制下的KunjinCprME基因盒(pSFVHelperCprME；圖10)或者是置於兩種不同26S啟動子控制下的KunjinprME和C基因(pSFVHelperprMEC；圖11)，均克隆入pSFVHelper2載體。在轉染後28小時和45小時收集組織培養液以檢測顆粒產生的水平(表5)。實施例2材料與方法質粒。基於RNA的和基於DNA的KUN複製子載體(分別為C20UbHDVrep和pKUNrep1)在克隆位點的上遊含有小鼠泛素基因並在克隆位點的下遊含有FMDV2A自身蛋白酶序列，將其用於構建含有HIV-1gag基因的質粒。基本上，通過PCR自質粒pBRDH2-neo擴增完整的HIV-1gag基因，引物為gagBssHII-F(5′-ACCATGGGCGCGAGCATCGGTATTA-3′)和gagBssHII-R(5′-CTAAAGCGCGCCTTGTGACGAGGGGTC-3′)。將PCR產物以BssHII消化並分別插入至此兩種KUN載體的AscI位點以產生質粒KUNRNAgag和KUNDNAgag。製備KUNgagVLP。基本上按照前述方法製備VLP，不同之處在於用大約30μg體外轉錄的KUNgagRNA對3×106BHK21細胞進行電穿孔。電穿孔後32小時，將細胞以胰蛋白酶消化並進行第二次電穿孔，電穿孔使用的是自構建體SFVMEC105的一種細胞致病性較低的形式，即含有亮氨酸713被取代為脯氨酸的nsP2基因的SFVL713PMEC體外轉錄得到的RNA。第二次電穿孔後，將細胞在37℃孵育18小時，然後將培養基更換為6ml的DMEM-5％FCS，將細胞在33℃進一步孵育30小時。通過以10倍系列稀釋的VLP感染Vero細胞並在感染後30-40小時進行免疫螢光分析計數NS3陽性細胞數量來確定感染性VLP的滴度。對小鼠進行免疫接種。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)得自AnimalResourcesCentre(Perth，WesternAustralia)。將小鼠以下列之一進行免疫接種(i)gagVLP溶於DMEM-5％FCS，腹腔內注射(i.p.)，每隻小鼠大約1×106感染單位，以及(ii)編碼HIV-1gag的重組痘苗病毒(107pfu，溶於200μl的RPMI1640，i.p.)。間接ELISA。將96孔板以1μg純化的重組p55抗原在4℃的抗原包被緩衝液中(15mMNa2CO3，35mMNaHCO3，pH9.6)包被過夜。然後將各孔在50μl封閉緩衝液(0.25％Gelatin/0.1％Tween-20溶於PBS)中37℃孵育1小時進行封閉，並以洗滌緩衝液(0.05％Tween-20溶於PBS)洗滌3次。將來自經過免疫的小鼠的血清稀釋於封閉緩衝液中，室溫孵育1-2小時，然後洗滌3次。以第二抗體，即1∶2000稀釋於封閉緩衝液中的綴合辣根過氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG，在室溫下孵育30分鐘。洗滌3次，然後，以50μl的K-BlueTMB底物(GraphicScientific，Australia)在室溫下避光孵育10分鐘直至發生結合的綴合物得以顯色。加入50μl的2MH2SO4終止反應，使用ELISA平板讀數器測定OD450吸光度讀數。KunjinVLP中和分析。將200μl含有衣殼化的KUN載體複製子RNA(5×105IU)的KUNVLP與20μl的來自KUNgagVLP免疫接種的小鼠的3種不同的血清樣品在37℃孵育1小時，所述小鼠經ELISA測定顯示具有最高的gag抗體滴度。還將VLP在相同條件下進行無抗體孵育以及與KUN抗E單克隆抗體(Mab)進行孵育，作為分析的陽性和陰性對照。孵育後，通過用每種樣品的稀釋液感染Vero細胞而確定每種樣品的滴度。用KUN抗NS3抗體進行IF分析並計數陽性點，計算滴度。痘苗病毒保護分析。按照每隻小鼠～106IU的KUNgagVLP，對各組(n＝5-6)6-8周齡的雌性Balb/c小鼠進行免疫接種(i)一次或兩次(間隔4周)，3周後進行攻擊實驗，即每隻小鼠腹腔注射107PFU的編碼HIV-1gag(rVVgag(14))的重組痘苗病毒。感染後第4天，切除雙側卵巢，洗滌並使用電動研磨器在1ml的PBS中進行勻漿。通過在匯合的CV1細胞上進行斑點分析確定卵巢懸液中的痘苗病毒的滴度。採用Wilcoxonrank-sum檢驗計算實驗組和對照組的病毒滴度之間的差異的顯著性。測定CD4+T細胞應答。雌性Balb/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)得自AnimalResourceCentre(Perth，WA)。小鼠(n＝4)經腹腔內注射(i.p)KUNgagVLP一次(KUNgagVLP)進行免疫接種或保持未免疫狀態(原初(naive))。免疫後2周，將小鼠挑出並處死，取脾細胞(gag)或單純的培養基(Media)在最後18小時中脈衝式加入3H胸苷。收集細胞於玻璃纖維上，測定配對物和β-射線。Gag脈衝的原初脾細胞在分析前一天製備；以RBC裂解緩衝液處理來自原初小鼠的脾細胞，並以2μg/ml的HIV-1gag蛋白在體外脈衝過夜。結果接種表達HIV-1gag的KUN複製子後誘導針對HIVGag蛋白的抗體應答。測定接種了2次KUNgagVLP(106IU每隻小鼠)或1次編碼HIV-1gag的重組痘苗病毒(rVVgag；107PFU每隻小鼠)的小鼠的血清中的抗gag抗體。接種gagVLP的8隻小鼠中的6隻和接種rVVgag的4隻小鼠中的3隻對免疫接種產生應答，並在這些小鼠中檢測到顯著的抗gag抗體滴度(＞1∶12800)(圖12)。這些抗體應答與免疫接種KUNgagVLP和rVVgag的小鼠的應答相似。免疫接種KUN複製子VLP後未出現針對KUNVLP蛋白的中和抗體應答。為了確定接種KUNgagVLP後是否出現針對KUNVLP表面的KUN包膜蛋白的中和抗體應答，我們通過將來自免疫接種KUNgagVLP的和未免疫接種的小鼠的血清與含有衣殼化KUN載體複製子RNA的KUNVLP進行孵育，進行感染性中和分析。未與任何抗體孵育的KUNVLP的滴度是2.8×106IU/ml。與來自未免疫接種的小鼠的3種不同血清孵育的KUNVLP的平均滴度是2.1×106IU/ml。當KUNVLP與針對KUNE蛋白的單克隆抗體孵育時，未觀察到感染性。與來自2次接種KUNgagVLP的小鼠的3種不同血清孵育的KUNVLP的平均滴度是6.3×105IU/ml。非參數非配對Mann-Whitney檢驗顯示，未免疫接種的小鼠的血清相比，在用來自接種KUNgagRNA的小鼠的血清進行的中和分析中，VLP滴度無顯著性差異(p＜0.1)。因此，2次免疫接種KUNgagVLP後，沒有觀察到針對VLP中的KUN蛋白的明顯的中和抗體應答。以編碼HIV-1gag的KUN複製子進行的VLP顆粒免疫接種保護小鼠抵抗實驗性病毒攻擊實驗。為了確定由免疫接種KUN複製子載體誘導的CD8+T細胞應答是否能夠保護抵抗病毒攻擊實驗，給各組的6隻小鼠免疫接種1次或2次KUNgagVLP或者是不接種，然後以rVVgag進行攻擊實驗。1次免疫接種組中的6隻小鼠中有3隻(50％)而2次免疫接種組中的6隻小鼠中有4隻(67％)完全沒有攻擊實驗病毒(表1)，說明產生完全的保護作用。KUNgagVLPx1組的1隻小鼠攜帶的攻擊實驗病毒的滴度幾乎與未免疫接種的小鼠(2×107)相同，提示免疫接種失敗。因此，接種1次和2次KUNgagVLP的其餘2隻產生應答的小鼠的平均滴度分別為6.7×106IU/ml和1.3×105IU/ml，這說明在接種1次或2次的小鼠中，自107PFU的攻擊實驗病毒rVVgag，病毒複製的減少高達超過6個對數級。本節的結果證實，編碼HIV-1gag基因的KUN基於複製子的疫苗誘導了HIV-1gag特異性的保護性CTL應答，單次VLP免疫接種產生了較兩次免疫接種裸RNA更加有效的保護作用。編碼HIV-1gag的KunjinVLP引發gag特異性CD4+T細胞應答。進行的實驗是要確定針對HIV-1gag的抗體產生是否伴有來自CD4+T細胞的T細胞輔助。圖13的數據指出，對於VLPgag免疫接種的小鼠，刺激指數(SI)為3.4，而對於原初小鼠，該SI為接近0。這些數據證實了在免疫接種的小鼠中存在VLPgag誘導的特異性的CD4T細胞應答。實施例3誘導長期的保護性CD8T細胞應答方法製備VLP。VLP的製備基本上如前所述，不同之處在於，用大約30μg體外轉錄的KUNgagRNA對3×106BHK21細胞進行電穿孔。電穿孔32小時後，將細胞用胰蛋白酶消化，用體外轉錄的編碼KUN結構蛋白的非細胞致病性塞姆利基森林病毒複製子RNA(衍生自SFV-MEC105的SFV-L713PMEC105；ref28)進行第二次電穿孔，並孵育48小時，然後收集分泌的VLP。通過以10倍系列稀釋的VLP感染Vero細胞，並在感染後30-40小時進行IF分析計數NS3陽性細胞而確定感染性VLP的滴度。對小鼠進行免疫接種。雌性BALB/c(H-2d)小鼠(6-8周齡)得自AnimalResourcesCentre(Perth，WesternAustralia)。小鼠以下列之一進行免疫接種(i)100μg的KUNgagDNA，稀釋於100μlPBS，並肌注(i.m.)於每條後腿的四頭肌部位(每條腿50μl)，(ii)大約30μg的體外轉錄的KUNgagRNA，溶於100μl焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)處理的，並肌注(每條腿50μl)，(iii)KUNgagVLP溶於DulbeccomodifiedEaglemedium(DMEM)-5％FCS，注射於腹腔內(i.p.)，每隻小鼠大約～1×106感染單位，(iv)編碼鼠多表位的KUNVLP(KUNmptVLP)，其含有4個H-2d限制性表位YPHFMPTML(YPH)、RPQASGVYM(RPQ)、TYQRTRALOV(TYQ)、SYIPSAEKI(SYI)(60)，並按照(iii)注射，以及(v)編碼HIV-1gag(WRTK-)的重組痘苗病毒(rVVgag)(2×107pfu溶於200μlPBS，i.p.)。ELISPOT和鉻釋放分析。使用如前所述(34)的肽表位(Mimotopes，Clayton，Australia)通過ELISPOT分析計數表位特異性的分泌IFN-γCD8T細胞。採用非配對學生t檢驗確定各組之間的差異的顯著性。使用免疫接種後2-3周處死的小鼠的脾細胞進行51Cr釋放分析，且脾細胞以照射過的LPS母細胞(應答細胞∶刺激細胞比例20∶1)在體外再刺激6天，該LPS母細胞以AMQMLKETI肽致敏(25μg/ml處理1小時，200μl培養基，37℃，隨後洗滌2次)。將得到的效應細胞群平分，並將等量的細胞以雙份的形式與肽致敏的和非致敏的51Cr標記的P815靶細胞作用，效應細胞與靶細胞的比例是指定的。痘苗病毒保護分析。給各組(n＝6)6-8周齡的雌性Balb/c小鼠(AnimalResourcesCentre，Perth，Australia)進行免疫接種，且和對照進行攻擊實驗，即每隻小鼠腹腔注射106pfu的編碼HIV-1gag(rVVgag)的重組痘苗病毒(WRTK-)或等量的rVVmpt(參考文獻31)。感染後第4天，切除雙側卵巢，洗滌並使用鋁網在1ml的PBS中進行勻漿。通過在匯合的CV1細胞上進行斑點分析確定卵巢中的痘苗病毒的滴度。採用非參數非配對t檢驗計算實驗組和對照組的病毒滴度之間的差異的顯著性。結果給小鼠接種一次KUNgagVLP僅免疫，然後在2周和6個月後通過ELISPOT分析AMQ特異性應答。6個月時的應答較2周時無明顯降低(p＝0.75，圖14A)，說明KUNgagVLP疫苗誘導了長期持續的CD8T細胞應答。與此類似，使用一種編碼鼠多表位的KUNVLP(KUNmptVLP)，即一種編碼4種H-2d限制性CD8T細胞表位的疫苗進行免疫接種後，觀察到存在長期的能夠分泌IFN-γ的表位特異性CD8T細胞。我們此前已經說明了在接種KUNmptVLP2-3周後出現針對這4種表位的應答，而現在發現6個月後這些應答沒有明顯地減弱(圖14B)，說明長期維持的CD8T細胞應答並不局限於AMQ特異性CD8T細胞。此外，使用編碼同樣4種表位的重組痘苗病毒對10個月前接種KUNmptVLP的小鼠進行攻擊實驗，依舊明顯存在實質性的保護作用(圖14C)。與對照小鼠相比，接種KUNmptVLP的小鼠的卵巢病毒滴度平均下降大約120倍(p＝0.015)，83％的接種KUNmptVLP的小鼠中攻擊實驗病毒完全消失。實施例4選擇適於在BHK細胞中持久複製的KUN複製子突變體選擇攜帶持久複製型KUN複製子RNA的嘌呤黴素抗性BHK細胞克隆。以體外轉錄的repPACβ-galRNA對BHK21細胞進行電穿孔，repPACβ-galRNA具有與野生型KUNcDNA相同的序列，包括NS1中250位的Pro(參考文獻16)。通過在含有5μg/ml嘌呤黴素的培養基中孵育7天建立嘌呤黴素抗性細胞克隆。將各個細胞克隆挑出並在含有嘌呤黴素的培養基中傳代4代。經X-gal染色測定，細胞為100％β-gal陽性，通過β-半乳糖苷酶分析試劑盒(Promega)測定不同細胞克隆的β-gal表達情況。不同細胞克隆之間的β-gal表達水平具有很寬的範圍(圖15)。選出具有不同表達水平的兩種差別明顯的克隆No.11和No.20用於對KUN複製子RNA進行測序分析。確定來自兩種選定的細胞克隆的KUN複製子RNA的適應性突變。使用AbsolutelyRNA試劑盒(Qiagen)分離來自嘌呤黴素抗性細胞克隆No.11和No.20的KUN複製子RNA，RT-PCR擴增，並使用BigDye測序試劑盒(PerkinElmer)通過測序分析來確定完整的KUN複製子序列(不包括β-gal基因)。在自克隆20分離的KUNRNA中發現一種適應性突變(NS2A中的Asn101被Asp取代)，在分離自克隆11的KUNRNA中發現兩種適應性突變(NS2A中的Ala30被Pro取代，以及NS5中的Pro270被Ser取代)(表7)。適應性突變賦予在BHK細胞中達到持久複製的優勢。通過定點PCR誘變，將由分離自克隆11和克隆20的KUN複製子RNA中鑑定出的適應性突變分別引入最初的repPACβ-ga1構建體以產生repPACβ-gal/NS2A(A-P)、repPACβ-gal/NS2A(N-D)和repPACβ-gal/NS5(P-S)。用野生型和突變的RNA對BHK細胞進行電穿孔，並在加入嘌呤黴素後第4天，通過嘌呤黴素抗性細胞克隆數目的差別評價適應性突變的效果(圖16)。如圖16所見，與野生型複製子相比，轉染含有突變的RNA導致選擇出更多數量的嘌呤黴素抗性細胞克隆，其中NS2A中Ala30被Pro取代的突變產生了最為有效的在BHK細胞中進行複製的適應性。本發明人還發現，相同的突變還產生了在HEK293細胞中達到持久複製的優勢。綜合討論本發明人已經證實，KUN複製子載體單次免疫就能夠誘導針對其所編碼的免疫原的CTL。所用三種輸送模式，即裸RNA、質粒DNA以及VLP，均可有效誘導CD8+CTL應答。免疫接種裸複製子RNA和VLP同樣保護小鼠抵抗病毒和腫瘤攻擊實驗。這些結果證實基於KUN複製子的疫苗載體能夠用於誘導包括CD8+CTL和CD4+T細胞的保護性T細胞應答。與用重組痘苗病毒，即一種被廣泛視作能夠有效誘導CTL的載體的疫苗載體模型(44)相比，使用KUN複製子載體所得到的CTL應答的程度與之相當或更優越。目前正在測試一些痘病毒疫苗載體在靈長類和人類誘導保護性CTL的能力；這些包括改良的安卡拉痘苗病毒(vacciniaAnkara)(48)、禽痘病毒(43)和ALVAC(15)。α病毒複製子已經被廣泛用於在動物模型中誘導免疫應答，同時衍生自VEE病毒的複製子最近已經被批准用於人類臨床前期試驗(http//www.alphavax.com/ppinhouse.html)。這裡的結果顯示KUN複製子可通過三種不同的模式輸送作為裸RNA、作為質粒DNA以及作為VLP。僅僅以0.1μg的KUN基於DNA的複製子進行免疫接種就足以誘發CTL應答。而要達到相似的CTL誘導水平，則需要免疫接種劑量為1000倍以上(100μg)的常規質粒DNA疫苗(圖4)。本發明的一個具體的方面涉及RNA免疫接種。裸RNA免疫接種可避免涉及DNA整合的問題，並具有優於免疫接種VLP的其他的優勢。不同於裸RNA，免疫接種VLP有可能導致誘導針對VLP結構蛋白的中和抗體應答，這一現象可能會限制VLP在個體中的使用次數。基於RNA的疫苗還較VLP更容易製造。最近的報導還提示RNA能夠被包囊化入微顆粒中，並通過以基因槍轟擊的方法施用於動物(37，54)。還發現包囊化的RNA能夠在4℃穩定8-12個月。本發明人已經發現，以KUN複製子疫苗進行RNA免疫接種可誘導特異於所編碼的免疫原的CTL應答，其效率堪與使用基於DNA的或基於VLP的KUN複製子進行免疫接種所達到的效率相媲美(圖3A)。使用KUN或SIN複製子進行RNA免疫接種還可在多種腫瘤模型中誘導顯著的抗腫瘤保護作用(圖5B)(58)。黃病毒的一個獨特的特徵可證實使用其複製子作為安全的疫苗載體是有益的。總體而言，尚未發現黃病毒在天然存在的不同病毒或病毒株之間發生重組的跡象。我們以前使用缺陷型全長KUNRNA和複製子RNA作為輔助物進行的多個補充實驗也沒有發現這兩種(全長和複製子)在同一細胞中共同複製的RNA之間有任何重組跡象，儘管兩種RNA存在具有高度相同性的長區域(總結於參考文獻29)。用在NS1基因中含有缺失的黃熱病毒RNA進行的補充實驗中，當補充來自同源性(黃熱病病毒)或來自異源性(登革熱病毒)病毒的輔助NS1(34，35)時，也沒有檢測到導致恢復重組病毒的重組。黃病毒的這種特徵不同於文獻中廣泛記載所α病毒RNA的重組能力(18，42，46)，因此當個體在免疫接種之前或之後的一段時間感染同一種或其他黃病毒時，其為該個體提供的免疫接種具有高水平的安全性。此外，使用來自完全不相關的病毒SFV的、用於表達KUN結構蛋白的、基於RNA的複製子載體的KUN複製子包裝系統的異源性特性，以及表達構建體的特殊設計，使得KUNVLP製劑絕對安全，並且不含任何感染性重組病毒物質(28，52)。或許KUN複製子最具區別性的特徵之一在於其複製不會引起明顯的細胞致病效應(CPE)或凋亡(26，52，53)。有文獻報導，含有疫苗抗原的感染細胞的CPE或凋亡是一種有效的交叉誘導(crosspriming)方法，結果是疫苗抗原被輸送至樹突狀細胞(DC)並有效誘導CTL(2，58)。不過，儘管其在體外的細胞致病性水平很低或檢測不到(含有Leu的變體；圖2A)，KUN複製子可在小鼠中有效誘導CTL應答(圖3和4)。此外，在含有Leu和含有Pro的KUN複製子載體變體所誘導的CTL中沒有觀察到顯著的區別(圖3和4)，而以兩者轉染的BHK21細胞則出現不同程度的細胞致病性(圖2A)。因此，KUN複製子誘導CTL可能不依賴於凋亡介導的交叉誘導(5)和/或可能不需要交叉誘導。已經發現，黃病毒能夠直接感染、複製並激活DC(19，21，22，32，57)，提示KUN複製子可能同樣能夠在DC中複製並產生疫苗抗原。疫苗載體直接感染DC可能代表了一種較交叉誘導更為有效的CTL誘導策略(49)。最近發現，嗜淋巴細胞性VEE複製子顆粒以及DC適應性SIN複製子顆粒能夠感染DC並表達由其編碼的疫苗抗原(14，36)。不過，α病毒複製子RNA的細胞致病性可引起抗原呈遞DC的凋亡並降低CTL的激活或誘導。與此不同，具有有限細胞致病性的KUN複製子可使得抗原在DC中長期表達，而不會引起凋亡；這一特徵可以促使對CTL應答產生長期的刺激。由於持續存在雙鏈RNA，而這被認為可誘導危險信號並激活DC(13)，因此誘導耐受的可能性不大。或許免疫接種KUNVLP的最不同尋常的結果持續存在長達6-10個月的CD8+T細胞應答，能夠在rVV攻擊實驗分析的4天內引起立即分泌IFN-γ並介導保護作用(圖14)。長期存在能夠立即產生保護性活性的CD8T效應細胞可以成為有效的抗HIV免疫接種的一個重要特徵，這是因為，攻擊實驗後自疫苗誘導的記憶性CD8T細胞庫中產生新的效應細胞的確是太慢了，其可能無法有效對抗迅速擴張的逆轉錄病毒的感染。總之，已經發現，KUN複製子是誘導長期的、具有保護性的CD8+T細胞的有效的疫苗載體，並代表了癌症和HIV疫苗中的一種很有吸引力的新模式。本說明書的目的在於結合優選實施方案對本發明作出說明，而非是要將本發明限制於任何一種實施方案或是各種特徵的具體集合。在不脫離本發明的寬泛的精神和範圍的條件下，可以對在此所述的實施方案作出各種變動和改良。本說明書中引用的所有電腦程式、演算法、專利以及科技文獻均以其全文併入本文作為參考。表1表2表6組rVVGag滴度降低的倍數表7參考文獻1.Agapov，E.V.，1.Frolov，B.D.Lindenbach，B.M.Pragai，S.Schlesinger，andC.M.Rice.1998.NoncytopathicSindbisvirusRNAvectorsforheterologousgeneexpression.ProcNatlAcadSciUSA.9512989-12994.2.Albert，M.L.，B.Sauter，andN.Bhardwaj.1998.DendriticcellsacquireantigenfromapoptoticcellsandinduceclassI-restrictedCTLs.Nature.39286-89.3.Bellone，M.，D.Cantarella，P.Castiglioni，M.C.Crosti，A.Ronchetti，M.Moro，M.P.Garancini，G.Casorati，andP.Dellabona.2000.Relevanceofthetumorantigeninthevalidationofthreevaccinationstrategiesformelanoma.JImmunol.1652651-2656.4.Berglund，P.，C.Smerdou，M.N.Fleeton，I.Tubulekas，andP.Liljestrom.1998.EnhancingimmuneresponsesusingsuicidalDNAvaccines.NatBiotechnol16562-5655.Binder，R.J.，D.K.Han，andP.K.Srivastava.2000.CD91areceptorforheatshockproteingp96.NatImmunol.1151-155.6.Bredenbeek，P.J.，I.Frolov，C.M.Rice，andS.Schlesinger.1993.SindbisvirusexpressionvectorspackagingofRNArepliconsbyusingdefectivehelperRNAs.JVirol.676439-6446.7.Conover，W.J.1980.Practicalnoparametricsatistics.Wiley，NewYork.8.Davis，N.L.，I.J.Caley，K.W.Brown，M.R.Betts，D.M.Irlbeck，K.M.McGrath，M.J.Connell，D.C.Montefiori，J.A.Frelinger，R.Swanstrom，P.R.Johnson，andR.E.Johnston.2000.VaccinationofmacaquesagainstpathogenicsimianimmunodeficiencyviruswithVenezuelanequineencephalitisvirusrepliconparticles.JVirol.74371-378.9.Elliott，S.L.，S.Pye，T.Le，L.Mateo，J.Cox，L.Macdonald，A.A.Scalzo，C.A.Forbes，andA.Suhrbier.1999.PeptidebasedcytotoxicT-cellvaccines；deliveryofmultipleepitopes，help，memoryandproblems.Vaccine.172009-2019.10.Fleeton，M.N.，P.Liljestrom，B.J.Sheahan，andG.J.Atkins.2000.RecombinantSemlikiForestvirusparticlesexpressingloupingillvirusantigensinduceabetterprotectiveresponsethanplasmid-basedDNAvaccinesoraninactivatedwholeparticlevaccine.JGenVirol.81749-758.11.Fleeton，M.N.，M.Chen，P.Berglund，G.Rhodes，S.E.Parker，M.Murphy，G.J.Atkins，andP.Liljestrom.2001.Self-replicativeRNAvacc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子的核苷酸序列，其中所述的黃病毒複製子編碼一或多種突變的黃病毒非結構蛋白；(ii)一種異源性核酸；(iii)可操縱地連接於編碼所述的黃病毒複製子的核苷酸序列的啟動子；以及(iv)至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列。11.權利要求10的表達構建體，其包含至少兩種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列，其中所述的至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第一種位於所述的異源性核酸的5′，而所述的至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列中的第二種位於所述的異源性核酸的3′。12.權利要求10的表達構建體，其中所述的編碼自身蛋白酶的核苷酸序列分別編碼一種口蹄疫病毒2A自身蛋白酶。13.權利要求10的表達構建體，其中(i)中所述的突變的黃病毒非結構蛋白選自如下一組(i)脯氨酸250突變為亮氨酸的非結構蛋白NS1；(ii)丙氨酸30突變為脯氨酸的非結構蛋白NS2A；(iii)天冬醯胺101突變為天冬氨酸的非結構蛋白NS2A；以及(iv)脯氨酸270突變為絲氨酸的非結構蛋白NS5。14.權利要求10的表達構建體，進一步包含分別編碼C蛋白的前20個胺基酸(C20)和E蛋白的最後22個胺基酸(E22)的核苷酸序列。15.權利要求10的表達構建體，進一步包含分別編碼選自NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B或NS5的一種野生型黃病毒非結構蛋白的核苷酸序列。16.權利要求15的表達構建體，其中所述的黃病毒複製子衍生自Kunjin病毒。17.權利要求10的表達構建體，其中所述的異源性核酸編碼一種免疫原性蛋白質。18.權利要求17的表達構建體，其中所述的免疫原是一種具有表位序列YPHFMPTNL、RPQASGVYM、TYQRTRALOV、SYIPSAEKI和SIINFEKL中的一或多種的鼠多表位蛋白。19.權利要求17的表達構建體，其中所述的免疫原性蛋白質是HIVgag蛋白。20.權利要求10的表達構建體，其是一種RNA構建體。21.權利要求20的表達構建體，其是RNALeuMpt、RNAProMpt或KUNRNAgag。22.權利要求10的表達構建體，其是一種DNA構建體。23.權利要求22的表達構建體，其是DNALeuMpt、DNAProMpt或KUNDNAgag。24.包含權利要求10的表達構建體的宿主細胞。25.一種表達系統，其包含(i)權利要求10的表達構建體；和(ii)至少另一種能夠表達一或多種蛋白的表達構建體，所述的蛋白有助於將所述的表達構建體包裝入黃病毒病毒樣顆粒(VLP)。27.權利要求25的表達系統，其中所述的另一種表達構建體衍生自塞姆利基森林病毒(SFV)或新培斯病毒(SIN)。28.權利要求27的表達系統，其衍生自SFV。29.權利要求27的表達系統，進一步包含SFV的突變的nsP2基因。30.權利要求29的表達系統，其中所述的SFV的突變的nsP2基因編碼一個由亮氨酸713至脯氨酸的取代。31.權利要求30的表達系統，其中所述的至少另一種表達構建體是SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P。32.一種宿主細胞，其包含選自SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P的所述的至少另一種表達構建體。33.權利要求32的宿主細胞，其是以SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PLacZNeo穩定轉染的BHK21細胞。34.權利要求32的宿主細胞，其進一步包含權利要求10的表達構建體。35.權利要求34的宿主細胞，其產生一或多種包含編碼一種免疫原性蛋白質的RNA的VLP。36.一種藥物組合物，包含一種可在動物細胞中自其轉錄得到RNA的黃病毒DNA表達構建體和一種藥物學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，其中所述的轉錄得到的RNA編碼(i)一種不能產生感染性病毒的黃病毒複製子；和(ii)一種免疫原性蛋白質。37.一種藥物組合物，包含一種可自黃病毒DNA表達構建體轉錄得到的RNA和一種藥物學可接受的載體、稀釋劑或賦形劑，所述RNA編碼(i)一種不能產生感染性病毒的黃病毒複製子；和(ii)一種免疫原性蛋白質。38.權利要求36或37的藥物組合物，其中所述的黃病毒DNA表達構建體包含(i)編碼一種不能產生感染性病毒的黃病毒複製子的DNA序列，其中所述的黃病毒複製子編碼一或多種突變的黃病毒非結構蛋白；(ii)一種編碼所述免疫原性蛋白質的異源性DNA；(iii)一種在動物細胞內可操縱的啟動子，且該啟動子可操縱地連接於所述編碼黃病毒複製子的DNA序列；和(iv)至少一種編碼自身蛋白酶的核苷酸序列。39.權利要求36或37的藥物組合物，其中所述的黃病毒是Kunjin病毒。40.權利要求36或37的藥物組合物，其是一種疫苗。41.權利要求40的疫苗，其在施用於動物後能夠引發一種保護性T細胞應答。42.權利要求41的疫苗，其中所述的T細胞應答是CTL應答。43.權利要求42的疫苗，其中所述的CTL應答的特徵在於一種長期的效應細胞CD8+T細胞應答。44.權利要求43的疫苗，其中所述的免疫原是一種病毒蛋白質。45.權利要求44的疫苗，其中所述的病毒蛋白質是HIVgag。46.權利要求40的疫苗，其中所述的動物是一種哺乳動物。47.權利要求46的疫苗，其中所述的哺乳動物是人。48.一種疫苗，包含由權利要求20的表達系統產生的一或多種VLP，其中所述的VLP包括一種編碼所述的免疫原性蛋白質的RNA。49.權利要求48的疫苗，其中所述的免疫原性蛋白質是一種病毒蛋白質。50.權利要求49的疫苗，其中所述的病毒蛋白質是HIVgag。51.一種免疫動物的方法，包括將權利要求40或權利要求48的疫苗施用於所述的動物的步驟從而在所述的動物中誘導免疫。52.權利要求51的方法，其中所述的免疫是抗體介導的。53.權利要求51的方法，其中所述的免疫是細胞介導的免疫。54.權利要求53的方法，其中所述的免疫是T細胞介導的免疫。55.權利要求54的方法，其中T細胞免疫的特徵在於CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CTL)應答。56.權利要求55的方法，其中T細胞免疫的特徵在於誘導一種長期的效應細胞CD8+CTL應答。57.權利要求56的方法，其中T細胞免疫的特徵在於CD4+T細胞應答。58.權利要求51的方法，其中在所述的動物中誘導針對病毒感染的免疫。59.權利要求51的方法，其中在所述的動物中誘導腫瘤免疫。60.權利要求59的方法，其中在所述的動物中誘導針對黑色素瘤的免疫。61.權利要求51的方法，其中所述的動物是哺乳動物。62.權利要求60的方法，其中所述的哺乳動物是人。63.一種選自SFVMEC/L713P/Neo、pSFV3L713PLacZNeo或SFVMEC/L713P的包裝構建體。64.一種包含權利要求63的包裝構建體的宿主細胞。65.權利要求64的宿主細胞，其是以SFVMEC/L713P/Neo或pSFV3L713PLacZNeo穩定轉染的BHK21細胞。全文摘要本發明提供了一種黃病毒表達載體、構建體和系統，其均包含一種黃病毒複製子，該黃病毒複製子有助於進行細胞內自我複製由此可高水平表達由一種異源性核酸編碼的RNA和蛋白。所述的黃病毒表達載體、構建體和系統優選地使用一種Kunjin病毒複製子，並特別適合用作一種疫苗輸送系統以促進表達能夠誘導針對病毒感染和癌症的保護性T細胞免疫的免疫原性蛋白質和肽。疫苗可以DNA、RNA或病毒樣顆粒的形式進行施用。文檔編號A61K35/76GK1671851SQ02827562公開日2005年9月21日申請日期2002年11月26日優先權日2001年11月26日發明者亞歷山大·A.·赫羅梅赫,安德烈亞斯·祖爾比爾申請人:昆士蘭大學,昆士蘭醫學研究所理事會