利用紫外光譜法測定細胞周期的方法
2023-11-11 11:17:27
專利名稱：利用紫外光譜法測定細胞周期的方法
技術領域：
本發明涉及一種細胞周期測定方法，特別涉及一種利用紫外光譜法準確反映細胞周期 變化的方法。
背景技術：
細胞作為生命科學研究的基礎， 一切生命的關鍵問題都要從細胞中尋找。生物的生殖 發育、遺傳、神經(腦)活動等重大生命現象的研究都要以細胞為基礎。植物與動物生長 發育是依靠細胞增殖、細胞分化與細胞凋亡來實現的， 一切疾病的發病機制也要以細胞病 變研究為基礎。細胞分裂是生命起源最基本也最重要的過程。細胞生長和細胞分裂是所有 生物增殖的基本形式，細胞生長和細胞分裂的周期即為細胞增殖周期簡稱細胞周期(cell cycle)。對於真核細胞而言，其細胞周期由G1期、S期、G2期和M期組成，它是細胞全 部生理過程的綜合體現，普遍存在於高等生物中。目前，細胞周期及其調控機制已在腫瘤、 幹細胞移植、衰老、生殖和遺傳學等領域顯示出巨大的指導意義。目前，對於細胞周期進行判定的研究方法主要有以下幾種光學顯微鏡法、流式細胞 儀分析法(DNA含量分析)、3H-TdR標記法等。光學顯微鏡法主要是通過顯微鏡對細胞 的形態進行觀察以判斷細胞所處細胞周期，該方法是通過人眼觀察，判斷速度慢；流式細 胞儀分析法在細胞周期研究中應用廣泛，但價格昂貴。從DNA含量入手，G1期和G2/M 期含有固定的DNA含量，分別為1倍和2倍，S期細胞的DNA含量介於1倍和2倍之間， 應用流式細胞儀就可通過監測細胞DNA含量的變化確定細胞周期的長短。但是由於G2 期和M期細胞的DNA含量都是2倍，故流式細胞儀無法區分G2期和M期細胞。3H-TdR 標記法是測定細胞的一種經典方法。但其測量中使用的放射性同位素要求專門設備，很容 易對操作者造成傷害和對環境造成汙染，同時放射性同位素本身對細胞周期也有幹擾且不 可避免。細胞在細胞周期的變化過程中，細胞內部的胺基酸、蛋白質、酶和輔酶、嘌呤、嘧啶、 核酸等物質都將隨著細胞的生長變化發生巨大的變化。紫外-可見光吸收光譜的變化對應細 胞周期的變化主要有蛋白質中的肽基團、芳香族胺基酸和某些輔基引起。芳香族胺基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，苯丙氨酸在257nm處有一吸收峰；酪氨酸在274nm處有 一強躍遷；色氨酸的吸收譜較複雜，在240 2卯nm範圍內至少存在3種電子躍遷。這些 胺基酸光譜均對pH變化敏感，也對溶劑極性敏感，所以可以用它們的譜線進行細胞周期 變化研究。利用紫外-可見光吸收光譜和螢光光譜可以對這個過程中的蛋白質和核酸的變化 進行精確的跟蹤進而得出在細胞周期不同時相的特徵光譜，並以此作為建立細胞周期光譜 信息模型的依據。同時，它還具有設備簡單、價格低廉、操作方便、靈敏度高等優點。利 用光譜技術對細胞進行研究也是對細胞內的各種有機物分子的變化進行跟蹤，以對細胞的 生理行為進行解釋。目前，國內外通過建立細胞紫外可見光光譜模型以對細胞的細胞周期進行判斷還未見 報導。發明內容針對現有技術中存在的上述不足，本發明的目的是提供一種能夠對真核細胞的細胞周 期各階段(Gl期、S期、G2期和M期)進行判斷的簡便方法，將細胞的紫外光譜信息同 細胞生長行為以及細胞增殖過程中生物化學反應聯繫起來對細胞周期進行判斷。本發明的目的是這樣實現的利用紫外光譜法測定細胞周期的方法，其特徵在於包括 如下步驟1)將某種細胞的單個細胞作為一個變化體系，用處於正常生長狀態下的細胞 周期G1期、S期、G2期和M期的單個細胞製成標準樣品，利用紫外分光光度計測量所述 細胞標準樣品在190nm 400nm的吸光度；對於在該範圍(190nm 400nm)內只有一個吸收峰的情況，則直接利用該吸收峰強度 與細胞周期的關係建立模型通過吸收峰強度對細胞周期進行判別；對於在該範圍(190nm 400nm)內有多個吸收峰的情況，則建立多條吸收峰強度與細胞周期的關係曲線，再利用 該關係對細胞周期進行判別；2)利用紫外可見光分光光度計在190 400mi範圍內，對被測樣品進行掃描，對所得 光譜曲線進行預處理後，將被測樣品光譜曲線的吸收峰強度與所述某種細胞周期的紫外光 譜模型的吸收峰強度對比，即可判斷出被測細胞處於細胞周期的哪一階段。本發明方法制樣簡單、操作方便、儀器設備普遍、準確性高、測量速度快，應用細胞 吸收峰強度隨細胞周期變化的關係，可很方便的對細胞的細胞周期進行判斷，有利於在生 物醫學研究過程中推廣應用。
圖1為吸收峰強度和細胞周期的關係圖；圖2為Hela細胞細胞周期各階段光譜曲線圖。
具體實施方式
下面通過具體的實施例對本發明作進一步說明。實施例利用紫外光譜法對Hda細胞進行細胞周期測量的方法1、 首先，建立Hela細胞周期的紫外光譜模型，每一時相的細胞標準光譜曲線按以下 步驟獲取① 樣品的獲得。為獲取準確的光譜數據，首先要保證細胞樣品處於自然生長狀態下， 採用光學顯微鏡觀察根據形態變化，獲取處於細胞周期不同時相(Gl期、S期、G2期和 M期)的細胞，將其製成標準樣品。② 各時相細胞光譜的測量。在生理溫度(36.5土0.5'C)下利用紫外可見光分光光度 計，進行標準樣品的紫外光譜測量，設定分光光度計的掃描範圍190 400nm，掃描步長 0. lnm，掃描次數5次。(測量結果曲線如圖l所示)。③ 細胞光譜的預處理。將每一細胞周期的5組光譜數據取平均作為該樣品組細胞的標 準光譜曲線，將平均所得光譜曲線進行平滑濾波處理，以降低消除測量中各種原因引起的 光譜畸變。④ 細胞紫外光譜模型的建立。完成細胞周期各階段樣品的光譜曲線的測量後，利用同 一波長處的吸收峰強度與細胞所處細胞周期相應階段的關係建立對應模型(如圖2所示)。2、 完成細胞周期各階段的光譜模型建立後，就可對細胞所處周期進行判斷了。首先， 利用紫外可見光分光光度計在190 400nm範圍內，對被測Hela細胞樣品進行掃描，對所 得光譜曲線進行平滑濾波等處理後，將光譜曲線建立模型所用波長對應的吸收峰強度與模 型對比，即可判斷出被測細胞處於細胞周期的哪一階段。本發明方法將某種細胞的單個細胞作為一個變化體系，用處於正常生長狀態下的細胞 周期Gl期、S期、G2期和M期的單個細胞製成標準樣品，利用紫外分光光度計測量各細 胞樣品在190nm 400nm的吸光度。在該範圍內的主要吸收波長處，吸收峰的強度會隨著 細胞周期變化中胞內物質(如胺基酸、核酸、蛋白質等)的不斷變化的有明顯的變化。對 於在該範圍內只有一個吸收峰的情況，則直接利用該吸收峰強度與細胞周期的關係建立模 型通過吸收峰強度對細胞周期進行判別。對於在該範圍內有多個吸收峰的情況，則需通過相關係數來判斷哪個吸收峰更利於對細胞周期進行判別，選擇相關係數最大的吸收峰，建 立其強度與細胞周期的關係模型。完成模型的建立後，當要對該種細胞所處的細胞周期進 行測定時，只需測量其在190nm 400nra的吸光度，將所得吸收峰強度與相關模型對比即 可判斷其所處細胞周期。本發明所提供的細胞紫外光譜法是可反映真核細胞在細胞周期過程中各個階段Gl期、 S期、G2期和M期的變化趨勢。細胞的生長、增殖過程都和細胞周期密不可分，在細胞 周期的各個時相中，由於細胞內胺基酸、蛋白質等物質隨細胞周期變化而在各時相中的不 均勻分布以及濃度變化，造成了細胞在各時相中紫外可見光吸收光譜的峰值及其強度的差 異，這種差異幾乎不受細胞形態變化的影響。故可將這種差異作為紫外光譜方法測定細胞 周期的主要參數，從而準確地對細胞的生長行為進行描述和判斷。
權利要求
1、利用紫外光譜法測定細胞周期的方法，其特徵在於包括如下步驟1)將某種細胞的單個細胞作為一個變化體系，用處於正常生長狀態下的細胞周期G1期、S期、G2期和M期的單個細胞製成標準樣品，利用紫外分光光度計測量所述細胞標準樣品在190nm～400nm的吸光度；對於吸光度在190nm～400nm範圍內只有一個吸收峰的情況，則直接利用該吸收峰強度與細胞周期的關係建立模型通過吸收峰強度對細胞周期進行判別；對於吸光度在該範圍內有多個吸收峰的情況，則建立多條吸收峰強度與細胞周期的關係曲線，再利用該關係對細胞周期進行判別；2)利用紫外可見光分光光度計在190～400nm範圍內，對被測樣品進行掃描，對所得光譜曲線進行預處理後，將被測樣品光譜曲線的吸收峰強度與所述某種細胞周期的紫外光譜模型的吸收峰強度對比，即可判斷出被測細胞處於細胞周期的哪一階段。
2、 根據權利要求1所述利用紫外光譜法測定細胞周期的方法，其特徵在於所述標準 樣品的獲得，要保證細胞樣品處於自然生長狀態下，採用光學顯微鏡觀察根據形態變化， 獲取處於細胞周期不同時相的細胞，將其製成標準樣品。
3、 根據權利要求1所述利用紫外光譜法測定細胞周期的方法，其特徵在於所述步驟1) 中吸光度的測量是在生理溫度(36.5士0.5'C)下利用紫外可見光分光光度計，進行標準 樣品的紫外光譜測量，設定分光光度計的掃描範圍190 400nm，掃描步長0. lnm，掃描次 數5次。
4、 根據權利要求1所述利用紫外光譜法測定細胞周期的方法，其特徵在於所述細胞 光譜的預處理是將每一細胞周期的5組光譜數據取平均作為該樣品組細胞的標準光譜曲 線，將平均所得光譜曲線進行平滑濾波處理。
全文摘要
本發明公開一種利用紫外光譜法測定細胞周期的方法。該方法利用細胞在細胞周期(G1期、S期、G2期和M期)變化過程中胞內物質(如胺基酸、核酸、蛋白質等)的不斷變化對其紫外光譜的峰位、譜峰及峰強造成的影響，找出這些參數與細胞所處周期的對應關係，建立特定細胞的細胞周期紫外光譜模型，最終利用該模型實現對單個細胞周期的準確測定。該方法將一種常規方法用於對細胞周期的測量，解決以往依賴流式細胞儀對細胞周期進行測定的較為繁瑣的判別方法，而且能夠對細胞周期G2期和M期的細胞進行區分，這是流式細胞儀無法實現的。本發明制樣簡單、操作方便、儀器設備普遍、準確性高、測量速度快，應用細胞吸收峰強度隨細胞周期變化的關係可很方便的對細胞的細胞周期進行判斷，有利於在生物醫學研究過程中推廣應用。
文檔編號G01N21/31GK101329270SQ200810069990
公開日2008年12月24日 申請日期2008年7月18日 優先權日2008年7月18日
發明者林曉鋼, 潘英俊, 郭永彩, 潮 高 申請人:重慶大學