毒素中和性肽的篩選方法和STX2抑制性肽以及Vero毒素中和劑的製作方法
2023-11-07 13:40:22 1
專利名稱：毒素中和性肽的篩選方法和STX2抑制性肽以及Vero毒素中和劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及能夠抑制Vero毒素或者霍亂毒素、百日咳毒素等毒素的毒素中和性肽的篩選方法。
此外，本發明還涉及STX2抑制性肽和Vero毒素中和劑。此外，更具體地講，涉及競爭性地抑制Vero毒素向細胞的附著、能夠有效地抑制Vero毒素的STX2抑制性肽、和能夠經口給予的新型的Vero毒素中和劑。
背景技術：
腸道出血性大腸桿菌O157:H7產生的Vero毒素是屬於與來自赤痢菌的志賀毒素類似的細菌毒素的AB5家族的蛋白質，已知這些毒素，識別各種目的臟器的血管內皮細胞上的球丙糖醯基鞘氨醇(globotriaosylceramide，Gb3，Galα-4Galβ1-4Glcβ1-Cer)中的globo三糖部分，通過附著攝取到細胞內，顯示出毒性。
並且，這樣的志賀樣毒素存在2種，這些毒素能夠引起毒素出血性大腸炎或者其後的一系列的微小血管障礙這樣的嚴重併發症(例如溶血性尿毒綜合症(HUS))等。作為STX1所表示的毒素，與志賀氏赤痢菌(Shige11a dysenteriae TypeI)產生的志賀毒素具有相同的胺基酸序列。另一方面，STX2所表示的毒素被認定與STX1具有50％～60％的胺基酸序列一致性。它們的毒性雖然在它們的胺基酸序列上稍有差別，不過通過蛋白質合成抑制展示出細胞毒性或者腸道毒性等活性。Stx是由2種亞單位(A和B)構成的AB5型的毒素，1分子的A亞單位周圍通過疏水鍵包圍著5分子的B亞單位。承擔毒素活性的是A亞單位，B亞單位承擔著與細胞表層上存在的糖鏈受體結合的作用。通過毒素的X射線結晶結構分析等得到詳細的研究可知，在1分子的B亞單位中存在3個糖鏈結合部位。即，根據在1分子的STX2中存在5分子的B亞單位，可以推測能夠提供共計15個結合部位。
即，STX分類成STX1和STX2的兩個家族，引起嚴重綜合症的幾乎都是STX2產生菌，在臨床上STX2這一方面更加重要。所以，當務之急是開發針對STX2的抑制劑。這些STX以A-B5型毒素形式，其中的B亞單位通過與細胞膜上的受體Gb3(globotriaosylceramideGalα(1-4)-Galβ(1-4)-Glcβ1-Ceramide)的結合被攝取到細胞內部。此外，B亞單位五聚體特異地識別Gb3的糖鏈部分(Globo三糖Galα(1-4)-Galβ(1-4)-Glcβ1-)。所以，Globo三糖的高密度聚集的化合物能夠以高親和力結合STX，成為抑制其作用的STX抑制劑。
隨著這樣的毒素的亞單位構成及其功能的闡明，選擇性地抑制具有向細胞表層上的糖鏈受體的結合功能的B亞單位結合的方法引人關注，開展了從各種觀點出發的研究。
本申請的發明人也進行了能對如前所述的毒素的糖鏈結合部位有效地進行糖鏈結合的、抑制毒素向宿主細胞粘附的人工糖鏈簇的構建。並且，到現在為止，提出了以碳矽烷為糖鏈承載骨架的枝型化合物群，或者水溶性聚合物化合物(專利文獻1～2，非專利文獻1)。
例如，下式所示的SUPER TWI G(1)6等。該物質是首次在O157:H7感染實驗中被證明有效的化合物。
包括SUPER TWIG，到目前為止STX抑制劑的開發是根據下述理念進行的為了使之在生物體內發揮抑制活性，著眼於如何使作為STX結合單位的globo三糖積聚。可是，globo三糖單獨對STX的親和性(Kd)是10-3M，不一定高，而且化學合成極其困難。這成為臨床應用的最大障礙。所以，為了進行能夠臨床應用的治療藥物開發，有必要開發比globo三糖更容易合成的、對STX的結合能力優良的新型的STX結合單位。
並且，推測上述那樣的課題並非Vero毒素所特有的，而是被認為是Vero毒素STX以外的、在受體結合部具有亞單位結構的霍亂毒素(A-B5型)受體GM1、毒素原性大腸桿菌易熱性痢疾的致病毒素LT(A-B5型)受體GM1、百日咳毒素(A-B5型)受體、炭疽菌毒素(7聚體型)受體具有VWA結構域的蛋白(anthrax toxin receptor)等的情況下共有的。
在這樣的情況下，本申請的發明人進行了構建這些毒素的受體的處方物質的研究專利文獻1WO 02/02588專利文獻2特願2004-108483號申請非專利文獻1Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2002；997669-74
發明內容
本發明在以上所述的背景下，發明人以迄今為止所做的研究為基礎，為了實現容易合成的、並能有效抑制Vero毒素等的在受體結合部分具有亞單位結構的毒素中和劑，以提供新的篩選方法為課題。
此外，本發明以迄今為止發明人所做的研究為基礎，以提供容易合成、並能有效抑制Vero毒素的新的STX抑制劑，即，Vero毒素中和劑為課題。
本申請的發明人為了解決上述課題，進行了針對實現毒素中和性肽的可能性的研究。注意力集中在肽上的主要原因是合成相對容易，應用到藥物中的安全性通常較高。
作為發明人辛苦研究的結果，為了解決上述課題，本申請首先提供了下述毒素中和性肽的篩選方法，更為具體的是提供了STX2抑制性肽和vero毒素中和劑。
第1毒素中和性肽的篩選方法，該方法是篩選能夠中和在受體結合部具有多個亞單位結構的毒素的肽，其特徵在於，該方法包括(1)通過導入突變確定受體結合位點，(2)根據將通過肽文庫法得到的與野生型亞單位結合的肽基序與前述結合位點功能性缺失的突變體結合的肽基序的對比得到的胺基酸選擇比，確定結合位點特異性肽基序。
第2毒素中和性肽的篩選方法，其特徵在於，多次重複上述(2)的步驟，依次確定胺基酸選擇比較高的結合位點特異性的肽基序。
第3毒素中和性肽的篩選方法，其特徵在於，在上述(2)的步驟中，使用形成多個賴氨酸(Lys)鍵合的核結構，其末端的胺基酸上結合多個肽文庫的、多價的一級肽文庫。
第4毒素中和性肽的篩選方法，其特徵在於，在上述的多價的一級肽文庫中，肽文庫通過間隔分子，結合於末端氨基上。
第5STX2抑制性肽形成特徵在於，在3分子的賴氨酸(Lys)的結合了肽的分子核結構部分上形成至少7個胺基酸的肽鍵所構成的肽基序，該肽基序是在該序列上有2處至少2個鹼性胺基酸結合的簇部，在C-末端側引入了鹼性胺基酸。
第6STX2抑制性肽，其特徵在於，作為簇部的鹼性胺基酸至少含有精氨酸(Arg)。
第7STX2抑制性肽，其特徵在於，簇部是Arg-Arg或者Arg-Arg-Asn。
第8STX2抑制性肽，其特徵在於，N-末端側是疏水性胺基酸。
第9STX2抑制性肽，其特徵在於，在3分子的賴氨酸(Lys)的結合了肽的分子核結構部分上引入了下述4種胺基酸序列的肽基序中的至少一種(1)FRRNRRN(序列號1)(2)PPPRRRR(序列號2)(3)PPRRNRR(序列號3)(4)KRRNPRR(序列號4)。
第10STX2抑制性肽，其特徵在於，肽基序通過間隔分子被引入。
第11STX2抑制性肽，其特徵在於，間隔分子是肽或者具有氨基和羧基的、具有4～10個碳原子數的烴鏈結構的分子。
第12STX2抑制性肽，其特徵在於，肽基序具有末端修飾分子。
第13STX2抑制性肽，其特徵在於，末端修飾分子是不具有電荷的分子。
第14STX2抑制性肽，其特徵在於，肽基序也可以具有胺基酸測序用分子。
第15STX2抑制性肽，其由下式(a)(b)任一項表示的權利要求12或者13的(Met-Ala-Xo-Ala-AHA-)4-3Lys(a)(乙醯-Xo-AHA-)4-3Lys (b)〔式中，AHA表示氨基己烷羧酸基(aminohexanecarboxylicacidgroup)，Xo表示前述的肽基序(1)(2)(3)(4)的任何一個，3Lys表示下式的結構
第16Vero毒素中和劑，其特徵在於，含有前述任一項的肽作為有效成分。
圖1是肽基序(1)FRRNRRN(序列號1)化合物的質譜圖。
圖2是肽基序(2)PPPRRRR(序列號2)化合物的質譜圖。
圖3是肽基序(3)PPRRNRR(序列號3)化合物的質譜圖。
圖4是肽基序(4)KRRNPRR(序列號4)化合物的質譜圖。
圖5是沒有肽基序的Met-Ala化合物的質譜圖。
圖6是例示了STX2B亞單位的親和力的圖。
圖7是例示了對vero細胞的STX2的細胞毒性的抑制效果的圖。
具體實施例方式
本發明具有前述的特徵，以下針對具體實施方式
進行說明毒素中和性肽的篩選
首先，基本的情況是在本發明的毒素中和性肽的篩選方法中，如上述第1的發明所述，包括下述的步驟(1)通過導入突變確定受體結合位點，(2)根據將通過肽文庫法得到的與野生型亞單位結合的肽基序與前述結合位點功能性缺失的突變體結合的肽基序的對比得到的胺基酸選擇比，確定結合位點特異性肽基序。
作為更優選的實施方式，考慮多次重複上述(2)的步驟，依次根據胺基酸選擇比，確定結合位點特異性高的肽基序。
此外，根據已知亞單位與受體間的結合存在簇(cluster)效果，期望上述(2)的步驟的起始(一級)肽文庫，作為與該簇效果相對應的肽文庫，使之通過多個胺基酸的結合而具有核結構。
對於這樣的核結構，例如，從例如其設計或者合成的容易性、以及由此為了得到實際的簇效果的分子大小的觀點出發，認為使用多個賴氨酸(Lys)，例如優選使用2～5個鍵合的，使肽文庫自身成為多價的肽文庫。
即，在上述(2)的步驟中，使用形成多個賴氨酸(Lys)鍵合的核結構，其末端胺基酸結合了多個肽文庫的、多價的一級肽文庫。該多價的一級肽文庫中，肽文庫與可以通過間隔分子結合在末端的氨基上。這種情況下，例如，間隔分子的一個優選的例子是具有肽或者氨基和羧基的、具有4～10個碳原子的烴鏈結構的分子。
此外，上述步驟(1)中的受體結合位點的確定，可以確定為對應於已知的位點，也可以確定為實際上導入突變對受體於結合產生很大影響的位點。本申請的發明人等，在Vero毒素STX的情況下，發現已經將受體結合位點確定為globo三糖的結合。
Vero毒素中和性肽的篩選和STX2抑制性肽
所以，下面針對表示Vero毒素的抑制性肽的篩選的例子，更詳細地對本發明進行說明。
O157:H7等的腸道出血性大腸桿菌的感染不僅引起出血性大腸炎，而且有時使溶血性尿毒症綜合症(HUS)或者腦部疾病並發，進一步這些綜合症成為導致患者死亡的最大原因。Vero毒素(Shiga toxin；Stx)被認為是腸道出血性大腸桿菌產生的主要的致病因子，在血中，侵入的Vero毒素導致的腎或者腦的微小血管內皮的障礙是上述綜合症的原因。所以，期待著強有力地吸附在腸道內產生的STX的、抑制STX向血中入侵的STX吸附劑、或者結合已經入侵到血中的極其微量的STX的、抑制其作用的STX中和劑就成為腸道出血性大腸桿菌感染症的有效治療藥。
進行這樣的大腸桿菌Vero毒素中和性的肽的篩選時，可以根據發明人對上述的SUPER TWIG(1)6的分子結構和作用機制之間的關係的詳細研究進行。
下面，進行詳細的說明。
1)對SUPER TWI G(1)6的STX1B以及2B的結合位點的確定B亞單位單體之一上存在名為位點1、2、3的3種的globo三糖結合位點。所以已知在B亞單位五聚體上共計能夠結合15個的golob三糖。為了開發新的STX結合單位，首先以哪個位點作為靶點是非常重要的問題。所以，向各位點導入一個、二個、三個的突變，製備各種突變體B亞單位，將這些突變體於SUPER TWIG(1)6間的結合親和性進行比較研究。其結果表明在SUPER TWIG(1)6與STX1 B亞單位的結合使用「位點1和2」或者「單獨的位點3」，此外與STX2B亞單位的結合僅僅使用「單獨的位點3」。也就是可以判定，為了開發臨床上更為重要的針對STX2的新型結合單位，可以使用位點3為靶點。
2)新型的STX結合單位的開發考慮到臨床上的重要性以及前述1)中明確的結合位點的特異性，針對將能夠結合到STX2B亞單位的、抑制STX2的毒性的新型物質作為具有肽結構的物質進行探索。著眼於肽的最大的理由是，其合成比較容易，常規的作為藥物使用沒有大的障礙，此外，開發出其變體、衍生物的可能性大。
從這樣的觀點出發，為了進行活性肽的探索，進行了肽文庫的新開發。
即，根據1)得到的發現，通過從與野生型STX2B亞單位結合的肽基序中扣除與位點3功能性缺失的突變體STX2B亞單位結合的肽基序，確定能夠與STX2B亞單位的位點3特異性結合的基序。
即，首先，發明人已經開發了確定對蛋白激酶的催化部位等的功能區域直接結合的基序的方法、肽文庫法(K.Nishikawa et al.，Mol，Cell，6，969-2000)。所以，鑑於該肽文庫法的知識，在Vero毒素中和劑中，利用在如上所述的B亞單位五聚體與Globo三糖之間的結合的簇效果，開發了基於將肽文庫自體多價化的新概念的肽文庫。
首先，考慮到上述的SUPER TWIG(1)6中的核分子結構的大小等，作為為了使肽文庫能多價地使用的核結構，使用了下式所示的將3個賴氨酸(Lys)結合的結構，合成了通過間隔子將4個肽文庫結合的化合物。
該化合物是在上述式子的Lys核分子結構的末端氨基上，結合式MAXXXXA-AHA-(序列號5)所示的4個肽文庫(Xaa-Xaa-Xaa-Xaa)的物質(MAXXXXA-AHA)4-3Lys。對於該化合物，式中的AHA表示氨基-己酸，構成間隔分子。
AHA(Amino-hexanoic acid)以6個碳原子的長度，為了與SUPERTWIG的最佳條件吻合而使用。此外，末端的MA(Met-Ala)是進行胺基酸測序時候，為了清楚地檢查是否進行了測序而在篩選時導入的。在AHA-前面的A(Ala)也是基於同樣的理由。其形狀、核結構上存在的分枝鏈間的距離、庫的價數、庫間的距離、這所有的點都按照滿足SUPERTWIG的最佳結構來設計。此外，對得到的化合物進行胺基酸測序的時候，能夠確認在胺基酸簡併的位置，使用的19種胺基酸(除了Cys)被有效地隨機化了。
使用該第一肽文庫，首先確定與野生型STX2B亞單位結合的肽基序，還確定與位點3突變體STX2B亞單位結合的肽基序。即，首先，將附在珠子上的2B以及2B突變體(32A)分別調整到3～5mg，分別裝入柱子中，製備親和柱。
向其中加入50mg左右的一級篩選用多肽文庫(MAXXXXA-AHA-)4-3Lys，使之充分結合。之後，用PBS等充分洗滌，洗去未結合的庫。
最後，用30％的醋酸洗脫殘留在柱子中的庫。將回收的級分乾燥，進行胺基酸序列分析。結果，對於各個簡併位置，得到了哪個胺基酸以哪種強度被選擇出來的數值化的結果。19種胺基酸全部值加到一起為1進行標準化。
並且，使用2B的時候，如上述得到的、各簡併位置的各胺基酸的值除以使用野生型W32A的時候，如上述得到的對應簡併位置的對應的胺基酸的值。結果將該胺基酸在2B中是否以與W32A相比幾倍地被選擇出進行數值化。最終，可以通過將前者基序中存在的各胺基酸的選擇比用後者的基序中存在的對應的胺基酸的選擇比相除，確定STX2B亞單位的位點3特異的結合基序。
對其他18種胺基酸進行同樣的研究，最後，將19種胺基酸的值加在一起為19進行標準化。此時，將各胺基酸之間沒有選擇性差異的值定為1，通常，判斷當該值一旦超過1.5，就可以認為是強的選擇性。表示該結果的為表1。並且，在下面的表1～表4，還有在圖6～圖7中，將胺基酸用一個字母進行標記。
表1對2B亞單位的結合基序的第一級篩選
然後，以得到的基序為基礎，製備如表2所示的2次庫。實際上，因為在一級篩選中選擇出了Arg、Asn、Phe等，將這些胺基酸作為固定位置導入到二級篩選中。於是，因為增加了對作為庫整體的2B亞單位的結合性，容易得到更特異的基序。
表2用於第二級篩選的肽文庫簡併位置1234567(MA-XXXXXXX-A-AHA)4-3LysXXRXNXXXXXRXXXXXXNXXX使用該二級肽文庫，與上述同樣確定與野生型STX2B亞單位結合的肽基序、還有與位點3突變體STX2B亞單位結合的肽基序。通過將前者的基序中存在的各胺基酸的選擇比用後者的基序中存在的對應的胺基酸的選擇比相除，能夠確定比用一級肽文庫得到的基序具有更高選擇性的、STX2B亞單位的位點3特異性的結合基序。該結果如表3所示。
表3
得到的肽基序，是下面所述的胺基酸序列(1)FRRNRRN(序列號1)(2)PPPRRRR(序列號2)(3)PPRRNRR(序列號3)(4)KRRNPRR(序列號4)並且，對於基序(1)FRRNRRN(序列號1)，即使進行二級篩選，儘管選出了鹼性胺基酸、Pro、疏水性胺基酸，作為最佳的基序選出了對於各個位置為最高數值的胺基酸，因為未反映出優選疏水性胺基酸的信息，所以作為通過各庫得到的一致的序列導入Phe。
所以，合成了將得到的基序向3個Lys結合而成的前述式子的分子核結構上作為Met-Ala-Xo-Ala-AHA-(Xo表示前述的任何一個基序，AHA表示同如前所述)引入的化合物。此時，Lya3的核結構因為以與珠子結合的狀態在市場上銷售，所以，用常規的胺基酸合成裝置從C末端依次合成，即，在3Lys的式子中，一級延伸4個鏈。AHA也因為具有氨基和羰基，所以可以同樣地可以使用胺基酸合成裝置。
對於這些化合物，通過質量分析進行鑑定。圖1、圖2、圖3以及圖4表示的分別是前述的肽基序(1)、(2)、(3)、(4)的情況下的質譜。此外，圖5作為參照，表示的是不含有任何前述肽基序的化合物(Met-Ala)Met-Ala-Ala-AHA-的情況下的質譜。
STX2抑制性肽和Vero毒素中和劑
針對以上的各個化合物對STX2B亞單位的親和性進行研究的時候，表示出以高的親和性結合。此外，闡明了能夠有效地抑制對Vero細胞的STX2的細胞毒性。
表4和圖6表示了對STX2B亞單位的親和性。測定方法如下所示。
即，首先，將圖6所示量的合成肽包被到ELISA用的塑料平板上。用1％的BSA封閉後，加入0.1microgram/ml的野生型2B-His或者位點3突變體W32A-His，在室溫下使之結合1小時。洗滌後，用對結合的各2B亞單位使用抗STX2多克隆抗體的ELISA法進行檢測。
圖6中的小圖表示對於已知量的野生型2B-His或者位點3突變體W32A-His，抗STX2多克隆抗體都同樣地反應。
此外，圖7A表示了對Vero細胞的STX2細胞毒性的抑制效果。在該圖7的結果的測定中，在培養的Vero細胞中使1pg/ml的STX2、以及各濃度的各合成肽存在，培養3天，將培養後的生存的細胞用WST分析(cell viabi1ity assay kit)進行定量。
將在STX2(-)的條件下的定量值定義為10O％，STX2、1pg/ml單獨的情況(也就是，沒有抑制劑)定義為0％進行表示。
此外，圖7B表示的是以E.coli O157:H7感染的小鼠作為對象的驗證結果。順序如下所示。即，第0天「蛋白質卡路裡缺乏小鼠中，用致死量的E.coli O157:H7 N-9株進行胃內感染。第2天～第4天向小鼠中每天2次，進行試樣肽、三糖類似物(按照體重計，75μg/g)或者僅僅是生理鹽水的胃內給藥。第2天～第5天PPR-tet或者PPP-tet(按照體重計，225μg/g)每天2次，進行胃內給藥。
確認了本發明的試樣肽的優良的作用效果。
另外，圖6和圖7中的表示的含義，MA表示不含有上述肽基序(1)(2)(3)(4)中的任何一種，圖5表示用質譜參考化合物(Met-Ala)Met-Ala-Ala-AHA作為對照的情況。此外，圖7中的PPR-tet等表示的含義與表4中表示的相對應。
表4合成的肽對His標籤的Stx 2B亞單位的結合動力學分析
對於前述例示的化合物，將AHA(amino-hexanoic acid)作為間隔分子，並且該AHA和肽基序Xo之間介入的Ala以及肽基序Xo末端修飾分子Met-Ala是為了確認胺基酸序列而導入的，這些也可以是各種各樣的。間隔分子的AHA作為具有氨基和羧基的為6個碳原子長度的物質是通過與SUPER TWIG的對比研究而選擇出的，其實該碳原子數更優選為6個，在4～10個的範圍內也可以。
此外，只要不損害肽基序Xo和分子核結構部分3Lys的STX2抑制活性，間隔分子也可以使用其他的各種分子。
此外，對於用於在篩選時的胺基酸測序而導入的末端的Met-Ala以及結合AHA的Ala，也可以使用其他的適合的物質。這些因為不具有STX2的抑制活性，在篩選後是不需要的。不過，當基序的末端露出NH2的時候會提供正電荷，所以從電荷調節的觀點出發，優選末端存在MA或者其他的物基團。這些基團通常不帶有電荷，而且不會對疏水性帶來很大影響的基團是非常優選考慮的。
可以考慮各種這樣的修飾等。
例如，可以考慮為了抑制伴隨經口給藥的消化道內的蛋白酶的分解，以穩定為目的將N-末端的Met的NH2基用乙醯基進行保護。
還有，發明人確認的時候，一旦乙醯基化，在體外的STX2導致抑制細胞抑制活性的作用(活性)增大了大約5倍。並且，通過感染實驗也確認了效果的增強。
根據這些情況，例如將(乙醯-Xo-AHA)43Lys、或者乙醯變更成其他的保護基，或者將AHA變更成別的間隔子的情況，此外，不使用間隔子的情況，也優選考慮。
並且，通過本發明人的研究，對於通過如上所述的篩選法而導出的STX2抑制性肽，作為表達其活性的物質還發現了多種變體。
即，發現可以考慮更常規地，作為STX2抑制性肽，在賴氨酸(Lys)3分子的結合了肽的分子核結構部分上形成由至少7個胺基酸的肽鍵構成的肽基序，該肽基序是在序列上有2處簇部，每個簇部結合了至少2個鹼性胺基酸，例如精氨酸(Arg)、或賴氨酸(Lys)、組氨酸(His)鍵合的，在C-末端側是導入到肽基序的鹼性胺基酸。
其中，作為構成簇部的鹼性胺基酸，考慮優選含有精氨酸(Arg)。為此，例如，優選簇部的為-Arg-Arg-、-Arg-Arg-Asn-等。
此外，本發明的STX2抑制性肽中，優選C-末端側是鹼性胺基酸，例如精氨酸(Arg)等，N-末端側是疏水性胺基酸，例如是脯氨酸(Pro)等。
優選C-末端側是鹼性胺基酸，是出於下述原因考慮的，因為結合方的STX2B亞單位的Glogo三糖結合部位3(Site 3)附近存在酸性胺基酸的簇，所以二者通過靜電相互作用能夠增加親和性。此外，優選N-末端側是疏水性胺基酸的理由是，與在STX2B亞單位的Glogo三糖結合部位3(Site3)起著中心性作用的Trp與疏水性相互作用。
出於上述考慮，在本發明中作為優選之一提供了上述的(1)(2)(3)(4)的肽基序。
另外，本發明中的肽基序，考慮到分子大小對STX2抑制作用的效果，由如上所述的至少7個胺基酸構成，如果在上述的7個以上，只要不對STX2抑制性造成大的損失，作為藥物等的應用，還可以是更多個胺基酸。此外，即使具有如上所述的各種間隔子或者末端修飾基也勿需多言。
並且，在本發明中，如上所述，作為以具有STX2抑制活性的肽為有效成分的Vero毒素中和劑，可以採用各種劑型，在經口給藥的途徑中，也可以與賦形劑等一起成形，作為片劑或者粉末使用，也可以作為與純化水等的組合物作為液體製劑使用。對於這些組合物或者劑型，可以使用包括以往公知的各種的配合成分，也可以採用其中使用的各種方法。
對於作為Vero毒素中和劑的給藥量，自從發現大腸桿菌O157:H7感染以來，通常考慮按照體重計算為5～500mg/kg左右的處方。當然根據症狀只要適宜即可。
另外，近年來，發現了很多的微量且具有強大的生理活性的肽，此外，由於基因重組技術或者細胞融合等的生物技術的迅速進步，能夠實現肽的大量供給，正在開展將這些生理活性肽作為醫藥品進行疾病治療應用的嘗試。可是，已知將這樣的肽性醫藥品即使經口給藥也不能得到很好的吸收率。其原因被認為是這些肽性醫藥品被消化道內的消化酶或者蛋白質分解酶迅速地分解，或者因為是水溶性的高分子，所以難以透過消化道黏膜。為此，這些藥品的給藥方法，目前現狀在臨床上幾乎全部局限於肌肉給藥、皮下給藥以及靜脈內給藥等通過注射進行給藥的方法。不過發現這些通過注射進行的給藥存在在患者中伴隨著痛苦，或者應激反應或者中毒反應等的嚴重副作用的缺點。所以，最近，作為代替這樣的注射的給藥途徑，包括經口給藥在內的經黏膜給藥引人注目，不過，目前的現狀是與注射相比，很難得到充分的吸收率。所以，目前，為了改善經口以及經黏膜給藥後的生理活性肽的吸收率，對各種方法進行了嘗試。將其進行大致分類，可以分成(1)吸收促進劑或者蛋白質分解酶抑制劑等的製劑添加物的利用，(2)藥物的新型的給藥途徑的開發，(3)藥物的分子結構修飾，(4)藥物的劑型改進。
在本發明中，作為實際應用的藥物給藥的時候，為了能夠經口給藥，基於至今為止的技術知識，可以使用各種各樣的形態。例如，可以使用作為吸收促進劑的代表性的表面活性劑或膽汁酸、螯合劑、脂肪酸等烴類，或者添加作為蛋白質分解酶抑制劑的甘膽酸鈉、桿菌肽、大豆胰蛋白酶抑制劑、卡莫司他、抑酞酶等，或者使之被脂質體或者乳劑所包含，封入膠囊中使用等使用適當的方法。
產業上的可利用性根據本發明的方法，可以篩選如前所述的對Vero毒素或者霍亂毒素、百日咳毒素、炭疽菌毒素等的受體結合部具有亞單位結構的毒素具有抑制性的、作為肽合成容易的、作為治療藥物的有效的毒素中和性肽，並可以提供這些肽。
還有，如前所述的本發明的肽具有STX2抑制性，作為肽合成容易，能夠提供作為腸道出血性大腸桿菌感染症的治療藥物的有效的Vero毒素中和劑。
序列表110獨立行政法人科學技術振興機構120毒素中和性肽的篩選方法、STX2抑制性肽和Vero毒素中和劑130
150JP 2004-1898011512004-06-28150JP 2004-2954051512004-10-07160521012117212PRT213人工序列220
223人工序列的描述合成寡肽4001Phe Arg Arg Asn Arg Arg Asn1 521022117212PRT213人工序列220
223人工序列的描述合成寡肽4002Pro Pro Pro Arg Arg Arg Arg1 52103
2117212PRT213人工序列220
223人工序列的描述合成寡肽4003Pro Pro Arg Arg Asn Arg Arg1 521042117212PRT213人工序列220
223人工序列的描述合成寡肽4004Lys Arg Arg Asn Pro Arg Arg1 521052118212PRT213人工序列220
223人工序列的描述合成寡肽220
223Xaa任何胺基酸220
223Aha氨基己酸4005Met Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Ala-Aha1 權利要求
1.毒素中和性肽的篩選方法，該方法篩選能夠中和在受體結合部具有多個亞單位結構的毒素的肽，其特徵在於，該方法包括(1)通過導入突變確定受體結合位點，(2)根據將通過肽文庫法得到的與野生型亞單位結合的肽基序與前述結合位點功能性缺失的突變體結合的肽基序的對比得到的胺基酸選擇比，確定結合位點特異性肽基序。
2.權利要求1的毒素中和性肽的篩選方法，其特徵在於，多次重複上述(2)的步驟，依次確定胺基酸選擇比較高的結合位點特異性的肽基序。
3.權利要求1或者2的毒素中和性肽的篩選方法，其特徵在於，在上述(2)的步驟中，使用形成多個賴氨酸(Lys)鍵合的核結構，其末端的胺基酸上結合多個肽文庫的、多價的1級肽文庫。
4.權利要求3的毒素中和性肽的篩選方法，其特徵在於，在上述的多價的肽1級文庫中，肽文庫通過間隔分子結合於末端氨基上。
5.STX2抑制性肽，其特徵在於，在3分子的賴氨酸(Lys)的結合了肽的分子核結構部分上形成至少7個胺基酸的肽鍵所構成的肽基序，該肽基序是在序列上有2處至少2個鹼性胺基酸結合的簇部，在C-末端側引入了鹼性胺基酸。
6.權利要求5的STX2抑制性肽，其特徵在於，作為簇部的鹼性胺基酸至少含有精氨酸(Arg)。
7.權利要求6的STX2抑制性肽，其特徵在於，簇部是Arg-Arg或者Arg-Arg-Asn。
8.權利要求5～7中任一項的STX2抑制性肽，其特徵在於，N-末端側是疏水性胺基酸。
9.權利要求5～7中任一項的STX2抑制性肽，其特徵在於，引入了下述4種胺基酸序列的肽基序中的至少一種(1)FRRNRRN(序列號1)(2)PPPRRRR(序列號2)(3)PPRRNRR(序列號3)(4)KRRNPRR(序列號4)。
10.權利要求5～9中任一項的STX2抑制性肽，其特徵在於，肽基序通過間隔分子被結合入。
11.權利要求10的STX2抑制性肽，其特徵在於，間隔分子是具有肽或者氨基和羧基的、具有碳原子數4～10個的烴鏈結構的分子。
12.權利要求5～11中任一項的STX2抑制性肽，其特徵在於，肽基序具有末端修飾分子。
13.權利要求12的肽，其特徵在於，末端修飾分子是不具有電荷的分子。
14.權利要求5的肽，其特徵在於，肽基序也可以具有胺基酸測序用分子。
15.下式(a)(b)任一項表示的權利要求12或者13的肽(Met-Ala-Xo-Ala-AHA-)4-3Lys (a)(乙醯-Xo-AHA-)4-3Lys (b)〔式中，AHA表示氨基己烷羧酸基，Xo表示前述的肽基序(1)(2)(3)(4)的任何一個，3Lys表示下式的結構
16.Vero毒素中和劑，其特徵在於，含有權利要求5～15中任一項的肽作為有效成分。
全文摘要
本發明涉及包括下述步驟的篩選方法(1)通過導入突變確定受體結合位點；(2)根據將通過肽文庫法得到的與野生型亞單位結合的肽基序與前述結合位點功能性缺失的突變體結合的肽基序的對比得到的胺基酸選擇比，確定結合位點特異性肽基序。篩選能夠抑制在受體結合部具有亞單位結構的毒素的肽，據此，提供向賴氨酸(Lys)3分子的結合了肽的分子核結構部上引入STX2抑制性肽的、並且合成容易的、能夠抑制Vero毒素的STX2抑制劑。
文檔編號A61P31/04GK101068560SQ20058002918
公開日2007年11月7日 申請日期2005年6月28日 優先權日2004年6月28日
發明者西川喜代孝 申請人:獨立行政法人科學技術振興機構